Orientador: Celio Kenji Miyasaka / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T03:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cavalheiro_LauraAndrade_M.pdf: 809451 bytes, checksum: 708c6f3b4585edd72f8cc635a5c73faf (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas presentes no soro de leite têm demonstrado um grande número de efeitos benéficos, como atividade anticarcinogênicas, efeito antiulcerogênica e função imunoestimulatória. Esta propriedade imunoestimulatória está sendo relacionada à possível manipulação da glutationa intracelular. Os linfócitos são importantes células do sistema de defesa celular e humoral. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da suplementação com soro de leite sobre os linfócitos de ratos Wistar. Cento e vinte animais foram divididos em 4 grupos (n = 30), sendo um grupo controle (C) e os demais suplementados com caseinato de cálcio (K), isolado protéico de soro de leite (I) e hidrolisado protéico de soro de leite (H). Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais com água e ração à vontade. Aos 18 dias de suplementação amostras de sangue foram recolhidas para realização de hemograma. Dez dias depois, os animais foram sacrificados e os linfócitos mesentéricos retirados, contados em câmara de Neubauer e incubados (5x107células/ml) em presença de peróxido de hidrogênio. A viabilidade celular foi avaliada antes e depois da incubação. Também foram avaliadas as atividades enzimáticas da glutationa redutase (GSH-Red) e da glutationa peroxidase (GSH-Px). Apesar de um maior consumo de ração, os animais do grupo C não foram os que apresentaram maior ganho de peso. Estatisticamente, seu ganho de peso foi maior que o do grupo K, menor que do grupo I e não diferiu significantemente do grupo H. Os animais do grupo H apresentaram número de linfócitos 134% maior quando comparado aos grupos I e K e 158% mais elevado em relação ao grupo C. Na análise de sangue o número de linfócitos (x10³ celulas/mL) dos animais dos grupos H e I foram estatisticamente maiores que os demais grupos. Os linfócitos dos animais do grupo H tiveram a sua viabilidade diminuída apenas 4,08% após incubação com peróxido de hidrogênio enquanto que no grupo C a diminuição de viabilidade foi de 28,9%. A enzima GSH-Red dos animais do grupo H (38,22 pmols . min-1. mg proteina-1) se mostrou maior que dos animais do grupo C (17,64 pmols . min-1. mg proteina-1). Não houve diferenças entre os grupos na determinação de GSH-Px. Assim, verificou-se a qualidade nutricional atribuída ao soro de leite e que este pode interferir no metabolismo de linfócitos / Abstract: The whey proteins have demonstrated some beneficial effects, as anticarcinogenic activity, antiulcerogenic effect and immunostimulanting function. These immunostimulanting properties have being related to the possible manipulation of intracellular glutathione. The lymphocytes are important cells of the cellular and humoral defense system. The aim of this work was to study the effect of the whey proteins supplementation on lymphocytes of Wistar rats. One hundred and twenty animals were randomly distributed in 4 groups (n = 30): one control group (C) while the others were supplemented with calcium caseinate (K), whey protein isolated (I) and whey protein hydrolysate (H). The rats were maintained in individual cages with water and ration ad libitum. After 18 days of supplementation, blood samples were collected for hemogram accomplishment. Ten days later, the animals were killed and the mesenteric lymphocytes were counted in Neubauer¿s camara and incubated (5x107células/ml) in the presence of hydrogen peroxide. The cellular viability was evaluated before and after the incubation. The enzymatic activities of glutathione reductase (GSH-Red) and of glutathione peroxidase (GSH-Px) were also evaluated. Animals of group C had the highest feed consumption, although its body weight gain was the same as group H, greater than group K and lesser than group I. The group H animals have presented number of lymphocytes 134% greater when compared with groups I and K and 158% more than group C animals. The blood analysis have shown that the number of lymphocytes (x103 cells/mL) of group H animals were bigger than the others groups / Mestrado / Nutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de Alimentos / Mestre em Alimentos e Nutrição

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cepeda_AnaOlivaTiroli_D.pdf: 3942958 bytes, checksum: 940e4a499333daa56fd9a4fc5899919c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas estão envolvidas com as mais diversas funções biológicas. No entanto, para realizar sua função adequadamente, uma proteína deve estar enovelada, ou seja, em sua conformação nativa. Para garantir isso, existe nas células, um elaborado sistema que envolve chaperones moleculares, capaz de auxiliar na prevenção do enovelamento incorreto e da agregação de proteínas Chaperones, de uma maneira geral, são proteínas que ligam e estabilizam polipeptídeos, facilitando seu enovelamento correto sem contribuir com informações conformacionais. O aumento no número de doenças provocadas pelo enovelamento incorreto de proteínas que se depositam nos tecidos na forma de amilóides (também chamadas de doenças conformacionais), tem chamado a atenção para estudos de agregados protéicos, que outrora foram considerados artefatos quando se trabalhava com esse tipo de macromolécula. Nesse sentido, o estudo de chaperones tem ganhado um interesse particular, já que são fortes candidatos ao combate de doenças amiloloidogênicas. Neste trabalho, são apresentados estudos sobre duas famílias de chaperones, a Hsp40 da subfamília A humana e duas sHsps de classe I de cana-de-açúcar, as quais estão envolvidas com o reconhecimento e a apresentação de substratos (proteínas parcialmente desenoveladas) para outras famílias de chaperones responsáveis pelo processo de reenovelamento. Essas