A Paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, endêmico na América Latina, especialmente Brasil. Para melhor avaliarmos a resposta imune celular frente a diferentes componentes do fungo, como gp43, considerada o antígeno imunodominante de P. brasiliensis, filtrado de cultura livre de gp43 (Filtrado), e gp43 tratada com metaperiodato (meta), utilizamos os ensaios de linfoproliferação e ELISA para detecção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. Os resultados com relação à gp43 corroboram dados da literatura e de nosso laboratório demonstrando que gp43 é o antígeno imunodominante do fungo e pode estar envolvido no mecanismo de anergia dos linfócitos T de pacientes com a micose ativa. Com o Filtrado observamos respostas linfoproliferativas positivas, porém menores que com gp43, também evidenciando a anergia de linfócitos T de pacientes, e a indução de IL-10 em células de controles curados, podendo representar assim um mecanismo de imunossupressão. Com relação à meta, esta não induziu resposta linfoproliferativa nem a síntese de citocinas, sugerindo não ser um antígeno apropriado para esse tipo de avaliação. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, endemic in latin América, specially Brazil. To better understand the cellular immune responses to different components of the yeast, such as gp43, considered the immunodominant antigen, a culture filtrate free of gp43 (CF), and gp43 treated with metaperiodate, we used lymphoproliferative assays and ELISA to detect the cytokines IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. The results with gp43 were consistent with the literature and previous with data from our Laboratory showing that gp43 is the immunodominant antigen of P. brasiliensis and is likely involved with the anergy of T-cells from patients. With CF we observed positive, but weaker, proliferative responses. It also evidenced the T-cell anergy of patients and the preferential induction of IL-10 in cells from cured controls. The latter can represent a mechanism of anergy induction. With meta, we observed that neither induce proliferative responses nor cytokine secretion, being apparently an inappropriate antigen for use in cellular immunoassays.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

Glicoesfingolipídios (GSLs) podem se inserir em regiões específicas das membranas (lipid rafts) quando adicionados em culturas celulares, modulando sua função. Nós avaliamos se GSLs de Paracoccidioides brasiliensis, glucosilceramida (CMH) e glicoinositolfosfoceramida (GIPC) possuem atividade imuno-moduladora. Foram estudados indivíduos com (grupo curado) ou sem histórico de paracoccidioidomicose (grupo controle). CMH elevou a expressão de CD80 e CD86 em monócitos, a linfoproliferação em PBMCs no grupo controle e reduziu a capacidade de DCs em induzir linfoproliferação. No grupo curado, CMH inibiu proliferação em culturas com CMA e gp43, reduziu a produção de IL-10 por DCs e aumentou a produção de IL-12. Já GIPC aumentou a produção de citocinas Th1, elevou a fagocitose de leveduras, reduziu a maturação de DCs e sua capacidade de induzir linfoproliferação. A avaliação de células iNKT não mostrou diferença no número de células, na expansão e produção de citocinas entre os grupos. Em conclusão, GSLs de P. brasiliensis alteram a função de células do sistema imune. / Glycosphingolipids (GSL) may insert into specific membrane regions (lipid rafts) when added to cell culture, modulating its function. We evaluated whether glucosylceramide (CMH) and glycoinositol-phosphoceramide (GIPC), extracted from Paracoccidioides brasiliensis, are able to modulate immune cells functions of cured paracoccidioidomycosis (PCM) patients (control group) or individuals who never had PCM (cured group). CMH increased CD80 and CD86 expression on monocytes, increased lymph-proliferation on PBMCs and reduced lympho-proliferation in co-cultures with dendritic cells (DCs). In cured groups, CMH decreased gp43 and CMA- induced lymph proliferation, reduced IL-10 and increased IL-12 production by DCs. GIPC increased phagocytic capacity, reduced the maturation levels on DCs and DC capacity to induce lymph-proliferation. iNKT cells were analyzed and there were no differences in iNKT cells number, expansion capacity and cytokines production among the groups. In conclusion, GSL extracted from P. brasiliensis are able to modulate immune cells functions.

