Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RibeiroJunior_EuripedesdeAlmeida_D.pdf: 1397794 bytes, checksum: 40e2446309eeecd5262d86e0aff53c7c (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A mioglobina é uma hemeproteína que tem a função de transportar e armazenar o oxigênio. Suas estruturas primária e secundária são compostas por 153 aminoácidos e oito a-hélices (nomeadas de A-H), respectivamente. Esta proteína tem sido usada como um bom modelo para estudos de estrutura, função, ligação de heme, estabilidade e enovelamento de proteínas. Em condições ligeiramente ácidas (pH em torno de 4), a apomioglobina se desenovela passando por uma forma intermediária que possui propriedades físicas entre o estado nativo (pH 7) e o estado desenovelado (pH 2). Este intermediário apresenta as hélices A, G e H protegidas como demonstrado por experimentos de troca de deutério. No presente trabalho, foram realizados estudos com mutantes de deleção e de permutações circulares de hélices da mioglobina com a finalidade de aumentar o conhecimento sobre como a estrutura terciária de uma proteína é construída. Três classes de mutantes foram criadas: 1) deleção de hélices: 1.1) um mutante de deleção da hélice H (Mb1-123) e 1.2) um mutante de deleção das hélices G e H (Mb1-99); 2) permutações circulares: 2.1) um mutante de permutação da hélice A da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb-B_GHA) e 2.2) um mutante de permutação das hélices A e B da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb- C_GHAB) e 3) permutação com deleção: um mutante de deleção da hélice G com permutação da hélice H da extremidade C-terminal para N-terminal (Mb-HAB_F). As proteínas mutantes foram purificadas diretamente na forma apo, embora estes mutantes possuam capacidade de se ligar ao grupo heme, com exceção do mutante Mb1-123. Estes mutantes possuem valores mais baixos de elipticidade molar e tendência maior à agregação do que a proteína selvagem. Quando na forma holo, os dois mutantes circularmente permutados são compactos e têm estrutura e função semelhantes à holoMbWT. Este resultado difere do resultado observado para as variantes de deleção (Mb1-99 e Mb-HAB_F) que não apresentaram restabelecimento da estrutura e nem supressão da tendência à agregação. Nossos resultados indicam que, embora a mioglobina possua um núcleo de ligação do grupo heme, as hélices A, B, G e H são necessárias para a correta arquitetura da proteína. Apesar da menor estabilidade dos mutantes de permutação circulares em relação à proteína selvagem, as extremidades N- e Cterminais da mioglobina são necessárias para que a proteína alcance uma estrutura estável e funcional semelhante à selvagem. As permuteínas estruturaram a forma intermediária mesmo em pH ao redor de 7, mostrando novamente que as extremidades N- e C- terminais de mioglobina são necessárias para que elas se estruturem como a selvagem. Acreditamos que um núcleo, que se mostrou insensível ao novelamento em meio ácido, foi formado nestes mutantes. Como estes mutantes diferem quanto à posição da hélice B, eles permitiram inferir sobre a participação da hélice B no intermediário de ApoMbWT. Duas formas de intermediários estão provavelmente presentes na via de enovelamento da mioglobina e suas maiores diferenças parecem estar na quantidade de estrutura formada pela hélice B. Nossos resultados estão de acordo com o modelo seqüencial de enovelamento para mioglobina, no qual a hélice B é incorporada após a formação do domínio AGH / Abstract: Myoglobin functions as a protein for transporting and storing oxygen and is a soluble, globular heme-binding protein, comprising 153 amino acids arranged in eight helical segments (named A to H). This protein has been used as a good model to study structure, function, heme binding, stability, and folding pathway. Under mild acid conditions (pH 4), apomyoglobin unfolds through an intermediate form with physical properties intermediate between the native (neutral pH) and the unfolded (pH 2.0) states. This intermediate has helices A, G and H protected from hydrogen exchange. Here we present studies of deleted and circularly permuted mutations of helical blocks of myoglobin to add to our understanding of how protein topology is built. Three classes of mutants were constructed: 1) helix deletion: 1.1) a mutant deleted of H helix, Mb1-123, and 1.2) a mutant deleted of G and H helices, Mb1-99; 2) circularly permutation: 2.1) Mb-B_GHA where B-helix is N-terminal and A helix is C-terminal, and 2.2) Mb-C_GHAB where C-helix is N-terminal and B helix is Cterminal; 3) permutation/deletion: a deleted circularly permutation where H-helix is N-terminal, the G helix is deleted, and the F helix is C-terminal, Mb-HAB_F. The mutants were purified in the apo form, where although they have the ability to bind heme with an exception to Mb1-123, they have lower ellipticity and a larger tend ency to aggregate than the wild-type. When in the holo form, the two circularly permuted mutants are compact and have native-like function and conformation, different form the myoglobin variants of deletion (i.e. Mb1-99 and Mb- HAB_F), where the heme binding does not seem to be native-like and do not suppresses their tendency to aggregate. Our results indicate that although myoglobin has a core that is able to bind heme, the A, G, H and B helices are needed for the correct structural architecture of the protein. And, since the circularly permutations are less stable than the wild-type, the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. The apopermuteins resembled the intermediate form even at physiological pH, showing again that the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. We believe that a nucleus, mostly independent of acid unfolding, was formed by these mutants and, since these permutants differ in the position of the B helix, they gave insights about the participation of the B helix in the intermediate. Two forms of intermediates are likely to be present in the folding pathway of apomyoglobin and their major difference seems to be in the amount of structure in the B helix. Our results agreed with a model of sequencial folding for apomyoglobin where the B helix is added later in the AGH nucleus / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Lilia Freire Rodrigues de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:19:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esteves_TalitaCasagrande_M.pdf: 3933592 bytes, checksum: 7ff95f45970c8b5e8483f59dd89237f8 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: o receptor sensor de cálcio (CASR) é membro da família III dos receptores que acoplam à proteína G e é de fundamental importância no processo da homeostase do cálcio. O domínio extracelular (ECD) do receptor é o principal sítio de ligação do Ca/+ e a maioria das mutações naturais que ocorrem nesse domínio afeta somente a afinidade do receptor pelo Cao2+.~AJgumasmutações no ECD podem causar uma alteração mais grosseira na estrutura do receptor, com conseqüente redução da sua expressão na superficie celular. O objetivo desta tese foi investigar o grau de expressão do CASR com mutações no ECD, incluindo alterações na polaridade ou no caráter ácido/base, em locais onde mutações ativadoras (ADH) ou inativadoras (FHH/NSHPT) já foram descritas. Além disso, também deletamos a região entre os aminoácidos 139 e 167 do ECD por ser uma região altamente hidrofóbica e cuja importância ainda não foi investigada. A técnica de Westem blotting nos permitiu verificar a expressão de todos os receptores mutados transfectados em células HEK-293. Através da densitometria das bandas de 140 e 160 kDa e a análise estatística do valores obtidos de três experimentos separados, verificamos uma expressão similar ao CASR nativo dos receptores mutados nas posições A116T, N118S, E127K, F128Y, T138K e Ll139-167. O receptor com a mutação P55S apresentou uma drástica redução na expressão das formas diméricas e oligoméricas (-220 kDa) em relação ao CASR nativo. Assim, podemos concluir que a expressão do CASR pode ser afetada de acordo com alterações das características dos aminoácidos nativos (polaridade, caráter ácido/base) e a mudança no padrão de expressão é dependente da posição do aminoácido mutado. A posição 55 demonstrou ser crítica para a expressão das formas diméricas do receptor, enquanto que a região hidrofóbica entre os aminoácidos 139 e 167 não é importante para a expressão nem para a formação de dímeros / Abstract: The calcium sensing receptor (CASR) is a member of the family III of G protein coupled receptors and plays an essential role in calcium homeostasis. The extracellular domain (ECD) of the receptor is the most important site for Ca/+-binding and the majority of the naturally occurring mutations in the ECD affects only the affinity of the receptor for Cao2+. Other mutations in the ECD could result in a more gross alteration of the receptor structure, reflected by reducing expression levels of the receptor at the cell surface. The objective of this thesis was to investigate the expression levels of the CASR with mutations in the extracellular domain where activating and inactivating mutations have been described. The mutation resulted in changes in aminoacid polarity or acid/base character. In addition, a deletion of a region between 139 and 167 aminoacids of the extracelullar domain of the CASR, a highly hydrophobic region, was perform to investigate its relevance. The Western blotting technique demonstrated that alI mutant receptors were expressed in HEK-293 cells. Analysis of the intensity of the bands by densitometry in three separate experiments showed no significant differences in expression levels of the mutants Al16T, Nl18S, E127K, F128Y, T138K and ~139-167 compared to the CASR wild type. The mutant receptor P55S showed a drastically decreased expression leveI in the dimeric and oligomeric forms (-220 kDa) when compared to the CASR wild type. In conclusion, the expression of the CASR could be affected by alterations of the amino acids characteristics (polarity, acid/base character) and the changes in the expression levels is dependent on the position of mutated amino acid. The position 55 is critica! for expression of the dimeric forms of the receptor, while the hydrophobic region between 139 and 167 amino acids is not important for the expression nor the dimerization of the CASR / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Antonio Condino Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_CarolinaCardosoPrandode_M.pdf: 5769811 bytes, checksum: 5de21cee2d90392a078c9567f11a0c17 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: As infecções de repetição são queixas frequentes no consultório pediátrico. Apesar das caracteristicas próprias de infecção recorrente nesta faixa etária, o Pediatra deve estar atento para a presença de defeitos imunológicos como fator determinante dos quadros infecciosos de repetição. Entre as imunodeticiências primárias, a Doença Granulomatosa Crônica (DGC) é causada por alteração no sistema NADPH oxidase das células fagocíticas. O objetivo deste estudo foi avaliar aspectos clínicos de 29 pacientes encaminhados a um laboratório especializado, com suspeita de defeito de fagócitos a nível do sistema NADPH oxidase. Foram realizados os testes de NBT e ânion superóxido e os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo I para os pacientes com alteração no sistema NADPH oxidase e grupo TI para os pacientes que não apresentaram alteração neste sistema. A ocorrência de infecção urinária esteve associada ao grupo em que não se confirmou o diagnóstido de DGC. A presença de história familiar de infecção de repetição apresentou forte associação ao grupo com diagnóstico DGC. Outros dados da história clínica não apresentaram diferenças estatisticamente signifivativa entre os 2 grupos. No grupo de pacientes com DGC observou-se a correlação genótipo-fenótipo descrita na literatura, onde pacientes com a forma ligada ao sexo apresentam início dos sintomas mais precocemente e quadros infecciosos mais graves / Abstract: Recurrent infections are ftequently referred to the Pediatrician' s office. As the irnrnune system continues to develop after birth and will be completed just after childhood, infants tend to present more infections. Besides this particular characteristic, Pediatricians should be aware to some abnormal conditions, the primary immunodeficiencies. Among the primary immunodeficiencies, Chronic Granulomatous Disease is the result of a defect in any of the proteins of the NADPH oxidase system of human phagocytic cells. The aim of this study was to evaluate the clinical aspects of 29 patients that were referred to a specialized laboratory, being suspected of having a defect in the NADPH oxidase system. It was performed the NBT slide test and superoxide dosage. Patients were divided into two groups: group I for patients with defect in this system and group TI for patients without defects in this system. Recurrent urinary tract infections were associated with group TI. A history of recurrent infections in the family was strongly associated to group I. Among CGD patients it was observed the genotype-phenotype correlation presented in the literature in wich X-CGD is associated with an earlier onset of clinical manifestations and more severe infections / Mestrado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Vital Paulino Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T16:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_JosePauloCabralde_D.pdf: 988691 bytes, checksum: ed9aef7fcff38c1838bfc4261d1754b0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Rejane Maria Tommasini Grotto / Banca: Alexandre Naime Barbosa / Banca: André Martins / Resumo: A coinfecção HIV/VHC tornou-se um importante problema de saúde pública devido à possibilidade desses vírus agirem sinergicamente, acelerando a progressão da doença hepática relacionada ao VHC e podendo favorecer a proliferação do HIV. Apesar de estabelecido que a alta variabilidade genética do HIV gera mutações, conferindo ao vírus a capacidade de responder rapidamente as alterações da pressão seletiva exercida pelo sistema imunológico ou pela terapia antirretroviral (TARV), não é conhecido se a presença do VHC pode favorecer a emergência de variantes do HIV resistentes. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de mutações de resistência a inibidores de transcriptase reversa: Inibidores de Transcriptase Reversa análogo nucleosídeo ou nucleotídeo (ITRNs), Inibidores de Transcriptase Reversa não análogo nucleosídeo (ITRNNs); e inibidores de protease (IPs) em variantes de HIV circulantes em indivíduos coinfectados pelo VHC. Foram incluídos 19 pacientes coinfectados pelos vírus HIV/VHC, maiores de 18 anos, com carga viral plasmática do HIV de pelo menos 1.000 cópias de RNA/mL, atendidos no Ambulatório de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina de Botucatu e, no Hospital dia "Domingos Alves Meira". A genotipagem e o sequenciamento foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, UNESP, utilizando o Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Foram observados dois subtipos do HIV-1, B e F, sendo o subtipo B o mais freqüente, 94,74%. Para o VHC foram observados os genótipos 1 (94,74%) e 3 (5,26%). Todos os pacientes apresentaram mutações de resistência as classes avaliadas, tendo maior freqüência mutações associadas aos ITRNs como M184V em 57,89%. As mutações associadas aos ITRNNs mais freqüentes foram a K103N e G190A, presentes em 21,05% das amostras. As mutações principais ... / Abstract: HIV/HCV coinfection has become an important public health problem due to the possibility of these viruses act synergistically, which can accelerate the progression of liver disease related to HCV and may favor the spread of HIV. It is established that the high genetic variability of HIV generates mutations, giving the virus the ability to respond quickly to changes in selective pressure exerted by the immune system or by antiretroviral therapy (ART). It is not known whether the presence of HCV can promote the emergence of resistant variants of HIV. Thus, this study aimed to evaluate the profile of resistance mutations to classes of reverse transcriptase inhibitors: nucleoside and nucleotide analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs), non-nucleoside analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs), in circulating HIV variants in HCV coinfected individuals. In this study were included 19 HIV/HCV coinfected patients, over 18, with plasma HIV viral load of at least 1,000 RNA copies/mL. These patients were treated at the Ambulatory of Gastroenterology of the Faculty of Medicine of Botucatu and at the Day-Hospital "Domingos Alves Meira". Genotyping and sequencing were performed at the Laboratory of Molecular Biology of the Blood Center of Botucatu, Faculty of Medicine, UNESP, using the Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Two subtypes of HIV-1, B and F, were observed, but the subtype B was observed more often, 94.74%. It was observed HCV genotypes 1 (94.74%) and 3 (5.26%). All patients presented resistance mutations to the evaluated classes, and the mutations associated to NRTIs as M184V were observed more often (57.89%). The most common mutations associated to NNRTIs were K103N and G190A, present in 21.05% of the samples. The main mutations associated to IPs more frequent were M46I, I54V and V82A, with 15.78% ... / Mestre

Orientador : Prof. Dr. Mário Antônio Navarro da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Entomologia). Defesa: Curitiba, 21/09/2016 / Inclui referências: f. 55-66 / Resumo: Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762), é considerado de grande importância epidemiológica por ser vetor dos vírus da dengue, da febre amarela, Chikungunya e Zika vírus. Está globalmente distribuído pelos trópicos e em todos os estados brasileiros. A utilização de controle químico resulta numa intensa pressão de seleção, ampliando a população de resistentes. Estudos envolvendo o monitoramento da resistência herdada por esta espécie, frente aos inseticidas, assim como o conhecimento da diversidade genética, podem subsidiar no delineamento de estratégias de controle desse vetor, podendo repercutir na redução do contato vetor hospedeiro. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a frequência das mutações kdr Val1016IIe e Phe1534Cys relacionadas com a resistência a piretróide e detectar a variação genética do gene NADH desidrogenase, subunidade 4 - ND4, do DNA mitocondrial de seis populações naturais de Ae. aegypti do Estado do Paraná Brasil: Alvorada do Sul, Marilena, Maringá, Nova Londrina, Paranavaí e São Carlos do Ivaí. Para avaliar a presença das mutações kdr foram genotipados 345 adultos de Ae. aegypti provenientes das seis populações do Paraná. Para a análise da variabilidade genética foram amostrados de 13 a 29 adultos de cada população, totalizando 120 adultos. Os resultados das populações avaliadas apresentaram polimorfismos simultâneos, no entanto a média da frequência da junção dos alelos mutantes 1016Ile + 1534Cys foi de 55%, indicando que metade das populações apresenta altos índices dos dois alelos mutantes. Com relação ao estudo da diversidade genética a análise mostrou a existência de 40 haplótipos e 44 sítios polimórficos polimorficos. O haplótipo H1 foi o mais frequente, representando 57,5% do total, não sendo detectado apenas na população de Alvorada do Sul. Os haplótipos obtidos para as populações do Paraná quando comparados com os disponíveis para América indicam uma relação com as populações provenientes da Amazônia Brasileira, Sudeste do Brasil, Peru, México e América do Norte. A diversidade genética foi reduzida, ; k = 0,655, Os testes de neutralidade não foram significativos, indicando que o polimorfismo genético está de acordo com o modelo neutro de mutações. A variação genética foi maior dentro das populações (86,28%), sendo a análise significativa (FST = 0,13) demonstrando estruturação genética. Conclui-se que as ações de controle do Ae. aegypti no Paraná utilizando piretróides devem ser avaliadas levando-se em consideração à presença significativa das mutações envolvidas no mecanismo de resistência. A variabilidade genética reduzida indica à intensa pressão de seleção ocasionada pela ação do controle químico, utilizado para combater o vetor, os valores sugerem uma redução no tamanho das populações embora positivo no curto prazo, podem resultar na perda de eficiência na repetição continuada do mesmo produto no controle químico do vetor. Palavras-chave: Canal de sódio voltagem dependente. Controle químico. Kdr Diversidade genética. ND4. / Abstract: Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762), is considered of great epidemiological importance being the vector of dengue virus, yellow fever, Chikungunya and Zika virus. It is globally distributed in the tropics, and all Brazilian states. The use of chemical control, results in an intense selection pressure, increasing the population of resistant. Studies involving the monitoring of resistance inherited by this species, compared to insecticides, as well as knowledge of genetic diversity, can support the development of this vector control strategies, which may cause the reduction of contact vector / host. Thus, this study aimed to evaluate the frequency of kdr mutations Val1016IIe and Phe1534Cys related to resistance to pyrethroid and detect the genetic variation of the NADH dehydrogenase gene, subunit 4 - ND4, the mitochondrial DNA of six natural populations of Ae. aegypti of Paraná Brazil: : Alvorada do Sul, Marilena, Maringá, Nova Londrina, Paranavaí and São Carlos do Ivaí. To evaluate the presence of kdr mutations were genotyped 345 of Ae. aegypti from the six populations of Paraná. For the analysis of genetic variability were sampled 13-29 adult population each, totaling 120 adults. The results of the evaluated populations showed simultaneous polymorphisms, however the average frequency of the junction mutant alleles 1016Ile + 1534Cys was 55%, indicating that half of the population has high levels of both mutant alleles. Regarding the study of genetic diversity analyzes showed 40 haplotypes and 44 polymorphics. The Haplotype H1 was the most frequent, accounting for 57.5% of the total, not being detected only in the population of Alvorada do Sul. The haplotypes obtained for the populations of Paraná when compared with those available to America indicates a relationship with the population from Brazilian Amazon, southeast Brazil, Peru, Mexico and North America. Genetic diversity was low, h = 0.301; = 0.005; k = 0.655, neutral tests were not significant, indicating that the polymorphism is according to the model of neutral mutations. Genetic variation was greater within populations (86.28%), with meaningful analysis (FST = 0.13) demonstrating genetic structure. It is concluded that the control actions of Ae aegypti at Parana using pyrethroids must be evaluated taking into consideration the significant presence of mutations involved in resistance mechanism. The limited genetic diversity indicates the intense selection pressure caused by the action of chemical control, used to combat the vector, values suggest a reduction in size of the population although positive in the short term, can result in loss of efficiency in the continuous repetition of the same product in vector chemical control. Keywords: sodium channel voltage dependent. Chemical control. Kdr Genetic diversity. ND4.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-05-26T04:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 333237.pdf: 2953007 bytes, checksum: d47a19328ddecfa298f35cb142d3e1bd (MD5) Previous issue date: 2014 / O milho MON810 tem inserido em seu genoma o gene truncado cry1Ab oriundo da bactéria B. thuringiensis (Bt). O gene cry1Ab produz a proteína inseticida Cry1Ab que confere à planta resistência aos insetos da ordem Lepidoptera. Mas a inserção do gene cry1Ab no milho MON810 foi incompleta, dado que parte da região 3' da construção original não foi integrada no genoma do milho, incluindo o terminador NOS. Neste contexto, o principal objetivo foi detectar as possíveis interações da proteína Cry1Ab com as proteínas endógenas de milho. Neste estudo foram utilizadas folhas de milho MON810 no estádio V2 para a caracterização da proteína Cry1Ab e a detecção de possíveis proteínas ligadas à Cry1Ab. Na caracterização da Cry1Ab, foi quantificada a proteína Cry1Ab no limbo e na bainha das folhas por DAS-ELISA, mostrando que o conteúdo da proteína Cry1Ab no limbo (55,56 ± 6,54µg Cry1Ab/g massa fresca) foi seis vezes maior do que na bainha (10,29 ± 2,42µg /g massa fresca). Para a extração da proteína Cry1Ab os protocolos de Mekawi e Gruber resultaram em maior rendimento de extração da proteína Cry1Ab. Os extratos protéicos de milho MON810 foram analisados por Western Blot. O ensaio evidenciou quatro bandas imunorreativas de 70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa correspondentes à proteína Cry1Ab, embora em alguns dos extratos foram detectadas bandas imunorreativas maiores do que 120 kDa em vez da proteína Cry1Ab ativa (70 kDa e 65 kDa). No ensaio de imunoprecipitação foram identificadas 49 proteínas de milho coimunoprecipitadas com a proteína Cry1Ab. De forma similar, o ensaio de Ligand blot mostrou que a proteina Cry1Ab poderia estar ligada com proteinas do milho, especialmente uma de 18 kDa, presente tanto nas plantas transgênicas ou na isolinha. Em conclusão, este estudo encontrou (i) evidencia da interação entre a proteína Cry1Ab e proteínas do milho; (ii) variação na quantidade de proteína Cry1Ab em distintas partes da folha e (iii) quarto formas moleculares distintas (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa) da proteína Cry1Ab, ao invés de uma como indicado pela empresa proponente da tecnologia.<br> / Abstract: The MON810 maize has a truncated version of the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis inserted into its genome. The cry1Ab gene produces the insecticidal protein Cry1Ab that confers on the maize resistance to insects of the order Lepidoptera. The construct used in the genetic transformation of MON810 maize contained the CaMV 35S promoter, the hsp70 intron, the cry1Ab gene and the NOS terminator. However, a truncation at the 3 end of the cry1Ab gene led to the complete loss of the NOS terminator, and insertion of cry1Ab gene was incomplete. In this context, the aim of this work was to detect possible interactions of Cry1Ab protein with endogenous protein maize. This study used MON810 leaves (stage V2) to characterize the Cry1Ab protein and to detect possible interaction of Cry1Ab with endogenous maize proteins. To characterize the Cry protein, it was quantified in lamella and sheath by DAS-ELISA. Cry1Ab protein concentration in lamella (55.56 ± 6,54µg Cry1Ab / g fresh weight) was six times greater than the sheath (10.29 ± 2,42µg / g fresh weight). For the extraction of the Cry1Ab protein, five extraction protocols were compared. The protocols of Mekawi and Gruber gave the highest extraction yields of the Cry1Ab protein. The protein extracts of transgenic maize were analyzed by Western blot. The analysis revealed four immunoreactive bands immunoreactive (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa and 34 kDa) corresponding to the Cry1Ab protein, although in some extracts, immunoreactive bands greater than 120 kDa were detected instead of the active Cry1Ab protein (70 kDa and 65 kDa). In addition, in the immunoprecipitation assay there were 49 co-imunoprecipitated proteins from maize with the Cry1Ab protein. Similarly, Ligand blot assay showed that the Cry1Ab protein could be binding with maize proteins, especially an 18 kDa protein which was present in both transgenic and isogenic maize. In conclusion, it was found (i) evidence of interaction between Cry1Ab protein and corn proteins; (ii) variation in the amount of Cry1Ab in distinct part of the leaves, and (iii) four distinct molecular form (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa), instead one indicated by the proponent of the technology.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP / O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... / The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... / FAPESP: 11/50801-4

O objetivo do presente trabalho foi verificar se a dexametasona provoca alterações em determinadas funções sexuais de cães. Para o estudo foram escolhidos 6 cães sem raça definida, da mesma idade e aproximadamente com o mesmo peso, que foram divididos em dois grupos, controle e experimental. O experimento foi dividido em dois períodos, preliminar e experimental, sendo cada um de 63 dias, o que corresponde ao tempo de uma espermatogênese. Após padronização das características sexuais estudadas no período preliminar (n=6), os animais do grupo experimental (n=4) receberam três dosificações de dexametasona sendo doses diárias de 0,5 mg/kg, 0,25 mg/kg e 0,125 mg/kg respectivamente, sendo cada uma no decorrer de uma semana. Após o término do experimento foram analisados e comparados os dados obtidos no período preliminar e experimental, bem como as três se- manas de medicação com a dexametasona no grupo experimental. As investigações proporcionaram os seguintes resultados: 1 - No comportamento sexual e desenvolvimento morfológlco dos órgãos genitais palpáveis não houve diferenças entre os dois grupos; 2 - Não houve alteração no aspecto do sêmen e vigor dos espermatozóides durante o período experimental; 3 - O volume, a concentração espermática e consequentemente o número de espermatozóides por ejaculado diminuiu em todos os animais do grupo experimental em relação ao período preliminar. Nas três semanas de medicação com dexametasona esta diminuição foi altamente significativa; 4 - Não houve alteração no índice de patologia espermática durante o período experimental no grupo medicado com dexametasona; 5 - Houve acentuada redução no nível plasmático de testosterona no grupo experimental durante a medicação com dexametasona, quando comparado com o grupo controle

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2014-08-13T17:59:57Z : No. of bitstreams: 1 000768576_20150224.pdf: 717853 bytes, checksum: 7408062cb04624121242b566d21504b8 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:27Z: 000768576_20150224.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:08Z : No. of bitstreams: 1 000768576.pdf: 1163804 bytes, checksum: c3cfaf6eb851846fa541ad311558450c (MD5) / A coinfecção HIV/VHC tornou-se um importante problema de saúde pública devido à possibilidade desses vírus agirem sinergicamente, acelerando a progressão da doença hepática relacionada ao VHC e podendo favorecer a proliferação do HIV. Apesar de estabelecido que a alta variabilidade genética do HIV gera mutações, conferindo ao vírus a capacidade de responder rapidamente as alterações da pressão seletiva exercida pelo sistema imunológico ou pela terapia antirretroviral (TARV), não é conhecido se a presença do VHC pode favorecer a emergência de variantes do HIV resistentes. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de mutações de resistência a inibidores de transcriptase reversa: Inibidores de Transcriptase Reversa análogo nucleosídeo ou nucleotídeo (ITRNs), Inibidores de Transcriptase Reversa não análogo nucleosídeo (ITRNNs); e inibidores de protease (IPs) em variantes de HIV circulantes em indivíduos coinfectados pelo VHC. Foram incluídos 19 pacientes coinfectados pelos vírus HIV/VHC, maiores de 18 anos, com carga viral plasmática do HIV de pelo menos 1.000 cópias de RNA/mL, atendidos no Ambulatório de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina de Botucatu e, no Hospital dia “Domingos Alves Meira”. A genotipagem e o sequenciamento foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, UNESP, utilizando o Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Foram observados dois subtipos do HIV-1, B e F, sendo o subtipo B o mais freqüente, 94,74%. Para o VHC foram observados os genótipos 1 (94,74%) e 3 (5,26%). Todos os pacientes apresentaram mutações de resistência as classes avaliadas, tendo maior freqüência mutações associadas aos ITRNs como M184V em 57,89%. As mutações associadas aos ITRNNs mais freqüentes foram a K103N e G190A, presentes em 21,05% das amostras. As mutações principais ... / HIV/HCV coinfection has become an important public health problem due to the possibility of these viruses act synergistically, which can accelerate the progression of liver disease related to HCV and may favor the spread of HIV. It is established that the high genetic variability of HIV generates mutations, giving the virus the ability to respond quickly to changes in selective pressure exerted by the immune system or by antiretroviral therapy (ART). It is not known whether the presence of HCV can promote the emergence of resistant variants of HIV. Thus, this study aimed to evaluate the profile of resistance mutations to classes of reverse transcriptase inhibitors: nucleoside and nucleotide analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs), non-nucleoside analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs), in circulating HIV variants in HCV coinfected individuals. In this study were included 19 HIV/HCV coinfected patients, over 18, with plasma HIV viral load of at least 1,000 RNA copies/mL. These patients were treated at the Ambulatory of Gastroenterology of the Faculty of Medicine of Botucatu and at the Day-Hospital “Domingos Alves Meira”. Genotyping and sequencing were performed at the Laboratory of Molecular Biology of the Blood Center of Botucatu, Faculty of Medicine, UNESP, using the Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Two subtypes of HIV-1, B and F, were observed, but the subtype B was observed more often, 94.74%. It was observed HCV genotypes 1 (94.74%) and 3 (5.26%). All patients presented resistance mutations to the evaluated classes, and the mutations associated to NRTIs as M184V were observed more often (57.89%). The most common mutations associated to NNRTIs were K103N and G190A, present in 21.05% of the samples. The main mutations associated to IPs more frequent were M46I, I54V and V82A, with 15.78% ...