duas famílias de chaperones em particular são também conhecidas como 'holdases¿, e são muito diversas, característica necessária para interagir com a grande diversidade de substratos em potencial que existe na célula. As duas sHsps estudadas aqui, as mais expressas em cana-de-açúcar, e a caracterização de suas estruturas e suas eficiências como chaperones, tornou possível a elaboração de uma hipótese sobre o mecanismo de ação dessas proteínas em função do aumento de temperatura. Nesse sentido, é mostrado neste trabalho que sHsps, respondem ao aumento de temperatura passando por expansão conformacional, provavelmente para aumentar a superfície hidrofóbica para a interação com os substratos. O efeito do calor sobre a Hsp40 também foi estudado e os resultados mostraram que essa proteína forma agregados com propriedades amiloidogênicas. Esta é a primeira vez que tais características são descritas para um chaperone de eucarioto. De maneira geral, as implicações dos resultados apresentados aqui podem aumentar o conhecimento geral sobre chaperones e sobre a pesquisa de tratamentos para as doenças conformacionais / Abstract: Proteins are involved with a large variety of biological functions. However, to function properly, proteins must be folded, i.e., they must reach their native conformation. According to that, an elaborated system involving molecular chaperones exists in the cell that helps to prevent the incorrect folding of proteins and also their aggregation. Chaperones, in a general way, are proteins that bind and stabilize polypeptides, facilitating its correct folding without contributing with conformational information. The increasing number of diseases caused by the incorrect folding of proteins that deposit in the form of amyloids (also called conformational diseases) has raised the interest in the study of protein aggregates, which, not long ago, where considered just purification artifacts. In this way, the study of chaperones has gained particular interest because they are potential candidates against amyloidogenic diseases. In this work, we present studies on two families of chaperones, a human Hsp40 from subfamily A and two sugar cane sHsps from class I, which are involved in substrate (partially unfolded proteins) recognition and presentation to other chaperone families that are more active in the protein refolding process. These particular chaperones are also know as 'holdases¿ and they are usually diverse, a characteristic necessary to interact with a large variety of substrate in the cell. The two sHsps studied here are the most expressed in sugar cane and their structure and chaperone efficiency characterization made possible to elaborate a hypothesis on the mechanism of action of these proteins when temperature increases. In that matter, we were able to show that sHsps respond to an increase in temperature by undergoing conformational expansion, likely to increase the hydrophobic area for substrate interaction. The effect of heat on Hsp40 has also been studied and our results showed that this protein form aggregates with amyloidogenic properties. To our knowledge, this is the first time that such characteristics are described for an eukaryotic chaperone. To sum up, we believe that the implications of the results shown here may add to the general knowledge on chaperones and to the search of a treatment for conformational diseases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Angela Maria Moraes, Carlos Augusto Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T04:29:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galesi_AdrianaLagesLima_D.pdf: 1381119 bytes, checksum: 756e8fc5c7c30b40f7e2ebe60c293b63 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Células de inseto têm sido freqüentemente empregadas na obtenção de proteínas recombinantes devido a algumas vantagens em relação às células de mamíferos, e a linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 é um dos sistemas de expressão utilizados para este propósito. Entretanto, a literatura é escassa em relação ao metabolismo e ao cultivo destas células, o que motivou o desenvolvimento deste trabalho. O objetivo deste estudo foi determinar, através da técnica estatística de planejamento fatorial de experimentos, um meio de cultura adequado ao crescimento da linhagem Drosophila melanogaster Schneider 2 transfectada para expressão da glicoproteína do vírus da raiva (GPV) e avaliar seu comportamento nos diferentes meios formulados. Para tal, no meio basal TC100, foram estudados os efeitos dos suplementos glicose, glutamina, concentrado protéico de soro de leite, yeastolate (extrato de levedura), hidrolisado de soja, lactoalbumina hidrolisada, emulsão lipídica e Pluronic F68 sobre o crescimento e a viabilidade celular, na tentativa de reduzir o percentual de soro fetal bovino do meio de cultura. A combinação de diferentes suplementos permitiu que o soro fetal bovino fosse eliminado do meio de cultura, principalmente em decorrência da adição de yeastolate, e, em várias das formulações desenvolvidas, a densidade de células foi bastante superior àquela obtida empregando o meio basal TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino. O meio de cultura que resultou no melhor desempenho celular foi formulado com o meio TC100 suplementado com 10 g/L de glicose e 3,5 g/L de glutamina (concentrações finais), 3 g/L de yeastolate, 1% (v/v) de emulsão lipídica e 0,1 % (m/v) de Pluronic F68. Inicialmente, os ensaios realizados em biorreator não reproduziram o crescimento celular obtido em menor escala. Porém, com o aumento da concentração de Pluronic F68 para 0,6%, tal limitação foi contornada. Glicose não foi o substrato limitante nos meios formulados e lactato foi produzido em pequenas quantidades. Apesar de produzido em elevadas concentrações, o amônio não influenciou o crescimento celular. A dosagem da glicoproteína mostrou que as células não perderam sua capacidade de expressão após a adaptação em diferentes meios de cultura e que a produção de GPV no meio formulado é superior à verificada com os meios comerciais SF900 II e TC100 suplementado com 10% de soro fetal bovino / Abstract: Insect cells have been intensively employed to obtain recombinant proteins due to some advantages over mammalian cells, and the Drosophila melanogaster Schneider 2 cell line is one of the expression systems used for this purpose. Nevertheless, literature is scarce with regard to metabolism and culture of these cells, what motivated the development of this work. The aim of this study was to establish an adequate culture medium to cultivate Drosophila melanogaster Schneider 2 cells transfected for the expression of the rabies virus glycoprotein (GPV), and to evaluate their behaviour in different formulated media. For this, the factorial design strategy was employed. The effects of glucose, glutamine, whey protein concentrate, yeastolate, soy hydrolysate, lactoalbumin hydrolysate, lipid emulsion and Pluronic F68 were studied over cell growth and viability, aiming to reduce the fetal bovine serum percentage from the culture medium. Adjusting the concentration of these distinct compounds, serum was eliminated, mainly due to the addition of yeastolate, and cell concentration was higher in several of the developed formulations than that achieved with basal TC100 medium supplemented with 10% of serum. The formulated medium which resulted in best cell performance was composed by TC100 containing 10 g/L of glucose, 3.5 g/L of glutamine, 3 g/L of yeastolate, 1% (v/v) of lipid emulsion and 0.1% (w/v) of Pluronic F68. When in bioreactor, initially the cells did not reproduce the growth behavior observed in smaller scale. However, increasing Pluronic F68 percentage to 0.6%, this limitation was circunvended. Glucose was not the limiting substrate in formulated culture media and lactate was produced in low quantities. Despite ammonium was produced in high concentrations, this compound did not influence cell growth. Glycoprotein quantification shows that cells did not loose their expression capacity after adaptation in the different media, and that glycoprotein production in the formulated medium was higher than that obtained in SF900 II medium and TC100 medium containing 10% of fetal bovine serum / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_CamilaRamosdos_D.pdf: 7751754 bytes, checksum: 779a2794a6dc213431c4264c43cc0af6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Neste trabalho realizamos estudos estruturais com duas proteínas, a Q4DV70 de Trypanosoma cruzi e a mesotelina de Homo sapiens. O objetivo foi contribuir para a compreensão da função dessas proteínas, as quais possivelmente são importantes para a doença de Chagas e o câncer, respectivamente. A proteína Q4DV70 estava anotada no genoma de T. cruzi como hipotética conservada. Em nosso estudo, a proteína foi pela primeira vez detectada em amostras do parasita. Essa expressão ocorre na fase epimastigota, mas não na fase tripomastigota metacíclica, indicando que a proteína pode ter uma função importante no ciclo de vida do T. cruzi. A estrutura cristalográfica da Q4DV70 foi resolvida por substituição molecular e refinada com dados até 1,5 Å de resolução. Ela apresenta enovelamento tiorredoxina, formado por uma folha ß de 5 fitas cercada por duas hélices a de cada lado. As proteínas que apresentam maior identidade seqüencial e superposição estrutural com Q4DV70 são as tiorredoxinas e PDIs, oxidorredutases de pontes dissulfeto. Porém, as duas cisteínas do sítio ativo dessas proteínas estão substituídas por serinas em Q4DV70, o que impossibilita a função de formação, redução ou isomerização de pontes dissulfeto. Diversas tiorredoxina-like apresentam atividade chaperona independente da função oxidorredutase. Essa função está relacionada a regiões hidrofóbicas na superfície e/ou depende da presença de outro domínio. Q4DV70 é monomérica, composta apenas pelo domínio tiorredoxinalike, e não apresenta regiões hidrofóbicas em sua superfície. Além disso, não demonstrou capacidade de aumentar o enovelamento da GAPDH de T. cruzi. Esses resultados indicam que Q4DV70 não apresenta atividade chaperona. Mesotelina é uma proteína expressa em mesotélio normal e em diversos tipos de câncer, como mesotelioma, câncer de ovário e de pâncreas e leucemia mielóide aguda. Ela é considerada um marcador diagnóstico para esses cânceres e tem sido alvo para o desenvolvimento de drogas anti-tumor. Além disso, ela interage com MUC16, uma proteína presente na superfície de células de câncer de ovário. Apesar da reconhecida importância e uso da mesotelina, pouco se sabe sobre sua estrutura e função. A proteína foi purificada em condições desnaturantes e submetida ao re-enovelamento por diálise. Experimentos de dicroísmo circular, fluorescência e proteólise limitada comprovaram que a mesotelina foi corretamente re-enovelada. Essa amostra foi submetida a ensaios de cristalização, os quais resultaram em cristais que difrataram a baixa resolução. A estrutura de baixa resolução da mesotelina foi calculada a partir de dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo e mostra que sua forma é alongada e curvada. O espectro de dicroísmo circular da mesotelina é típico de proteínas ricas em hélices a. Recentemente foi proposto que a estrutura da mesotelina é formada por uma estrutura em super-hélice, composta por repetições do tipo ARM, as quais apresentam 3 hélices a cada uma. Nossos resultados experimentais indicam que esse modelo teórico está correto. Proteólise limitada com quimotripsina resultou em um domínio estável de 20 kDa na região N-terminal da proteína. Esse domínio contém os 64 resíduos descritos como possível sítio de ligação a MUC16 e deve ser formado pelas 4 primeiras repetições do tipo ARM, de acordo com o modelo publicado. / Abstract: In this work we carried out studies with two proteins, Q4DV70 from Trypanosoma cruzi and mesothelin from Homo sapiens. The aim was to help the understanding of the function of these proteins which possibly are important to Chagas disease and cancer, respectively. Q4DV70 protein was annotated in T. cruzi genome as a conserved hypothetical protein. In our studies, the protein was detected for the first time in parasite samples. Its expression occurs in the epimastigote form but not in the metacyclic trypomastigote form indicating that Q4DV70 is important for the pathogen life cycle. Q4DV70 crystal structure was solved by molecular replacement and refined with data to 1.5 Å maximum resolution. It shows a thioredoxin fold, formed by a five stranded ß-sheet flanked by two a-helixes in each side. The proteins more sequentially identical and better structurally superposed to Q4DV70 are thioredoxins and protein disulfide isomerases, which are disulfide oxidoreductases. However, the cysteine residues from CXXC motif of the active site are replaced by serines in Q4DV70, what prevents the function of formation, reduction and isomerization of disulfide bonds. Different thioredoxin-like proteins show chaperone activity independent of oxidoreductase function. This function is related to hydrophobic regions on the surface and/or is dependent of another domain. Q4DV70 is monomeric, composed only by thioredoxin-like domain and does not show hydrophobic regions on its surface. Moreover the protein does not increase the refolding of GAPDH from T. cruzi. These results indicate that Q4DV70 does not present chaperone activity. Mesothelin is a protein expressed in normal mesothelium and in different types of cancer, such as mesothelioma, ovarian cancer, acute myeloid leukemia and cancer of pancreas. It is considered a diagnostic marker for these cancers and it has been used in the development of antitumor drugs. Besides that, it binds to MUC16, a protein present on the surface of ovarian cancer cells. In spite of its recognized significance and use in cancer, little is known about its structure and function. The protein was purified under denaturing conditions and submitted to refolding by dialysis. Circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis experiments confirmed that mesothelin was correctly refolded. This sample was submitted to crystallization trials that resulted in crystals which diffracted at low resolution. The low resolution structure of mesothelin was calculated from small angle X-ray scattering data and it shows an elongated and curved shape. The circular dichroism spectrum for mesothelin is typical of proteins that are rich in a-helixes. Recently it was proposed that mesothelin has a superhelix structure made by ARM repeats which are composed by 3 a-helixes each one. Our experimental results indicate that this theoretical model is correct. Limited proteolysis with chymotrypsin resulted in a stable domain of 20 kDa in the Nterminal region of the protein. This domain has the 64 residues described as the possible binding site for MUC16 and should be composed by the first four ARM repeats according to the model. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Carolina Lanaro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T03:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zaccariotto_TaniaRegina_D.pdf: 2817876 bytes, checksum: 398eb33fe8d04a2605c7871ddf95d10b (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As fosfatidilinositol-fosfato quinases (PIPKs) são uma família de enzimas lipídio quinases responsáveis pela produção do segundo mensageiro PI4,5P2 (fosfatidilinositol 4,5 bifosfato), que tem um importante papel regulatório em uma variedade de processos celulares, inclusive na expressão gênica. As PIPKs são classificadas em 3 subfamílias -PIPK I (isoformas a, P e y), PIPK II (a, P e y) e PIPK III - que apresentam distintas funções e localização celular. Recentemente, em estudo desenvolvido em nosso laboratório, o gene da PIPKIIa apresentou-se diferencialmente expresso em reticulócitos de dois irmãos com Doença da Hb H. Sua maior expressão, bem como do gene da globina P, foi encontrada no paciente com concentração de Hb H mais elevada, sugerindo uma relação entre a PIPKIIa e a produção de globinas, particularmente da globina p. No presente trabalho, avaliamos, por PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), os perfis de expressão dos genes das PIPKs (I e II, isoformas a, P, y, e III) durante a eritropoese em cultura de células CD34+ do sangue periférico de 11 indivíduos sadios e de 6 pacientes com hemoglobinopatias (2 a-talassêmicos, 2 P-talassêmicos e 2 com Anemia Falciforme), comparando-os com os perfis de expressão dos genes das globinas a, P e y, nos dias 7, 10 e 13 da cultura eritróide. Na cultura de células dos indivíduos controles, os resultados revelaram que a expressão de todos os genes PIPKs aumentam durante a diferenciação eritróide e que o perfil de expressão do gene da PIPKIIa coincide com o perfil dos genes de globinas. Nas culturas de células dos pacientes, a expressão do gene da PIPKIIa tornou-se maior durante a diferenciação, enquanto os genes das outras PIPKs apresentaram resultados heterogêneos. O gene PIPKIIa esteve altamente expresso na cultura de células de um dos pacientes a-talassêmicos, enquanto na cultura de um dos P-talassêmicos apresentou expressão reduzida em relação ao controle. Os resultados também foram diferentes entre as culturas de células dos pacientes falciformes. Este é o primeiro estudo sobre o perfil de expressão dos genes dessas PIP quinases durante a eritropoese humana in vitro. Um padrão de normalidade foi estabelecido. Embora os resultados tenham sido heterogêneos entre os pacientes, o que enfatiza a complexidade dos sistemas regulatórios que atuam na formação da hemoglobina, eles fortalecem a hipótese da existência de uma relação entre PIPKIIa e produção de globina ß / Abstract: Phosphatidylinositol-phosphate-kinases (PIPKs), a family of lipid kinases, produce the second messenger PI4,5P2 (phosphatidylinositol 4,5-biphosphate), which regulates various cellular activities, incluing the gene expression. PIPKs are divided into three subfamilies [PIPK I (a, p, y), PIPK II (a, p, y) and PIPK III], which are functionally distinct and located in different subcellular compartments. In a recent study in our laboratory, the PIPKIIa gene was differentially expressed in reticulocytes from two siblings with Hb H disease. Expression of both the PIPKIIa and p globin genes were higher in the patient with the higher Hb H level, suggesting a relationship between PIPKIIa and the production of globins, particularly P-globin. The aim of this study was to determine the gene expression profiles of PIPKs (I and II - with their isoforms - and III) during erythropoiesis in peripheral blood haematopoietic CD34+ cell culture from eleven healthy volunteers and six patients with haemoglobinopathies (2 with a-thalassemia, 2 with P-thalassemia and 2 with sickle cell anaemia) using quantitative real time PCR (qRT-PCR) and to compare these profiles with the gene expression profiles of a, P and y globins on the 7th, 10th and 13th days of culture. The results for the cell cultures from healthy individuals showed that the expression of PIPKs increase during erythroid differentiation and that the PIPKIIa and globin expression profiles are similar. Expression of the PIPKIIa gene increased in the patients' cell cultures during erythroid differentiation, whereas expression of the other PIPK genes varied. PIPKIIa was overexpressed in the cell culture of an a-thalassemic patient, while its expression was reduced in the culture of a P-thalassemic patient. The results also differed between the cultures from sickle cell patients. This is the first study of the gene expression profiles of PIPKs during in vitro human erythroid differentiation. We identified a standard pattern of gene expression in the healthy group. Although the results varied between patients, our findings strengthen the hypothesis of a relationship between PIPKIIa and production of P-globin / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Lucia Helena Innocentini Mei, Elke Jurandy Bran Nogueira Cardoso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T18:48:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariani_PilarDrummondSampaioCorrea_D.pdf: 18147924 bytes, checksum: 325f49ef8840be70ed59254449097128 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O desenvolvimento de polímeros biodegradáveis tem como objetivo contribuir com a redução do volume de lixo plástico descartado no meio ambiente. Em vista disso, a utilização de polímeros naturais na confecção de blendas tem proporcionado o aproveitamento de recursos de fontes renováveis como e o caso do amido e da soja. Nesse trabalho, dando continuidade as pesquisas realizadas anteriormente no grupo de materiais biodegradáveis da Profa. Lucia H. Innocentini-Mei (FEQ/UNICAMP),foram utilizadas blendas a base de poli (e-caprolactona), amido de milho modificado, proteína isolada de soja (PIS) e sorbitol. As blendas foram preparadas através de extrusão em extrusora mono-rosca e prensagem a quente e as amostras assim obtidas foram submetidas a caracterização e estudo da biodegradação em diferentes solos, com o apoio do Laboratório de Microbiologia do solo da ESALQ/USP, sob a supervisão da Profa. Elke J.B. Cardoso. A caracterização dos materiais obtidos deu enfoque as propriedades térmicas, mecânicas, morfológicas e capacidade de biodegradação em solos de diferentes texturas, e com ou sem a adição de N-fertilizante. Observou-se que a incorporação de amido modificado e proteína isolada de soja foram responsáveis pela redução das propriedades térmicas e mecânicas dos materiais, mas, para muitas aplicações estas propriedades não são requisitos indispensáveis. Com relação à proteína isolada de soja, esta proporcionou a redução da relação carbono/nitrogênio (C/N) da blenda como esperado, atributo que foi decisivo durante o processo de biodegradacao das formulacoes em diferentes solos. A mineralizacao das formulações foi maior em solo de textura arenosa, com maior conversão de carbono a dióxido de carbono (CO2); por outro lado, o solo de textura argilosa não apresentou taxas altas de conversão de carbono a dióxido de carbono para as blendas, mas foi mais eficiente na formação de biomassa microbiana, comparado ao solo arenoso. / Abstract: The development of biodegradable polymers came to reduce the volume of plastic waste discarded in the environment. As a result, the use of natural polymers in the manufacture of blends has provided the use of renewable resources such as starch and soy. In this work, continuing the research done previously in the biodegradable materials group of School of Chemical Engineering School at State University of Campinas/ Brazil, supervised by Prof. Lucia H. Innocentini-Mei, blends of poly (e-caprolactone)/modified starch, soy protein isolate (SPI) and sorbitol were prepared by extrusion in single-screw extruder and hot pressing machine. The samples obtained were subjected to characterization and study of biodegradation in different soils, with the support of the Laboratory of Soil Microbiology (ESALQ/USP), under the supervision of Professor Elke J. B. N. Cardoso. The characterization of the material has focused on thermal, mechanical and morphological properties, and also on the biodegradation capacity in soils of different textures, and with or without the addition of N-fertilizer. It was observed that the incorporation of modified starch and soy protein isolate were responsible for the reduction of thermal and mechanical properties of materials but, for many applications, these properties are not necessaries. With respect to soy protein isolate (SPI), it reduced the carbon / nitrogen (C/N) of the blend as expected, an attribute which was decisive in the process of biodegradation of the studied formulations in different soils. Mineralization of the formulations was higher in sandy soil, with the higher conversion of carbon to carbon dioxide (CO2) compared to the clay soil, which did not show high rates of conversion but was more efficient in the formation of microbial biomass. / Doutorado / Ciencia e Tecnologia de Materiais / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_Renatade_D.pdf: 4015661 bytes, checksum: e48a1ea1afcdb807a4d9186f4bb5777c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A Discondrosteose de Leri-Weill (DLW), caracterizada por baixa estatura, encurtamento mesomélico dos membros e deformidade de Madelung, deve-se a alterações no gene SHOX, localizado na região pseudoautossômica dos cromossomos sexuais e que atua como fator de transcrição. Alterações em um dos alelos são encontradas em casos de baixa estatura com ou sem DLW, e em ambos os alelos na Displasia Mesomélica de Langer (DML), na qual há alterações esqueléticas mais graves. Há variação fenotípica na DLW, atribuída ao envolvimento de outros genes ou a alterações nas regiões reguladoras à jusante ao gene. No presente estudo, realizou-se a investigação do gene SHOX de 10 pacientes com DLW e um com DML por meio de análises de microssatélites, PCR em tempo real, análise de MLPA e sequenciamento direto. Essas análises permitiram confirmar a etiologia genética do quadro apresentado por sete pacientes, dos quais três apresentavam deleção total ou parcial de um dos alelos. Em um destes pacientes a clinica foi associada a mutação de ponto (IVS3+21G>A no íntron 3), outro paciente (DML) a deleção dos dois alelos, outros pacientes (DLW) a deleção na região downstream do gene, outros dois mutações de ponto (c.439C>A no éxon 3 e c.523delC no éxon 4), outro a deleção (c.523delC) associada a mutação na região 5'UTR. Quatro outros pacientes apresentaram alterações de patogenicidade ainda indefinida: mutações não descritas na região 5'UTR, que poderia interferir no processo de tradução do gene (dois casos), e deleção das regiões referentes às sondas 8, 10 e 12 na análise de MLPA (um caso) e outro caso com relação à deleção da sonda SHOX reg. Os resultados mostram a grande heterogeneidade alélica associada à DLW e indicam a necessidade de que a investigação molecular nesses casos seja ampla, permitindo um diagnóstico molecular mais preciso. / Abstract: Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) is characterized by short stature, mesomelic shortening of members and Madelung deformity. It results from changes in the SHOX gene, located in the pseudoautosomal region of the sex chromosomes. The protein it codes acts as a transcription factor. Changes in one SHOX allele are found in cases of short stature with or without LWD, whereas Langer Mesomelic Dysplasia (LMD), in which more serious skeletal disorders occur, results from alterations in both alleles. There is phenotypic heterogeneity in LWD, attributed to the possible involvement of other genes, or to changes in regulatory regions downstream of the gene. In the present study, the SHOX gene and the chromosomal SHOX gene region were evaluated in 11 patients with LWD and LMD by using microsatellite PCR, real time PCR analysis, MLPA analysis, and direct sequencing. Those tests confirmed the genetic etiology of the clinical characteristics in seven patients. Three of them carried alleles bearing a partial or total deletion of the SHOX gene, one of which bearing a mutation located in intron 3 (IVS3+21G>A) that has not been described previously; the patient with LMD carried SHOX gene deletion in both alleles; and another had a deletion in the dpwnstream region of the gene. Two patients bore mutations that have not been described previously in exons 3 (C.4390A, Arg147Ser) and 4 (c.523delC, Gln175Lisfs44x219). The later was also associated with a mutation in 5'UTR. Four other patients showed nucleotide changes and deletions of undefined pathogenicity: novel mutations in the 5'UTR, which might interfere with the translation process of the gene (two cases), and deletion of regions related to the probes 8, 10 and 12 in the MLPA analysis (one case) and deletion oh probe SHOX reg. Results showed great molecular heterogeneity associated with LWD, and pointed out the need of a more detailed research to allow more accurate molecular diagnosis. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosselli_LucianaKauer_D.pdf: 3396544 bytes, checksum: 1ed6069e60d6f5966add93778319a1d0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o programa de seqüenciamento genômico da bactéria Xylella fastidiosa gerou um enorme número de ORFs ("Open Reading Frames" - quadro de leitura aberto ou genes putativos) pertencentes às categorias de patogenicidade, virulência e adaptação deste importante fitopatógeno. Uma destas ORFs (XF 1729) foi anotada como sendo uma fenilacetaldeído desidrogenase de 31,4 kDa. No entanto, a análise de sua seqüência primária de aminoácidos revelou similaridades com proteínas pertencentes à superfamília de aldo-ceto redutases. As proteínas desta superfamília são oxidorredutases NADPH-dependentes relacionadas funcionalmente e estruturalmente. Neste trabalho, a seqüência similar de X fastidiosa foi clonada no vetor de expressão pET32Xa/LIC com o objetivo de super expressar a proteína recombinante fusionada a seis resíduos de histidina em Escherichia colí BL21(DE3). A proteína expressa na fração solúvel foi purificada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado (resina Agarose-IDA-Ni). O conteúdo de sua estrutura secundária foi verificado por espectroscopia de dicroísmo circular. As medidas de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) forneceram os parâmetros estruturais gerais (raio de giro de 27,5 :I: 0,8 Á e máxima dimensão de 90 Á) e indicaram que a proteína apresenta-se como um monômero em solução. Além disto, os cálculos estruturais ab initio mostraram que a proteína apresenta algumas similaridades com uma aldo-ceto redutase previamente cristalizada. A proteína XF 1729 purificada foi capaz de catalisar a redução dos substratos DL-gliceraldeído (Kcat 2.26 S-l, Km 8.20:1: 0.98 mM) e 2-nitrobenzaldeido (Kcat 11.74 S-l, Km 0.14:1: 0.04 mM) na presença de NADPH. A seqüência de aminoácidos da proteína XFI729 apresentou mais alta identidade (maior que 40%) com inúmeras proteínas de função desconhecida. Entre as AKRs identificadas, encontramos aproximadamente 29% dê identidade com YakC (AKRI3) de Schizosaccharomyces pombe, 30% e 28% com AKRIIA e AKRIIB, ambas de Baci/lus subtiZis, respectivamente. Os resultados estabeleceram a proteína XF 1729 como um novo membro da superfamília das AKRs, da nova sub-família AKR13B 1. Finalmente, os experimentos de caracterização por cromatografia de gel filtração indicaram que a proteína apresenta wna forma alongada, gerando wn peso molecular aparente maior que o esperado. Além da proteína AKRl3B 1, selecionamos mais duas proteínas codificadas pelas ORFs XFl934 e XFl532 para estudos de estrutura e função. A proteína HetI (XFI934), de 22,4 kDa, apresenta similaridade proteínas da família phosphopantetheinyl transferase, sendo necessária à síntese de ácido graxo via acetato na bactéria. A proteína XF1532, de 36,8 kDa, é sirpilar a reguladores transcricionais de extresse oxidativo, sendo sua seqüência similar (44%) à proteína OxyR de Escherichia coZi, a qual pertence à família LysR de reguladores transcricionais. As duas ORFs foram clonadas e expressas em Escherichia coZi, no entanto não foi possível obter a proteína na fração solúvel, impossibilitando o seguimento dos estudos de caracterização estrutural e funcional. A descrição da metodologia utilizada para produção destas proteínas e os resultados preliminares obtidos estão descritos no item Resultados Complementares desta tese. Um amplo benefício no conhecimento dos mecanismos de patogenicidade da X fastidiosa tem sido esperado, desde o seqüenciamento completo de seu genoma. Neste sentido, passos iniciais foram dados no sentido de se caracterizar a função das proteínas codificadas por seus genes / Abstract: The Xylella fastidiosa genome program generated a large number of gene sequences that belong to pathogenicity, virulence and adaptation categories from this important plant pathogen. One of these genes (XF 1729) was described in the genome annotation as being a phenylacetaldehyde dehydrogenase. However, the XF 1729 primary sequence analysis showed similarities to Aldo-keto reductase superfamily proteins. The AKRs are NADPH-dependent oxidoreductases structurally and functionally related. In this work, the similar sequence XF 1729 from Xylella fastidiosa was cloned onto the pET32Xa/LIC vector in order to over-express a recombinant His- Tag fusion protein in E. coli BL21(DE3). The expressed protein in the soluble fraction was purified 'by immobilized metal affinity chromatography (agarose-IDA-Ni resin). Secondary structure contents were verified by circular dichroism spectroscopy. Small-Angle X Ray Scattering (SAXS) measurements furnish general structural parameters (the particle radius of gyration of 27.5:J::0.8A and the particle maximum dimension of 90A) and provide a strong indication that the protein has a monomeric form in solution. Also, ab initio calculations show that the protein has some similarities with a previously crystallized aldo-keto reductase protein. The recombinant XF1729 purified to homogeneity catalyzed the reduction ofDL-glyceraldehyde (Kcat 2.26 S-I, Km 8.20:J:: 0.98 mM) and 2-nitrobenzaldehyde (Kcat 11.74 S-I, Km 0.14:J:: 0.04 mM) in the presence of NADPH The amino acid sequence deduced from XF 1729 showed the highest identity (40% or higher) with several functionally unknown proteins. Among the identified AKRs, we found approximately 29% of identity with YakC (AKR13) from Schizosaccharomyces pombe, 30% and 28% with AKR11A and AKR11B, both from Bacillus subtilis, respectively. The results establish XF 1729 as the new member of AKR family, AKR13B1. Finally, the first characterization by gel filtration chromatography assays indicates that the protein has an elongated shape, which generates an apparent higher rnolecular weight. Since Xylellafastidiosa 9a5c strain (associated with CVC) is the first plant pathogen to be fully sequenced, a large benefit for the whole field of disease research can be expected. An initial step has been taken towards the characterization the protein function encoded by its genes / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Gelatina Hidrolisada (GH), Glúten de Trigo (GT) e Isolado Protéico de Soja (IPS) foram misturados em diferentes proporções com o objetivo de substituir proteínas lácteas em uma formulação alimentícia utilizada em programas institucionais de alimentação escolar, buscando-se uma redução de custos sem alterações significativas das propriedades nutricionais e sensoriais do produto final. A qualidade nutricional das misturas foi avaliada de acordo com os métodos \"Escore Químico corrigido pela Digestibilidade PDCAAS\" e \"Razão de Eficiência Protéica - NPR\". As misturas, aplicadas àformulação de uma bebida láctea, foram avaliadas sensorialmente através do método de \"Diferença Escalar do Controle\". Os resultados obtidos experimentalmente pelo delineamento simplex-centróide foram utilizados para modelar equações canônicas de Scheffé que pudessem descrever o efeito da proporção de cada componente na qualidade final. Todos os resultados foram correlacionados através de análise multivariada e representados na forma de Análise de Componente Principal (ACP). Uma \"solução de compromisso\" contendo 25% de GH, 15% GT e 60% de IPS foi selecionada na otimização conjunta das respostas nutricional, sensorial e econômica, resultando na redução média de 6% do custo do produto final