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fornazim_MarciaCristina_D.pdf: 1869002 bytes, checksum: b2e5012f736532c7b201f92582544179 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resposta Th1 com a ativação eficiente de macrófagos constituiu o principal mecanismo de defesa na infecção causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Componentes do sistema imune inato que induzem a polarização a resposta adaptativa como as células dendríticas (DCs) e seus produtos foram pouco explorados, principalmente na doença humana. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente e funcionalmente DCs obtidas a partir de monócitos do sangue periférico (MSP) de indivíduos saudáveis (C), pacientes com a forma adulta (FA) e juvenil (FJ) da paracoccidioidomicose (PCM), estimuladas in vitro por células leveduriformes do fungo P. brasiliensis das cepas Pb18 (alta virulência) e Pb265 (baixa virulência). Em uma segunda etapa pretendeu-se verificar se estas DCs eram capazes de ativar linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos. Os MSP foram cultivados na presença de IL-4 e GM-CSF por 7 dias e posteriormente submetidos à estimulação por células leveduriformes do fungo (Pb18 ou Pb265) ou CD40L (controle positivo) ou somente meio (SE) por 18 horas. DCs derivadas de monócitos do sangue periférico dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) se diferenciam em DCs maduras na presença de células leveduriformes do fungo. Nos pacientes com as FA e FJ as células leveduriformes Pb18 e Pb265 induzem maturação semelhante nas DCs que passam a expressar características morfológicas e fenótipo de células maduras com aumento da expressão dos marcadores de maturação (CD83 e CCR7), das moléculas de coestimulação (CD80/B7-1 e CD86/B7-2), das moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (HLA-I e HLA-II), dos receptores envolvidos no reconhecimento de antígenos (TLR2, TLR4 e dectina-1) e diminuição da expressão do CD1a e CD209. No grupo C foram observadas as mesmas características de fenótipo acima mencionadas, mas de forma mais evidente em DCs que foram estimuladas com as células leveduriformes da cepa Pb265, quando comparada a Pb18. DCs estimuladas com CD40L mostraram potencial máximo de expressão dos marcadores de superfície. Constatou-se também em DCs do grupo controle uma diminuição da capacidade fagocítica, após 18h de contato com as células leveduriformes do fungo, comprovando o processo de maturação, que foi mais efetivo na presença de Pb265. A análise da expressão gênica demonstrou que ambas as células leveduriformes do fungo induziram a expressão de TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 e TGF- . A estimulação das DCs com as células leveduriformes da cepa Pb265 induziu aumento da expressão de IL-6 (C, FA, FJ). Em relação à IL-10 as células leveduriformes Pb265 induziram maior expressão somente nos pacientes (FA e FJ). Na segunda etapa do estudo verificou-se que DCs fenotipicamente competentes foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos de forma mais acentuada quando eram provenientes de pacientes. Nestes grupos (FA e FJ) também foi constatada uma diminuição da frequência de linfócito T CD4+/CD8+/CD45RA+ e um aumento da frequência células CD4+/CD8+/CD45RO+ e CD4+/CD8+/CD69+. Inesperadamente, os resultados também mostraram que DCs dos 3 grupos estudados, que foram estimuladas com células leveduriformes do fungo, induziram a proliferação de linfócitos T CD3+CD4+CD25+Foxp3+, em relação às DCs que não receberam estímulos (SE). DCs de pacientes que foram estimuladas por ambas as células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IL-2, IL-17, IL- 10 e IFN- por LT/CD3+CD8(neg), quando comparada com DCs do grupo C. Por outro lado, DCs dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) que foram estimuladas células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IFN- por LT/CD3+CD8+. Em conjunto os resultados do nosso estudo mostraram que a estimulação com células leveduriformes do fungo induz uma população heterogênea de DCs, capazes de dar origem a uma resposta linfocitária mista com proliferação de linfócito Th1 (produtoras de IFN-?), Th17 (produtoras de IL-17) e células com fenótipo regulatório Foxp3+ (produtoras de IL-10) / Abstract: A Th1 response with an efficient activation of macrophages is the main mechanism of defense in Paracoccidioides brasiliensis infection. Components of the innate immune system that induce the polarization of the adaptive response such as dendritic cells (DCs) and their products have been little explored, particularly in human disease. The aim of this study was to phenotypically and functionally characterize DCs obtained from peripheral blood monocytes (PBM) of healthy individuals (C), patients with the adult form (AF) and juvenile form (JF) of paracoccidioidomycosis (PCM), induced in vitro by P. brasiliensis yeasts cells of Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) strains. In a second step we sought to determine whether these DCs were capable of activating autologous CD4/CD8 T cells. PBM were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 7 days and then stimulated by yeasts cells (Pb18 or Pb265) or CD40L (positive control) or medium only (WE), for 18 hours. PBM of the 3 groups (C, AF, JF) acquired the capacity to differentiate into DCs in the presence of P. brasiliensis yeasts cells. In patients with FA and FJ yeast cells induced maturation of DCs with increased expression of maturation markers (CD83 and CCR7), co-stimulatory molecules(CD80/B7-1 and CD86/B7-2), antigen presentation molecules (HLA-I and HLA-II), receptors involved in antigen recognition (TLR2, TLR4 and dectin-1) and decreased expression of CD1a and CD209. DCs from group C showed the same phenotypic characteristics, more evident in DCs that were stimulated with Pb265 when compared to Pb18. DCs stimulated with CD40L showed maximum expression of surface markers. A decrease in phagocytic capacity was detected in DCs of the control group after stimulation with yeast cells, demonstrating the maturation process, which was more effective in the presence of Pb265. The gene expression analysis showed that both strains of yeasts cells induced expression of TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 and TGF- mRNA. Stimulation of DCs with Pb265 induced increased expression of IL-6 in all groups. Pb265 also induced a higher expression of IL-10 mRNA only in patients (AF and JF). Our study also showed that phenotypically competent DCs were able to stimulate the proliferation of autologous CD4+/CD8+ cells, mainly in patients. In these groups (FA and FJ) it was also observed a reduction in the frequency of CD4+/CD8+/CD45RA+ and na increased frequency of CD4+/CD8+/CD45RO+ and CD4+/CD8+/CD69+. Unexpectedly, the results also showed that DCs stimulated with the yeast cells induced proliferation of T lymphocytes CD3+CD4+CD25+Foxp3+, compared to DCs that received no stimulation. DCs from patients stimulated by both strains of yeast cells induced a higherr production of IL-2, IL-17, IL-10 e IFN- by LT/CD3+CD8(neg) compared with DCs from group C. Moreover, DCs from the 3 groups also induced a stronger IFN-? production by CD3+/CD8+T cells. Altogether the results showed that stimulation with P. brasiliensis yeast cells induces a heterogeneous population of DCs, capable of giving rise to a mixed lymphocyte response with proliferation of Th1, Th17, and Foxp3+ cells / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_D.pdf: 7669317 bytes, checksum: eeec29689d95e50ddec45928c2c76343 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro / Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T06:51:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Corvino_ClaudiaTres_M.pdf: 633875 bytes, checksum: 46aff21f882b64dcbb4eefa73f93a232 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A interleucina 18 (IL-18) é uma citocina pró-inflamatória com importante participação tanto na resposta inata como adquirida. Concentrações elevadas de IL-18 são encontradas em várias doenças inflamatórias e infecciosas. A expressão aumentada de IL-18 pode contribuir para a resolução de processos infecciosos, mas também pode promover uma resposta inflamatória exagerada, prejudicial ao hospedeiro. O objetivo deste estudo foi determinar as concentrações séricas de IL-18 e outros mediadores inflamatórios (IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10), antes e após tratamento antifúngico, em pacientes com a forma juvenil (FJ) e adulta (FA) da paracoccidioidomicose (PCM), assim como em indivíduos normais saudáveis e relacionar com a atividade e gravidade da doença. Também foram avaliadas as concentrações de IgG total, subclasses de IgG e IgE anti-gp43 de P. brasiliensis. Todas as dosagens foram realizadas por método imunoenzimático (ELISA). Os níveis séricos basais de IL-18, IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10 estavam mais elevados em pacientes com PCM em relação ao grupo controle. Pacientes com a FJ apresentaram concentrações mais elevadas de IL-18 e sTNFRII em relação aqueles com a FA da PCM, enquanto estes mostraram maiores concentrações de sTNFRI em relação aos pacientes com a FJ. Houve correlação positiva entre as concentrações de IL-18 e sICAM-1 (r=0.62, p<0.0001), sTNFRI (r=0.61, p<0.0001), sTNFRII (r=0.64, p=0.002) e também em relação a gravidade da doença nos pacientes com a FJ. A terapia anti-fúngica resultou em significante diminuição das concentrações séricas de todos os mediadores inflamatórios analisados que, de maneira geral, atingiram os valores encontrados no grupo controle ao final de 2 anos de tratamento. A pesquisa de anticorpos mostrou níveis basais maiores de IgG4 e IgE nos pacientes com a FJ, enquanto que a IgG1 estava mais elevada naqueles com a FA. Em conjunto os resultados mostraram que uma forte resposta inflamatória marca a fase inicial da PCM humana e que mediadores como a IL-18 e o sTNFRII parecem contribuir em particular para uma forma mais grave da doença / Abstract: IL-18 is a pro-inflammatory cytokine of the IL-1 superfamily that exhibits broad functional effects in innate and acquired immune responses and which has been found in high levels in several chronic inflammatory and autoimmune diseases. Over-expression of IL-18 may promote early resolution of infection or could induce a detrimental exaggerated immune response. The aim of this study was to determine serum levels of IL-18 and other inflammatory mediators (IL-12, sICAM-1, sTNFRI, sTNFRII, CXCL9, CXCL10) at baseline and after antifungal therapy in serum from patients with juvenil (JF) and adult form (AF) of paracoccidioidomycosis (PCM) as well as in healthy controls (C), and to assess their possible relationships to the severity of disease. IL-18 and sTNFRII levels in patients with the JF of PCM were significantly higher than in the AF and controls. In relation to sICAM-1, no difference was observed between JF and AF but both presented higher levels than controls. sTNFRI levels were higher in patients with PCM than in controls, and significant higher concentrations were detected in AF patients as compared to JF ones. Moreover IL-12 and chemokines CXCL9 and CXCL10 were also higher in patients than in controls. In JF patients IL-18 levels significantly correlated with sICAM-1 (r=0.62, p<0.0001), sTNFRI (r=0.61, p<0.0001), sTNFRII (r=0.64, p=0.002), as well as with clinical severity. The results suggest the value of serum IL-18 and sTNFRs levels as a parameter of PCM severity and may support a possible role for them in the pathogenesis of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:22:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaCarolina_M.pdf: 3235698 bytes, checksum: 858844d8c2fb54db25e9acd5fcdbb327 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) apresentam supressão da resposta imunológica celular, caracterizada por testes de hipersensibilidade do tipo tardio negativos a antígenos do P. brasiliensis, alta taxa de apoptose de linfócitos e alta expressão de CTLA-4 (CD152) e alta produção de citocinas supressoras (IL-10 e TGF-b). Esses dados indicam a possível participação de células T regulatórias (CD4+CD25+ - Tregs) na PCM. O objetivo desse trabalho foi verificar se, e por qual mecanismo as células T regulatórias estão envolvidas nessa imunossupressão. Para isso, analisamos o número, fenótipo, assim como a atividade funcional das células regulatórias do sangue periférico de pacientes com PCM antes e após o tratamento antifúngico efetivo. O número e o fenótipo das células T regulatórias foram avaliados por citometria de fluxo, e os resultados demonstraram que pacientes com PCM ativa (DA) apresentam um maior número dessas células que pacientes tratados (DT) ou controles normais (C). Além disso, observamos uma maior expressão de CD95L, CTLA-4, LAP-1 e GITR em células regulatórias do grupo DA em relação aos grupos DT e C. A expressão do RNAm (quantificado por PCR em tempo real) para FoxP3, IL-10 e TGF-ß em CMSP ex vivo também foram maiores no grupo DA que nos controles e pacientes do grupo DT. Com o intuito de comparar a atividade funcional das células T regulatórias, analisamos o efeito da cocultura com células T regulatórias na resposta proliferativa de CMSP estimuladas com ConA. As células regulatórias do grupo DA exibiram uma atividade supressora maior que as provenientes do grupo DT ou C, de uma maneira dose dependente. Para verificar se o mecanismo por meio do qual as células regulatórias exercem sua atividade é dependente de contato, utilizamos um sistema "transwell". Os resultados demonstraram que a atividade supressora das células T regulatórias do grupo controle é dependente de contato, mas que essa atividade para as células provenientes dos pacientes do grupo DA é apenas parcialmente revertida com esse sistema. A adição de citocinas supressoras recombinantes (IL-10 e TGF-ß), assim como de anticorpos neutralizantes para essas citocinas nas coculturas, mostrou que a produção de citocinas regulatórias pode ser outro mecanismo utilizado pelas células regulatórias do grupo DA. Em conclusão, o número aumentado de células T regulatórias no sangue periférico de pacientes com DA, expressando altos níveis de moléculas associadas à atividade regulatória, ao lado da alta expressão do RNAm para FoxpP3, IL-10 e TGF-b, sugere uma participação dessa população de linfócitos na imunossupressão observada em pacientes com PCM ativa. Além disso, nossos resultados indicam que as células T regulatórias dependem principalmente do contato intercelular para exercer seus efeitos supressores, e que a produção de citocinas supressoras também está envolvida nesse processo. / Abstract: Patients with paracoccidioidomycosis (PCM) present suppression of cellular immune response characterized by negative DTH to P. brasiliensis antigens, elevated apoptosis of lymphocytes, high expression of CTLA-4, and production of IL-10 and TGF-ß. Together these data point towards the involvement of regulatory T cells (CD4+CD25+ - Tregs) in PCM. The aims of this study were to verify whether and how Tregs are involved in this immunosuppression, through the analysis of the number and the phenotype, as well as, the functional activity of Tregs cells from peripheral blood of patients before and after antifungal treatment. The number and phenotype of Tregs cells were evaluated by flow cytometry, and