O Eucalyptus é o gênero mais importante para a indústria brasileira de papel e celulose. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden e seus híbridos são preferencialmente usados pela indústria devido ao rápido crescimento e alta produtividade volumétrica. Embora possua características adequadas à utilização comercial, vários estresses abióticos e bióticos influenciam sua produção. O IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) destaca a Puccinia psidii como sendo a maior ameaça para a cultura nos tempos atuais. A doença não co-evoluiu com o hospedeiro e por essa razão, torna o patógeno um elemento potencial a vencer as barreiras impostas pelo hospedeiro. O fungo ataca plantas jovens, incluindo mudas em viveiros, plantas em jardins clonais e plantações comercias com até 2 anos de idade. Com o objetivo de identificar proteínas diferencialmente expressas e avaliar as mudanças ocorridas na composição química da parede celular das folhas, o presente trabalho analisou o impacto da presença do fungo sobre os clones comerciais, resistentes (7) e suscetíveis (24), de eucalipto. Os clones de E. grandis, 7 e 24, previamente inoculados com uredósporos de P. psidii, foram utilizados para extração de proteínas após 24 horas de interação com o fungo. As análises foram realizadas com auxílio de SDS-PAGE de primeira e segunda dimensão, em gradiente de pH na faixa de 4-7, utilizando-se 750 µg de proteínas. As imagens dos géis, em triplicata, analisadas pelo programa (Image Master Elite v. 3.01), possibilitaram a identificação de 466 spots. A comparação entre os perfis eletroforéticos dos clones que foram analisados e os controles não inoculados, mostrou que o processo de infecção do fungo nas plantas induziu o aparecimento de 72 spots exclusivos para o clone 7 além de alterações do volume de outros 115 spots. Já para o clone 24, a exposição ao fungo promoveu o aparecimento de 22 spots exclusivos e alterações de outros 98. Os perfis eletroforéticos dos clones controle, que não foram expostos ao fungo, mostraram diferenças genéticas entre os clones 7 e 24. O clone resistente, apresentou grande concentração de spots na região entre 14 a 45 kDa. Já para o clone suscetível, os spots se concentraram na região entre 25 a 97 kDa. A avaliação do conteúdo de carboidratos e ácidos urônicos da parede celular mostrou alterações no conteúdo dos açúcares no material inoculado com P. psidii, após 24 horas, 6 e 12 dias de inoculação. Os teores de glicose observados para os clones 7 e 24, já após 24 horas da inoculação, mostraram-se bastante alterados, indicando que esse açúcar possui papel chave no processo de formação da parede celular e conseqüentemente no mecanismo de defesa vegetal. / Eucalyptus is the most important genus for the Brazilian pulp and paper industry. Eucalyptus grandis Hill ex. Maiden and hybrids are preferentially used by the industry due to its rapid growth and high volumetric productivity. Although they possess characteristics adequate for commercial use, various biotic and abiotic stresses influence production. IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) highlight Puccinia psidii as the largest current threat to the culture. The disease did not co-evolve with the host and for this reason has become the pathogen with most potential to overcome the barriers imposed by the host. The fungus attacks young plants, including saplings in nursery, clonal gardens and commercial plants up to 2 years-old. With the objectives of identifying the proteins differentially expressed and evaluate the changes occurring in the chemical composition of the cell walls in the leaves, the present work analyzed the impact of the presence of the fungus on the commercial eucalyptus clones, resistant (7) and susceptible (24). The E. grandis clones (7 and 24) were inoculated with P. psidii urideospores and proteins extracted after 24 hours interaction with the fungus. The analyses were carried out using a pH gradient (4-7) in the first and SDS-PAGE in the second dimension, loading 750 µg onto the gel. The gel images, in triplicate, were analyzed using the software Image Master Elite v. 3.01, allowing the identification of 466 spots. The electrophoretic profiles for each clone were analyzed and compared to the uninoculated controls, showing that the fungal infection process induced the appearance of 72 exclusive spots in clone 7 and an alteration in the volume of another 115 spots. In clone 24, exposure to the fungus induced the appearance of 22 exclusive spots and altered another 98. The electrophoretic profiles of the control clone, not exposed to the fungus, demonstrated genetic differences between the 7 and 24. The resistant clone (7) presented a large concentration of spots around 14 to 45 kDa. In contrast, the susceptible clone (24) presented a concentration of spots around 25 to 97 kDa. Evaluation of the carbohydrate and uronic acid content of the cell wall showed an alteration in the sugar content in the material exposed to P. psidii after 24 hour, 6 and 12 days after inoculation. The glucose levels observed for clones 7 and 24 were considerable altered 24 hours after inoculation, indicating that this sugar has a key role in cell wall formation and consequently in the plant defense mechanism.

A parede celular vegetal, estrutura essencial para as plantas, é extremamente importante para a economia humana, já que apresenta diversas utilidades, como por exemplo, fabricação de papel, fibras de vestuário, construção civil, entre outras. A maior parte da parede celular vegetal primária (aproximadamente 90%), é formada por polissacarídeos como celulose, hemiceluloses e pectinas. Os monossacarídeos, unidades formadoras dos polissacarídeos, são sintetizados, nas plantas, a partir de diferentes açúcares nucleotídeos, sendo que, o suprimento desses, pode afetar a biossíntese dos polissacarídeos da parede celular. Visando analisar o impacto da alteração do fluxo metabólico do carbono na composição da parede celular, o presente projeto de pesquisa teve como objetivo alterar a composição dos polissacarídeos da parede celular de Nicotiana tabcum, através da modulação da expressão do gene uxs, responsável pela codificação da enzima UDP-D-glucuronato descarboxilase (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) que converte UDP-D-glucuronato em UDP-D-xilose, importante açúcar nucleotídeo, precursor do monossacarídeo xilose. Para isso, após a clonagem do gene uxs de ervilha, foram obtidas plantas transgênicas de tabaco superexpressando esse gene. Diversas análises foram realizadas para determinação da composição química da parede celular primária e secundária dessas plantas. Pela análise de FTIR da parede celular primária, verificou-se que três linhagens transgênicas apresentaram espectrotipos consistentes, indicando uma redução na quantidade de pectinas e ligações ésteres carboxílica nessas linhagens transgênicas. Apesar de não terem sido detectadas alterações na proporção dos monossacarídeos ramnose, xilose, arabinose, manose e galactose, e na quantidade de celulose, na parede celular primária das plantas transgênicas, foram observadas diferenças na proporção de galactose não esterificada, nas linhagens que apresentaram espectrotipo. Com relação à parede celular secundária, observou-se que algumas linhagens transgênicas apresentaram maior concentração de lignina solúvel relacionada a uma redução no conteúdo de lignina insolúvel. / The plant cell wall is not only an essential structure for plants, but also an extremely important raw material in human economy. The plant cell wall has diverse utilities, for example, papermaking, textile fiber, civil construction. Polysaccharides, such as cellulose, hemicelluloses and pectins, are the major components of the primary plant cell wall (approximately 90%). These polysaccharides are formed by monosaccharides, which are synthesized in the plant from different nucleotide sugars. The suppliment of the nucleotide sugars can affect plant cell wall polysaccharides biosynthesis. Aiming at analyzing the impact of the alteration in the metabolic carbon flux on cell wall composition, the objective of this research project was to alterate the plant cell wall polysaccharides composition by the modulation of the uxs gene. This gene encodes the UDP-D-glucuronic acid decarboxylase enzyme (UDPGlcADC, EC 4.1.1.35) that promotes the conversion of UDP-D-glucuronic acid to UDP-D-xylose, an important sugar nucleotide precursor of xylose monosaccharide. To achieve this goal, the pea uxs gene was cloned and transgenic tobacco plants overexpressing this gene were obtained. Several analyses were performed to determinate the primary and secondary cell wall composition of those transgenic plants. The primary cell wall analysis by FTIR identified three transgenic lines that show different spectrotypes compared to wild type and those transgenic spectrotypes had the same features. The results indicate a reduction of pectin and ester carbonyl binding in the transgenic plants. No alterations were detected in the monosaccharide (rhamnose, xylose, arabinose, manose and galactose) proportions and the amount of cellulose in the primary cell wall of the transgenic plants. Nevertheless, differences in the proportion of unesterified galactose were observed in the same transgenic lines that showed spectrotypes. With regard to secondary cell wall, some transgenic lines showed an increase in soluble lignin which is related to a reduction in insoluble lignin.

Apenas muito recentemente estratégias genômicas e pós-genômicas têm sido utilizadas em estudos de espécies arbóreas importantes na silvicultura. Nos países tropicais, a exemplo do Brasil, as espécies de eucalipto são especialmente importantes nos plantios comerciais principalmente destinados à indústria de papel e celulose. O eucalipto é caracterizado por elevadas taxas de crescimento e alta adaptabilidade resultante da interação de mecanismos moleculares e processos metabólicos ainda pouco conhecidos. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivo principal o estabelecimento de perfis transcricionais comparativos para folhas e para o xilema em formação de árvores de Eucalyptus grandis. grandis. O uso do método SAGE permitiu analisar 5864 genes dos quais 2247 (38%) puderam ser identificados. Foram encontrados 464 genes diferencialmente expressos, sendo 47 exclusivamente expressos na região cambial e 64 nas folhas. Além disso, as estratégias adotadas na identificação tags-genes permitiram que as SAGE tags fossem eficientemente utilizadas na diferenciação de isoformas gênicas tecido-específicas e de localização celular específica. Genes relacionados à fotossíntese, fotorrespiração e destoxificação celular foram preferencialmente encontrados na biblioteca SAGE de folhas, enquanto genes relacionados à síntese da parede celular, organização do citoesqueleto e respiração, foram preferencialmente expressos na biblioteca SAGE de madeira. Os níveis de expressão dos transcritos sugeriram a ocorrência de possíveis mecanismos de controle transcricional comum para grupos de genes funcionalmente relacionados e foram também utilizados para sugestão de genes e processos que representam alvos potenciais para o melhoramento do eucalipto. / Recently genomic and post-genomic strategies have been used to study important tree species in planted forests. In the tropical countries, like Brazil, Eucalyptus species are especially important in commercial plantations destined for the paper and cellulose industry. Eucalyptus species are characterized by their high growth rates and great adaptability resulting from the interaction between molecular mechanisms and metabolic processes that are still uncharacterized. Thus, the main goal of this work was the comparison of the transcriptional profiles from leaves and the cambial region of Eucalyptus grandis trees. The use of SAGE allowed the evaluation of 5864 expressed tags of which 2247 (38%) could be identified. 464 differentially expressed tags were indicated, of which 47 were exclusively expressed in the cambial region library and 64 in the leaf library. Furthermore, the strategies used in the tag mapping process allowed an efficient use of the SAGE tags to distinguish gene isoforms with tissue-specific and/or specific cell localizations. Genes related to photosynthesis, photorespiration and cellular detoxification were preferentially found in the SAGE leaf library, while genes involved in cell wall biosynthesis, cytoskeletal organization and respiration were preferentially expressed in the developing xylem. Transcript expression levels suggested the presence of a common transcriptional control for a few functionally related genes, for example, some lignin related genes. Importantly, transcript expression levels were also used for the identification of target genes and processes potentially useful in future Eucalyptus breeding programs.

Orientadores: Marcia Regina Braga, Marcia Maria Camargo de Morais / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:21:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galvao_DaianeFelbergAntunes_D.pdf: 15313845 bytes, checksum: aa218f685858df886eb7062bfe4337dc (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Fruto-oligossacarídeos (FOS) são frutanos de baixo peso molecular produzidos por microorganismos. O interesse em FOS vem aumentando uma vez que eles são considerados ingredientes funcionais benéficos à saúde humana. Com o objetivo de analisar como a produção de FOS e a composição da parede celular de fungos filamentosos é afetada pela fonte de carbono, os fungos Fusarium solani (URM 3338) e Neocosmospora vasinfecta (URM 3329) foram cultivados em meios contendo cinco fontes de carbono diferentes (sacarose, inulina, glucose, frutose ou glucose mais frutose, todos a 1%) e coletas foram realizadas aos 5, 10 e 15 dias de crescimento. A partir do meio de cultivo filtrado foram analisados o pH, teores de açúcar total, açúcares redutores e proteínas, a presença de FOS e atividades enzimáticas invertásica e inulinásica. A partir do micélio, a biomassa foi quantificada e a parede celular foi isolada e sua composição em açúcares neutros, ácidos urônicos e quitina analisada. Foi avaliada também a expressão relativa de genes de síntese de parede celular b-1,3-glucano sintase e quitina sintases. Os dois fungos utilizaram todas as fontes de carbono crescendo nas diferentes condições. Atividade de hidrólise foi detectada no meio contendo sacarose ou inulina para o fungo F. solani, gerando glucose, frutose e fruto-oligossacarideos como produtos havendo utilização dos monossacarídeos. O micélio deste fungo apresentou alterações visíveis no crescimento em meio sólido apenas no meio com frutose, mas foi observada igual quantidade de quitina da parede celular deste fungo quando crescido por cinco dias em sacarose e inulina, mas em menor quantidade com relação aos demais meios. As análises de expressão relativa de genes mostraram indução do gene da b-1,3-glucano sintase e repressão do gene quitina sintase 5 em sacarose e inulina com relação a condição frutose. Estes dados sugerem que a alteração na composição da parede celular do F. solani pode ter relação com a secreção de enzimas nos meios sacarose e inulina. Para N. vasinfecta, quando crescido em sacarose foi observada atividade de transfrutosilação, com a liberação de glucose e síntese de 1-cestose (FOS) no meio. Transfrutosilação também foi observada no meio que teve inulina como fonte de carbono. O micélio deste fungo apresentou alterações visíveis em meio sólido nas condições frutose e inulina, sendo mais hialino do que nas demais condições. A quantidade de quitina na parede celular deste fungo crescido por cinco dias foi maior nas condições frutose e inulina com relação às demais. As análises de expressão relativa de genes mostraram indução dos genes de quitina sintase 4 e 5 nestas duas condições em relação à sacarose. A partir dos resultados, pode-se concluir que as fontes de carbono oferecidas foram utilizadas pelos fungos, que as mesmas afetaram a composição de açúcares da parede celular e a expressão de genes de síntese de componentes da parede e que estes fungos são promissores para a produção de FOS, pois possuem enzimas que hidrolisam a inulina, além de enzimas que sintetizam oligossacarídeos a partir de sacarose por transfrutosilação / Abstract: Fructooligosaccharides (FOS) are low molecular weight fructans produced by microbes and plants. Interest in FOS has been increasing since they are considered as functional food ingredients with benefical effects in human nutrition. With the aim of examining how the production of FOS and the composition of the cell wall of filamentous fungi are affected by the carbon source, Fusarium solani (URM 3338) and Neocosmospora vasinfecta (URM 3329) were cultured in media containing five different carbon sources (sucrose, inulin, glucose, fructose or glucose plus fructose) and samples were taken at 5, 10 and 15 days of growth. From the filtered culture medium, pH, total carbohydrates, reducing sugars and proteins, the presence of FOS and inulinase and invertase activities were analyzed. Mycelium biomass was measured and the cell wall was isolated and its composition in neutral sugars, uronic acids and chitin analyzed. The expression of b-1,3-glucan synthase and chitin synthase genes was also evaluated. Both fungi utilized all the carbon sources for growing. In sucrose- and inulin-containing media, hydrolytic activity was detected in F. solani generating glucose, fructose and FOS as products. When grown on solid culture media, visible changes were observed in mycelium of this fungus only in fructose, but the amount of chitin in the cell wall was higher in the sucrose and inulin-containing media when compared to other carbon sources. The expression b-1,3-glucan synthase gene was induced and chitin synthase 5 gene repressed on sucrose and inulin media. N. vasinfecta showed transfructosilation activity when was grown in sucrose, with release of glucose and synthesis of 1-kestose (FOS) in the culture medium. Transfructosilation was also observed in the inulin-containing medium. The mycelium showed visible changes when the fungus was cultured in solid medium with fructose or inulin as carbon sources. The amount of chitin in the cell wall of this fungus when grown for five days in inulin or fructose was higher in comparison to other carbon sources. The analysis of gene expression showed induction of chitin synthase 4 and 5 genes in these two conditions in relation to sucrose. From the results it can be concluded that the carbon sources affected growth, enzymic activity, composition of the cell wall and gene expression in F. solani and N. vasinfecta, and that these fungi are promising organisms for FOS production since they secrete enzymes that hydrolyze inulin or synthesize oligosaccharides from sucrose by transfructosylation / Doutorado / Biologia Celular / Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Dietary fiber (DF) consumption is related with several healthy benefits such as the decreasing risk of colon cancer development. The DF is not digested by the digestive enzymes and reach to colon where is fermented by the colonic microbiota. The fermentation process releases metabolites as short chain fatty acids (SCFA) such as butyrate, propionate and acetate. Besides the fermentation process, the DF can directly interact with intestinal epithelial cells inducing mechanism that can also be related with the associated DF consumption benefits. The lack of information regarding DF and colon cancer are due to the complexity of both the cancer and the DF structure. The papayas DF are derived from the fruit cell wall, and they are probably naturally modified during ripening through a massive polysaccharide hydrolysis, because papayas show a very fast pulp softening. Due to the lack of information about DF and their beneficial effects to human health as well as the possibility of the natural papaya ripening to modifying the DF presented in the fruit pulp, the present thesis had as the primary objectives: 1) to evaluate how the cell-wall degrading enzymes affect the fruit cell wall solubilization and molecular weight; 2) to investigate the direct effects of the papaya pectin derived from unripe to ripe papayas in cancer cell lines, in galectin-3 interaction and in HEK cells expressing pattern recognition receptors (PRR); 3) to evaluate the human colonic in vitro fermentation using DF from unripe and ripe papayas as substrates; 4) to conduct an in vivo experiment using rats with pre-neoplastic colon lesions while receiving a diet with DF from unripe and ripe papayas. The endopolygalacturonases were the main enzymes acting on the solubilizing papaya cell wall pectin affecting both the papaya firmness and pectin structure. Overall, the papayas DF showed a ripening dependent structureeffects. In the cancer cell lines experiments, the ripe papayas pectin showed a more pronounced effects in inducing cancer cell death, inhibiting cancer cells migration and aggregation, activating PRR as toll-like receptors and inhibiting the pro-metastatic protein galectin-3. The DF from papayas also showed different aspects in colonic in vitro fermentation regarding the DF utilization by the bacteria and the bacteria abundance profile. Lastly, the animals receiving the diet with the DF from ripe papayas had less aberrant crypt foci in colon than the animals that received the DF from unripe papayas or cellulose (AIN-93G DF). Therefore, the study of papaya DF was carried out both during papaya ripening and its biological effects in vitro and in vivo, generating unprecedented results relating the endogenous biochemical changes of the fruits during maturation with the possible beneficial effects of their ingestion for health human. / O consumo de fibras alimentares (FA) está relacionado com vários benefícios à saúde como a diminuição no risco do desenvolvimento de câncer de cólon. A FA não é digerida pelas enzimas digestivas do trato gastrointestinal sendo fermentada pela microbiota intestinal do cólon. Como subproduto do processo de fermentação há a liberação de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA) - como o butirato, o propionato e o acetato. Além do processo de fermentação, a FA pode interagir diretamente com as células epiteliais do intestino, induzindo mecanismos que também podem estar relacionados com os benefícios associados ao consumo de FA. A falta de informação sobre a FA e o câncer de cólon é, em partes, devido à complexidade de ambos, tanto do câncer quanto da estrutura da FA. As FA do mamão papaia são derivadas da parede celular da fruta apresentando diferentes estruturas dependendo do ponto de amadurecimento do fruto. Esse fato ocorre, pois, durante o amadurecimento do mamão papaia, existe uma extensa hidrólise dos polissacarídeos presentes na parede celular, diminuindo rapidamente a firmeza da polpa do fruto. Devido à falta de informações sobre FA e seus efeitos benéficos à saúde humana que são dependentes da sua estrutura, bem como a possibilidade do amadurecimento do mamão papaia naturalmente modificar as FA presentes na polpa dos frutos, a presente tese teve como principais objetivos: 1) avaliar como as enzimas que degradam a parede celular do mamão papaia afetam a solubilização e o peso molecular da parede celular do fruto; 2) investigar os efeitos diretos da pectina derivada de mamões verdes e maduros em linhagens de células de câncer, na interação com a galectina-3, e em células do tipo HEK que expressam receptores de reconhecimento de padrões (RRP); 3) avaliar a fermentação colônica humana in vitro utilizando as FA de mamões verdes e maduros; 4) avaliar em ratos com lesões pré-neoplásicas no cólon o efeito do consumo de ração com ou sem FA de mamões papaias verdes e maduros. As endopoligalacturonases foram relacionadas como as principais enzimas que atuam solubilizando a pectina da parede celular do mamão, afetando tanto a firmeza da polpa do fruto quanto a solubilização da pectina durante o amadurecimento. De modo geral, as FA dos mamões exerceram um efeito estruturadependente de acordo com a maturação do fruto. Nos experimentos utilizando linhagens de células de câncer, a pectina do mamão papaia maduro apresentou efeitos mais pronunciados na indução da morte e na inibição da migração e da agregação das células, bem como ativando os RRP, como por exemplo, os receptores do tipo toll-like, além de inibir a proteína pró-metastática galectina-3. As FA dos mamões também apresentaram diferentes resultados na fermentação colônica in vitro quanto à utilização das FA pelas bactérias do intestino, e também no perfil de crescimento dessas bactérias. Por fim, os animais que receberam a dieta com as FA dos mamões maduros apresentaram menor incidência de focos de criptas aberrantes do que os animais que receberam as FA provenientes de mamões verdes ou de celulose (FA da ração AIN-93G). Portanto, o estudo das FA dos mamões foi efetuado tanto durante o amadurecimento dos mamões quanto dos seus efeitos biológicos in vitro e in vivo, tendo gerado resultados inéditos relacionando as alterações bioquímicas endógenas dos frutos durante o amadurecimento com os possíveis efeitos benéficos da sua ingestão para a saúde humana.

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

Os fungos filamentosos passam por um crescimento polarizado, desde a germinação ao alongamento das hifas, até formar um complexo micélio. A região apical do crescimento polarizado do fungo apresenta dois tipos diferentes de vesículas, entre elas, as microvesículas. As ADP-ribosylation factors (ARFs), são proteínas monoméricas ligadoras de GTP e pertence ao grupo de proteínas da superfamília Ras. Essas proteínas são divididas em cinco famílias: ARF, RAB, RAN, RAS e RHO que formam um conjunto de sub-sistemas que são responsáveis, entre outras funções, pela regulação do transporte de vesículas no interior da célula fúngica, entre outras funções, como transduções de sinais e regulação do tráfego vesicular na região de crescimento apical, o spitzenkörper. São proteínas de ancoramento e de marcação de vesículas, envolvidas no tráfego, catálise e fusão por meio de sinalização de membrana-alvo para as vesículas de transporte transmembrana. As ARF são importantes para o crescimento das hifas, além de participar da montagem de vesículas por meio de endocitoses, do transporte destas vesículas entre as organelas e na exocitose. Adicionalmente, as ARFs sofrem o processo de N-miristoilação, uma irreversível lipidação proteica em que o miristato do miristoil CoA é covalentemente ligado a uma glicina secundária da proteína alvo, aumentando a sua hidrofobicidade. Além desta regulação, as ARFs são moduladas pela ação das ARF-GAP (GTPase Activating Protein) e ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). Neste trabalho foi proposta a deleção de três ARFs preditivamente miristoiladas (arfA, arfB and arlA), além de dupla-deleção com ?gcsA (ARF-GAP) e a caracterização genotípica e fenotípica das ADP ribosylation fator no fungo filamentoso patogênico Aspergillus fumigatus. Como caracterização das linhagens deletadas, notou-se que arfA demonstra ser essencial para A. fumigatus, enquanto que o fungo foi capaz de se desenvolver na ausência de arfB, arlA e duplo mutantes com ?gcsA. Porém, de forma alternada nas linhagens mutantes, houve redução do diâmetro da colônia, desestruturação de conidióforos, polarização dicotômica e redução de corpos lipídicos na região de crescimento apical. Além das alterações da parede celular que implicou em altações na carga de superfície, formação de biofilme e virulência. Testes de sensibilidades, bem como as análises de níveis de expressão gênica frente a a compostos danosos a eucariotos e antifúngicos evidenciaram que as ARFs e GcsA estão envolvidas em reparos a danos frente a diferentes alvos citoplasmáticos. Ainda, a localização das ARFs fusionadas com GFP (Green Flourescence Protein) em A. fumigatus evidenciou que ArfB está nas regiões apicais das hifas e conidióforos, enquanto ArlA está distribuído em todo citoplasma. Portanto as ARFs em A. fumigatus estão envolvidas nos processos básicos do fungo, como: o crescimento, a virulência e a reprodução / The filamentous fungi undergo polarized growth, from germination to hyphae elongation, to form a mycelial complex. The apical region of the polarized growth of the fungus presents two different types of vesicles, among them, the microvesicles. ADP-ribosylation factors (ARFs) are monomeric GTP-binding proteins and belong to a group of superfamily Ras proteins. These proteins are divided into five families: ARF, RAB, RAN, RAS and RHO that form a set of subsystems that are responsible, over others things, for the regulation of vesicle transport within the fungal cell, among other functions, such as signal transduction and regulation of the vesicular traffic in the apical growth region, the Spitzenkörper. They are anchoring and vesicle marking proteins involved in trafficking, catalysis and fusion by means of target membrane signaling to the transmembrane transport vesicles. ARFs are important for the growth of hyphae, besides participating in vesicle assembly through endocytosis, the transport of these vesicles between the organelles and exocytosis. In addition, the ARFs undergo the N-myristoylation process, an irreversible protein lipidation in which the myristoyl CoA myristate is covalently linked to a secondary glycine of the target protein, increasing its hydrophobicity. In addition to this regulation, the Arfs are modulated by the action of Arf-GAP (GTPase Activating Protein) and ARF-GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factor). In this work, the deletion of three myristoylated ARFs (arfA, arfB and arlA), as well as double-deletion with ?gcsA (ARF-GAP) and phenotypic and genotypic characterization of ADP ribosylation fator in the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus was proposed. As a characterization of the deleted strains, arfA shown to be essential for A. fumigatus, whereas the fungus was able to develop in the absence of arfB, arlA and double mutants with ?gcsA. However, in the mutant strains, there was a decrease in colony diameter, deconjugation of conidiophores, dichotomous polarization and reduction of lipid bodies in the apical growth region. In addition, cell wall changes were registered that implied in surface charge elevations, biofilm formation and virulence. In tests of sensitivities, as well as the analysis of levels of gene expression against compounds harmful to eukaryotes and antifungals showed that ARFs and GcsA (Arf-GAP) are involved in damage repair against different cytoplasmic targets. Furthermore, the location of the GFP-fused GFPs (Green Flourescence Protein) in A. fumigatus evidenced that ArfB is in the apical regions of the hyphae and conidiophores, while ArlA is diffuse in every cytoplasm. Therefore, the ARFs in A. fumigatus are involved in the basic processes of the fungus, such as growth, virulence and reproduction

Sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. acumulam suas reservas de carbono no endosperma na forma de um polissacarídeo de parede celular, o galactomanano. Os galactomananos são polissacarídeos constituídos de uma cadeia principal de resíduos de D-manose ligadas β-1,4, ramificada por resíduos de D-galactose α-1,6 ligados. A mobilização deste ocorre após a germinação e envolve três enzimas hidrolíticas (α-galactosidase, endo-β-mananase e exo-β-manosidase). A α-galactosidase é a primeira enzima atuar sobre o galactomanano hidrolisando as ligações α-1,6 das galactoses ramificadas a cadeia principal de manano (ligados β-1,4), permitindo a ação da endo-β-mananase, que hidrolisará o polissacarídeo a oligossacarídeos, onde a β-manosidase atuará (ligações β-1,4), transformando oligossacarídeos a monossacarídeos a serem utilizados no desenvolvimento do embrião. Buscando a compreensão das características da α-galactosidase e modo de ação sobre o galactomanano, procedeu-se com a purificação, em três etapas,e caracterização bioquímica (pH ótimo, temperatura ótima e aspectos cinéticos) da α-galactosidase de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. Além disso, visando evidenciar a modulação da enzima endo-β-mananase pela distribuição de ramificações de galactose no galactomanano (estrutura fina do galactomanano), procedeu-se com hidrólises enzimáticas do galactomanano de Sesbania virgata (Cav.) Pers. utilizando a enzima endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) somente ou em conjunto com a α-galactosidase semipurificada de Sesbania virgata (Cav.) Pers. (Capítulo 1) ou com a α-galactosidase comercial de Cyamopsis tetragonoloba (Megazyme®), seguido de análise dos oligossacarídeos por HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). Também procedeu-se com hidrólises enzimáticas de galactomananos de 6 espécies com razão manose:galactose variando de 1:1 a 150:1 com endo-β-mananase de Aspergillus niger (Megazyme®) e análise dos oligossacarídeos produzidos por HPAEC-PAD. A α-galactosidase semipurificada possui, aproximadamente, 42 kDa de peso molecular em condições desnaturantes e, aproximadamente 72 kDa de peso molecular na forma nativa, sugerindo que a enzima assuma estrutura quartenária. A temperatura ótima apresentada se encontra na faixa de 50°C a 55°C, pH ótimo na faixa de 4,4 a 5,4, Km= 1,8276 mM e a velocidade máxima de 0,5024 μmolGal.min-1.mgprot-1. A espectrometria de massas gerou os fragmentos: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSM-TSIADS NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, estando a proteína referente a esta sequência relacionada à mobilização de reserva. Durante a purificação e sequenciamento interno da α-galactosidase e demais proteínas foram detectadas isoformas da α-galactosidase de pesos moleculares variados (42 kDa a 20 kDa). Sugere-se que estas isoformas encontradas inicialmente na purificação estejam relacionadas com outras funções da α-galactosidase, enquanto as isoformas encontradas após todas as etapas de purificação e identificação por espectrometria de massas estejam relacionadas com ativação e adaptação da α-galactosidase durante todo o processo de mobilização de reservas. Os dados gerados das comparações dos oligossacarídeos produzidos em cada hidrólise sugerem que as ramificações do galactomanano podem modular o reconhecimento de sítios de clivagem pela endo-β-mananase: (1) existe a produção de oligossacarídeos limites de digestão F1, F2 e F3 após hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase, como demonstrado para xiloglucanos; (2) os oligossacarídeos F1 possuem proporções distintas quando da hidrólise do galactomanano com endo-β-mananase em diferentes concentrações (ExP I e EXP IV), evidenciando preferência por sítios com menor grau de galactosilação; (3) a presença da α-galactosidase diminui a produção dos oligossacarídeos F2 e F3, mostrando que estes não possuem resistência intrínseca a hidrólise e que a reação atinge o equilíbrio mesmo quando ainda existem sítios de clivagem ainda disponíveis (EXP III); (4) polissacarídeos com estruturas diferentes, razão manose:galactose variando entre 150:1 a 1:1, são digeridos em diferentes taxas de hidrólise pela mesma enzima, evidenciando que a ramificação com galactose dificulta a ação da endo-β-mananase. Dessa forma, sugere-se que a estrutura do polissacarídeo galactomanano também contenha, pelo menos, parte da informação requerida para seu próprio metabolismo, código para a sua degradação, estando esta informação contida na distribuição das ramificações com resíduos de D-galactose. Sendo assim, sugere-se que as diferentes isoformas da α-galactosidase relacionadas à degradação da reserva de galactomanano de sementes de Sesbania virgata (Cav.) Pers. seriam produto da ação proteolítica da própria enzima a fim de melhorar a afinidade da α-galactosidase ao substrato durante o processo de mobilização de reserva. O aumento da afinidade da α-galactosidase ao substrato durante todo o processo de mobilização garantiria a liberação das ramificações com galactose de forma contínua, permitindo e aumentando a eficiência da ação da enzima endo-β-mananase aos sítios de clivagem, garantindo a degradação do polissacarídeo a oligossacarídeos de forma regulada, passível de bloqueio, pelo acúmulo de oligossacarídeos e galactose livre que inibem a ação das enzimas endo-β-mananase e α-galactosidase, respectivamente, e dificultando a ação de microorganismos, propiciando ao embrião a maior quantidade de açúcares para o seu desenvolvimento, aumentando as chances de sucesso no estabelecimento da plântula / The seeds of Sesbania virgata (Cav.) Pers. have an endosperm which accumulates galactomannan as a storage polysaccharide in the cell walls. Galactomannans are composed of a linear backbone of β-(1,4)-linked D-mannose residues with D-galactose α-(1,6)-linkages substitutions. The galactomannans are hydrolysed after protrusion of the radicle. This process is perfomed by three enzymes (α-galactosidase, endo-β-mannanase and exo-β-manosidase). The α-galactosidase is the first enzyme to cleave the polysaccharides, removing the D-galactose residues, allowing the performance of the endo-β-mannanase, which hydrolyses the mannan backbone to mannan oligosaccharides. The last part of the process includes exo-β-manoside, that cleaves the mannan oligosaccharides to mannose residues, which could be used by the embryo during growth. Aiming at understanding the function of ?-galactosidase in the process of galatomanannan degradation, we studied its mode of action on mannans and galactomannans. The α-galactosidase of Sesbania virgata (Cav.) Pers. was purified and characterized (pH and temperature optimum and the enzyme kinetics). We found that the semipurified α-galactosidase molecular weight was 42kDa at denaturating conditions, but in native conditions was 72kDa, suggesting that the enzyme has a quaternary structure. The enzyme optimum pH was between 4,4-5,4, optimum temperature between 50°C-55°C, Km= 1,8276 mM and Vmáx= 0,5024 μmolGal.min-1.mgprot-1. Mass spectrometry measures resulted the following fragments: ALADYV-HSK-RMPGSLGHEE-QDAK-TT-GDIEDNWNSMTSIADS-NDKW-ASYAGPGGWN-DPDMLEVGNG-GMTTEEYR-AP-LLVGCDIR-VAVIL-WNR, being the protein from this sequence related with storage mobilization. Possible α-galactosidase isoforms were detected during the purification, suggesting other functions for the enzyme. The α-galactosidase isoforms detected after all purification steps and with measured mass spectrometry (from 42kDa to 20kDa) should be related to the storage mobilization. We suggest that the α-galactosidase isoforms in Sesbania virgata (Cav.) Pers. seeds represents products of the enzyme self-digestion, this process being correlated with the enzyme/polysaccharide affinity and at last, correlated to the galactomannan mobilization. An extract semipurified from Sesbania virgata (Cav.) Pers. and enriched with α-galactosidase activity, was used along with endo-β-mannanase from Aspergillus niger (Megazyme®) or both endo-β-mannanase and α-galactosidase (semipurified from Sesbania virgata seeds - Chapter 1- or commercial enzyme from Cyamopsis tetragonoloba - Megazyme®) were used to study the fine structure of galactomannans. Hydrolysis of galactomannans from six species with different mannose:galactose (1:1 to 150:1) ratio were performed with endo-β-mananase from Aspergillus niger. The oligosaccharides from all hydrolysis were analyzed by HPAEC-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection). The hydrolysis fragments data (HPAEC-PAD) suggest that the side-chains of the polysaccharides can modulate the hydrolytic sites recognition on the galactomannan by the endo-β-mannanase. This conclusion is supported by: (1) the presence of limited digest oligosaccharides F1 and dimmers (F2) and trimers (F3) of the F1 oligosaccharides; (2) the presence of different F1 oligosaccharides proportions after hydrolysis with endo-β-mannanase at different concentrations, showing preference on less-branched hydrolytic sites; (3) the α-galactosidase digestion avoided the accumulation of oligosaccharides F2 and F3, showing that these oligosaccharides do not present intrinsic resistance to hydrolysis and that the reaction reaches an equilibrium even when sites of hydrolysis are still available; (4) polymers with different fine structure (ratio mannose:galactose 1:1 to 150:1) were hydrolysed at different rates by the endo-β-mannanase, showing that galactose branching interferes on the enzyme action. Considering that, the branching pattern of the polysaccharide seems to have direct influence on the interaction of the enzyme with substrate; we suggest that the structure of the galactomannan holds part of information required for its own degradation. The higher enzyme x substrate affinity, ensure the galactose branches digestion, improving the endo-β-mannanase action, ensuring the degradation of the polysaccharides to oligosaccharides. This highly regulated degradation process prevents microorganisms predation and increases the plantlet establishement

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:25:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patricia kott.pdf: 7658177 bytes, checksum: ad9ad7831fb8596c7e55d3b1f0eee117 (MD5) Previous issue date: 2010-02-26 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic human pathogenic fungus that lives at 23”C in the mycelium phase (infecting phase) and at 37”C in the yeast phase (parasite phase). In attempt to survive, the cell wall of fungi can change its composition and/or structure in response to environmental stress by compensatory mechanisms. The molecules involved in these mechanisms are possible target for the development of effective antifungal agents. In P. brasiliensis, the main components of the cell wall are glucans and chitin polymers. These polymers make a primary barrier that is responsible for the structural integrity and form of the cell wall. In this work the behavior of P. brasiliensis was evaluated against stress conditions with the aim of study, for the first time, the mechanisms used by this fungus in the maintenance of the cell wall integrity. Our results shown that P. brasiliensis yeast cells are sensitive to cell wall stressors calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, KCl, NaCl and sorbitol. There was an increase in the PbFKS1 transcripts expression and in the content of cell wall β- 1,3-glicana after treatment with all stressor agents. After treatment with SDS and KCl the PbGFA1 transcripts