Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4117.pdf: 5793236 bytes, checksum: 6e9e8b71aff655615342fa85bd1e3c3e (MD5) Previous issue date: 2012-12-09 / Universidade Federal de Minas Gerais / In this work were isolated eighteen secondary metabolites from Ruta graveolens (Rutaceae), eleven alkaloids (five akridonic, five quinolinics and one quinolonic) and seven furanocoumarins. Thirteen compounds had their herbicide potential evaluated in vitro and in vivo. The inhibitory activity of photosynthesis in vitro was determined by Hill reaction and the active compounds were classified as inhibitors of electron transport and the mechanisms of action were located in the photosystems (PSI and PSII). Studies of chlorophyll a fluorescence in leaf discs of S. oreaceae (semi in vivo) and in plants Lolium pereni (in vivo) confirm the electron transport results. The quantitative analysis parameters of fluorescence`s kinetics were measured and evaluated by energy flows absorbed by PSII antenna system, energy used for QA reduction, energy used for electron transport, and energy dissipation of flow as heat, fluorescence or transferred to other photosystems. In fluorescence in leaf disk, the Plabs parameter showed a decrease of 70% at concentration of 150μM, indicating a stress on the photosynthetic apparatus. Evaluating other parameters, were observed reductions in the PSI0, PHI(E0) and ET0/CS0 and ET0/RC of 40%, 40%, 60% and 40% at 150μM respectively, showing that at low concentrations the effect is intensified for the substance 2-nonyl-N-methyl-4- quinoline. Tests were performed by dry biomass, and the substance 4-methoxy- 7H-furo [3,2-g] chromene-7-one (bergapten) inhibited the growth of grass l. pereni in 20 and 23% at concentrations of 150 and 300μM, acting as postemergent herbicide. The isolated and evaluated compounds can be used as bioherbicides directly or as prototypes of new herbicides for weed control. / Neste trabalho, foram isolados dezoito metabólitos secundários da Ruta graveolens (Rutaceae), sendo onze alcalóides (cinco acridônicos, cinco quinolínicos e um quinolônico,) e sete furanocumarinas. Dessas substâncias, treze tiveram seu potencial herbicida avaliado in vitro, semi in vivo e in vivo. A atividade inibidora da fotossíntese in vitro foi determinada por meio da reação de Hill e os compostos ativos foram classificados como inibidores do transporte de elétrons e os mecanismos de ação foram localizados nos fotossistemas (PSI e PSII). Estudos de emissão da fluorescência da clorofila a em discos foliares de S. oreacea (semi in vivo) e em plantas da espécie Lolium pereni (in vivo) confirmaram os resultados de transporte de elétrons. As variáveis de análise quantitativa da cinética de emissão da fluorescência foram mensurados e avaliados por meio dos fluxos de energia absorvida pelo complexo antena do PSII, de energia utilizada para a redução da QA, de energia utilizada para o transporte de elétrons; e dissipação de energia de fluxo na forma de calor, fluorescência ou transferidos para outras moléculas. Na emissão de fluorescência em disco foliar, a variável PI(abs) apresentou uma diminuição de 70% em concentração de 150μM de 2-nonil-N-metil-4-quinolina, que indica um estresse no aparato fotossintético. Avaliando as outras variáveis de emissão de fluorecência, foram observadas reduções de PSI0, PHI(E0) e ET0/CS0 e ET0/RC de 40%, 40%, 60% e 40% em 150μM respectivamente, mostrando que em baixas concentrações os efeitos são intensificados para a substância 2-nonil-Nmetil- 4-quinolina. Foram realizados ensaios de biomassa seca utilizando uma estufa a 65º, e a substância 4-metoxi-7H-furo[3,2-g]cromen-7-ona, bergapteno, inibiu o crescimento da gramínea L.pereni em 20 e 23% nas concentrações de 150 e 300μM , respectivamente, atuando como herbicida pós-emergente.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4844.pdf: 14332150 bytes, checksum: b6b2c83d9815e4cee2df2458d7c3ddd0 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / Insects are the major competitors for food in relation to humans. Ants ("sauvas" and "quenquéns") are the major pests of several culture and in reforestation areas in Brazil represent more than 75% of the time and financial expenditure in the control of forest pests and obviously limit the full development of agriculture and forestry. The technology involved in the search for pesticides for the control of pests is in the frontiers of science, which involves different aspects of multidisciplinary and can contribute greatly to the agriculture advancement. One of these aspects is related to natural products, where new molecules isolated from plants can serve as prototypes for new insecticides. The aim of this study was the phytochemical study of Myracrodruon urundeuva in order to search for compounds with insecticidal activity and the synthesis of metal complexes of copper with molecules that present biological activity. The phytochemical study led to the isolation and structural identification/caracterization of 34 secondary metabolites, being seven unique and among them, are the dimeric chalcones, only identified in two species of Anacardiaceae. 