Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-06T14:41:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1116633 bytes, checksum: fc318cc7ff97c79f0496b3e69c56e3fa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T14:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1116633 bytes, checksum: fc318cc7ff97c79f0496b3e69c56e3fa (MD5) Previous issue date: 2013-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos. / The yeast Kluyveromyces marxianus has been considered a candidate host for industrial synthesis of biomolecules. Despite its potential, there are few studies reporting the expression of heterologous proteins using this yeast. Here, it was reported for the first time a dengue viral protein expression in K. marxianus. The dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) was integrated into the K. marxianus UFV-3 genome at the LAC4 locus using adapted integrative vector designed for high-level expression of recombinant protein in Kluyveromyces lactis. The gene of dengue-1 NS1 was optimized using preferential codons to increase the levels of proteins expression in yeast. The synthetic gene was cloned in frame with K. lactis mating-α-factor signal peptide and the recombinant plasmid obtained was used to transform K. marxianus UFV-3 by electroporation. The transformants cells selected in Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) containing 200 μg mL-1 Geneticin were mitotically stable. The analysis of recombinant strains by RT-PCR technique and the protein detection using blot analysis have confirmed both transcription and expression of the extracellular peptides. After induction with galactose, the NS1 protein was analyzed by SDS-PAGE and immunogenic detection. The protein production was investigated under two conditions: with galactose and biotin pulse at 24 hours intervals during 96 hours of induction and without galactose and biotin pulse. Protease activity was not detected into the medium. Our results indicate that the constructed recombinant K. marxianus can be considered good host for the production of dengue virus proteins, which have a potential for diagnostic applications.

As aminoacil-tRNA sintetases catalisam fielmente a ligação do aminoácido ao seu tRNA cognato. A triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) catalisa a ligação de triptofano e alguns análogos de triptofano ao tRNATrp. 1-metiltriptofano (1MW) e 1-metil-7-azatriptofano (1M7NW) não são reconhecidos pela TrpRS, mas possuem características espectroscópicas convenientes para estudos de fluorescência em complexos multiprotéicos. O objetivo deste trabalho é modificar o sítio ativo da TrpRS de E.coli, visando promover a catálise da ligação de 1MW e 1M7NW ao tRNATrp in vivo e permitir a incorporação destes em proteínas recombinantes. Com base numa análise da estrutura da TrpRS:Trp-AMP de B. Stearothermophilus, foram produzidos quatro mutantes de TrpRS de E. coli, com substituição do Asp 135 por Ala (D135A), Cys (D135C), Ser (D135S) e Thr (D135T). Estas proteínas foram superexpressas nas condições utilizadas para a incorporação de análogos de Trp. Através de ensaio de fluorescência do 1MW, pôde-se observar uma pequena incorporação deste nas TrpRS mutantes. Construiu-se um novo vetor de expressão no qual os TrpRS mutantes seriam expressos de forma constitutiva e uma segunda proteína, troponina C F29W, seria expressa de forma induzível. No entanto, não se observou incorporação do 1MW nestas proteínas. Ensaios de atividade in vitro, de formação de triptofano-hidroxamato e de intercâmbio de pirofosfato da TrpRS e mutantes indicaram uma baixa atividade dos mutantes utilizando triptofano como substrato. Os mutantes D135C e D135S apresentaram um considerável aumento (aproximadamente 24 vezes) na especificidade para 1MW em comparação ao Trp. A anotação do genoma da Xanthomonas indicou que a TrpRS deste organismo possui 88 aminoácidos extras na região C-terminal, o que é incomum para procariotos (somente observado em Xyllela e Pseudomonas). Clonou-se, expressou-se e purificou-se a TrpRS da Xanthomonas, com e sem os 88 aminoácidos extras. Observou-se atividade enzimática em ensaios de formação de triptofano-hidroxamato e intercâmbio de pirofosfato nas quais a TrpRS sem os 88 resíduos C-terminais apresentou uma atividade um pouco menor que a enzima tipo selvagem. / Abstract not available.

A utilização de células humanas para a produção do fator VIII de coagulação recombinante (rFVIII) visa obter padrões de glicosilação equivalentes aos encontrados na proteína normal. O objetivo do trabalho foi obter um processo de produção do rFVIII em biorreator em perfusão, devido à sua labilidade térmica. Foram realizados estudos preliminares em Spinner e biorreator utilizando uma linhagem de rHeLa, cujos resultados embasaram os estudos com a linhagem produtora rSkHep. Foram utilizados microcarregadores nos cultivos com esta linhagem devido à dificuldade de adaptação da mesma à suspensão. Ensaios preliminares identificaram a melhor condição de cultivo com 3 g/L Mic e 1 cel/mic e, a partir destes valores, realizou-se um ensaio em perfusão, com tempo de residência de 24 h, no qual as variáveis controladas foram mantidas constantes durante três tempos de residência. A concentração de rFVIII obtida foi semelhante 2 UI/ mL. / The interest in using human cells for the recombinant coagulation factor VIII (rFVIII) lies in obtaining glycosylation patterns similar to the ones found in the normal protein. The objective of this work was to obtain a process for rFVIII production in bioreactor, in perfusion mode, due to the thermal lability of the protein. Using a recombinant HeLa cell line adapted to suspension growth a group of studies in a bioreactor in batch mode were performed. These results were the basis for the studies performed with the producing cell line rSkHep. Microcarriers (micc) were used due to the harshness to adapt the cell line to suspension and to serum-free medium. Preliminary tests identified the best culture condition with 3 g micc/L and 3 cell/micc and, from its values, it was performed a bioreactor study in perfusion mode, with a residence time of 24 hours. The controlled variables were kept constant for three residence times. The maximum rFVIII concentration obtained was 2 UI/mL.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. No mundo, aproximadamente 500.000 casos são reportados a cada ano, com 10% de taxa de mortalidade. Atualmente, vacinas contra leptospirose são compostas por células inativadas e são ineficazes em diferentes aspectos. Após analise do genoma, os genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 foram escolhidos para caracterização da imunogenicidade de suas respectivas proteínas. Esses genes foram clonados no vetor de expressão pAE e as proteínas recombinantes foram purificadas. Os resultados sugerem que essas proteínas podem estar localizadas na membrana externa, são imunogênicas, possivelmente expressas durante a infecção e que podem ter envolvimento em mecanismos de evasão do sistema imune e de patogenicidade da bactéria. Além disso, em um de dois experimentos, a proteína rLIC11084 induziu imunidade protetora parcial em hamsters imunizados frente desafio letal. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. In the world, nearly 500,000 cases are reported each year, with 10% of mortality rate. Currently, vaccines against leptospirosis are composed by inactivated cells that are ineffective in many aspects. After genome analysis, the genes LIC11121, LIC11087, LIC11228 e LIC11084 were chosen for immunogenicity characterization of their respective proteins. These genes were cloned in the pAE expression vector and the proteins encoded by LIC11087, LIC11228 and LIC11084 were purified. The results suggest the localization of these proteins in the bacterial outer membrane, are immunogenic, are possibly expressed during infection and may have involvement in mechanisms of immune system evasion and pathogenicity. Moreover, in one of two experiments, the rLIC11084 protein induced partial protective immunity of immunized hamsters against lethal challenge.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

O sistema de expressão de proteínas que utiliza baculovírus como vetor tem sido intensamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, pois ele permite a formação de modificações pós-traducionais e conta com um forte promotor, a poliedrina. Porém, em alguns casos, esse sistema não é tão eficaz, pois a infecção das células pelo vírus induz morte por apoptose, limitando a produção industrial de várias proteínas recombinantes de interesse. Reportamos a ocorrência de apoptose em cultivos de células de insetos e de mamíferos com depleção de nutrientes ou induzidos por agentes químicos e virais, e a suplementação dessas culturas com hemolinfa de Lonomia obliqua é capaz de estender a viabilidade da cultura evitando a morte por apoptose. Como objetivo, verificamos previamente o mecanismo de ação antiapoptótica de um isolado protéico da hemolinfa de L. obliqua. A identificação deste mecanismo poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias para controlar a apoptose nos cultivos permitindo a otimização da produtividade viral e de proteínas recombinantes. / The protein expression system using baculovirus as a vector has been intensively used for the production of recombinant proteins because it allows the formation of post-translational modifications and has a strong promoter, polyhedrin. However, in some cases, this expression system is not as effective because the infection of cells by baculovirus induces death by apoptosis, thereby limiting the industrial production of various recombinant proteins of interest. We report the occurrence of apoptosis in cultured insect cells and mammalian depleted of nutrients or induced by chemical and viral agents, and supplementation of these cultures with hemolymph of Lonomia obliqua is able to extend the viability of the culture avoiding death by apoptosis. This study aimed to determine in advance the anti-apoptotic mechanism of action of a protein isolated from hemolymph of L. obliqua. The identification of this mechanism may help develop strategies for controlling apoptosis in cell culture allowing the optimization of productivity of viral and recombinant proteins.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e ferramentas de bioinformática nos permitiram selecionar 15 genes que codificam proteínas hipotéticas conservadas preditas de superfície. A conservação foi confirmada por PCR em seis dos sorovares mais predominantes de L. interrogans. As proteínas recombinantes foram clonadas em vetor de expressão de E. coli em fusão com seis resíduos de histidina, que permite a purificação por cromatografia de afinidade a metal. Seis proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose. Através de um ensaio de adesão por ELISA, identificamos uma nova adesina de leptospira, Lsa21, que interage fortemente com laminina, colágeno IV e fibronectina plasmática. Usando a metodologia de Western blotting, identificamos mais nove possíveis adesinas. Nossos ensaios de desafio demonstraram que as proteínas rLIC12730 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Nossos dados sugerem que seja um promissor candidato na prevenção da leptospirose. / The whole-genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni and the bioinformatic tools allow us to choose fifteen genes encoding for conserved hypothetical proteins predicted to be exported to the membrane. The chosen genes were amplified by PCR from six predominant pathogenic serovars, the DNA cloned in an E. coli vector, the recombinant proteins expressed in fusion with 6xHis-tag at N-terminus and purified by metal affinity chromatography. Six proteins were recognized by antibodies present in sera from human patients diagnosed with leptospirosis. By ELISA-attachment assay, we have identified a novel adhesion, named Lsa21, that binds strongly to laminin, collagen IV, and plasma fibronectin. By western blotting assay, we have further identified nine novel probable adhesions. The immunization/challenge assays showed that the recombinant protein rLIC12730 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Our data suggest that it is a promising candidate for prevention of leptospirosis.

Leptospirose é uma zoonose altamente disseminada causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Nos centros urbanos, os roedores são os mais importantes reservatórios da doença. Desde que o controle dos roedores e medidas sanitárias não são facilmente implementadas, o desenvolvimento de uma vacina é necessário para o combate da leptospirose. Desta maneira, os genes LIC10258, LIC12880 e LIC12238 foram selecionados por análises de bioinformática e amplificados do DNA genômico de L. interrogans por metodologia de PCR. A avaliação da capacidade de adesão das proteínas recombinantes com componentes da matriz extracelular mostrou que rLIC10258 interage com a laminina e fibronectina plasmática. Todas as proteínas recombinantes foram capazes de ligar ao plasminogênio e gerar plasmina, mostrando atividade proteolítica específica, enquanto que apenas rLIC12238 foi capaz de ligar ao fibrinogênio. Os resultados obtidos sugerem que estas proteínas podem desempenhar algum papel na patogênese da doença. / Leptospirosis is worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochaetes of the genus Leptospira. In the urban settings, rodents are the most important reservoirs. Since the control of the rodents and sanitation measures are not easily implemented, the development of vaccine is necessary to combat the leptospirosis. Thus, the genes sequences of LIC10258, LIC12880 and LIC12238 were selected by bioinformatics analysis and amplified by PCR methodology from genomic DNA of L. interrogans. Evaluation of the adhesion capacity of the recombinant proteins with extracellular matrix components showed that rLIC10258 interacts to laminin and plasma fibronectin. All recombinant proteins were capable to bind plasminogen and to generate plasmin, showing specific proteolytic activity, whereas that only rLIC12238 was capable to bind fibrinogen. The results obtained suggest that these proteins may play a role in leptospiral pathogenesis.

Streptococcus pneumoniae é um importante agente causador de pneumonia, meningite e septicemia. O alto custo e a cobertura limitada da vacina conjugada atual reforçam a necessidade de se desenvolver uma vacina mais abrangente e acessível. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é imunogênica e protetora em modelos animais; porém, devido à sua diversidade - há 6 clados e 3 famílias de PspA - uma vacina baseada em PspA deverá incluir fragmentos das duas famílias prevalentes (1 e 2). Neste estudo, foram produzidos fragmentos contendo a região N-terminal de PspA das famílias 1 e 2, e proteínas híbridas - contendo fusões destes fragmentos. Os anticorpos gerados contra os híbridos reconheceram PspAs nativas das duas famílias, foram capazes de se ligar a bactérias íntegras, e de aumentar a deposição de complemento em sua superfície. Finalmente, a imunização de camundongos com os híbridos foi capaz de proteger contra desafio com pneumococos contendo PspAs diversas, mostrando que estes seriam candidatos promissores na composição de uma vacina anti-pneumocócica. / Streptococcus pneumoniae is an important cause of pneumonia, meningitis and septicaemia. The high cost and limited coverage of the available conjugate vaccine reinforce the need for cost effective strategies, with broader coverage. Pneumococcal Surface Protein A (PspA) is immunogenic and protective in animal models; however, due to its diversity - there are six clades and threee families of PspA - a PspA based vaccine should include fragments of each major family (1 and 2). In the present study, we have produced fragments of the N-terminal region of PspAs families 1 and 2, and hybrid proteins - containing fusions of these fragments. Sera made against the hybrids induced antibodies that recognized PspAs from both families; these sera were also able to bind pneumococcal strains bearing diverse PspAs, and to increase complement deposition on their surface. Finally, immunization of mice with PspA hybrids was protective against challenge with pneumococci bearing diverse PspAs, showing that these hybrids should constitute promising candidates in an anti-pneumococcal vaccine.

O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária. / This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.