sem alteração significativa de qualidade (p < 0,01). Estes resultados revelaram a eficiência da utilização de técnicas estatísticas multivariadas na otimização simultânea e na visualização das interações que ocorrem em processos complexos como sistemas biológicos. / Hidrolizated Gelatin (HG), Wheat Gluten (WG) and Soybean Protein Isolate (SPI) were mixed at different proportions in order to partially replace milk proteins in food formulation utilized in Food Programs to reduce its cost without significant decrease in its nutritional and sensorial properties. The nutritional quality of the mixtures was evaluated by the \"Protein DigestibilityCorrected Amino Acid Score (PDCAAS)\" and \"Net Protein Ratio (NPR)\"methods. The sensorial quality of the mixtures was evaluated by the \"Scale Difference of Control\". The results obtained experimentally by simplex design were used to elaborate Scheffé\'s canonical equations that would describe the effect of the proportion of each component on the final nutritional quality of the product. Ali the results were correlationed by Multivariate Analysis and represented by Principal Component Analysis (PCA). A \"compromise solution\" containing 25% HG, 15% WG and 60% SPI was selected as multiresponse optimization. This mixture was applicated in food formulation and submitted to the evaluations of nutrition and sensorial quality. The final product showed about 6% of cost reduction without any significant change in its quality (p< 0,01). These results demonstrated the statistics multivariate methods efficiency in simultaneous optimization and visualization of interactions which are present in complex process like biological systems.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_NayaraPatriciaVieirade_M.pdf: 3098417 bytes, checksum: 6441392e6b6c275daba6bd89e88cbaf8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Xylella fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens são bactérias fitopatogênicas que infectam, respectivamente, o interior do xilema e de tecidos vasculares de raiz, ambientes cuja tensão de oxigênio é relativamente baixa. Uma vez que Xylella e Agrobacterium são bactérias estritamente aeróbicas, elas apresentam o operon bigR, responsável pela detoxificação do sulfeto de hidrogênio ou gás sulfídrico, um potente inibidor do citocromo c oxidase e respiração aeróbica. O operon bigR codifica cinco proteínas denominadas Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), um repressor transcricional e regulador do operon, e MP1-3, proteínas que compõem um transportador de membrana. Em trabalho anterior, foi demonstrado que mutantes de Agrobacterium deficientes na produção de Blh acumulavam gás sulfídrico, enquanto mutantes no repressor BigR secretavam mais sulfito, indicando que a proteína Blh convertia gás sulfídrico em sulfito e que este, que também é tóxico, seria exportado pelo complexo MP1-3. Além disso, dados de modelagem molecular indicaram que Blh poderia desempenhar funções de sulfotransferase e dioxigenase de enxofre, uma vez que apresenta os domínios DUF442 (rodanase) e ETHE1 (dioxigenase). A fim de testar tais hipóteses, este trabalho teve como principais objetivos a caracterização enzimática dos domínios DUF442 e ETHE1 da Blh de Xylella e Agrobacterium, como também confirmar interações proteína-proteína entre os componentes do operon bigR. Ensaios de atividade enzimática usando-se proteínas recombinantes purificadas confirmaram a função de dioxigenase de enxofre e de rodanase dos domínios ETHE1 e DUF442, respectivamente. Além disso, verificou-se que ambos os domínios produzem sulfito como produto final da reação, embora atuando em substratos diferentes. Ainda, ensaios de duplo híbrido de levedura mostraram haver inúmeras interações entre as proteínas do operon bigR, mas não entre os dois domínios DUF442 e ETHE1 de Blh que, de acordo com os ensaios enzimáticos, atuam de forma independente. / Abstract: Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens are phytopathogenic bacteria that infect, respectively, the xylem vessels and root vascular tissues, where the oxygen tension is relatively lower. Since Xylella and Agrobacterium are strict aerobic organisms, they use the bigR operon for the detoxification of hydrogen sulfide, a potent inhibitor of cytochrome c oxidase and aerobic respiration. The bigR operon encodes five proteins designated Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), a transcriptional repressor that regulates the operon, and MP1-3, proteins that act as a membrane transporter. In a previous work, it was shown that Agrobacterium mutants deficient in Blh production accumulated hydrogen sulfide, whereas BigR-deficient mutants secreted sulfite at higher levels than the wild type bacteria, indicating that Blh converted hydrogen sulfide into sulfite, which would be exported by the MP1-3 complex. In addition, molecular modeling indicated that Blh could function as a sulfur transferase and sulfur dioxigenase, since it carries a DUF442 (rhodanese) and ETHE1 (dioxygenase) domains. To test such hypothesis, this work aimed to demonstrate the enzymatic activities of the DUF442 and ETHE1 domains of Blh from Xylella and Agrobacterium, as well as to confirm protein-protein interactions between components of the bigR operon. Enzyme activity assays using the purified proteins confirmed the sulfur dioxygenase and rhodanese activities of the ETHE1 and DUF442 domains, respectively. In addition, it was found that both domains produce sulfite as a final product, although having different substrates. Furthermore, yeast two-hybrid assays showed that many of the bigR operon proteins interact with each other, suggesting the formation of a protein complex. However, no physical interactions were detected between DUF442 and ETHE1 domains, which, according to the enzyme activity assays, act independently. / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular