A habênula é uma estrutura epitalâmica diferenciada em dois complexos nucleares, a habênula medial (MHb) e a habênula lateral (LHb). Recentemente, a MHb junto com seu alvo principal, o núcleo interpeduncular (IP), foram identificados como estruturas chaves envolvidas na mediação dos efeitos aversivos da nicotina. Contudo, estruturas intimamente interligadas com o eixo MHb-IP, como o núcleo mediano (MnR), a parte caudal do núcleo dorsal da rafe (DRC), e o núcleo tegmental laterodorsal (LDTg) podem contribuir para os efeitos comportamentais da nicotina. As conexões aferentes e eferentes do IP, até agora, não foram sistematicamente investigadas com traçadores sensíveis. Assim, realizamos injeções de traçadores retrógrados ou anterógrados em diferentes subdivisões do IP, no MnR, ou LDTg e também examinamos a assinatura neuroquímica de algumas das mais proeminentes aferências dessas três estruturas através da combinação de rastreamento retrógrada com métodos de imunofluorescência e hibridização in situ. Além de receber entradas topograficamente organizadas da MHb e também da LHb, observamos que o IP está principalmente interligado de forma recíproca com estruturas da linha média, incluindo o MnR/DRC, o núcleo incerto, o núcleo supramamilar, o septo e o LDTg. As conexões bidirecionais entre o IP e o MnR assim como as entradas do LDTg para o IP provaram de ser principalmente GABAérgicas. Com respeito a uma possível topografia das saídas do IP, todos os subnúcleos do IP deram origem a projeções descendentes, enquanto as suas projeções ascendentes, incluindo projeções focais para o hipocampo ventral, o septo ventrolateral, e a LHb originaram da região dorsocaudal do IP. Nossos resultados indicam que o IP está intimamente associado a uma rede de estruturas da linha média, todos eles considerados moduladores chave da atividade teta do hipocampo. Assim, o IP forma um elo que liga MHb e LHb com esta rede e com o hipocampo. Além disso, as proeminentes interconexões predominantemente GABAérgicas entre IP e MnR, assim como IP e LDTg, suportam um papel chave dessas vias bidirecionais na resposta comportamental à nicotina. / The habenula is an epithalamic structure differentiated into two nuclear complexes, medial (MHb) and lateral habenula (LHb). Recently, MHb together with its primary target, the interpeduncular nucleus (IP), have been identified as major players in mediating the aversive effects of nicotine. However, structures downstream of the MHb-IP axis, including the median (MnR), caudal dorsal raphe nucleus (DRC), and the laterodorsal tegmental nucleus (LDTg), may contribute to the behavioral effects of nicotine. The afferent and efferent connections of the IP have hitherto not been systematically investigated with sensitive tracers. Thus, we placed injections of retrograde or anterograde tracers into different IP subdivisions, the MnR, or LDTg and additionally examined the transmitter phenotype of some major IP and MnR afferents by combining retrograde tract tracing with immunofluorescence and in situ hybridization techniques. Besides receiving topographically organized inputs from MHb and also LHb, we found that the main theme of IP connectivity are strong reciprocal interconnections with midline structures, including the MnR/DRC, nucleus incertus, supramammillary nucleus, septum, and LDTg. The bidirectional connections between IP and MnR and the LDTg inputs to the IP proved to be mostly GABAergic. Regarding a possible topography of IP outputs, all IP subnuclei gave rise to descending projections, whereas ascending projections, including focal projections to the ventral hippocampus, ventrolateral septum, and LHb mostly originated from the dorsocaudal IP. Our findings indicate that IP is closely associated to a distributed network of midline structures, all of them considered key modulators of hippocampal theta activity. Thus, IP forms a node that links MHb and LHb with this network and the hippocampus. Moreover, the rich predominantly GABAergic interconnections between IP and MnR, as well as IP and LDTg, support a cardinal role of these bidirectional pathways in the behavioral response to nicotine.

Els coneixements actuals sobre els efectes crònics de l'alcohol en el SNC són encara força limitats. Malgrat haver identificat en part els canvis que subjauen a fenòmens com la tolerància o la dependència, el mecanisme responsable de l'addicció encara és desconegut. Diversos estudis s'han centrat en la neurotransmissió GABAèrgica, glutamatèrgica, dopaminèrgica i serotoninèrgica, aquests sistemes quan son afectats crònicament per l'alcohol, responen amb adaptacions que o bé són reversibles, o es compensen i neutralitzen després d'un període d'abstinència, no poden per tan ésser el suport d'un fenomen permanent com l'addicció. Estudis fets en animals consumidors voluntaris de dosis tòxiques d'alcohol, han mostrat diferències significatives respecte als controls en diversos processos d'aprenentatge tant excitatori com inhibitori, i han estat identificants canvis tan fisiològics com moleculars en la transmissió colinèrgica de tipus nicotínic. Aquests canvis, sensibilització i regulació a l'alça del receptor nicotínic, són presumiblement irreversibles, no obstant, desconeixem si els processos d'aprenentatge, i els substrats neurals subjacents, es troben alterats en aquests animals alcohòlics durant l'abstinència. En aquesta tesi ens hem plantejat estudiar l'estat funcional de la funció colinèrgica de tipus nicotínic del feix septohipocàmpic durant l'abstinència, avaluant l'efecte d'una injecció intraseptal de nicotina en la capacitat de l'animal alcohòlic per aprendre la resposta a la palanca durant l'abstinència d'alcohol (Experiment I). D'altra banda, s'ha estudiat la capacitat d'aprenentatge inhibitòri per tal de conèixer l'estat funcional i la implicació d'aquest circuit en el control de la conducta. Amb aquest objectiu, hem avaluat mitjançant aprenentatge de discriminació (amb estímuls excitatori i inhibitori), l'efecte d'una injecció intraseptal de nicotina en la capacitat d'inhibir una resposta en la Prova de Dos Estímuls de Pavlov i en l'extinció simple, en situació d'abstinència (Experiment II). Els resultats obtinguts en l'Experiment I mostren que l'abstinència d'alcohol modifica dràsticament, en sentit negatiu, la capacitat d'aprenentatge simple en els animals alcohòlics. D'altra banda, la nicotina té efectes oposats en els subjectes alcohòlics Abstinents i No-Abstinents, en aquests empitjora l'adquisició triplicant el temps necessari per assolir l'aprenentatge a la dosi de 10nM, mentre que en el cas dels Abstinents, neutralitza l'efecte disruptor de l'abstinència, en l'aprenentatge d'aquesta resposta, a la dosi de 20nM. Els subjectes alcohòlics No-Abstinents respecte dels controls mostren una sensibilització funcional a la nicotina administrada intraseptalment, que es fa palesa amb el desplaçament de la corba dosi-resposta cap a l'esquerre i amb un increment considerable de l'efecte màxim. Els resultats obtinguts en l'Experiment II mostren que l'abstinència té un efecte disruptor sobre el control inhibitori que és més pronunciat en els animals alcohòlics (sensibilització). Pel que fa a l'efecte de la nicotina en la Prova de Dos Estímuls de Pavlov, s'observa un efecte disruptor dosi-depenent en els alcohòlics No-Abstinents mentre que els Abstinents té l'efecte contrari, millorant el seu control inhibitori. Així doncs, la corba dosi-resposta per a la nicotina intraseptal pels animals alcohòlics Abstinents, respecte a la mateixa corba dels No-Abstinents, mostra la inversió del perfil de la nicotina i un desplaçament a l'esquerre (sensibilització) de l'efecte màxim. Els resultats obtinguts permeten concloure que els subjectes alcohòlics mostren una reactivitat exacerbada a l'administració de nicotina intraseptal, en comparació amb els controls. En l'abstinència d'alcohol, la resposta dels subjectes és molt diferent a la dels alcohòlics No-Abstinents, l'administració de nicotina "normalitza" la resposta dels Abstinents, equiparant-los als No-Abstinents injectats amb salí. Tot plegat és congruent amb una sensibilització funcional de la resposta colinèrgica de tipus nicotínic a l'acció concurrent de l'alcohol i la nicotina, en l'abstinència la nicotina pot substituir l'alcohol i neutralitzar-ne l'abstinència, aquestes propietats caracteritzen el cervell alcohòlic i el distingueixen del cervell control. Paraules clau: Consum crònic i voluntari d'alcohol; Abstinència; Nicotina; Septum medial. / The current knowledge about chronic alcohol consumption effect on the CNS is still limited. Despite to have identificated some of the changes that underlie phenomenons as tolerance and dependence, we still unknown the main mechanism responsible of addiction. Several studies have focused on GABAergic, glutamatergic, dopaminergic or serotoninergic transmission. These systems, whereas they become adapted by chronic alcohol, after an abstinence period their adaptation is reverted or compensed, for this reason, they could not be the main support of a permanent fenomenon as addiction. Previous studies, done with chronic alcohol drinking animals, have shown significant differences between alcohol and control groups in several excitatory and inhibitory learning processes. On the other hand, it has been identificated several physiologic and molecular changes in the nicotinic cholinergic transmission of these alcoholic animals. These changes, sensitization by up-regulation of the nicotinic receptor, are supposed to be irreversible. However, we unknow if these learning processes, and the underlying neural substratum, are also modificated during abstinence in these alcoholic animals. One of the main objectives of this thesis is to study the functional state of the nicotinic cholinergic function of the septo-hippocampal pathway during abstinence. For this purpose, we have evaluated the effect of an intraseptal injection of nicotine upon the acquisition and extinction of lever-press response during the alcohol abstinence (Experiment I). Furthermore, we have studied the acquisition of an inhibitory learning in order to know the implication and functional state of that pathway over behaviour control during withdrawal. For this purpose, after the acquisition of a discriminative learning (with excitatory and inhibitory stimulus), we have evaluated the effect of an intraseptal injection of nicotine on the capacity of the animal to inhibit a response, in the Pavlov's Two Stimuli Test and extinction session, during alcohol abstinence (Experiment II). Results obtained in Experiment I show that alcohol abstinence drastically impaired in the alcoholic animal the acquisition of a simple learning. On the other hand, nicotine has opposed effects in Abstinent and Non-Abstinent alcoholic animals. In Non-Abstinent subgroup, subjects that received nicotine 10nM show the worst acquisition, taking threefold more time to attain the criterion compared with saline subgroup, while in the case of the Abstinent, nicotine neutralizes the disruptive effect of abstinence at the dose of 20nM. The alcoholic Non-Abstinent animals compared with those of the control group show a functional sensitization to the intraseptal nicotine with an inverted U-shaped dose-response curve that appears shifted leftwards and with a significative increase of the maximum effect. Results obtained in Experiment II show that abstinence has a disruptive effect over the inhibitory control that is more pronounced in alcoholic animals (sensitization). Regarding nicotine effect in Pavlov's Two Stimuli Test, we observe a dose-dependent disruptive effect in Non-Abstinent subgroup while in the case of Abstinent it has the opposite effect improving their inhibitory control. The dose-response curve for the intraseptal nicotine injection in the Abstinent alcoholic animals compared to the same curve for the Non-Abstinent, shows an inverted U-shaped dose-response curve that appears shifted leftwards (sensitization). Overall results show that alcoholic subjects have an exacerbated reactivity to the intraseptal nicotine when compared to the control group. During alcohol abstinence, the response of that subjects is significantly different of that one of the Non-Abstinent, while the nicotine administration "normalizes" the Abstinent animals response equaling them to the Non-Abstinent injected with saline. All these results are congruent with a functional sensitization of the nicotinic cholinergic response to the concurrent action of alcohol and nicotine. During abstinence nicotine seems to substitute the alcohol and to neutralize the abstinence caused by that drug. Those properties would characterize the alcoholic brain and would distinguish it from the control one, implications for pharmacological therapies are discussed. Keywords: Chronic voluntary alcohol; Withdrawal; Nicotine; Medial septum.

Antecedentes La adicción a los cigarrillos se debe principalmente a la nicotina que contienen, pero poco se conoce sobre su dosificación en fumadores. La medición de la cotinina, el principal metabolito de la nicotina, ayuda a caracterizar la dosis de nicotina recibida por los fumadores, reflejando diferencias en la conducta tabáquica y en la motivación para dejar de fumar, en el tipo de cigarrillos fumados y en el metabolismo de la nicotina en diferentes poblaciones. Hipótesis 1. El número de cigarrillos fumados será el principal determinante de las concentraciones de cotinina en saliva: las concentraciones de cotinina en saliva se incrementarán al incrementar el consumo de cigarrillos. 2. Las concentraciones de cotinina en saliva serán mayores cuanto menor tiempo haya transcurrido desde que el fumador se despierta hasta que fuma el primer cigarrillo. 3. Los fumadores más dependientes tendrán concentraciones de cotinina en saliva más altas que los fumadores menos dependientes. 4. Los fumadores muy dependientes y con altas concentraciones de cotinina en saliva estarán menos preparados para dejar de fumar. Objetivos 1. Caracterizar la distribución de las concentraciones de cotinina en saliva en fumadores y los factores que la influencian. 2. Estudiar la asociación entre el tiempo transcurrido hasta el primer cigarrillo fumado después de despertarse y la concentración de cotinina en saliva. 3. Analizar la relación entre la dependencia a la nicotina y las concentraciones de cotinina en saliva. 4. Estudiar la preparación para dejar de fumar (estadios del cambio de Prochaska y DiClemente) de acuerdo al perfil de dependencia y los niveles de cotinina en saliva. Metodología Los datos provienen de dos estudios independientes. Uno de ellos es un estudio transversal (2004-2005) de una muestra representativa de la población general de Barcelona (n=1245), en el que se utilizó un cuestionario sobre tabaquismo y exposición pasiva al humo del tabaco, así como una muestra de saliva para determinar la concentración de cotinina. El otro también es un estudio transversal (2006) de una muestra representativa de la población española ≥l8 años (n=2522), en el que se utilizó una entrevista telefónica sobre consumo de tabaco y exposición al humo ambiental del tabaco. Se calcularon medias y desviaciones estándar o medianas y rangos intercuartílicos, según fuera apropiado, para describir los datos. Se utilizaron análisis descriptivos y modelos de regresión múltiple en función de los objetivos propuestos. Resultados Las concentraciones de cotinina en saliva aumentaron a mayor consumo de cigarrillos hasta llegar aproximadamente a los 20 cigarrillos, nivel donde las concentraciones de cotinina se estabilizaban. El consumo diario de cigarrillos, el momento del día en que se fuma más y el tiempo transcurrido desde que el fumador se despierta hasta que fuma su primer cigarrillo estuvieron significativamente relacionados con la concentración de cotinina en saliva. Éste último en particular demostró ser un buen indicador de dependencia. Por otra parte, no se observó una asociación entre las concentraciones de cotinina en saliva y los estadios del cambio, si bien en cada estadio se observó que las concentraciones de cotinina aumentaban a mayor consumo de cigarrillos, a mayor nivel de dependencia y a menor tiempo transcurrido hasta fumar el primer cigarrillo del día. Conclusiones Las concentraciones de cotinina en saliva están relacionadas con el consumo diario de cigarrillos, el tiempo transcurrido hasta fumar el primer cigarrillo del día y el nivel de dependencia a la nicotina, no así con los estadios del cambio en los que se encuentran los fumadores. El consumo diario de cigarrillos, el tiempo hasta fumar el primer cigarrillo y el momento del día en que se fuma más son buenos indicadores del nivel de dependencia del fumador.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Organização Mundial da Saúde estima que existam aproximadamente 250 milhões de mulheres tabagistas no mundo. Em países em desenvolvimento, a prevalência do tabagismo pode variar de 11 a 35% em mulheres grávidas, constituindo um problema de saúde pública. Nicotina, um agonista colinérgico considerado o mais importante componente ativo da fumaça do cigarro, é capaz de causar déficits em um cérebro em desenvolvimento, no entanto, muitos estudos investigam estes efeitos durante a gestação de roedores, que corresponde aos dois primeiros trimestres de gestação em humanos. O presente estudo, foi focado nos efeitos da nicotina sobre o sistema colinérgico cerebral durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos. Ratas lactantes foram expostas a nicotina (NIC, 6 mg/Kg/dia) ou a salina (SAL) via mini-bombas osmóticas (s.c.) a partir do 2 dia ate o 16 dia pós-natal (PN). Filhotes NIC e SAL foram sacrificados durante a exposição, em PN15, e após a retirada em três momentos diferentes, PN21, PN30 e em PN90. Quatro biomarcadores foram considerados. Para avaliação dos efeitos sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), nós utilizamos [3H]citisina, que é um ligante seletivo para α4β2. Nos também medimos o marcador [3H]hemicholinium-3 (CH-3) de alta afinidade para o transportador pré-sináptico de colina, e a atividade das enzimas colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE) no córtex cerebral (CX), mesencéfalo (MB) e hipocampo (HP) na prole. O grupo NIC apresentou supra-regulação de nAChRs em todas as regiões durante a exposição, este efeito foi revertido pouco tempo após a retirada. Interessantemente, uma significante infra-regulação de nAChRs foi observada após um longo tempo da retirada somente em CX. A exposição à nicotina reduziu a marcação para HC-3 durante a exposição em todas as regiões e foi revertida em PN21. Já em PN30, o grupo NIC apresentou uma diminuição do HC-3. Em contraste, em PN90, foi observado um aumento de HC-3. Não foram observados efeitos para atividade da ChAT e da AChE em CX. No que diz respeito ao MB, o grupo NIC apresentou um aumento de atividade para ambas as enzimas, ChAT e AChE, em PN30. Para a mesma idade, nos observamos um decréscimo desta atividade somente em HP. E, após um longo tempo de retirada, somente HP apresentou um aumento na atividade da ChAT. Estes dados sugerem que a exposição à nicotina em ratos durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos promove alterações no sistema colinérgico dos filhotes. Somado a isto, nossos resultados indicam que os efeitos prejudiciais são observáveis mesmo muito tempo após a exposição ter sido interrompida. / The Word Health Organization estimates that there are approximately 250 million women smokers in the world. In developing countries, the prevalence of smoking varies from 11% to 35% in pregnant women, constituting a public health concern. Nicotine, a cholinergic agonist that is considered one the main active components of cigarette smoke, causes deleterious effects on brain development, however, most studies investigate its effects during rodents gestation, which corresponds to the first two trimesters of human gestation. In the present study, we focused on nicotine effects on the brain cholinergic system during the third trimester equivalent of human gestation. Lactating rats were exposed either to nicotine (NIC, 6 mg/Kg/day) or to saline (SAL) via osmotic minipumps (s.c.) from the 2nd to the 16th postnatal day (PN). NIC and SAL offspring were sacrificed during exposure (PN15), or at withdrawal (PN21, PN30 and PN90). Four cholinergic biomarkers were considered. For evaluation of effects on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), we utilized [3H]cytisine, a ligand that binds selectively to the a4b2 nAChR. We also assessed the binding of [3H]hemicholinium-3 (HC-3) to the high-affinity presynaptic choline transporter, choline acetyltransferase (ChAT) and acetylcholinesterase (AChE) activities in the cerebral cortex (CX), midbrain (MB) and hippocampus (HP) of the offspring. NIC offspring presented nAChR upregulation in all regions during exposure that was reversed at short term withdrawal, in PN21. Interestingly, a significant nAChR downregulation was observed at long term withdrawal only in CX. Nicotine reduced HC-3 binding during exposure in all regions that was reversed on PN21. On PN30, NIC offspring presents a decrease HC-3 binding. In contrast, on PN90 was observed an increase on HC-3 binding. There were no effects for ChAT and AChE in the CX. Regarding MB, NIC offspring presents an increase in both ChAT and AChE activity on PN30. At the same age, we observed a decreased in both ChAT and AChE activity on HP. At long term withdrawal, only HP showed an increase in ChAT activity. These data indicate that maternal nicotine exposure during the third trimester equivalent of human gestation promotes cholinergic system alterations in the offsprings. In addition, our data indicate that detrimental effects are observable even long after the exposure has been interrupted.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2011 / Bibliografia: f. 41-46 / Objetivo: avaliar se o tratamento com L-arginina influencia a cicatrização de retalhos cutâneos em ratos expostos ou não à nicotina. Método: Utilizaram-se 20 ratos Wistar tratados por quatro semanas com nicotina, submetidos ao retalho cutâneo, sendo a seg / Objective: To evaluate if the treatment with L-arginine influences the healing of skin flaps in rats exposed to nicotine. Method: It was used 40 Wistar rats weighing 142,4"b10,1 g separated into four groups. GC: treatment with phosphate buffer solution pH

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os agrotóxicos são substâncias químicas usadas, entre outras coisas, para o controle de pragas ou doenças das plantas e animais. Utilizados desde a Grécia clássica, esses produtos foram difundidos em vários países após a Segunda Guerra Mundial e no Brasil a partir da década de 60. Atualmente o Brasil é o maior consumidor de agrotóxicos no mundo. O uso inadequado dos agrotóxicos tem se constituído um problema para saúde humana e ambiental. Especialmente os trabalhadores da agricultura estão expostos aos efeitos danosos desses produtos. Na fumicultura, associados aos problemas causados pela exposição aos agrotóxicos os trabalhadores rurais ainda estão expostos a intoxicação causada pela nicotina presente na folha do tabaco. Em Arapiraca, importante produtor de tabaco no cenário nacional, a fumicultura destaca-se pela excessiva utilização de agrotóxicos, fato que contribui para ocorrência de agravos à saúde dos trabalhadores, principalmente pelas condições inadequadas de trabalho e desrespeito às normas de segurança. Esse trabalho objetivou caracterizar o perfil ocupacional dos fumicultores de Arapiraca-AL e sua exposição a agrotóxico e nicotina. Trata-se de um estudo transversal, do tipo descritivo, onde 70 trabalhadores do cultivo do tabaco foram entrevistados, utilizando-se um questionário semi-estruturado para obter informações acerca do perfil ocupacional. Os resultados mostraram que, 41,4% dos trabalhadores entrevistados possuíam idade entre 30-45 anos e 55,7% tinha ensino fundamental incompleto ou eram analfabetos. Também se observou que 37,1% eram proprietários da terra e 58% tinham renda per capita até um quarto de salário mínimo. Quase metade dos agricultores (47,1%) iniciou o trabalho na fumicultura até os 8 anos de idade e 48,6% tinham entre 11-30 anos de trabalho. A maioria, 54,3%, relatou trabalhar até 8 horas/dia, sendo que 61% trabalhavam seis dias da semana. Também a maioria dos trabalhadores, (62,9%) aplicava agrotóxicos e destes 43,2% gastava entre 5-8 horas diárias na aplicação. O pulverizador costal manual era utilizado por 72,7% dos aplicadores. Dentre os agrotóxicos utilizados o Confidor foi o mais citado. Quanto ao uso de medidas de proteção durante a mistura do agrotóxico, 56,8% não usava nenhuma medida e 34,1% justificava devido ao custo elevado. A maioria lavava as mãos (93,2%) e tomava banho (79,5%) frequentemente logo após aplicar agrotóxicos. Dois terços (61,3%) dos agricultores nunca ingeriam líquido durante a aplicação do agrotóxico e 75% nunca comiam durante o mesmo procedimento. Enquanto 40,9% dos entrevistados já passaram mal após aplicar agrotóxicos, 72,7% referiram nunca ter tido intoxicação por agrotóxico. Dor de cabeça, náusea e vômito foram sinais e sintomas mais referidos. Quanto à exposição à nicotina, 84,3% dos entrevistados referiram contato da pele com a folha do tabaco e 71,5% tinham este contato sempre. O uso de luvas durante a colheita e a lavagem das mãos após a colheita foi referida por 57,1% e 85,7% dos trabalhadores, respectivamente. A maioria dos fumicultores já havia se sentido mal durante a colheita (64,3%) e os sintomas mais citados foram dor de cabeça, vômito e náusea. A maioria dos trabalhadores, 58,6%, não era fumante e 51,4% não fumavam enquanto manipulava a folha do tabaco. Concluiu-se com esse estudo que os fumicultores estão permanentemente expostos aos efeitos dos agrotóxicos e a nicotina devido à longa jornada de trabalho, baixa adesão às tecnologias de prevenção disponíveis devido às vulnerabilidades e minimização do risco.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-06-07T10:20:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1642997 bytes, checksum: a9190cecf7b70ea7e238c98b99466014 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T10:20:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1642997 bytes, checksum: a9190cecf7b70ea7e238c98b99466014 (MD5) Previous issue date: 2014-09-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os membros da família de fatores de transcrição NAC (acrônimo de NAM, ATAF e CUC) são específicos de plantas e são conhecidos por atuarem tanto no desenvolvimento quanto na regulação da resposta a estresse. Dentre os genes NAC envolvidos em respostas contras estresses bióticos e abióticos já identificados em soja (Pinheiro et al., 2009, Le et al., 2011),o gene GmNAC081 é induzido pela expressão de NRPs (Faria et al., 2011) e por diferentes condições de estresses fisiológicos (Pinheiro et al., 2009) portanto, é possível que elementos em cis presentes no seu promotor promovam a integração de diferentes sinais que resultem em morte celular mediada por GmNAC081.A presente investigação teve como objetivos principais confirmar a presença de domínios discretos no promotor do gene GmNAC081 responsivos a estresses osmótico, induzido por PEG, e do retículo endoplasmático, induzido por tunicamicina e avaliar a expressão basal e tecido- específica do promotor em condições de cultivo in vitro e em casa de vegetação. Além disso, foi avaliado a atividade do promotor GmNAC081 durante o desenvolvimento. Para isso, foram utilizadas plantas transgênicas contendo o promotor GmNAC081 na extensão de 1000 pb, 750 pb e 500 bp fusionadas ao gene repórter GUS. Análises fluorimétricas quantitativas de GUS revelaram a presença de elementos em cis responsivos a PEG na regiao contida pelas posições -1000 a -750. Pelo menos dois elementos responsivos a tunicamincina devem estar contidos nas regioes -1000 a -750 e -750 a -500. Os resultados da presente investigação revelaram que a atividade do promotor de 1000pb de GmNAC081 está relacionada às condições de cultivo de plantas trangênicas de Nicotiana tabacum, sendo fortemente induzido durante a senescência. Estes resultados foram confirmados por meio de análises histoquímicas. De fato, a região 5’ de -1000pb que flanqueia o gene GmNAC081 é induzível por estresses osmótico e do retículo endoplasmático em diferentes orgãos e tecidos (Rosado, 2012). As sequências de 1000pb do promotor de GmNAC081 foram capazes de direcionar a expressão de GUS no tecido vascular em plantas cultivadas in vitro. Além disso, as análises histoquímicas de atividade de GUS confirmaram que o promotor de GmNAC081 é fortemente induzido em tecidos em estádios avançados de desenvolvimento. Coletivamente, estes resultados demonstram que a inducão do gene GmNAC081 por estresses e durante a senescência ocorre no nível transcricional por meio de elementos cis-regulatórios presentes em regiões discretas do promotor. Além disso, os resultados de atividade do promotor GmNAC081 substanciam o argumento de que GmNAC081 esteja envolvido em resposta a estresse e no processo de senescência natural. / The members of the NAC (NAM, ATAF and CUC acronyms) family are plant- specific transcriptional factors, which are involved in development and stress responses. Among the abiotic and biotic stress response NAC genes already identified in soybean, GmNAC081 is induced by NRP expression and different conditions of physiological stresses; hence it is possible that cis-regulatory elements on its promoter cause the integration of different stimuli that result in GmNAC081 mediated cell death. The present investigation aimed at confirming the presence of discrete domains on the GmNAC081 promoter, which are responsive to osmotic stress, induced by PEG, and endoplasmic reticulum stress, induced by tunicamycin as well as at evaluating the basal and tissue-specific expression of the promoter under in vitro and greenhouse growth conditions. In addition, the GmNAC081 promoter activity was evaluated during development under greenhouse conditions. For this, we used transgenic plants harboring different extensions (up to positions -1000, -750 and -500) of the GmNAC081 promoter fused to the GUS reporter gene. Quantitative fluorometric analyses of GUS revealed the presence of cis-elements responsive to PEG in the region delimitated by the positions -1000 to -750. At least two responsive cis-elements to tunicamycin may be present in the regions -1000 to -750 and -750 to -500. The results of the present investigation also revealed that the GmNAC081 promoter (1000bp) activity is related to the cultivation conditions of Nicotiana tabacum transgenic plants and it is strongly induced during natural senescence. These results were further confirmed through histochemical analyses. In fact, the 1000-bp 5’ flanking sequences of GmNAC081 is induced by osmotic stress and reticulum endoplasmic stress in different organs and tissues. The 1000-bp sequences of the GmNAC081 promoter were capable of directing GUS expression in the vascular tissue of in vitro cultivated plants. Furthermore, the histochemical analyses of GUS activity confirmed a strong induction of the GmNAC081 promoter in tissues under advanced stages of development. Taken together, these results demonstrate that the induction of GmNAC081 expression by stresses and during senescence occurs at the transcriptional level through positive cis-regulatory elements presents in discrete regions of the promoter. In addition, the pattern of the GmNAC081 promoter activity substantiates the argument that GmNAC081 is involved in the process of natural senescence.

A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa e a principal causa de demência re lacionada a idade. Os números em crescimento de pessoas afetadas pela DA estão diretamente ligados ao aumento na expectativa de vida da população mundial. A DA, por se tratar de uma doença multifatorial, envolve fatores genéticos, moleculares e ambientais.As principais alterações fisiopatológicas, hoje alvos de estudos, são os emaranhados neurofibrilares, constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas senis, compostas pelo peptídeo beta-amilóide (Aβ). O peptídeo Aβ tem sido considerado o principal responsável pelos processos de disfunção sináptica, morte neuronal e consequente declínio cognitivo dos pacientes com DA. Diversos processos estão envolvidos na formação deste peptídeo, que uma vez formado desencadeia uma cascata de eventos que envolvem alterações na sinalização celular, ativação da neuroinflamação e geração de um desbalanço na produção de espécies reativas de oxigênio nas organelas presentes nos neurônios culminando na disfunção sináptica e morte celular. Apesar do intenso estudo sobre a fisiopatologia da DA observado nas últimas décadas, ainda não existe o conhecimento completo sobre as causas e sobre o mecanismo que levam a progressão da doença. Os receptores nicotínicos estão presentes no sistema nervoso e, de uma forma geral, são responsáveis pela liberação de neurotransmissores importantes para uma diversidade de processos cognitivos. O estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial estão correlacionados a um ciclo vicioso de desequilíbrio que desempenha um importante papel na patogênese da DA. Por isto, neste trabalho procuramos avaliar o efeito da nicotina em um modelo in vitro de toxicidade do peptideo Aß em cultura organotípica de hipocampo de ratos, bem como avaliar os efeitos desta droga sobre as proteínas relacionadas com a neurodegeneração, AKT e GSK-3ß . Além disso, avaliamos as alterações mitocondriais que a nicotina ocasionou em culturas organotipicas. Para isso, as culturas foram expostas ao peptideo Aß e á nicotina concomitantemente por um período de 48h. A morte celular foi aval iada a partir da incorporação do iodeto de propídeo, um marcador de morte de células principalmente em processo de necrose. As cul turas expostas ao peptídeo Aß quando tratadas com nicotina não apresentaram prevenção da morte celular. A nicotina não teve efeito sobre a fosforilação das proteínas AKT e GS K-3ß. através da análise obtida por Western blotting. Entretanto, na análise real izada por citometria de fluxo, utilizando as sondas mitocondriais MitoTracker® e MitoSOX®, observamos um aumento na produção do ânion superóxido, bem como uma diferença na massa mitocondrial nas culturas expostas ao peptideo com nicotina. / Alzheimer's Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder and the leading cause of age-related dementia. The growing numbers of people affected by AD are directly linked to the increase in life expectancy of the world population. The AD, because it is a multifactorial disease, involving genetic, molecular and environmental factors. The main pathophysiological changes, today object of studies, are the neurofibrillary tangles formed by the hyperphosphorylated tau protein and the senile plaques, composed of the betaamyloid peptide (Aß). The Aß peptide has been considered the main responsible for synaptic dysfunction processes, neuronal death and consequent cognitive decline in AD patients. Several processes are involved in the formation of this peptide, which once formed triggers a cascade of events that involve alterations in cell signaling, activation of neuroinflammation and generate an imbalance in the production of reactive oxygen species in the organelles present in neurons culminating in synaptic dysfunction and cell death. Despite the intense study of the pathophysiology of AD observed in recent decades, there is still no complete knowledge about the causes and the mechanisms that lead to disease progression. Nicotinic receptors are present in the nervous system and, in general, are responsible for the release of neurotransmitters important for a variety of cognitive processes. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction is correlated to a vicious circle of imbalance plays an important role in the pathogenesis of AD. Therefore, in this study we evaluated the effect of nicotine on a model in vitro toxicity of Aß peptide in organotypic culture in rat hippocampus, and to evaluate the effects of this drug on proteins related to neurodegeneration, Akt and GSK-3β. In addition, we evaluated the mitochondrial alterations that nicotine caused in organotypic cultures. For this, the cultures were exposed to the Aß-peptide and nicotine concomitantly for a period of 48h. Cell death was evaluated from the incorporation of propidium iodide, a marker of cell death mainly in necrosis process. Cultures exposed to Aß peptide when treated with nicotine did not show any preventing cell death. Nicotine had no effect on the phosphorylation of Akt and GSK-3β protein, obtained through the analysis by Western blotting. However, the analysis performed by flow cytometry using the mitochondrial probe MitoTracker® and MitoSOX®, an increase in the production of superoxide anion as well as a difference in mitochondrial mass in peptide cultures exposed to nicotine.

Fumar e consumir bebidas alcoólicas estão frequentemente associados durante a adolescência. Contudo, poucos estudos em modelos animais têm como foco as bases neurobiológicas da exposição combinada à nicotina e ao etanol no cérebro de adolescentes. Nesse estudo investigamos morte celular e alterações na densidade neuronal e glial nas regiões granulosa do giro denteado (GrDG), camada moleuclar (Mol), CA1, CA2 e CA3 do hipocampo, durante a exposição e dois e cinco dias após o seu término. Para tanto, do 30 ao 45 dia pós-natal (PN30-PN45), 233 camundongos C57BL/6 machos e fêmeas foram expostos à nicotina (NIC) e/ou etanol (ETOH). Assim, quatro grupos experimentais foram utilizados: 1) NIC+ETOH: exposição concomitante a NIC (50&#956;g/ml em 2% de sacarina na água de beber) e ETOH (25%, 2g/kg i.p. em dias alternados), 2) exposição à NIC, 3) exposição ao ETOH, 4) exposição ao veículo. Avaliamos morte celular por apoptose pela técnica do TUNEL, densidades neuronal e glial pelo método do Disector óptico e espessuras das regiões durante a exposição (PN45) e dois (PN47) e cinco dias (PN50) após o seu término. ANOVAs foram utilizadas para detectar efeitos do tratamento e/ou interações do tratamento com outros fatores. O grau de significância assumido foi de p<0.05. Em PN45, a exposição ao etanol aumentou o número de células TUNEL+ em todas as regiões hipocampais quando comparado ao grupo veículo e a nicotina provocou uma resposta menos severa e dependente da região. Os animais que receberam nicotina+etanol não diferiram dos animais veículo em todas as regiões hipocampais. Em PN47, ainda foi identificado aumento no número de células TUNEL+ nos grupos ETOH e NIC, mas em menor magnitude que os efeitos identificados durante a exposição. Esses resultados foram acompanhados por redução das densidades neuronal e glial em todos os grupos tratados. Em PN50, a abstinência de nicotina e/ou etanol foi associada com reduções compensatórias de células TUNEL+ em todas as regiões hipocampais quando comparados com o grupo veículo e com a recuperação das densidades neuronal e glial. Não houve alterações nas espessuras das regiões nas três idades analisadas. Esses resultados sugerem que os efeitos deletérios da nicotina e/ou etanol durante a exposição e/ou da abstinência são revertidos durante a abstinência prolongada. / Smoking and consumption of alcoholic beverages are frequently associated during adolescence. However, there have been few animal studies on the neurobiological bases of the combined exposure in the adolescent brain. In the present study, we investigated the effects of adolescent nicotine and/or ethanol exposure and withdrawal on the following regions of the hippocampus: Granular layer of the Dentate Gyrus (GrDG), Molecular layer (Mol), CA1, CA2 and CA3. From the 30th to the 45th postnatal day (PN30-PN45), 233 C57BL/6 male and female mice were exposed to nicotine free base (NIC) and/or ethanol (ETOH). Four groups were analyzed: 1) concomitant NIC (50 &#956;g/ml in 2% saccharin to drink) and ETOH (25%, 2 g/kg i.p. injected every other day) exposure; 2) NIC exposure; 3) ETOH exposure; 4) vehicle. We evaluated cell degeneration (TUNEL assay), neuronal and glial densities (optical Disector) and region thicknesses during the exposure (PN45) and two (PN47) and five (PN50) days post-exposure. ANOVAs were used to identify treatment effects and/or interactions with other factors. Significance was assumed at the level of p<0.05. On PN45, ETOH elicited an increase in the number of TUNEL+ cells relative to the vehicle group in all hippocampal regions. NIC elicited less severe regiondependent effects. Concomitant NIC and ETOH failed to elicit significant changes in the number of TUNEL+ cells. On PN47, the effects were similar to those described for PN45, even though smaller in magnitude. These results were paralleled by reductions in neuronal and glial cells densities for all treatment groups. In contrast, on PN50, ethanol and/or nicotine withdrawal were associated with compensatory reductions in TUNEL+ cells in all hippocampal regions. These results were paralleled by a reversal of effects on neuronal and glial densities. There were no effects on region thicknesses both during exposure and withdrawal. These results suggest that deleterious effects of nicotine and/or ethanol are reversed during prolonged withdrawal.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Organização Mundial da Saúde estima que existam aproximadamente 250 milhões de mulheres tabagistas no mundo. Em países em desenvolvimento, a prevalência do tabagismo pode variar de 11 a 35% em mulheres grávidas, constituindo um problema de saúde pública. Nicotina, um agonista colinérgico considerado o mais importante componente ativo da fumaça do cigarro, é capaz de causar déficits em um cérebro em desenvolvimento, no entanto, muitos estudos investigam estes efeitos durante a gestação de roedores, que corresponde aos dois primeiros trimestres de gestação em humanos. O presente estudo, foi focado nos efeitos da nicotina sobre o sistema colinérgico cerebral durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos. Ratas lactantes foram expostas a nicotina (NIC, 6 mg/Kg/dia) ou a salina (SAL) via mini-bombas osmóticas (s.c.) a partir do 2 dia ate o 16 dia pós-natal (PN). Filhotes NIC e SAL foram sacrificados durante a exposição, em PN15, e após a retirada em três momentos diferentes, PN21, PN30 e em PN90. Quatro biomarcadores foram considerados. Para avaliação dos efeitos sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs), nós utilizamos [3H]citisina, que é um ligante seletivo para &#945;4&#946;2. Nos também medimos o marcador [3H]hemicholinium-3 (CH-3) de alta afinidade para o transportador pré-sináptico de colina, e a atividade das enzimas colina acetiltransferase (ChAT) e acetilcolinesterase (AChE) no córtex cerebral (CX), mesencéfalo (MB) e hipocampo (HP) na prole. O grupo NIC apresentou supra-regulação de nAChRs em todas as regiões durante a exposição, este efeito foi revertido pouco tempo após a retirada. Interessantemente, uma significante infra-regulação de nAChRs foi observada após um longo tempo da retirada somente em CX. A exposição à nicotina reduziu a marcação para HC-3 durante a exposição em todas as regiões e foi revertida em PN21. Já em PN30, o grupo NIC apresentou uma diminuição do HC-3. Em contraste, em PN90, foi observado um aumento de HC-3. Não foram observados efeitos para atividade da ChAT e da AChE em CX. No que diz respeito ao MB, o grupo NIC apresentou um aumento de atividade para ambas as enzimas, ChAT e AChE, em PN30. Para a mesma idade, nos observamos um decréscimo desta atividade somente em HP. E, após um longo tempo de retirada, somente HP apresentou um aumento na atividade da ChAT. Estes dados sugerem que a exposição à nicotina em ratos durante o equivalente ao terceiro trimestre de gestação em humanos promove alterações no sistema colinérgico dos filhotes. Somado a isto, nossos resultados indicam que os efeitos prejudiciais são observáveis mesmo muito tempo após a exposição ter sido interrompida. / The Word Health Organization estimates that there are approximately 250 million women smokers in the world. In developing countries, the prevalence of smoking varies from 11% to 35% in pregnant women, constituting a public health concern. Nicotine, a cholinergic agonist that is considered one the main active components of cigarette smoke, causes deleterious effects on brain development, however, most studies investigate its effects during rodents gestation, which corresponds to the first two trimesters of human gestation. In the present study, we focused on nicotine effects on the brain cholinergic system during the third trimester equivalent of human gestation. Lactating rats were exposed either to nicotine (NIC, 6 mg/Kg/day) or to saline (SAL) via osmotic minipumps (s.c.) from the 2nd to the 16th postnatal day (PN). NIC and SAL offspring were sacrificed during exposure (PN15), or at withdrawal (PN21, PN30 and PN90). Four cholinergic biomarkers were considered. For evaluation of effects on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), we utilized [3H]cytisine, a ligand that binds selectively to the a4b2 nAChR. We also assessed the binding of [3H]hemicholinium-3 (HC-3) to the high-affinity presynaptic choline transporter, choline acetyltransferase (ChAT) and acetylcholinesterase (AChE) activities in the cerebral cortex (CX), midbrain (MB) and hippocampus (HP) of the offspring. NIC offspring presented nAChR upregulation in all regions during exposure that was reversed at short term withdrawal, in PN21. Interestingly, a significant nAChR downregulation was observed at long term withdrawal only in CX. Nicotine reduced HC-3 binding during exposure in all regions that was reversed on PN21. On PN30, NIC offspring presents a decrease HC-3 binding. In contrast, on PN90 was observed an increase on HC-3 binding. There were no effects for ChAT and AChE in the CX. Regarding MB, NIC offspring presents an increase in both ChAT and AChE activity on PN30. At the same age, we observed a decreased in both ChAT and AChE activity on HP. At long term withdrawal, only HP showed an increase in ChAT activity. These data indicate that maternal nicotine exposure during the third trimester equivalent of human gestation promotes cholinergic system alterations in the offsprings. In addition, our data indicate that detrimental effects are observable even long after the exposure has been interrupted.