expression and the cell wall GlcNAc residues also increased. The transcript expression of PbGEL3 was also evaluated being increased after treatment with CFW, NaCl and sorbitol. Thus we showed that these molecules are involved in the maintenance of the cell wall against stress conditions. Apart from these analyses we obtained the active recombinant protein PbFks1pc. Through the anti-PbFks1pc antibody we performed immunocitolocalization assays. These experiments revealed the localization of PbFks1p in regions of apical growth in the mycelium phase and in the cell surface in yeast phase. / Paracoccidioides brasiliensis Š um fungo patog‰nico e termodim‚rfico que se apresenta na forma de micŠlio a 23”C (forma infectante) e na forma de levedura a 37”C (forma parasit€ria). A parede celular de fungos Š capaz de alterar sua composiƒ o e atŠ mesmo sua estrutura em resposta a condiƒ•es ambientais de estresse atravŠs de mecanismos compensat‚rios. As prote…nas envolvidas nestes mecanismos s o poss…veis alvos para o desenvolvimento de agentes antifˆngicos espec…ficos. Em P. brasiliensis, os principais pol…meros que constituem a parede celular s o glicanas e quitina. Estes pol…meros formam uma barreira prim€ria que Š respons€vel pela integridade estrutural e forma da parede celular. Neste trabalho, o comportamento de P. brasiliensis diante de situaƒ•es de estresse foi investigado com o intuito de estudar, pela primeira vez, os mecanismos utilizados por este fungo na manutenƒ o da integridade da parede celular. Nossos resultados mostram que cŠlulas leveduriformes de P. brasiliensis s o sens…veis aos agentes estressores da parede celular calcofluor white (CFW), congo red (CR), SDS, NaCl, KCl e sorbitol. Houve um aumento na express o de transcritos de PbFKS1 e no conteˆdo do pol…mero de β-1,3-glicana na parede celular ap‚s tratamento com todos os agentes estressores. Ap‚s tratamento com SDS e KCl a express o de transcritos de PbGFA1 assim como o conteˆdo de res…duos de GlcNAc na parede celular tambŠm aumentaram. A express o dos transcritos de PbGEL3 tambŠm foi avaliada estando aumentada ap‚s tratamento com CFW, NaCl e sorbitol. Desta forma, mostramos que estas molŠculas est o envolvidas na manutenƒ o da parede celular diante de situaƒ•es de estresse. AlŠm destas an€lises, a prote…na recombinante PbFks1pc ativa foi obtida. AtravŠs do anticorpo anti-PbFks1pc realizamos ensaios de imunocitolocalizaƒ o. Estes experimentos revelaram a presenƒa de PbFks1p em regi•es de crescimento apical no micŠlio e na superf…cie celular em cŠlulas leveduriformes.

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: A alta frequência de Estafilococos Coagulase-Negativa (CoNS) na pele de indivíduos saudáveis e em doenças associadas ao sangue, associados à seleção de cepas resistentes devido a uso indiscriminado de antimicrobianos, tornou mais estreitos os limites entre o ambiente hospitalar e o comunitário quanto à distribuição de cepas. Objetivou-se, com este estudo, caracterizar isolados de CoNS de origem hospitalar e comunitária da cidade de Botucatu-SP quanto ao perfil clonal, analisar os aspectos de resistência à oxacilina pela aferição de metodologia de detecção, e investigar os determinantes de heterorresistência à vancomicina nessas cepas. As espécies estudadas incluíram S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis, S. capitis, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. simulans e S. xylosus. O teste de disco-difusão (TDD) com discos de oxacilina e cefoxitina, fitas de Etest impregnadas com oxacilina e pesquisa do gene mecA por PCR em tempo real foram realizadas. A triagem em ágar com 6 e 8 µg/ml de vancomicina, microdiluição em caldo para aferição da Concentração Inibirtória Mínima (MIC), microscopia eletrônica de transmissão para verificar espessamento da parede celular e alterações fenotípicas por testes bioquímicos foram realizadas. O perfil clonal foi determinado por PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) e para clones de S. epidermidis, o MLST (Multilocus Sequence Typing). S. epidermidis apresentou alta diversidade clonal, mas presença de clusters no ambien... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The high frequency of Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) on the skin of healthy individuals and in bloodstream infections, together with the selection of resistant strains, has narrowed the boundaries between the hospital and the community environment for the distribution of strains. This study aimed to characterize CoNS isolated from clinical and colonization specimens of patients and individuals from Botucatu-SP, to compare their clonal profile, to analyze the determination of oxacillin resistance by the evaluation of the methodology of detection, and to investigate the determinants of reduced susceptibility to vancomycin in those strains. CoNS species included S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis, S. capitis, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. simulans and S. xylosus. The disc diffusion test (DDT) using oxacillin and cefoxitin discs was employed, Etest strips impregnated with oxacillin and mecA gene detection by real-time PCR were used. An agar screening with 6 and 8 µg/ml of vancomycin, the broth microdiluition method for the Minimal Inhibitory Concentration (MIC), the transmission eletronic microscopy for evaluation of cellwall thickening and phenotypic modifications by biochemical tests were performed. Clonal profile was determined by PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) and, for S. epidermidis clones, MLST (Multilocus Sequence Typing). S. epidermidis presented high clonal diversity, despite some clusters circulating within hospi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor