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Le VIP (ou vasoactive intestinal peptide) est un neuropeptide actif au niveau du syst¨¨me nerveux central et p¨¦riph¨¦rique (syst¨¨mes cardiovasculaire, respiratoire, tractus gastro-intestinal¡­). Il agit sur ces tissus cibles par interaction avec les r¨¦cepteurs VPAC1 et VPAC2, pour lesquels il poss¨¨de une haute affinit¨¦. Ces r¨¦cepteurs appartiennent ¨¤ la classe II des r¨¦cepteurs ¨¤ 7 h¨¦lices transmembranaires coupl¨¦s aux prot¨¦ines G, distincte de celle des r¨¦cepteurs apparent¨¦s ¨¤ la rhodopsine. En r¨¦ponse au VIP, ils stimulent pr¨¦f¨¦rentiellement l'ad¨¦nylate cyclase. Seul le r¨¦cepteur VPAC1 est capable, lorsqu'il est exprim¨¦ ¨¤ haute concentration, d¡¯augmenter les concentrations de calcium intracellulaire :G*i participe ¨¤ cette interaction. L'exposition des deux r¨¦cepteurs au VIP n'aboutit pas seulement ¨¤ leur activation :elle induit une succession de m¨¦canismes cellulaires intrins¨¨ques responsables d'une diminution de la capacit¨¦ du r¨¦cepteur ¨¤ r¨¦pondre ¨¤ un agoniste :la d¨¦sensibilisation. <p>Diff¨¦rents processus peuvent contribuer ¨¤ la d¨¦sensibilisation d¡¯un r¨¦cepteur :le d¨¦couplage du r¨¦cepteur de la prot¨¦ine G, la s¨¦questration du r¨¦cepteur, ou encore leur "down regulation", r¨¦sultat ¨¤ plus long terme de la perte d'une partie du pool total de r¨¦cepteurs. Les m¨¦canismes impliqu¨¦s d¨¦pendent du r¨¦cepteur consid¨¦r¨¦ et de l'¨¦quipement prot¨¦ique de la cellule. <p>Il a ¨¦t¨¦ r¨¦cemment montr¨¦ que le r¨¦cepteur VPAC1 humain ¨¦tait phosphoryl¨¦ (en position S447) en r¨¦ponse ¨¤ l¡¯agoniste, que la ¦Â-arrestine ¨¦tait transloqu¨¦e ¨¤ la membrane plasmique et que l¡¯internalisation qui s¡¯en suivait induisait un ph¨¦nom¨¨ne dynamine-d¨¦pendant. Aucune information plus pr¨¦cise n¡¯est r¨¦f¨¦r¨¦e dans la litt¨¦rature. <p>Ce travail de th¨¨se a donc consist¨¦ en une ¨¦tude plus approfondie de la phosphorylation, l¡¯internalisation et la r¨¦cup¨¦ration du r¨¦cepteur VPAC1 humain.<p><p>Dans un premier temps, nous nous sommes consacr¨¦ ¨¤ l¡¯¨¦laboration d¡¯un anticorps monoclonal sp¨¦cifique anti-r¨¦cepteur afin de visualiser le r¨¦cepteur. Nous avons eu recours ¨¤ l¡¯immunisation g¨¦n¨¦tique qui consiste ¨¤ injecter l¡¯antig¨¨ne sous forme d¡¯ADN. <p>Une majorit¨¦ des souris immunis¨¦es ont produit des anticorps. L¡¯une d¡¯entre-elle a permis de g¨¦n¨¦rer un anticorps monoclonal, lequel a ¨¦t¨¦ compl¨¨tement caract¨¦ris¨¦ :les r¨¦sultats obtenus par FACS montrent qu¡¯il est sp¨¦cifique, s¨¦lectif et que son ¨¦pitope est localis¨¦e au sein de l¡¯extr¨¦mit¨¦ amino-terminale du r¨¦cepteur (figure 1). Il n¡¯interf¨¨rent pas avec la liaison du ligand et ne modifie en rien l¡¯activation du r¨¦cepteur par celui-ci. Cet anticorps monoclonal ne permet pas de d¨¦tecter le r¨¦cepteur par Western Blott, mais est capable de l¡¯immunopr¨¦cipiter. <p><p>Dans un second temps, nous avons abord¨¦ l¡¯¨¦tude de la phosphorylation, de l¡¯internalisation et du trafficking du r¨¦cepteur VPAC1 humain.<p> / Doctorat en sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le canal Kv11.1, dont l’inhibition occasionne une prolongation de l’intervalle QT, est directement impliqué dans des cas d’effets secondaires cardiotoxiques. Depuis 2006, Santé Canada exige que les nouvelles molécules et leurs métabolites soient évalués en phase préclinique pour le risque d’allongement de l’intervalle QT. La méthode de référence évalue l’électrophysiologie des cardiomyocytes en culture lors d’une courte exposition au médicament (<30min). Bien que cette méthode soit la plus fiable actuellement, elle permet seulement d’identifier les molécules qui bloquent directement le passage des ions dans le pore du canal (effet aigu). La méthode HERG-BRET vise à identifier les molécules susceptibles d’interagir avec le canal Kv11.1 par le moyen d’une altération du trafic vésiculaire (effet chronique). Ce type d’interaction est considéré comme un biomarqueur de la capacité à bloquer l’activité de ce canal. L’étude présentée tente de déterminer si un test de localisation cellulaire de hERG basé sur le BRET permettra un criblage à haut débit et une meilleure évaluation de l’affinité d’interaction avec hERG, comparativement aux méthodes alternatives actuelles. Dans le modèle HERG-BRET, la protéine hERG fusionnée à la luciférase de renilla (donneur d’énergie) est exprimée dans une lignée cellulaire HEK293. Cette même lignée exprime également une protéine verte fluorescente modifiée (accepteur d’énergie) qui est ancrée à la membrane plasmique. L’échange d’énergie entre le donneur et l’accepteur est un indice de la localisation de hERG à la membrane plasmique. Les fluctuations de ratio BRET suite à une exposition de 16h à un composé pharmaceutique reflètent donc l’effet du composé sur la translocation de Kv11.1. Vingt-cinq composés pharmaceutiques déjà caractérisés dans la littérature scientifique ont été testés : 12 ont été classés comme chaperons pharmacologiques, 4 comme inhibiteurs du trafic, 1 comme inhibiteur ayant les deux effets mentionnés et 8 n’ont pas pu être classés. Le comportement du biosenseur à l’égard des composés testés suggère que la méthode HERG-BRET ne peut pas être utilisée seule pour évaluer le risque cardiotoxique des médicaments. Toutefois, elle peut fournir des informations complémentaires pertinentes quand à la nature de l’interaction entre un composé pharmaceutique et la sous unité hERG du canal Kv11.1. / The Kv11.1 channel is directly involved in cardiotoxic adverse effects since its inhibition is responsible for a prolongation of the QT interval. In 2006, Health Canada established a guideline that constrains drug developers to a preclinical evaluation of QT prolongation risks for new molecules and their metabolites. The gold standard method (patch-clamp) consists in electrophysiology measurements on cultured cardiomyocytes for a brief exposition to the tested compound (<30min). Even though this method is the most reliable, it only allows the identification of molecules that inhibit the channel by preventing ions from traveling through the pore (acute effect). The HERG-BRET method aims to identify molecules that can interact with Kv11.1 and alter its vesicular transport as a proxy for inhibiting the activity of the channel (chronic effects). This study attemps to determine if a BRET-based cellular localization assay will allow a high throughput screening and a better evaluation of the affinity of pharmaceuticals compounds with hERG, in comparison to alternative methods. In the HERG-BRET model, a fusion protein generated with the gene sequence for hERG and the one for the renilla luciferase (energy donor) is stably expressed in a HEK 293 cell line. The same cell line also stably expresses a green fluorescent protein (energy acceptor) that is anchored at the plasma membrane. The energy transfer that occurs between the donor and the acceptor suggests that hERG is located at the membrane. Variations of BRET ratios following a 16 hours inucabtion with a compound reflects the compound’s effects on Kv11.1’s translocation. Twenty-five compounds that have been previously characterized in the literature were tested: 12 were categorized as pharmacological chaperones, 4 as traffic inhibitors, 1 as an inhibitor that undergoes both effects and 8 remain uncategorized. The biosensor’s behavior towards the tested compounds suggests that the HERG-BRET method cannot be used alone to assess cardiotoxic liability, but it can bring interesting facts to our attention regarding the nature of the interaction between the hERG subunits of Kv11.1 and a tested compound.

Les transporteurs membranaires sont des éléments importants dans le devenir, l’efficacité, et la toxicité du médicament. Ils influencent la pharmacocinétique et la pharmacodynamie de ces derniers. Plusieurs interactions médicamenteuses observées cliniquement sont attribuables à la fois aux enzymes responsables du métabolisme des médicaments et aux transporteurs membranaires. Il est connu qu’une variabilité existe entre différents individus dans la réponse à un médicament et les polymorphismes génétiques retrouvés dans les gènes codant pour les transporteurs membranaires peuvent partiellement expliquer cette variabilité. OATP1A2 est un transporteur membranaire exprimé sur des organes importants, comme le cerveau et le rein. Plusieurs médicaments utilisés en clinique sont des substrats d’OATP1A2 et l’expression localisée de ce transporteur suggère un rôle important dans le devenir du médicament. Donc, mon projet de doctorat consistait à caractériser l’activité d’OATP1A2 en relation avec ses substrats et inhibiteurs, et de plus, à évaluer l’impact de différents variants génétiques d’OATP1A2 sur leur transport. Dans le premier article, la rosuvastatine a été utilisée comme substrat-type pour étudier le transport d’OATP1A2. Les expériences ont été menées en introduisant la rosuvastatine en compétition avec différent β-bloqueurs, une classe de médicaments rapportée dans la littérature comme substrats d’OATP1A2. Parmi les β-bloqueurs évalués, le carvédilol était l’inhibiteur le plus puissant. Dans la deuxième partie de l’étude, des médicaments ayant une structure similaire au carvédilol, tels que les antidépresseurs tricycliques, ont été évalués quant à leur potentiel d’inhibition sur OATP1A2. Une relation structure-activité a été définie à l’aide de ces données. Nous avons démontré que des composés tricycliques avec une courte chaîne aliphatique pouvaient inhiber OATP1A2. Dans le deuxième article, OATP1A2 a été étudié en considérant son expression et son rôle au sein de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Des études précédentes ont démontré qu’OATP1A2 est exprimé sur la membrane luminale des cellules endothéliales formant la BHE. Nos données démontrent que les triptans, une classe de médicaments couramment utilisées pour traiter la crise migraineuse, sont des substrats d’OATP1A2 et que les composés tricycliques identifiés comme inhibiteurs d’OATP1A2 dans nos études précédentes peuvent inhiber le transport des triptans par OATP1A2. Ces résultats sont importants puisque: 1) il a été suggéré que les triptans peuvent agir au niveau du système nerveux central en se liant aux récepteurs trouvés sur les neurones centraux; 2) comme les triptans sont des molécules hydrophiles, un mécanisme de transport facilité est nécessaire pour qu’ils pénètrent la BHE et OATP1A2 pourrait être l’élément clé; 3) l’inhibition d’OATP1A2 par les composés tricycliques pourrait limiter l’accès des triptans à leur site d’action. Le troisième article caractérise l’activité associée à deux variants génétiques d’OATP1A2 (OATP1A2*2 et *3). Leur capacité à transporter les triptans et leur potentiel d’inhibition par les médicaments tricycliques ont été évalués. Des résultats supplémentaires caractérisant OATP1A2, mais sans liens directs avec les trois articles, seront présentés en annexe. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans cette thèse servent à caractériser le transporteur membranaire OATP1A2 en relation avec ses substrats et inhibiteurs, et en fonction de ses variants génétiques. / Drug transporters are important determinants in drug disposition, efficacy, and toxicity. They influence the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs. Several clinically-observed drug-drug interactions are mediated through drug metabolizing enzymes and drug transporters. It is well known that there is an interindividual variability in the response to medications and polymorphisms found in genes encoding for drug transporters partially account for it. OATP1A2 is a membrane drug transporter expressed on important organs, such as the brain and the kidney. A wide spectrum of drugs used in the clinic are substrates of OATP1A2. Its localisation suggests an essential role in drug disposition. Thus, my PhD project consisted of characterizing the activity of OATP1A2 in regards to its substrates, inhibitors, and different protein variants due to genetic polymorphisms. In the first article, rosuvastatin was used as the probe substrate to study OATP1A2 transport activity. Experiments were conducted by putting rosuvastatin in competition with different β-blockers, a class of drugs known in the literature to be transported by OATP1A2. One of the drugs evaluated, carvedilol, inhibited OATP1A2 with much more potency than the others. In the second part of the study, drugs with a structure similar to carvedilol, such as tricyclic antidepressants, were tested for their potential to inhibit OATP1A2. A structure-activity relationship was defined using the data. It was demonstrated that drugs composed of a tricyclic ring with a short aliphatic amine chain were potent OATP1A2 inhibitors. In the second article presented, OATP1A2 was studied in the context of its localization at the blood-brain barrier (BBB). OATP1A2 expression at the luminal membrane of the endothelial cells making up the BBB was demonstrated in the literature. Our article showed that triptans, a class of commonly used anti-migraine drugs, were OATP1A2 substrates. The tricyclic drugs previously evaluated were shown to potently inhibit triptan transport through OATP1A2. These findings are important for three reasons: 1) it has been postulated that triptans may act at the central nervous system by binding to receptors found on central neurons; 2) as triptans are hydrophilic molecules, a facilitated transport mechanism is required for them to penetrate the BBB and OATP1A2 may be the key player; and 3) the inhibition of OATP1A2 by the tricyclic drugs may limit the entrance of triptans to their site of action. The third article characterized the transport activity of two OATP1A2 protein variants (OATP1A2*2 and *3). Their capacities to transport triptans and their potential of being inhibited by tricyclic drugs were evaluated. Additional data characterizing OATP1A2 but considered out of the scope of the three articles will be presented in appendices. In overall, the central theme of this thesis looks into the characterization of the OATP1A2 membrane drug transporter in regards to its substrates, inhibitors, and proteins variants.

La mise en évidence du caractère actif de la phase de la résolution de l'inflammation a ouvert la porte à de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour les maladies inflammatoires. Des paradigmes qui reposent sur l’utilisation de médiateurs actifs ayant le potentiel de promouvoir la résolution de l’inflammation. En d’autres termes, ces médiateurs régulent la réaction inflammatoire, initient la réparation tissulaire et conduisent au retour de l’homéostasie. Parmi ces médiateurs, la résolvine D1 (RvD1) présente des propriétés anti-inflammatoires et prorésolutives remarquables et ce, dans divers fonctions et tissus de l’organisme. Bien que les effets de la RvD1 aient été bien caractérisés par de nombreuses recherches, son rôle potentiel au niveau ostéoarticulaire demeure peu documenté. Dans cette étude, nous approfondissons les connaissances sur l’effet de la RvD1 dans la protection et la préservation de l’intégrité ostéoarticulaire, en étudiant sa capacité à réguler les principaux facteurs impliqués dans la physiopathologie articulaire. Dans un premier temps, nous avons démontré que la RvD1 est bien présente dans l’environnement articulaire et que ses niveaux sont plus élevés dans le liquide synovial des genoux arthrosiques par rapport aux genoux sains. Ces genoux sont obtenus d’un modèle d’arthrose chez le chien réalisé lors d’une étude antérieure. Par la suite, nous avons étudié ses effets sur les composantes cellulaires de l’articulation. Sur les chondrocytes arthrosiques humains, nous avons démontré que la RvD1 inhibe l’expression des médiateurs inflammatoires et cataboliques induits par l'IL-1β, à savoir la COX-2, la PGE2, l’iNOS, le NO et la MMP-13. L’étude des voies de signalisation a ensuite révélé que la RvD1 s’oppose à l'activation de NF-κB / p65, p38 / MAPK et JNK1 / 2, induite par l’IL-1β. En plus de ces remarquables effets, la RvD1 confère une protection contre l’apoptose cellulaire et le stress oxydatif induits par le HNE, tel que démontré par l'inactivation des caspases, l'inhibition de la libération de la LDH, l’augmentation des taux de la Bcl-2 et de l’AKT, ainsi que la stimulation du GSH. À côté des chondrocytes, la RvD1 a montré des effets puissants sur les ostéoclastes. En effet, elle inhibe la différenciation et l'activation des ostéoclastes tel que démontré par l’inhibition de l’expression de TRAP et de la cathepsine K. Elle réduit l’expression de TNF-α, de l’IL-1β, de l’IFN-γ, de la PGE2 et de RANKL, induite par le LPS et augmente celle de l’IL- 10. De plus, elle protège contre la résorption de la matrice d’hydroxyapatite ainsi que l’érosion ii de la matrice osseuse ex vivo, induites par le RANKL et le M-CSF. Enfin, l’étude des propriétés de la RvD1 dans un modèle d’arthrite chez la souris a révélé qu’elle réduit le score clinique, l'inflammation de la patte et la destruction des os et des articulations. De surcroit, elle inhibe les médiateurs inflammatoires et diminue significativement les marqueurs sériques du remodelage osseux et cartilagineux. Nos résultats sont très prometteurs et confirment le potentiel de la RvD1 dans la résolution de l’inflammation et le maintien de l’intégrité articulaires. Ils mettent ainsi en évidence sa pertinence clinique en tant qu’agent actif dans la prise en charge thérapeutique des maladies ostéoarticulaires. / The recognition of the proactive character of the resolution phase of inflammation has revealed alternative therapeutic paradigms for inflammatory conditions, based on the use of active mediators capable of promoting the resolution of inflammation. In other words, these mediators regulate the inflammatory response, initiate tissue repair and promote the return to homeostasis. Among them, resolvin D1 (RvD1) has remarkable anti-inflammatory and proresolutive properties. Although the effects of RvD1 have been well studied, its potential role in the osteoarticular tissues remains poorly documented. In this study, we expand our understanding of the potential of RvD1 in protecting and preserving joint integrity by studying its ability to regulate the major factors involved in the articular pathophysiology. First, we demonstrated that RvD1 is produced in the articular environment and that its levels are higher in the synovial fluid of osteoarthritic knees compared to healthy knees. The knees were obtained from an osteoarthritic dog model performed in a previous study. Therefore, we studied RvD1 actions on the cellular components of the joint. In human osteoarthritic chondrocytes, we demonstrated that RvD1 inhibits IL-1β-induced inflammatory and catabolic mediators, namely COX-2, PGE2, iNOS, NO, and MMP-13. This led to the study of signaling pathways, which revealed that RvD1 counter-regulates IL-1β-induced activation of NF-κB / p65, p38 / MAPK and JNK1 / 2. In addition, RvD1 confers a protection against cellular apoptosis and oxidative stress induced by HNE, as revealed by caspases inactivation, LDH inhibition, as well as increased levels of Bcl-2, AKT, and GSH. In addition to chondrocytes, RvD1 showed remarkable effects on osteoclasts. Indeed, it inhibits osteoclast differentiation and activation, as demonstrated by the inhibition of TRAP and cathepsin K expression. Moreover, it reduces LPSinduced TNF-α, IL-1β, IFN-γ, PGE2 as well as RANKL and concurrently increases IL-10 expression. Furthermore, it inhibits RANKL and M-CSF-induced hydroxyapatite matrix degradation and bone matrix erosion, ex vivo. Finally, the study of the properties of RvD1 in a mouse model of arthritis, revealed that it alleviates the clinical score, paw inflammation, as well as bone and joint destruction. Furthermore, it reduces the inflammatory mediators and significantly decreases serum markers of bone and cartilage remodeling. Our results are very promising and confirm the high potential of RvD1 in resolving inflammation and preserving joint integrity. They highlight its clinical relevance as a therapeutic agent for the management of osteoarticular diseases.

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