31 compounds were synthesized: eight of them have the ligands obtained by Mannich reaction with 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone; eight complexes from these ligands; two iminic derived from the flavonoid naringine and naringenine; two complex from these ligands; four complexes of the type Cu(FLAV)2 and seven complexes of the type Cu(X)(FLAV) where X is 2,2´-Bipyridine our 1,10´- Phenanthroline. The extracts of M. urundeuva, isolated compounds and metal complexes were tested in nests of Atta sexdens rubropilosa (test of toxicity by ingestion), enzyme inhibition in AChE and fungicide test in ants symbiotic fungus (Leucoagaricus gongylophorus) withsignificative results. / Os insetos são os grandes competidores por alimento em relação ao ser humano. As formigas cortadeiras (saúvas e quenquéns) constituem as principais pragas de diversas culturas e nas áreas de reflorestamento brasileiro representam mais de 75% dos custos do tempo e dispêndio financeiro no controle das mesmas e, obviamente, limitam o pleno desenvolvimento agrícola e florestal. A tecnologia envolvida na busca de agrotóxicos visando o controle de pragas representa uma das fronteiras da ciência, a qual envolve diferentes aspectos multidisciplinares e pode contribuir muito para o avanço da agricultura. Um desses aspectos diz respeito aos produtos naturais, onde novas moléculas isoladas de plantas podem servir de modelos para novos protótipos inseticidas. Este trabalho teve como objetivo o estudo fitoquímico de Myracrodruon urundeuva em busca de substâncias com atividade inseticida e a síntese de complexos metálicos de cobre com moléculas com conhecida atividade. O estudo fitoquímico propiciou o isolamento e a identificação/caracterização estrutural de 34 metabólitos secundários, sendo sete inéditas e dentre os compostos isolados destacam-se as chalconas diméricas, isoladas apenas em duas espécies de Anacardiaceas. Foram sintetizadas 31 substâncias: oito delas tendo os ligantes obtidos via reação de Mannich com a 2- hidroxi-1,4-naftoquinona; oito complexos a partir desses ligantes; dois derivados imínicos a partir do flavonóide naringina e naringenina; dois complexos a partir desses ligantes; quatro complexos do tipo Cu(FLAV)2 a partir de flavonóides e sete complexos do tipo Cu(X)(FLAV) onde X é 2,2´- Bipiridina ou 1,10´- Fenantrolina. Extratos da espécie vegetal, substâncias isoladas e os complexos metálicos foram testados em ninhos de Atta sexdens rubropilosa (teste de toxicidade por ingestão); em inibição enzimática da AChE e teste fungicida no fungo mutualista de A. sexdens rubropilosa (Leucoagaricus gongylophorus) com resultados significativos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2013-04-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Leaf-cutting ants are known by their strong power of to pulling down several vegetable crops and to cause economic lost to the agriculture. Several methods have been used for their control such as the use of halogenated, sulfurous and phosphorus compounds. However, the continued use of these compounds leads to problems such as environmental contamination and then raising the needed of new strategies to control of leaf-cutting ants. In this context, this work presents a phytochemical study of the species Schinus terebinthifolius, Anacardium humile e Macairea urundeuva and the insecticide and fungicide potential of the crude extracts, fractions and isolated compounds against the leaf-cutting ants, Atta sexdens rubropilosa, and its symbiotic fungus, Leucoagaricus gongylophorus. The study of these species allowed the isolation and/or identification of several secondary metabolites including triterpens, steroids, flavonoids, biflavonoids, glycosylated flavonoids and phenolic compounds. For both species A. humile and M. urundeuva this is the first report of their chemical composition. From the biological assays with leaf-cutting ants, it was found that several extracts showed insecticidal activity as a result of the synergistic effect of their chemical composition. The elagic acid isolated from M. urundeuva showed activity against the symbiotic fungus of leaf-cutting ants. The metal complexes of flavonoid quercetin didn`t present good results on biological assays against the workers of leaf-cutting ants and its symbiotic fungus. Besides these results, this study contributed to a project that has been developed by the Natural Product Laboratory at UFSCar, which aims to evaluated the biological activity of several metal complexes with different metals and flavonoids to the control of several agriculture pests. / As formigas cortadeiras são conhecidas pelo poder de destruição de um grande número de espécies vegetais e pelo prejuízo econômico causado à agricultura. Vários métodos têm sido utilizados para o controle dos mesmos, tais como, a utilização de substâncias orgânicas halogenadas, sulfuradas e fosforadas. No entanto, a utilização contínua desses compostos tem gerado vários problemas de contaminações ambientais, sendo de extrema importância, a busca de novas estratégias de controle das formigas cortadeiras. Nesse contexto, esse trabalho apresenta o estudo fitoquímico das espécies Schinus terebinthifolius, Anacardium humile e Macairea urundeuva e avaliação do potencial inseticida e fungicida dos extratos, frações e compostos obtidos frente às formigas cortadeiras da espécie Atta sexdens rubropilosa e seu fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus. O estudo fitoquímico destas espécies proporcionou o isolamento e identificação de diversos metabólitos secundários, dentre eles, triterpenos, esteroides, flavonoides, biflavonoides, flavonoides glicosilados e compostos fenólicos. Para as espécies A. humile e M. urundeuva, este é o primeiro relato de suas composições químicas. A partir dos ensaios biológicos realizados com as operárias de Atta, verificou-se que vários extratos provocaram aumento na mortalidade quando comparados ao controle (dieta pura) de acordo com o teste de log-rank (p<0,05), assim, sugere-se que o potencial tóxico apresentado pelos mesmos estejam correlacionados ao efeito sinergístico. O ácido elágico e epicatequina isolados de M. urundeuva foram ativos sobre o crescimento do fungo simbionte. Os complexos metálicos com o flavonoide quercetina apresentarem resultados significativos sobre os ensaios de toxicidade por ingestão em Atta sexdens rubropilosa e seu fungo simbionte. Este trabalho contribui com um amplo projeto que vem sendo desenvolvido pelo grupo de Produtos Naturais da UFSCar, que visa avaliar a atividade inseticida e fungicida de diversos complexos de coordenação com diferentes metais e flavonoides no controle de diversas pragas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseWCR.pdf: 10434375 bytes, checksum: 36e8a9c56cf09c072ce4bfecfeb78389 (MD5) Previous issue date: 2004-08-12 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work was the search for antiparasitic and insecticide compounds in active extracts from the following amazon plants: A. fusciflorus (Rutaceae), T pallida e T. rubra (Meliaceae). The selected biological models were: 1) antiparasitic activity against the forms tripomastigota of T. cruzi, inhibition of the activity of gGAPDH of T. cruzi, inhibition of the activity of APRT of L. tarentolae and 2) insecticidal activity - against Spodoptera frugiperda and Atta sexdens a leafcutter ant. All the extracts were bioasseyed and liquid-liquid partition was carried out. From this each partition they were obtained five fractions that were obtained from each extract and these were assayed as well. The fractions were selected by two criteria: the) evaluation of the biological activity of the fractions in relation to your respective extracts and chemical profile of each fraction. Through successive fractioning it was possible to isolate and identify series of different compounds such as: dihydrocinnamic acid derivatives, coumarins, alkaloids, triterpenoids and steroids (some of them are described for the first time), limonoids and flavonoids. The identification of the compounds was carried out through different kind of NMR technique and comparison with data from the literature. The search for compounds with inhibitory activity on the enzyme APRT led to the furanoquinoline alkaloids. The results obtained for inhibitory effect of the enzyme gGAPDH of T. cruzi are promising compounds. Some of the isolated compounds showed interesting activity against trypomastigote forms of T. cruzi. The results obtained for inhibitory effect of the enzyme gGAPDH of T. cruzi are promising compounds. Some of the isolated compounds showed interesting activity against trypomastigote forms of T. cruzi. In the search for insecticidal compounds against S. frugiperda it was evaluated the activity of limonoids, cicloartane triterpenes, steroids, flavonoids, cumarins and alkaloids. Special attention was driven to the incorporation of skiamminine and the estimate DL50. In the bioassay carried out to A. sexdens it was observed the toxicity of some extracts, mainly the methanol extract of leaves from A. fusciflorus. It was also observed that some compounds exhibited antimicrobial activity on symbiotic fungi of A. sexdens and for some pathogenic bacteria. In conclusion, in this work it was possible to isolate and identify active compounds in all proposed biological models. / Este trabalho teve como principal objetivo buscar metabólitos secundários com atividade antiparasitária e ou inseticida em A. fusciflorus (Rutaceae), T. pallida e T. rubra (Meliaceae). Os modelos biológicos selecionados foram: 1) Atividade antiparasitária - à forma tripomastigota de T. cruzi, inibição da atividade de gGAPDH de T. cruzi, inibição da atividade de APRT de L. tarentolae e 2) Atividade inseticida - ensaio frente a Spodoptera frugiperda e Atta sexdens uma formiga cortadeira de folhas. Todos os extratos foram bioensaiados e fracionados através de partição líquido-líquido. De cada partição foram obtidas cinco frações que também foram submetidas aos ensaios biológicos. As frações foram selecionadas por dois critérios: a) avaliação dos efeitos biológicos das frações em relação aos seus respectivos extratos e b) perfil químico da fração. Através de fracionamentos sucessivos foi possível isolar e ou identificar várias substâncias de diferentes classes químicas: derivados do ácido diidrocinâmico, cumarinas, alcalóides, triterpenos, esteróides (alguns com estruturas inéditas), limonóides e flavonóides. A identificação estrutural das substâncias se deu através de diferentes técnicas de RMN e comparação com os dados publicados na literatura. Assim, na busca por substância com atividade inibitória da atividade da enzima APRT foi apresentava o efeito de alcalóides; a inibição da atividade da enzima gGAPDH de T. cruzi principalmente causada pelos flavonóides e furanocumarinas e a atividade de algumas substâncias frente as formas tripomastigotas de T. cruzi. Na busca por substâncias inseticidas para S. frugiperda pode-se destacar a atividade de limonóides, triterpenos cicloartanos, esteróides colestanos, flavonóides, cumarinas e alcalóides quando incorporados a dieta artificial dando enfoque à atividade inseticida de esquimianina e à estimativa da sua DL50. Nos ensaios realizados por ingestão com operárias de A. sexdens foi observado a toxicidade de alguns extratos, principalmente o extrato em metanol das folhas de A. fusciflorus e de um triterpenos cicloartano isolado deste extrato que também teve sua atividade avaliada. Foi observado ainda, que algumas substâncias isoladas causaram efeito deletério sobre o fungo simbionte da formiga cortadeira e para algumas bactérias. Assim, ao fim deste trabalho, foram obtidas substâncias ativas frente a todos os modelos biológicos inicialmente propostos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The project "Metabolic, enzymatic and genetic studies of the endophytic fungus P. brasilianum" resulted in biosynthetic studies of bisphenylpropanoid amides, the brasilimides, confirming the origin of these substances via phenylpropanoid biosynthesis pathway, very unusual in fungi. PAL activity, the first enzyme involved in this biosynthetic route was successfully evaluated and the conditions of PAL production by P. brasilianum were optimized (culture medium and induction of PAL adding Phe to the culture), and the incubation conditions of the enzymatic reaction. The specificity of the PAL enzyme was studied, and the enzyme showed activity toward all substrates tested, including acting as TAL (tyrosine ammonia lyase). In vivo studies throught the addition of different substrates lead to N-acetylation confirmed by spectroscopy data. The genome of the fungus P. brasilianum was sequenced, and extensive studies through bioinformatics lead to the gene encoding PAL enzyme. From molecular biology studies, the enzyme was cloned and expressed as recombinant PAL fused to a SUMO protein and a his-tag at the N- terminus of the protein in pETSUMO vector expressed in E. coli BL21 (DE3) to obtain the best conditions for enzyme overexpression in its soluble form. The purification process of the recombinant enzyme was studied from a single purification step (affinity chromatography) by pH gradient elution, obtaining a high degree of purity confirmed by one-dimensional electrophoresis. The pure recombinant PAL enzyme obtained was characterized by MS and biochemically yielding Km values of 4,8 mM. Recent studies seem to point out that there is a relationship between the production of brasiliamides when the fungus is subjected to stress conditions. The PAL enzyme appears to be involved in defense mechanisms in this fungus, as has been described for plants. / O projeto "Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico P. brasilianum" tratou de investigações biossintéticas das amidas bisfenilpropanoídicas, as brasiliamidas, confirmando a origem fenilpropanoídica destas substâncias, muito incomum em fungos. A atividade da enzima Fenilalanina amônia-liase, primeira da rota biossintética, foi avaliada pela primeira vez no fungo em estudo, e as condições da produção de PAL por P. brasilianum foram otimizadas (meio de cultivo e indução ao adicionar fenilalanina ao cultivo), assim como as condições de incubação da reação enzimática. A especificidade da enzima foi determinada a qual se apresentou altamente promíscua em todos os substratos testados, inclusive atuando como TAL (tirosina amônia-liase). In vivo, a adição de diferentes precursores ao meio de cultivo levou a N-acetilação destes confirmado por dados espectroscópicos. O genoma do fungo P. brasilianum foi sequenciado, e através de extensos estudos de bioinformática pode-se determinar o gene que codifica a enzima PAL. A partir de estudos de biologia molecular foi possível clonar e expressar a enzima PAL recombinante fusionada a uma proteína SUMO e uma cauda polihis no N-terminal da proteína em vetor pETSUMO expresso em E. coli BL21(DE3) obtendo-se, dessa maneira, as melhores condições para superexpressão enzimática na forma solúvel. O processo de purificação da enzima recombinante foi estudado a partir de um único passo de purificação (coluna de afinidade) por gradiente de pH, obtendo alto grau de pureza comprovado através de eletroforese monodimensional. A enzima PAL recombinante pura obtida foi caracterizada por MS e bioquimicamente obtendose valores de Km de 4,8 mM. Estudos parecem deixar claro que exista uma relação entre a produção de brasiliamida A quando o fungo é submetido a situações de estresse, seguindo mesmo comportamento relatado em plantas e, portanto, a enzima PAL parece estar envolvida em mecanismos de defesa neste fungo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-10-23 / Universidade Federal de Sao Carlos / Spodoptera frugiperda is a major pest of maize and its damage may lead to reduction of agricultural production. The use of synthetic insecticides has been the primary method of pest control, but their indiscriminate use has has altered the selection of populations, as well as damage to human health and environment.Thus, the study of insecticidal plants as a promising tool to control of pest insects have been stimulated. Good results were obtained previously with extracts of T. pallida, T. pallens and To. ciliata on larvae of S. frugiperda, but there are no studies related to metabolization by the insect of natural substances derived from these species. Therefore the goals of this study were to isolate and identify secondary metabolites of T. pallida, T. pallens and To. ciliata to assay them, and to understand how these compounds are metabolized by caterpillars at different larval stages. The phytochemical study provided isolation and identification of steroids sitosterol, stigmasterol and campesterol, triterpenes dammaradienol and 30-normetilenocicloartan- 3&#946;-ol, limonoids cedrelone and 23-hidrooxicedrelone, coumarins siderin, scopoletin and 4-methoxy-5- methylcoumarin, flavonoids catechin, epicatechin and gallocatechin, indole-3-carbaldehyde, protocatechuic acid, inosil 5'- nucleoside and a purine adenine. Insecticides tests of ingestion against S. frugiperda were performed with crude extracts, fractions and pure substances. The best results were obtained from two species of Trichilia, where the branches fraction of T. pallens led to 100% larval mortality. Chemical studies of the metabolism of the insect was developed with the limonoid cedrelone, which was highly active. Thus, in order to understand how insects metabolize this active principle, some strategies were used to detect cedrelone in S. frugiperda larvae feeded with artificial diet containing this limonoid. The study of 1st instar larvae by Nuclear Magnetic Resonance (600 MHz) identified cedrelone intact in these extracts. The analysis of the extracts of the faeces of the fifth instar S. frugiperda feeded at 5 and 24 hours with diet enriched in cedrelone by Mass Spectrometry (LTQ-Orbitrap Velos), demonstrated that the metabolization pathway of cedrelone takes a longer time to be activated, because in 5 hours the limonoid was almost totally excreted intact in the faeces. In 24 hours, the insect metabolized a high amount of cedrelone, the metabolic products were released in faeces and a small amount of intact cedrelone, observing values below 500 ng when it was quantified. In metabolic activity assays of the insect, we observed an increase in relative metabolic rate and metabolic cost after ingestion of the active ingredient, which may be related to the attempted detoxification of the compound by the insect. The study of the microbiota associated with S. frugiperda by MALDITOF/ MS enabled the secure identification of micro-organisms isolated from treatments cedrelone and control at genus Enterococcus, and the specie E. mundtii was identified for all treatments. These micro-organisms seems to be associated with metabolism of cedrelone by the insect. Furthermore in this work it were carried out tests of inhibition of acetylcholinesterase enzyme in screening mode searching for potential candidates for natural insecticides, with the best results observed for cedrelone. / Spodoptera frugiperda (Lepidoptera:Noctuidae) é uma das principais pragas da cultura do milho podendo seu dano levar à redução na produção agrícola. A utilização de inseticidas sintéticos tem sido o principal método de controle para o inseto, porém, seu uso indiscriminado tem alterado a seleção de populações, além dos prejuízos à saúde humana e ao meio ambiente. Desta forma, o estudo de plantas inseticidas como ferramenta promissora no controle de insetos pragas vem sendo estimulado. Bons resultados foram conseguidos anteriormente com extratos de T. pallens, T. pallida e To. ciliata sobre as larvas de S. frugiperda, porém não há estudos relacionados à metabolização pelo inseto das substâncias naturais provenientes destas espécies. Assim, os objetivos deste trabalho foram: isolar e identificar metabólitos secundários de T. pallida, T. pallens e To. ciliata para ensaiá-los e simultaneamente entender como são metabolizados pelas lagartas em diferentes estádios larvais. O estudo fitoquímico proporcionou o isolamento e identificação de esteroides sitosterol, estigmasterol e campesterol, os triterpenos damaradienol e 30-nor-metilenocicloartan-3&#946;-ol, limonoides cedrelona e 23-hidrooxicedrelonelídeo, cumarinas siderina, escopoletina e 4-metóxi-5-metilcumarina, flavonoides catequina, epicatequina e galocatequina, 3- indol-carbaldeído, ácido protocatecuico, um nucleosídeo 5'-inosil e uma purina adenina. Os ensaios inseticidas por ingestão frente à S. frugiperda foram realizados com os extratos brutos, frações e substâncias puras e os melhores resultados foram provenientes das duas espécies de Trichilia, onde a fração dos ramos de T. pallens levou a 100% de mortalidade larval. O estudo químico da metabolização do inseto foi desenvolvido com o limonoide cedrelona, o qual se mostrou altamente ativo e promissor. Com isso, no intuito de buscar entender como o inseto metaboliza este princípio ativo algumas estratégias foram utilizadas para detectar cedrelona em larvas de S. frugiperda alimentadas com dieta artificial contendo este limonoide. O estudo das lagartas de 1º instar via Ressonância Magnética Nuclear (600 MHz) permitiu detectar cedrelona intacta nos extratos. As análises dos extratos das fezes de S. frugiperda no quinto instar alimentadas por 5 e 24 horas com dieta enriquecida em cedrelona via Espectometria de Massas (LTQ-Orbitrap Velos), demonstraram que a via de metabolização da cedrelona leva um tempo maior para ser ativada, pois em 5 horas o limonoide foi excretado praticamente todo intacto nas fezes. Em 24 horas, o inseto metabolizou grande parte da cedrelona, sendo liberados nas fezes os produtos do metabolismo e uma pequena quantidade de cedrelona intacta, verificando valores abaixo de 500 ng quando foram quantificados. Na análise da atividade metabólica do inseto, observou-se aumento na taxa metabólica relativa e do custo metabólico após a ingestão do princípio ativo, o qual pode estar relacionado à tentativa de detoxificação do composto pelo inseto. O estudo da microbiota associada à S. frugiperda via MALDI-TOF/MS possibilitou a identificação segura dos micro-organismos isolados dos tratamentos com cedrelona e controle em nível de gênero Enterococcus, sendo a espécie E. mundtii identificada para todos os tratamentos. Esses micro-organismos podem estar associados na metabolização de cedrelona pelo inseto. Ainda neste trabalho foram realizados testes de inibição da enzima acetilcolinesterase na forma de screening para possíveis candidatos a inseticidas naturais, sendo o melhor resultado observado para a cedrelona.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6532.pdf: 4134216 bytes, checksum: 66fda1fc89e3d69ae6b01c3cbca83d4e (MD5) Previous issue date: 2015-02-06 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsin D is an aspartyl endopeptidase involved in many pathological processes when overexpressed. In addition, it is responsible for degradation of hemoglobin ingested by parasites of schistosomiasis. For these reasons cathepsin D is considered an important target for chemotherapeutic intervention. The assays commonly performed to evaluate the inhibition of this enzyme monitor reaction products generated from the cleavage of fluorogenic peptide substrates or human hemoglobin in the presence of inhibitors that may exhibit autofluorescence/absorbance at the same wavelength used. Considering this problem, this paper presents the development and application of four methodologies for cathepsin D assays. In two methodologies the assays were performed in solution, and in one of them was used isolated bovine cathepsin D, and the other employed an extract of proteins taken from Schistosoma mansoni adult worms. A third assay was developed to evaluate inhibitors by means of a CatD-IMER bioreactor coupled to a multidimensional system in which it is possible to monitor the immobilized enzyme activity directly by quantifying the product formed. Finally, the last methodology was carried out by immobilizing the substrate human hemoglobin in the quartz crystal. The hydrolysis of hemoglobin by cathepsin D was evaluated by using a Quartz Crystal Microbalance technique, a method that monitor the enzyme activity by mass variations. For the enzymatic assays, twenty plant extracts were evaluated, which led to the isolation and identification of the alkaloid evolitrine, the compound 4-hydroxy-3- methoxycinnamaldehyde and the flavonoids orientin and isovitexina. It were also tested 31 pure compounds, among them, the substance (Z)-2-(pentadec-5- enyl)benzene-1,4-diol, which showed significant activity both against the isolated enzyme as the protein extract of S. mansoni. Finally, recombinant cathepsin D from S. mansoni was cloned and expressed using E. coli system, and in vitro studies of isolated natural product compounds showed excellent results regarding the limonoid cedrelona against somules and adult worms of S. mansoni. / A catepsina D é uma aspartil endopeptidase envolvida em muitos processos patológicos quando expressa de forma desregulada. Além disso, é responsável pela degradação da hemoglobina ingerida por parasitos causadores da esquistossomose. Por esses motivos a catepsina D é considerada um alvo importante na busca de inibidores. Os ensaios comumente realizados para avaliação da inibição dessa enzima monitoram produtos reacionais gerados a partir da clivagem de substratos peptídicos fluorogênicos ou a hemoglobina humana, na presença de inibidores, que podem apresentar autofluorescência/absorbância nos mesmos comprimentos de onda utilizados. Considerando esta problemática, este trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de quatro metodologias para a realização de ensaios com a catepsina D. Em duas metodologias os ensaios são realizados em solução, sendo que, em uma delas utiliza-se a catepsina D bovina isolada, e na outra se emprega um extrato de proteínas retirado de vermes adultos de Schistosoma mansoni. Um terceiro ensaio foi desenvolvido para estudo de inibidores por meio do biorreator CatD-IMER acoplado a um sistema multidimensional no qual é possível monitorar a atividade da enzima imobilizada diretamente por meio da quantificação do produto formado. Por fim, a última metodologia foi desenvolvida imobilizando-se o substrato hemoglobina humana em cristal de quartzo. Sua hidrólise pela catepsina D foi avaliada por meio do uso da técnica de Microbalança de Cristal de Quartzo, uma metodologia que monitora a atividade enzimática através de variações de massa. Nos ensaios enzimáticos foram avaliados 20 extratos de plantas, que levaram ao isolamento e identificação do alcaloide evolitrina, do composto 4-hidroxi-3-metoxicinamaldeído e dos flavonoides orientina e isovitexina. 31 compostos puros também foram ensaiados e, dentre estes, a substância (Z)-2-(pentadec-5-enil)benzeno-1,4-diol se destacou apresentando uma atividade expressiva tanto frente à enzima isolada quanto em relação ao extrato de proteínas de S. mansoni. Para finalizar, a catepsina D recombinante de S. mansoni foi clonada e expressa em sistema E. coli, e ensaios in vitro com compostos isolados de produtos naturais mostraram excelentes resultados em relação ao limonoide cedrelona frente à esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6648.pdf: 4219788 bytes, checksum: 80aac49ad1c6f625b5a97327943740ca (MD5) Previous issue date: 2015-03-26 / Universidade Federal de Sao Carlos / A primeira etapa deste trabalho de pesquisa envolveu uma triagem de extratos de plantas do cerrado paulista através de ensaios frente à arginase (ARG) de Leishmania amazonensis. Os resultados de inibição enzimática da ARG apresentados pelos extratos, levaram ao fracionamento biodirecionado dos extratos de acetato de etila (folhas e galhos) de Byrsonima coccolobifolia Kunth. (Malpighiaceae). Alguns compostos bioativos foram isolados (flavonóides, ácido galoilquínicos, uma lignana, uma fenatrenona e uma ortoquinona) o que indicou que estes compostos seriam os responsáveis pela diminuição da atividade enzimática da ARG observada nos extratos de B. coccolobifolia. Os flavonoides e os ácidos galoilquínicos apresentaram modo de inibição do tipo não-competitivo da ARG, com atividade inibitórias significativas (IC50 = 0,13 à 4,8 &#956;M) e com forte afinidade (valores de Ki variando entre 0,10 à 3,80 &#956;M). Os estudos de relação entrutura atividade (SAR) revelaram que o grupo catecol dos flavonóides, tanto como a unidade galoila das estruturas dos ácidos galoilquínicos, forneceram importantes características em relação as interações ARG inibidor. Na segunda parte deste trabalho, experimentos subsequentes foram realizados para investigar os produtos naturais frente a proteases, as quais possuem funções importantes na patogenicidade de virus e parasitas, tais como: as serino proteases NS2B-NS3 dos vírus da dengue serotipos 2 e 3 (dengue), a rodesaína de Trypanosoma brucei rhodesiense (tripanossomíase africana), a cruzaina de Trypanosoma cruzi (doença de chagas), a catepsina L de Leishmania mexicana (leishmaniose) e a falcipaina-2 de Plasmodium falciparum (malária). Através destes estudos foram descobertos alguns inibidores das proteases NS2B- NS3 dos vírus da dengue (tipo 2 e 3) e da catepsina L (r-CPB2.8) de L. mexicana. Os flavonóides agatisflavona, miricetina, e quercetina (Ki = 11,1; 4,7; e 20,7 &#956;M; respectivamente) mostraram inibição do tipo não-competitiva frente à NS2B-NS3. Também foram realizados, um experimento de termoforese em microescala (MST) (ensaio livre de substrato) e um estudo in silico, de forma a obter maiores informações sobre as interações biomoleculares envolvidas. Os metabólitos secundários, agatisflavona e ácido 3-oxo-urs-12-en- 28-óico, foram determinados serem inibidores do tipo não-competitivo parcial da catepsina L do tipo r-CPB2.8, e a tetrahidrorobustaflavona como um inibidor incompetitivo desta catepsina L (r-CPB2.8), com valores de Ki na faixa de micromolar (Ki = 0,14&#8722;1,26 &#956;M). / The early phase of this work involved a screening of plant extracts of São Paulo cerrado using assays with arginase (ARG) from Leishmania amazonensis. The results of enzymatic inhibition of ARG by the extracts led to the bioactivity-guided fractionation of the ethyl acetate extracts (leaves and stems) of Byrsonima coccolobifolia Kunth. (Malpighiaceae). Thereafter, several bioactive compounds were isolated (flavonoids, galloylquinic acids, a lignan, a phenathrenone and an orthoquinone) indicating that these compounds may are the responsible for the decrease in ARG activity observed in B. coccolobifolia extracts. The flavonoids and galloylquinic acids showed to be noncompetitive inhibitors of ARG with significant inhibitory activities (IC50 = 0.13 to 4.8 &#956;M) and strong affinity (Ki values ranging from 0.10 to 3.8 &#956;M). Additionally, structure activity relationship study (SAR) revealed that catechol group in flavonoids, likewise as galloyl unit in galloylquinic acids structures yielded important features for ARG inhibitor interactions. In the second part of this work, subsequent experiments were performed to investigate the natural products against proteases. These enzymes play pivotal roles in the pathogenicity of virus and parasites, such as: serine proteases NS2B-NS3 from dengue virus serotype 2 and 3 (dengue fever), rhodesain from Trypanosoma brucei rhodesiense (African trypanosomiasis), cruzain from Trypanosoma cruzi (chagas disease), cathepsin L from Leishmania mexicana (leishmaniasis), and falcipain-2 from Plasmodium falciparum (malaria). Through these studies were discovered inhibitors of NS2B-NS3 proteases of dengue virus and inhibitors of the L. mexicana cathepsin L-like r- CPB2.8.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseARPA.pdf: 8348697 bytes, checksum: 2d133cc93364ad78e1934fb8f60c7968 (MD5) Previous issue date: 2004-02-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work involved the bioassay-guided study of Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae), and Trichilia ramalhoi (Meliaceae). The bioassays were carried out with T. cruzi GAPDH and L. tarentolae APRT enzymes, and trypomastigote forms of T. cruzi as model assays. The results obtained with extracts and fractions showed that selected plants are promising source for the search of antiprotozoal compounds. Chemical investigation of active fractions (or extracts) allowed the isolation of 30 substances. Among them, 6 are described for the first time: an eudesmane sesquiterpene, pyranoflavones, a tetrahydrofuroquinoline alkaloid, an indolopyridoquinazoline alkaloid, an anthranilic acid derivative, and 1,5-diphenyl-1-pentanone; and 24 substances have already been described in the literature: &#946;-sitosterol and stigmasterol, sitostenone, &#946;-sitosteryl benzoate, lupeol, lupenone, flavone, 7-methoxyflavone, 5-hydroxyflavone, dictamine, kokusagine, skimmianine, &#948;-fagarine, isokokusagine, isoskimmianine, isodutaduprine, haplotusine, 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone, arborinine, scoparone, scopoletin, marmesine, paprazine, N-transferuloyltyramine, and siringic acid. Among these substances, furoquinolone alkaloids isokokusagine and isoskimmianine were actives on the inhibition of APRT enzyme; marmesine was active on GAPDH enzyme; and haplotusine and the 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone alkaloid showed significant trypanocidal activities. The biological results showed that a systematic investigation of active chemical classes is needed for determination of structure-activity relationship and obtaining more active substances, that could be used as targets for the development of new antichagasic and antileishmaniasis drugs. / Esse trabalho envolveu o estudo fitoquímico de Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae) e Trichilia ramalhoi (Meliaceae), biomonitorado através de três modelos biológicos: enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae; e ensaios in vitro nas formas tripomastigotas de T. cruzi. Os testes biológicos de extratos e frações mostraram que as plantas selecionadas são promissoras na procura de compostos antiparasitários. O estudo químico das frações (ou extratos) ativas permitiu o isolamento de 30 substâncias, sendo 6 inéditas: sesquiterpeno eudesmano, piranoflavonas, alcalóide tetraidrofuroquinolínico, alcalóide indolopiridoquinazolínico, derivado do ácido antranílico e 1,5-difenil-1-pentanona; e 24 já descritas na literatura: &#946;- sitosterol e estigmasterol, sitostenona, benzoato de &#946;-sitosterila, lupeol, lupenona, flavona, 7-etoxiflavona, 5-hidroxiflavona, dictamina, kokusagina, esquimianina, &#948;-fagarina, isokokusagina, isoesquimianina, isodutaduprina, haplotusina, alcalóide 2-fenil-1-metil-4-quinolona, arborinina, escoparona, escopoletina, marmesina, paprazina, N-trans-feruloitiramina e ácido siríngico. Dentre essas substâncias, os alcalóides furoquinolônicos isokokusagina e isoesquimianina mostraram ser inibidores potentes da enzima APRT; a cumarina marmesina ocasionou uma inibição considerável da atividade da enzima GAPDH; e os alcalóides haplotusina e 2-fenil-1-metil-4-quinolona, e o triterpeno lupeol apresentaram atividades tripanocidas significativas. Os resultados biológicos indicaram a necessidade de um estudo sistemático posterior das classes dos compostos ativos, para a determinação da relação estrutura-atividade e, desta forma, de substâncias mais ativas, que possam ser utilizadas como protótipos no desenvolvimento de novos quimioprofiláticos e/ou quimioterápicos para a doença de Chagas e leishmanioses.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPVA.pdf: 9142806 bytes, checksum: 948d3cc5bc8ab3c444a18bb8a31d7d51 (MD5) Previous issue date: 2006-08-04 / This work describes sixteen substances isolated by C. limonia: xanthyletin, seselin, xanthoxyletin, trans-kellactone, trans-decursidinol, junosmarin, scopoletin, isoscopoletin, demethylsuberosin, xanthoarnol, clausarin, limonianin, 5,4 - dihydroxy-6-(3 -methyl-2 -buthenyl)-2 ,2 -dimethylpyrano(5 ,6 -7,8)flavanone, &#946;- sitosterol, estigmasterol e campesterol. Three of them are especially important: 5,4 -dihydroxy-6-(3 -methyl-2 -buthenyl)-2 ,2 -dimethylpyrano(5 ,6 -7,8)flavanone that was unknown in the literacy, trans-kellactone and trans-decursidinol that weren t found previously in the Rutaceae family but at Apiaceae family. The chemical constituents isolated by the upper and low parts from the grafted plant (C. sinensis on C. limonia) and from ungrafted C. limonia were compared. It indicated that the grafted plant has a metabolic translocation process. The Minimum Inhibitory Concentration of many substances isolated from plants of Rutaceae family was related. The test was against the bacteria Xylella fastidiosa that causes Citrus Variegated Chlorosis. The successful classes the pyranocoumarins and flavones whose MIC was 1,0 mg/mL. We have studied the plant-insect interaction and discovered that the grafted plant (C. sinensis on C. limonia) undergoes chemical alteration of the volatile compounds and essential oils when it is in contact with the sharpshooter. The sharpshooters Oncometopia facialis belongs to the Cicadellidae family and carries the Xylella fastidiosa. This chemical alteration was greater in the volatile compounds than in the essential oils of the plants. Different amounts of Hesperidin were found in the grafted plant when different species of Citrus were analized: C. limonia without CVC, C. reticulata without CVC, C. sinensis on C. limonia with and without CVC. The C. limonia presented the lower amount of the secondary metabolic and the C. sinensis on C. limonia presents the higher amount. The higher amounts of Hesperidin were found in sick plants witch corresponds the metabolic alteration that occurs when the plant is infected by the bacteria. / Neste trabalho estão descritas dezesseis substâncias isoladas de C. limonia: xantiletina, seselina, xantoxiletina, trans-kelactona, trans-decursidinol, junosmarina escopoletina, isoescopoletina, demetilsuberosina, xantoarnol, clausarina, limonianina, 5,4 -diidróxi-6-(3 -metil-2 -butenil)-2 ,2 -dimetilpirano(5 ,6 -7,8) flavanona, &#946;-sitosterol, estigmasterol e campesterol; sendo uma destacada, a 5,4 - diidróxi-6-(3 -metil-2 -butenil)-2 ,2 -dimetilpirano(5 ,6 -7,8) flavanona, por ser inédita na literatura; e duas, a trans-kelactona e trans-decursidinol, não isoladas anteriormente em plantas da família Rutaceae, apenas na família Apiaceae. Uma comparação entre os constituintes químicos isolados da parte superior e inferior da planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia e do C. limonia não enxertado foi realizada, indicando que a planta enxertada possui um processo de translocação metabólita. São relatadas as Concentrações Mínimas Inibitórias de diversas substâncias, todas isoladas de plantas da família Rutaceae, contra a bactéria causal da Clorose Variegada dos Citros, Xylella fastidiosa. As classes promissoras foram as piranocumarinas e flavanonas, sendo a Xantiletina e a Catequina, com MIC igual a 1,0 mg/mL. Foi realizado um estudo de interação planta-inseto, o qual indicou que a planta enxertada C. sinensis sobre C. limonia apresenta uma alteração na composição química dos seus voláteis e em seus óleos essenciais quando em contato com as cigarrinhas Oncometopia facialis, pertencentes a família Cicadellidae, as quais são transmissores de Xylella fastidiosa, correspondendo a uma resposta da planta ao ataque. A modificação dos constituintes químicos e suas porcentagens foi mais perceptível nos voláteis do que nos óleos essenciais das plantas. A planta enxertada também sofreu uma alteração em um metabólito secundário, a Hesperidina, quando foi feita a análise do teor desta substância em diferentes espécies de Citrus, C. limonia sem CVC, C. reticulata sem CVC, C. sinensis sobre C. limonia com e sem CVC. O C. limonia foi a espécie que apresentou menor quantidade de Hesperidina e C. sinensis sobre C. limonia foi o que apresentou o maior teor. O estudo comparativo da quantidade de Hesperidina da planta enxertada com e sem sintomas de CVC indicou que esta possui uma maior quantidade da substância quando doente, correspondendo a uma alteração metabólita que ocorre na planta quando infectada pela bactéria.