the results showed that PCM patients with active disease (AD) present higher number of Treg cells than patients after treatment (TD) or healthy controls (C). Furthermore, we observed higher expression of CD95L, CTLA-4, LAP-1 and GITR on Tregs from AD group, than in cells from TD and C groups. mRNA expression (quantified by qRT-PCR) for FoxP3, IL-10 and TGF-ß in ex vivo PBMC, were also higher in AD group than in controls and in TD group. In order to compare the functional activity of Tregs, we analyzed the effect of Treg cells on the proliferative response of PBMC stimulated with ConA. Tregs from AD group exhibited stronger regulatory activity than cells from TD and C groups, in a dose dependent manner. To verify the possible mechanism through which Tregs suppress the cell proliferation we utilized a transwell system, which showed that the contact is mandatory for regulatory activity of Treg cells from C group, but had only a partial involvement in cells from AD patients. The addition of IL-10 and TGF-ß and anti cytokines in the co-cultures showed that the production of immunoregulatory cytokines may be other mechanism used by Tregs. In conclusion, the increased number of Treg cells in peripheral blood of patients with active disease, expressing high levels of regulatory markers and suppressive activity, besides the high expression of Foxp3, IL-10 and TGF-ß mRNAs suggest the potential participation of this population in the immunosuppression observed during the disease. Moreover, our results indicate that Tregs act mainly by contact to exert their inhibitory effects, but the production of immunoregulatory cytokines are also involved. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Liana Verinaud, Wilson Savino / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T05:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gameiro_Jacy_D.pdf: 7674475 bytes, checksum: 85104c8f2befe30630bf49436c0fb352 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O timo é o órgão linfóide primário responsável pelo amadurecimento dos linfócitos T. O processo de maturação é dependente da integridade do microambiente e da migração coordenada por elementos de matriz e quimiocinas dos precursores hematopoiéticos nos distintos nichos tímicos. Entretanto, a literatura mostra que profundas alterações no microambiente tímico, e conseqüentemente no desenvolvimento e amadurecimento dos linfócitos T, podem ocorrer como resultado de algumas patologias. No presente trabalho, analisamos a indução de atrofia e as alterações no microambiente tímico frente a três diferentes agentes indutores de atrofia, sendo dois agentes patogênicos, P.brasiliensis e P.berghei e uma doença metabólica, a diabetes induzida por aloxana. Nos três modelos estudados foi observada a atrofia do órgão com diferente intensidade nas alterações de componentes do microambiente tímico. Importantes moléculas associadas com a migração intratímica mostraram-se alteradas com modificações significativas nos elementos de matriz e nas quimiocinas bem como na expressão dos seus respectivos receptores. Ainda, a migração ex vivo também se mostrou alterada na atrofia induzida pelos agentes patogênicos, mas não no modelo de atrofia induzido por aloxana, sugerindo que as alterações desencadeadas são específicas de cada condição patológica analisada. As modificações nos elementos estudados sugerem alterações no padrão de migração intratímica e na exportação de timócitos, com comprometimento da função tímica, levando a maturação desequilibrada dos timócitos, com conseqüências para a resposta imune periférica. / Abstract: Thymus is the primary lymphoid organ responsible for differentiation of Tlymphocytes. This process is dependent of thymic microenvironment integrity and coordinated migration of hematopoietic precursors by chemokines and extracellular matrix elements. However, the literature shows that deep alterations in thymus microenvironment with modifications in thymocyte development may occur such as result of some pathological disorders. In this study we analyzed the atrophy induction and alterations in thymic microenvironment in three different models of thymus atrophy. We studied two models of infectious diseases, P.brasiliensis and P.berghei, and a metabolic disorder, alloxan induced diabetes. We have observed thymus atrophy in all models with different alterations levels in thymus microenvironment elements. Important molecules associated with intrathymic migration were been altered with significant modifications in extracellular matrix elements, chemokines and their specific receptors. Besides, ex vivo migration was altered in thymus atrophy induced by pathogenic agents, but no alterations were observed in diabetic mice suggesting that different pathological conditions studied, leads to singular alterations in thymus compartment. The modifications in thymic molecules observed in our models, suggest impaired thymus functionality and alterations in thymocyte migration patterns These alterations can lead T cell maturation imbalance with consequences in Tlymphocyte immune response. / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Liana Verinaud, Dea Maria Serra Villa-Verde / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T21:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Loyola_PatriciaResendeAloNagib_D.pdf: 6019241 bytes, checksum: 171494f158eff0d6b54b029e9583a35c (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O timo é o órgão linfóide primário onde os precursores de células T, chamados de timócitos, sofrem processos de diferenciação, seleção e proliferação. Todos estes processos são seqüencialmente dependentes de distintos microambientes no interior do órgão delimitados morfológica e fenotipicamente. Por isso a manutenção do microambiente é essencial para a funcionalidade do órgão. Recentemente, o timo tem sido visto como um órgão alvo de diversas infecções e patologias. No presente trabalho, foi avaliado o comprometimento do timo em três diferentes modelos experimentais capazes de induzir sua atrofia, a saber, infecção experimental pelo fungo P. brasiliensis, infecção experimental por Plasmodium berghei e diabetes induzida quimicamente. Foram avaliadas as subpopulações celulares tímicas, a expressão de citocinas essenciais à maturação dos timócitos e o possível papel do hormônio leptina no estabelecimento e manutenção da atrofia tímica. Sucintamente, os resultados demonstraram que nos três modelos, houve diminuição de celularidade com alterações significativas na freqüência dos subtipos de timócitos, principalmente queda de DP, e menor número de TNCs/animal . No modelo de diabetes além destas alterações, foi detectado a queda dos níveis de leptina, aparentemente, devido á queda da insulina. No modelo de PCM, não houve alteração nos níveis de leptina, entretanto, houve queda na expressão gênica de IL-7 e TGF-ß, fatores timo-estimulantes e inibição da capacidade migratória. Em animais infectados pelo P. berghei, houve queda de leptina e queda na expressão dos genes específicos para IL-7 e TGF-ß, além de aumento na atividade de migração Mediante os dados obtidos em cada modelo, sugere-se que no caso do modelo de PCM a atrofia de grau leve que foi observada deve-se à perda de células por diminuição da expressão das citocinas timo-estimulantes. Em malária acredita-se que a intensa atrofia ocorra por perda da região cortical devido, à queda na expressão das citocinas IL-7, TGF-ß e nos níveis séricos de leptina. Na diabetes induzida, o grau intermediário de atrofia pode ser correlacionado apenas à queda dos níveis séricos de leptina. / Abstract: The thymus is the primary lymphoid organ in which T cell precursors, called thymocytes, undergo processes of differentiation, selection, and proliferation. All these processes are sequentially dependent on distinct thymic microenvironments, which in turn, are delimited morphologically and phenotypically. For these reasons, the maintenance of this microenvironment is crucial for thymus functionality. Recently, the thymus has been seen an organ targeted by several infections and pathologies. In this study, we evaluated thymus compromise under three experimental models capable of inducing atrophy, as follows: (1) experimental infection by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (PCM), (2) experimental infection by Plasmodium berghei, and (3) chemically-induced diabetes. We evaluated subpopulations of thymic cells, the expression of cytokines that are essential to thymocyte maturation, and the possible role of the leptin hormone in the establishment of thymic atrophy. Briefly, the results showed that in all three models there was a decrease of cellularity along with significant alterations in the frequency of each thymocyte subtype, especially a decrease in DP, and lower numbers of TNCs per animal. In the diabetes model, besides these alterations, we detected a decrease in leptin levels, apparently related to the insulin drop. In the PCM model, there were no alterations in leptin levels. However, we observed a drop in the expression of IL-7 and TGF- ß, both thymus-stimulant factors, as well as an inhibition of migratory ability. In P. berghei-infected animals there was a drop in leptin as well as in the expression of IL-7 and TGF- ß genes; besides an increase in migration activity. According to the data obtained within each model, we suggest that for the PCM model, the low degree of observed atrophy is a consequence of the loss of cells due to a drop in thymus-stimulant cytokine expression. In malaria, the intense atrophy happens due to the loss of the cortex region, generated by the drop in the expression of IL-7 cytokines, TGF- ß, and seric levels of leptin. As for the induced diabetes, the intermediate degree of atrophy can be correlated only to the drop in seric levels of leptin. / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular