Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-10Bitstream added on 2014-06-13T20:45:26Z : No. of bitstreams: 1 amorim_ab_dr_botfmvz.pdf: 559370 bytes, checksum: 29ab57986a4159c6c7be368b68635707 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As consequências do desmame precoce são, alterações nas características das vilosidades e das criptas do intestino delgado dos leitões, comprometendo a eficiência dos processos de digestão e de absorção de nutrientes. Foram realizados dois experimentos com o objetivo de verificar a influência das dietas no turnover do carbono e na morfologia da mucosa do duodeno e jejuno de leitões desmamados aos 21 dias de idade. As dietas foram sem glutamina, glutamato e nucleotídeos (DC); contendo 1% de glutamina (DG); contendo 1% de glutamato (DAG) e contendo 1% de nucleotídeos (DN). No primeiro experimento foram utilizados 123 animais, sendo abatidos três leitões no dia 0 e três animais de cada tratamento nos dias 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 20, 27 e 49 após o desmame, para coleta de amostras da mucosa do duodeno e jejuno, que foram analisadas quanto à composição isotópica de 13C e mensurada a velocidade de substituição do carbono no tempo. No segundo experimento foram utilizados 65 animais, em delineamento experimental em blocos ao acaso, com arranjo fatorial dos tratamentos 4 x 3 +1 (quatro dietas: DC, DG, DAG e DN, três épocas de abate: 7, 14 e 28 dias pós desmame e abate no desmame: dia 0), para análises morfológicas. Os valores da meia-vida do carbono para o duodeno foram 7,3; 7,6; 6,2 e 5,2 dias e para o jejuno de 7,1; 6,7; 6,2 e 4,9 dias para as DC, DG, DAG e DN, respectivamente. As dietas não alteram a altura das vilosidades (AV), profundidade das criptas (PC) e relação altura das vilosidades: profundidade das criptas (AV:PC), com exceção da DN que determinou maior PC no duodeno, quando comparado com a DAG. A inclusão de 1% de nucleotídeos ou de 1% de glutamato nas dietas de leitões acelera o turnover do carbono da mucosa intestinal, sugerindo sua recuperação mais rápida no período... / The consequences of early weaning are the changes in the characteristics of the small intestine villus and crypts of piglets, reduce the efficiency of digestion and absorption of nutrients. Two experiments were conducted in order to study the influence of diets on carbon turnover and morphology of the mucosa of the duodenum and jejunum of piglets weaned at 21 days of age. The diets were: Diets without glutamine, glutamate and nucleotides (DC); containing 1% of glutamine (DG); containing 1% of glutamate (DAG) and containing 1% of nucleotides (DN). In the first experiment a hundred twenty three animals were used and three of them were slaughtered at day 0 and three animals from each diets on days 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 20, 27 and 49 after weaning, for collecting samples of mucosa duodenum and jejunum was taken, which were analysis for the isotopic composition ‰13C and measured the time of carbon substitution. In the second experiment, sixty five animals were used in a randomized complete blocks design experiment with a 4x3x1 factorial arrangement of diets (four diets: DC, DG, DAG and DN; three slaughter ages: 7,14 and 28 days post weaning and slaughter at weaning day: day 0) for morphology analysis. The values of carbon half-life into the duodenum were 7.3, 7.6, 6.2 and 5.2 and into the jejunum were 7.1, 6.7, 6.2 and 4.9 for DC, DG, DAG and DN, respectively. Diets do not change the villus height (VH), crypt depth (PC) and villus:crypt ration (AV:PC), except that DN determined that most PC duodenum compared with the DAG. The inclusion of 1% of nucleotides or 1% of glutamate in the diet of piglets accelerates the carbon turnover of intestinal mucosa, suggesting a faster recovery post-weaning, however, was not evaluated any effect on the action of products by results of morphology analysis, indicating that the technique... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-23. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:23Z : No. of bitstreams: 1 000828384.pdf: 1799745 bytes, checksum: 62d94c169b45d13aee9881b05c12e0d6 (MD5) / O estudo da microbiota bucal de bebês e como ela se altera com o tempo é de grande importância para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças bucais num estágio precoce. O objetivo desse estudo foi avaliar longitudinalmente, nos períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de idade, o microbioma oral de bebês saudáveis e suas respectivas mães por análise de pirosequenciamento. Setenta e quatro pares de mães e bebês acompanhados em um programa de saúde bucal foram incluídos no estudo. Um total de cinquenta e oito participaram em todo o período experimental. A população de bebês foi acompanhada durante todo o período, recebendo orientações e procedimentos previstos no protocolo do programa. Dados sobre dieta, higiene bucal, presença de dentes, prevalência de cárie e condições periodontais de bebês e suas respectivas mães foram coletados. Para a análise de pirosequenciamento, foram selecionados 5 pares de bebês e mães seguindo rigorosos critérios de inclusão para obtenção de amostra homogênea de bebês que se mantiveram sem a ocorrência de doenças bucais durante todo o período de avaliação. Também foram analisadas amostras do único bebê que desenvolveu cárie ao longo do estudo. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dentário do bebê e suas respectivas mães para análise da diversidade microbiana por pirosequenciamento 454 dos produtos de PCR do gene 16S ribossomal. A eficácia do programa de promoção de saúde bucal para este estudo foi reiterada com a ocorrência de cárie em apenas 1 dos bebês (1,51%) acompanhados durante 24 meses. A diversidade microbiana da saliva e biofilme dentário dos bebês manteve-se estável em relação ao número de Filos ao longo dos períodos. Observou-se aumento considerável de gêneros na saliva dos bebês dos 6 meses aos 12 meses de idade do bebê, sendo que esta distribuição se manteve nos demais períodos. Aos ... / Data on infants' oral microflora and how it changes in time is of utmost importance for the prevention, diagnosis and treatment of oral diseases in early stages. The goal of this study was evaluate, longitudinally, in the periods of 6, 12, 18 and 24 months of age, the oral microbiome of healthy babies and their mothers by pyrosequencing analysis. Seventy-four pairs of mothers/babies followed in a Program of Oral Healthy were included in the study. A total of fifty-eight participated in all the experimental period. The population of babies was followed during all the period, receiving orientation on oral health and procedures foreseen in the protocol of the referred program. Data on diet, oral hygiene, presence of teeth, prevalence of caries, and periodontal conditions of babies and their mothers were collected. For pyrosequencing analysis, 5 pairs of babies and mothers were selected following rigorous criteria of inclusion, in order to obtain a homogeneous sample of babies who did not develop caries during all the evaluation period. Also, samples from of the only baby who developed caries along the study were analyzed. Samples of saliva and dental biofilm from the babies and mothers were analyzed for the microbial diversity by pyrosequencing 454 of products of PCR of 16S ribosomal gene. The effectiveness of the Oral Health Program in this study was confirmed with the occurrence of caries in only 1 of the babies (1.51%) followed during 24 months. Salivary and biofilm microbial diversities of babies were stable in relation to the number of Phyla during the evaluation periods. A considerable increasing in the number of genus in babies' saliva was observed in the period of 6 to 12 months of age. After this period, the distribution was stable. At the age of 12 months, 77 different genus were found in the microbioma of infants' dental biofilm and this value was higher when compared to ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-29Bitstream added on 2014-06-13T19:35:47Z : No. of bitstreams: 1 pelicia_vc_me_botfmvz.pdf: 473034 bytes, checksum: 42ede2046acc80e2fb52f44e068b5c16 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Diante da crescente proibição da utilização dos antibióticos promotores de crescimento na produção animal, a busca por alternativas naturais é pauta atual entre os pesquisadores. Sobre estes aspectos, os nucleotídeos tornam-se um suplemento interessante na criação de frangos alternativos, pois vem demonstrando efeito benéfico sobre a integridade, desenvolvimento e turnover celular intestinal, entre outros. Com o presente trabalho, objetivou-se avaliar o efeito da suplementação com nucleotídeos na dieta sobre o desempenho, rendimento de carcaça e de partes e na morfologia da mucosa do intestino delgado de frangos de corte criados no sistema alternativo. Foram utilizados 600 pintos de corte machos da linhagem Ross distribuídos em delineamento em blocos casualizados com seis tratamentos (rações sem promotor de crescimento antimicrobiano Surmax® e com adição de 0; 0,04; 0,05; 0,06 e 0,07% de nucleotídeos e uma ração com promotor de crescimento antimicrobiano e sem adição de nucleotídeos), com quatro repetições de 25 aves cada. As rações foram formuladas a base de milho e farelo de soja sem ingredientes de origem animal e sem adição de anticoccidianos. Com três dias de idade as aves foram vacinadas contra coccidiose via água de bebida. As análises estatísticas dos dados de desempenho, rendimento de carcaça e partes e morfologia intestinal foram feitas pela análise de variância 5% de significância. Não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos para as variáveis estudadas. Numericamente observou-se maior ganho de peso (GPD) e melhor conversão (CA) alimentar para o tratamento com 0,05% de inclusão de nucleotídeos aos 7 dias de idade e aos 21 e 42 dias de idade, maior GPD para o tratamento com 0,07% de inclusão. Diante desses resultados conclui-se que os nucleotídeos adicionados... / In view of increasing ban of antibiotics use as growth promoters in animal production, the demand for natural alternatives is the inquiry most current among researchers. Under these aspects, the nucleotides become an interesting supplement for the breeding of alternative broilers, because their demonstrated beneficial effect on the integrity, development and intestinal cell turnover, among others. The present study aimed to evaluate the effect of supplementation with nucleotides in broiler diet on raised performance, carcass and parts yield and on the morphology of intestinal mucosa of broilers in alternative breeding system. Six hundred 1-day-old male Cobb chicks were allotted in a randomized block design with six treatments (diet without antimicrobial growth promoter, and with addition of 0; 0.04; 0.05; 0.06 and 0.07% nucleotides and diet with antimicrobial growth promoter and without nucleotides addition), with four replicates of 25 chickens each. Diets were formulated utilizing corn and soybean meal without animal origin ingredients and without addition of anticoccidia drugs. Chicks were vaccinated against Coccidiosis by drinking water at three-day old. Statistical analyses of performance, carcass yield and parts and intestinal mucosa morphology were performed by analysis of variance and means compared by Tukey test was (P < 0.05). There were no significant differences between the treatments for these variables. Numerically there was higher weight gain and better conversion for treatments with 0.05% nucleotides inclusion to 7 days of age and 21 and 42 days, higher weight gain for treatments with 0.07% of inclusion. It was concluded that the nucleotides added to the diet did not influence carcass and parts yield and intestinal mucosa morphology, however in levels greater than or equal to 0.05%, nucleotides increase performance of alternative... (Complete abstract click electronic access below)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, multisystem inflammatory disease with autoimmune features evident, expressing a cellular response of Th1. Characterized primarily by chronic synovitis, erosive and symmetrical, preferably peripheral joints, where there is an intense inflammatory process. The purinergic signaling system plays an important role in the modulation of inflammatory and immune responses through extracellular biomolecules such as nucleotides adenine and adenosine derivative nucleodise therefore, which are essential to providing the trigger and maintain the trigger inflammatory response. The effects of these molecules are promoted by the action of purinergic receptors specific and controlled by ectoenzymes, in cell surface. Based on these principles, this study investigated the effect of cinnamaldehyde in thermal hyperalgesia, , arthritis score, paw edema and thermal hyperalgesia as well histolgical parameters beyond the activity of the E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes in rats adjuvant arthritis. The rats were divided in four groups, of wich two were adjuvant induced arthritis in the other two control groups. The animal received the compound at a concentration of 2,1% orally for a period of 15 days. Not differences were observed among analysis the arthritis score, paw edema it is however noted differences in thermal hyperalgesia in about 60% and in group induced arthritic and treated with cinnamaldehyde. Compared histological analysis it was noticed a slight reduction the lynphocitytic inflammatory infiltration in rats induced arthritis and treated with cinnamaldehyde. We found the increased the ATP hydrolysis in about 94,14% in arthritis induced when compared with control group and 20,58% when compared with groups treated with cinnmaldehyde . However, E-NTPDase activity when used ADP as substrate rised in 152,56% in relation the control group and 122,76% in relation the control group treated with cinnamaldehyde. In E-ADA activity was observed the increased in about 151,84%%in group arthritis induced when compared with control groups and rise 69,7% when compared with group arthritis induced treated with cinnamakdehyde. In conclusion, the data indicate that cinnamaldehyde was able to reduce thermal hyperalgesia and alterations histological in rats induced arthritis, as well as decreased the ectonucleotidase cascade, once we observed a activity gradual decrease in lymphocytes in group induced arthritis and treated with cynnamaldehyde in relation with all others groups. Therefore cinnamaldehyde was act to skewing some effects inflammatory of induced arthritis. Although requiring further study, cinnamaldehyde could be used as a complementary fot the benefit of people with rheumatoid arthritis. / Artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica e multisistêmica, com características evidentes de autoimunidade, que expressa uma resposta celular do tipo Th1. Caracteriza-se basicamente por sinovite crônica, simétrica e erosiva, preferencialmente de articulações periféricas, onde existe um intenso processo inflamatório. O sistema de sinalização purinérgica desenvolve um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes, através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado nuclesídeo adenosina, os quais são indispensáveis para a iniciação e manutenção de respostas inflamatórias. Os efeitos de tais moléculas são promovidos pela ação dos receptores purinérgicos específicos e controlados por ectoenzimas, na superfície das células. Com base nestes princípios esta pesquisa avaliou os efeitos do cinamaldeído no escore de artrite, edema de pata e hiperalgesia termal bem como em análises histológicas além da atividade de E-NTPDae e E-ADA em linfócitos de ratos com artritre induzida por adjuvante. Os ratos foram divididos em quatro grupos, dois grupos com artrite induzida por adjuvante e dois grupos controles. Estes animais receberam o composto na concentração de 2,1%, via oral por um período de 15 dias. Não se observou diferenças entre análises de escore de artrite e edema de pata, porém notou-se-se alterações em hiperalgesia termal em cerca de 60% no grupo com artrite induzida tratado com cinamaldeído. Em relação às análises histológicas foi notada uma leve redução do infiltrado inflamatório linfocitico em ratos com artrite induzida e tratados com cinamaldeído. Mostrou-se um aumento da hidrólise do ATP em 94,14% no grupo com artrite induzida quando comparado com o grupo controle e em 20,58% quando comparado com o grupo tratado com cinamaldeído. Contudo, a atividade da E-NTPDase quando utilizado ADP como substrato obteve um aumento 152,56% no grupo artrite induzida quando comparado com o grupo controle e 122,76% quando comparado com grupo tratado com cinamaldeído. Na atividade da EADA foi observado um aumento em cerca de 151,84% no grupo artrite induzida em relação ao grupo controle e em 69,7% quando comparado com a grupo artrite induzida e tratado com cinamaldeído. Em conclusão, os dados indicam que cinamadeído foi capaz de reduzir hiperalgesia termal e alterações histológicas, como também diminui a cascata das ectonucleotidases, uma vez que observamos uma queda gradativa das atividades nos linfócitos no grupo com artrite induzida por adjuvante tratados com cinamaldeído quando comparado com os demais grupos. Desta forma cinamaldeído foi capaz de exercer seus efeitos desfavorecendo alguns eventos inflamatórios característico da artrite induzida por adjuvante. Embora careça de maiores estudos, o cinamaldeído poderia ser utilizado como alvo terapêutico complementar para a artrite reumatoide.

Orientador: Cristiane Yumi Koga-Ito / Co-orientador: Fernanda Lourenção Brighenti / Banca: Janete Dias Almeida / Banca: Ana Cláudia Okamoto / Banca: Elizabete Brasil dos Santos / Banca: Rebeca Di Nicolo / Resumo: O estudo da microbiota bucal de bebês e como ela se altera com o tempo é de grande importância para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças bucais num estágio precoce. O objetivo desse estudo foi avaliar longitudinalmente, nos períodos de 6, 12, 18 e 24 meses de idade, o microbioma oral de bebês saudáveis e suas respectivas mães por análise de pirosequenciamento. Setenta e quatro pares de mães e bebês acompanhados em um programa de saúde bucal foram incluídos no estudo. Um total de cinquenta e oito participaram em todo o período experimental. A população de bebês foi acompanhada durante todo o período, recebendo orientações e procedimentos previstos no protocolo do programa. Dados sobre dieta, higiene bucal, presença de dentes, prevalência de cárie e condições periodontais de bebês e suas respectivas mães foram coletados. Para a análise de pirosequenciamento, foram selecionados 5 pares de bebês e mães seguindo rigorosos critérios de inclusão para obtenção de amostra homogênea de bebês que se mantiveram sem a ocorrência de doenças bucais durante todo o período de avaliação. Também foram analisadas amostras do único bebê que desenvolveu cárie ao longo do estudo. Foram coletadas amostras de saliva e biofilme dentário do bebê e suas respectivas mães para análise da diversidade microbiana por pirosequenciamento 454 dos produtos de PCR do gene 16S ribossomal. A eficácia do programa de promoção de saúde bucal para este estudo foi reiterada com a ocorrência de cárie em apenas 1 dos bebês (1,51%) acompanhados durante 24 meses. A diversidade microbiana da saliva e biofilme dentário dos bebês manteve-se estável em relação ao número de Filos ao longo dos períodos. Observou-se aumento considerável de gêneros na saliva dos bebês dos 6 meses aos 12 meses de idade do bebê, sendo que esta distribuição se manteve nos demais períodos. Aos ... / Abstract: Data on infants' oral microflora and how it changes in time is of utmost importance for the prevention, diagnosis and treatment of oral diseases in early stages. The goal of this study was evaluate, longitudinally, in the periods of 6, 12, 18 and 24 months of age, the oral microbiome of healthy babies and their mothers by pyrosequencing analysis. Seventy-four pairs of mothers/babies followed in a Program of Oral Healthy were included in the study. A total of fifty-eight participated in all the experimental period. The population of babies was followed during all the period, receiving orientation on oral health and procedures foreseen in the protocol of the referred program. Data on diet, oral hygiene, presence of teeth, prevalence of caries, and periodontal conditions of babies and their mothers were collected. For pyrosequencing analysis, 5 pairs of babies and mothers were selected following rigorous criteria of inclusion, in order to obtain a homogeneous sample of babies who did not develop caries during all the evaluation period. Also, samples from of the only baby who developed caries along the study were analyzed. Samples of saliva and dental biofilm from the babies and mothers were analyzed for the microbial diversity by pyrosequencing 454 of products of PCR of 16S ribosomal gene. The effectiveness of the Oral Health Program in this study was confirmed with the occurrence of caries in only 1 of the babies (1.51%) followed during 24 months. Salivary and biofilm microbial diversities of babies were stable in relation to the number of Phyla during the evaluation periods. A considerable increasing in the number of genus in babies' saliva was observed in the period of 6 to 12 months of age. After this period, the distribution was stable. At the age of 12 months, 77 different genus were found in the microbioma of infants' dental biofilm and this value was higher when compared to ... / Doutor

Estudos teóricos e experimentais acerca de danos em biomoléculas induzidos pela captura eletrônica em meio biológico têm sido largamente discutidos ao longo da última década. No presente trabalho, abordou-se o problema da captura eletrônica pelo nucleotídeo monofosfato 3\'-dGMP com técnicas de estrutura eletrônica, explorando estados ligados do ânion. Buscou-se investigar o ânion em fase gasosa e em solução aquosa, além de estimar barreiras de energia pontecial e energia livre associadas à sua dissociação (quebra da ligação ribose-fosfato). Utilizando os modelos de solvatação implícita (PCM) e explícita (simulação computacional com o método de Monte Carlo), concluiu-se que, em meio aquoso, o estado fundamental do ânion 3 -dGMP apresenta caráter de valência sobre a base nitrogenada (orbital com ocupação simples), em oposição ao resultado em fase gasosa, que prevê um estado ligado por dipolo. A barreira de dissociação, relativa ao estiramento da ligação entre os grupos ribose e fosfato, foi estimada em 16-30 kcal/mol, dependendo da técnica de solvatação utilizada. / Theoretical and experimental studies on the damage to biomolecules induced by electron attachment in the biological environment have been widely discussed over the past decade. In the present work, we addressed electron capture by the monophosphate nucleotide 3 -dGMP with electronic structure techniques, exploring bound anion states. We have investigated these anion states in gas phase and in aqueous solution, and estimated the potential and free energy barriers related to the dissociation reaction (breakage of the ribose-phosphate bond). Employing implicit (PCM) and explicit (computer simulation with the Monte Carlo method) solvation models, we have concluded that, in aqueous environment, the ground state of the 3-dGMP specie has valence character with the singly occupied molecular orbital localized on the base. In contrast, the gas phase results point out a dipole-bound ground state. The free energy barrier for the dissociation mechanism, according to the present results, would be around 16-30 kcal/mol in aqueous solution, depending on the salvation model.

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

A radiação ultravioleta (UV) pode ser absorvida por diferentes moléculas celulares, incluindo o DNA no qual provoca distorções estruturais. As lesões mais comuns induzidas pela radiação UV são o ciclobutano de pirimidina (CPD) e o fotoproduto (6-4)-pirimidina-pirimidona [(6-4)PPs]. Estas lesões podem ser reparadas pela fotorreativação, caracterizada por ter uma única proteína (fotoliase) que remove lesões empregando luz visível (320-500 nm) como fonte de energia. Foram identificados dois tipos de fotoliases que diferem por sua especificidade ao substrato: CPD-fotoliase e (6-4)-fotoliase. Um outro mecanismo de reparo é o reparo por excisão de nucleotídeos (NER), um mecanismo que envolve múltiplos passos e proteínas. Enquanto os efeitos genotóxicos da UVC e UVB já estão relativamente esclarecidos e bem aceitos, ainda existem controvérsias sobre a genotoxicidade da radiação UVA, devido ao fato de ser fracamente absorvida pelo DNA. Alguns autores acreditam que os seus principais efeitos são gerados de forma indireta pela produção de espécies reativas de oxigênio enquanto outros acreditam que a UVA pode gerar danos ao DNA de forma direta, provocando a formação de dímeros de pirimidina. O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos genotóxicos da radiação UVA em fibroblastos humanos deficientes e proficientes em NER utilizando adenovírus recombinantes contendo uma ou outra fotoliase para verificar se as lesões CPD e (6-4)PP são geradas pela UVA e se elas teriam alguma importância nas respostas verificadas após irradiação. Foi verificado que as células deficientes no gene XPA são mais sensíveis à radiação UVA quando comparadas às células selvagens. Por meio da detecção imunológica, confirmamos a geração das lesões CPD, (6-4)PP e Dewar, fotoisômero da lesão (6-4)PP, após irradiação com UVA no genoma de células humanas. Empregando vetores adenovirais para transdução de fotoliase específica para lesões tipo CPD ou (6-4)PP, confirmamos que de fato essas lesões são formadas em células humanas deficientes em reparo de DNA após irradiação com UVA. Além disso, esses vírus permitiram verificar a relevância biológica dessas lesões na indução de morte celular em células XP-A irradiadas. De fato, os dados indicam que para doses baixas de radiação UVA essas lesões desempenham um importante papel na indução de morte. Não podemos descartar, porém, que lesões indiretas (provavelmente geradas por estresse oxidativo) também tenham papel na indução de morte pela radiação UVA, o que parece ser mais importante a doses médias e altas dessa radiação. / Ultraviolet radiation (UV) is absorbed by different cellular molecules, including DNA in which induces structural distortions. The most common lesions induced by UV radiation are the cyclobutane pyrimidine (CPD) and the photoproduct (6-4)-pyrimidine-pyrimidone [(6-4)PP]. These lesions can be repaired by the photoreactivation, characterized by a single protein (photolyase) that removes lesions using visible light (320-500 nm) as energy source. Two types of photolyases had been identified that differ by their substrate specificity: CPD-photolyase and (6-4)-photolyase. Another repair mechanism is the nucleotide excision repair (NER), a mechanism that involves multiple steps and proteins. While the genotoxic effects of UVB and UVC are already relatively well-understood and accepted, there is still controversy about the genotoxicity of UVA radiation, due to its low absorption by DNA. Some authors believe that the major effects are generated indirectly by the production of reactive oxygen species, while others believe that UVA can cause damage to DNA directly, inducing the formation of pyrimidine dimers. The aim of this study was to assess the genotoxic effects of UVA radiation in human fibroblasts deficient and proficient in NER, using recombinant adenovirus expressing the photolyases to verify if CPDs and (6-4)PPs are generated by UVA and whether they had any importance in the responses observed after irradiation. It was found that cells deficient in the XPA gene are more sensitive to UV radiation compared to wild type cells. By immunological detection, we confirm the generation of CPD, (6-4)PP and Dewar, photoisomer of the (6-4)PP lesion, in the genome of human cells after irradiation with UVA. Using adenoviral vectors for the transduction of photolyases specific for CPD or (6-4)PP lesions, we confirm that in fact these lesions are generated in human cells deficient in DNA repair after irradiation with UVA. Moreover, these viruses allowed us to verify the biological relevance of these lesions in the induction of cell death in irradiated XP-A cells. In fact, our data indicates that for low doses of UVA radiation, these lesions play important roles in the induction of death. We cannot rule out, however, that indirect lesions (probably caused by oxidative stress) could also have a role in the induction of death by UVA radiation, which seems to be more important in intermediate and high doses of this radiation.

O sistema complemento participa da patogenia da Doença Hepática Alcoólica (DHA), onde C3 contribui para o acúmulo de triglicerídeos (tg) e C5 para injúria e inflamação hepática. Investigamos o papel de C5 em modelo de DHA aplicando as linhagens B6 e A/J, e geramos a linhagem congênica B6.A-Hc0 (B6 C5def). B6 e A/J foram tratados com dieta contendo ou não etanol, ou maltodextrina, por 6, 8 e 10 semanas. Em ambas as linhagens a dieta com etanol induziu hepatomegalia, acúmulo de tg e redução de IL6 e IL12 hepáticos ao longo das semanas. Os A/J tratados com etanol exibiram aumento de leucócitos circulantes, IL10 e NO hepáticos e menor acúmulo de tg hepáticos em relação aos B6. Os B6 tratados com etanol exibiram redução de IL1b, IL10 e NO hepáticos. Tratando a linhagem congênica por 10 semanas com a dieta com etanol observamos aumento de IL17 e IL10 e redução de IL1b e TGFb hepáticos nos B6.A-Hc0 em relação aos B6. Independentemente da dieta, houve aumento sérico de AST, FA, albumina, colesterol, tg e redução hepática de IL6, IL12 e IFNg nos B6.A-Hc0. Portanto, C5 promoveu um ambiente hepático pró-inflamatório e pareceu influenciar os valores séricos das enzimas de função e síntese hepática, citocinas e do perfil lipídico no modelo de DHA. / The complement system may be involved in the pathogenesis of Alcoholic Fatty Liver Disease (ALD). Murine models of ALD showed that C3 contributes to the accumulation of triglycerides (tg) in liver and the C5 seems to be involved with hepatic inflammation. We here investigated the contribution of C5 in ALD using C57Bl/6 (B6) and A/J (C5 deficient), and B6 C5 deficient congenic mice (B6.A-Hc0). B6 and A/J were treated with modified diet containing ethanol or maltodextrin for 6-10 weeks. In both strains, the ethanol diet induced hepatomegaly, increased liver tg and decreased IL6 and IL12 levels. However, total blood leukocytes counting, IL10 and NO liver production increased only in A/J. In addition, only in B6 the IL1b levels increased while IL10 and NO decreased in liver. A/J mice suffered more inflammatory damage and accumulated less liver tg than B6. In B6.A-Hc0 IL17 and IL10 increased while of IL1b and TGFb decreased when compared to B6. Independently of the diet, levels of AST, FA, albumin, cholesterol, tg increased in B6.A-Hc0 serum and IL6, IL12 and IFNg reduced in liver. In conclusion, C5 promoted a pro-inflammatory environment in the liver and influenced the serum levels of hepatic enzymes, cytokines and lipid profile.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T14:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amstalden_LucilaGobby_D.pdf: 2331693 bytes, checksum: b9984b5e8cbc2821d446ee5281ae4200 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O câncer de mama (CM) é o tipo de câncer que mais comumente ocorre entre mulheres, com a estimativa de 49.240 novos casos diagnosticados em 2010 no Brasil. O CM apresenta fatores de risco conhecidos como idade, fatores sócio-econômicos, etnia, exposição excessiva a hormônios, radiação, dieta, exercícios físicos, história ginecológica e história familiar. Além dos fatores de risco, o CM apresenta fatores de prognóstico mensurados no momento do diagnóstico e que servem como preditor da sobrevida do paciente. Existem pelo menos 20 subtipos de CM distintos morfologicamente. O complexo formado pelos genes FANCD2 e FANCI tem a função chave de co-localizar o sítio nuclear de reparo para proteínas que diretamente estão relacionadas à recombinação homóloga como BRCA1, juntamente com FANCJ, RAD51, BRCA2/FANCD1 com FANCN. A descoberta de que o gene BRCA2 é, na verdade, FANCD1 atraiu pesquisadores para um novo alvo na corrida para a compreensão da história natural da doença, informação esta que permitirá avaliar a hipótese dos genes de reparo de DNA na susceptibilidade ou refratariedade para carcinogênese. O objetivo do atual estudo foi analisar as principais alterações nos genes FANCD2 e FANCI utilizando PCR e digestão enzimática e, paralelamente, rastreamento dos éxons dos genes por meio do sequenciamento automático. A casuística foi formada por 137 mulheres com CM hereditário. Foram encontradas oito alterações em 33 indivíduos e cinco variantes exônicas não relatadas, novas. Por meio de análise estatística, houve a correlação entre indivíduos mutados e dados clínicos. Esse estudo foi de grande valia para a detecção de alterações que podem funcionar como estopim para o desenvolvimento do câncer em indivíduos com CM com histórico familiar sem mutações em genes de alta suscetibilidade, como também servir para caracterizar um tipo histológico distinto auxiliando na terapêutica futura / Abstract: Breast Cancer (BC) is the cancer type more commonly occurs among women with estimative of 49.240 new cases in 2010. The BC presents risk factors as: age, social-economic factors, ethnicity, hormone exposure, radiation, diet, physical exercises and familiar history. Besides the risk factors BC has prognosis factors measured in diagnostic. There's, at least, 20 subtypes of BC morphologically different. Corcerning molecular epidemiology, the BC is associated to many genes and in mutations in various genes as BRCA1 e 2, p53, PTEN. The FANCD2/FANCI complex have a key function of co-localize motif of DNA repair to proteins that directly act on homologue recombination as BRCA1 with FANCJ, RAD51, BRCA2/FANCD1 with FANCN. The discovery the BRCA2 is, actually, FANCD1 gene has leaded researchers to the new target in knowledge of natural history of disease.The aim of this study was to analyse alterations in FANCD2 and FANCI genes through PCR followed enzimatic restriction. At same time, was performed the screening of the genes exons. The casuistic was constituted from 137 women with hereditary breast cancer. We encountered eight alterations in 25 individuals and 5 exonic variants not reported. This study was very important with the purpose to detect alterations can be responsible by the cancer evolution in BC patients without mutations in high susceptibility genes and to server to characterize a distinct histological types to future therapeutic / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas