Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:05:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_GustavoPereirade_M.pdf: 7665145 bytes, checksum: 3fef8dc5d333834f8117015fea3b10ef (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A produção de energia por meio de fontes renováveis é uma exigência atual para se atingir uma economia sustentável. Os organismos fotossintetizantes surgem nesse contexto como ferramentas importantes na produção de compostos carbônicos ricos em energia, com destaque para microalgas em que tais compostos podem atingir até 80% do peso seco. Entretanto, um fator ainda desfavorável para sua utilização é o seu baixo rendimento na produção de biomassa. A espécie Chlamydomonas reinhardtii, por exemplo, é capaz de duplicar apenas algumas vezes durante 24 horas. As vias que controlam o crescimento celular, portanto, são alvos promissores para modificação genética. Dentre essas vias, à via de sinalização sensível à rapamicina aparece como um controlador central. Com o intuito de entender melhor como esse controle é exercido ao nível da expressão gênica global, foi utilizado a ferramenta de sequenciamento de RNA em larga escala para obtenção dos transcriptomas de culturas (sincronizadas) sob inibição dessa via e na condição controle, em oito momentos ao longo de um ciclo celular de 24h. O controle exercido por essa via sobre o metabolismo e sobre o ciclo celular foi o foco das análises. Foi encontrado que a inibição da via da TOR é capaz de gerar uma resposta de direcionamento parcial do metabolismo para a produção de TAG em detrimento de moléculas complexas como proteínas. Esse direcionamento foi considerado parcial devido à ocorrência concomitante de reações catabólicas. Outros dados obtidos sugerem que a via da TOR, além de regular o metabolismo de uma maneira geral e diversas funções celulares, também exerce influência sobre o progresso do ciclo celular e sua inibição resulta no atraso do desenvolvimento das fases do ciclo. Diversos fatores reguladores da transcrição envolvidos no desenvolvimento, no crescimento e na regulação do ciclo celular, foram encontrados diferencialmente expressos e constituem possíveis genes chave no controle do crescimento. Eles representam alvos em potencial para modificação genética com intuito de otimizar as taxas de crescimento na primeira etapa do sistema de produção. Na busca de alternativas aos processos atuais de indução do acúmulo de cadeias carbônicas, os efeitos da combinação rapamicina e via da TOR representam uma abordagem interessante para pesquisas futuras para viabilização da utilização de microalgas como fonte de energia. Este estudo possibilitou um melhor entendimento da atuação da via da TOR no crescimento e progresso do ciclo celular em C. reinhardtii ao nível de expressão gênica / Abstract: The energy production through renewable sources is an actual demand for achieving a sustainable economy. In this context, photosynthesizing organisms come to light as important tools for the production of energy-rich carbonic compounds, especially the microalgae, in which these compounds can reach up to 80% of the dry weight. However, an unfavorable factor for its utilization is the low yield of biomass production. The species Chlamydomonas reinhardtii, for instance, is capable of achieving only some duplication after 24 hours. The pathways that control cell growth are therefore promising targets for genetic modification. Among them, the rapamycin-sensitive signaling pathway emerges as a central controller. With the aim of better understanding how this control is fulfilled by the means of global gene expression, the high throughput RNA sequencing technology was used. With it, the synchronized cultures transcriptome under the inhibition of this pathway and in the control condition, of eight points during a cellular cycle of 24 hours, were obtained. The metabolism and the cell cycle control by the TOR pathway was the main focus of the analysis. It was found that the inhibition of this pathway is capable to partially draw the metabolism towards TAG production to the detriment of producing more complex chains as proteins. This directing was considered partial due to the concomitant occurrence of catabolic reactions. Other data suggested that the TOR pathway, apart from the metabolism regulation in a general way and regulation of many other cellular functions, also influence the cell cycle progression and its inhibition retards the development of cell phases. Several transcription regulators involved in development, growth and cell cycle regulation were found out to be differentially expressed and are likely to constitute key genes in growth control. They represent potential targets for genetic modification aiming the optimization of growth rate in the first step of the production system. In the search for alternatives to the current process of inducing carbon chain accumulation, the effects of the combination between rapamycin and TOR pathway represent an interesting approach for future research intending to turn the utilization of microalgae as an energy source into a feasible option. This study enabled a better understanding of the role of the TOR pathway in growth and cell cycle progression of C. reinhardtii at the level of gene expression / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador : Kleber Gomes Franchini / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T00:30:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_JoaoEustaquio_D.pdf: 5472161 bytes, checksum: d84f6389e6baf3e2959126f6345e6a14 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A compreensão de como a quinase de adesão focal (FAK) contribui para os processos de hipertrofia, insuficiência cardíaca e câncer são de grande interesse científico. Um dos nossos objetivos específicos é desenvolver inibidores desta tirosina quinase com vistas à sua aplicação terapêutica no tratamento de insuficiência cardíaca e câncer. Portanto, foi realizado planejamento racional e a síntese de inibidores farmacológicos para a FAK. Estudos computacionais de docking e farmacocinéticos permitiram selecionar 28 estruturas de quinazolina mais promissoras em relação à capacidade de inibir a FAK. Desta forma, economiza-se tempo e dinheiro para obter-se a síntese apenas de 6 das estruturas pré-selecionadas. Uma quinazolina denominada 4-BZLO foi sintetizada após o planejamento racional. Tal quinazolina foi capaz de inibir em 50% da atividade da FAK in vitro com aproximadamente 1nM. Os testes de pureza da síntese, absorção por via oral, melhor resultado em triagem em células que superexpressam a FAK e o melhor resultado para triagem em duas linhagens de célula leucêmicas e tumor sólido permitiram direcionar o 4- BZLO para ser o composto líder deste estudo. O composto 4-BZLO apresentou resultado promissor para experimentos com camundongos submetidos à coarctação da aorta, que induz hipertrofia cardíaca. Para avaliar se o tratamento preventivo seria eficiente para hipertrofia cardíaca, foi realizado experimento em animais tratados com 30mg/Kg/dia durante 30 dias. Após este período, foi realizada cirurgia de coarctação da aorta para induzir a hipertrofia cardíaca nos animais e os mesmos foram tratados por mais 30 dias. Parâmetros tais como: peso médio do ventrículo esquerdo sobre peso corpóreo de cada animal (LVW/BW), medida da espessura da parede do ventrículo esquerdo (LVWT) e parâmetros histológicos (diâmetro dos miócitos cardíacos) demonstrou que nos animais tratados houve regressão da hipertrofia comparada ao controle (animais sem tratamento). Outro estudo realizado no qual os animais foram tratados de maneira curativa, ou seja, o tratamento foi realizado somente após a coarctação da aorta demonstrou uma melhora no quadro de hipertrofia e função cardíaca. O modelo de fibrose cardíaca foi usado para avaliar se tratamento com 4-BZLO é capaz de reduzir a fibrose cardíaca nos animais. Os resultados obtidos demonstraram que os animais tratados com 4-BZLO por 30 dias apresentaram redução da acumulação de colágeno, que é um indicador de fibrose, em relação ao controle. Nosso laboratório desenvolveu camundongos transgênicos específicos para a FAK que desenvolve moderada hipertrofia cardíaca. Assim, tal modelo permitiu testar o tratamento com o 4-BZLO para hipertrofia cardíaca induzida pela FAK. Os animais transgênicos específicos para a FAK foram tratados com o composto líder e houve melhora dos parâmetros cardíacos. Os resultados obtidos permitiram concluir que a quinazolina denominada 4-BZLO é um bom candidato a fármaco como inibidor da FAK / Abstract: Understanding how the focal adhesion kinase (FAK) contributes to the processes of hypertrophy, heart failure and cancer are of great scientific interest. One of our goals is to develop specific inhibitors of this tyrosine kinase with potential therapeutic application in the treatment of heart failure and cancer. In this view, we used rational design to select a group of possible FAK inhibitors. Computational studies such as docking and pharmacokinetic studies allowed us to select 28 structures most likely to inhibit FAK. In this way, we saved up time and money in devising the synthesis of 6 pre-selected structures. Accordingly, quinazoline 4-BZLO was prepared and was able to inhibit the in vitro activity of FAK by 50% at a concentration of approximately 1nM. Several factors contributed to 4-BZLO being chosen as the lead compound in this study: 1) the degree of purity achieved during synthesis; 2) good oral bioavailability; 3) the best inhibition values in cells over expressing FAK in screening, 4) the best result against two leukemic cell lines and one solid tumor target. 4-BZLO showed promising results in experiments with mice subjected to aortic coarctation, which develops cardiac hypertrophy. To assess whether 4- BZLO would be effective for the preventive treatment of cardiac hypertrophy, an experiment was conducted in animals treated with 30 mg/kg/day for 30 days. After this period, an aortic coarctation was performed surgically in order to induce cardiac hypertrophy in animals, and these were further treated for 30 days. Parameters such as left ventricular weight per body weight ratio (LVW/BW), measurement of the left ventricle wall thickness (LVWT), and histological parameters, such as the diameter of cardiac myocytes in treated animals showed that there was a regression of hypertrophy, compared to untreated animals (control). A similar study, where treatment with 4-BZLO was performed only after aortic coarctation showed an improvement regarding hypertrophy and cardiac function. A cardiac fibrosis model was used and the results obtained demonstrated that animals treated with 4-BZLO for 30 days showed a reduction of collagen accumulation, which is an indicator of fibrosis, equal to the control group. Our laboratory has developed transgenic mice specific for FAK, which develop moderate cardiac hypertrophy. Consequently, this model allows us to test 4-BZLO for the treatment of FAK induced cardiac hypertrophy. The transgenic animals were treated with 4-BZLO, leading to an improvement of the cardiac parameters. These results showed that synthetic quinazoline 4-BZLO is a good drug candidate for the inhibition of the FAK enzyme / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_MichelleBuenodeMouraPereira_D.pdf: 4387492 bytes, checksum: bf7a9e478bc9627b01a4e45548a6f170 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular / Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientadores: Licio Augusto Velloso, Marcio Alberto Torsoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T11:00:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MaristelaCesquinide_D.pdf: 2056313 bytes, checksum: fe162225f6402886dd228faa021438b9 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O aumento da prevalência da obesidade e diabete tipo 2 nas sociedades modernas está fortemente associado às doenças cardiovasculares, hipertensão, infarto e aterosclerose. Estas patologias têm sido relacionadas com ingestão calórica excessiva e diminuição do gasto energético. Muitos fatores regulam a ingestão alimentar, incluindo hormônios como insulina e leptina, alimentos e comportamento. Estes fatores são integrados no hipotálamo que media um sistema de sinalização celular para regular o comportamento alimentar e o balanço energético da célula. A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) tem sido proposta como capaz de mediar as adaptações celulares às variações nutricionais ambientais. O resultado da ativação da AMPK é a inibição de vias biossintetizantes que consomem energia, tais como as vias de síntese de ácidos graxos e proteínas, e a ativação de vias catabólicas, como a via de oxidação de ácidos graxos e a glicólise. No hipotálamo, a AMPK desempenha o papel de mediar os efeitos hormonais na ingestão alimentar e no balanço energético. Outras moléculas, como a acetil-CoA carboxilase (ACC) e o seu produto, o malonil-CoA têm sido propostas como possíveis intermediários na sinalização hipotalâmica que monitora o estado energético do corpo. No presente trabalho, nós administramos citrato, um ativador alostérico da ACC, no hipotálamo de ratos a fim de investigarmos o efeito deste composto na atividade hipotalâmica e hepática da AMPK. O resultado desta modulação no metabolismo energético, metabolismo de glicose e comportamento alimentar foi comparado aos ratos tratados com salina. Nós observamos que o tratamento com citrato inibiu a fosforilação da AMPK hipotalâmica seguido de inibição da fosforilação da ACC hipotalâmica, indicando menor atividade da AMPK neste tecido. A inibição da AMPK promoveu diminuição da ingestão alimentar, perda de peso corpóreo e aumento da expressão dos neuropeptídeos anorexigênicos POMC e CRH. No grupo de ratos tratados com citrato, a captação de glicose foi maior do que nos ratos que receberam solução salina, como mostrada pelo teste tolerância à glicose (GTT) e pelo clamp hiperinsulinêmico-euglicêmico. Consistente com estes resultados, no fígado, os ratos tratados com citrato mostraram maior fosforilação das proteínas da cascata de sinalização da insulina, reduzidos níveis de fosforilação da AMPK e ACC e expressão aumentada da PEPCK e G6Pase, se comparado aos animais controle. O efeito central do citrato na melhora da sinalização da insulina nos tecidos periféricos, na ativação da produção de glicose pelo fígado e na inibição da AMPK hepática foi bloqueado por antagonista ?-adrenérgico. De acordo com estes resultados, nós podemos sugerir que a modulação da AMPK por intermediários metabólicos possa ser um mecanismo importante de controle da homeostase energética e consequentemente do diabetes e obesidade / Abstract: The increased prevalence of obesity and type II diabetes in modern societies is largely linked to cardiovascular disease, hypertension, stroke and atherosclerosis. These pathologies have been associated to excessive caloric intake and decreased energy expenditure. Many factors regulate food intake, including hormones such as insulin and leptin, fuels and behavior. These factors are integrated in the hypothalamus that mediates a signaling system to regulate food behavior and cellular energy balance. The AMPactivated protein quinase (AMPK) has been proposed to be capable of mediating the cellular adaptations to nutritional environmental variation. The result of AMPK activation is the inhibition of nergy-consuming biosynthetic pathways, such as fatty acid and protein synthesis, and activation of ATP-catabolic pathways, such as fatty acid oxidation and glycolysis. In the hypothalamus, AMPK mediates hormonal effects on food intake and energy balance. Other molecules, such as acetyl-CoA carboxylase (ACC) and its product malonyl-CoA have been proposed as possible intermediaries in the hypothalamic signaling pathway that monitors energy status. In the present work we administrated citrate, an allosteric activator of ACC, in the hypothalamus to investigate its effect on hypothalamic and hepatic AMPK activity and the result of this modulation in the energetic cellular metabolism, such as glucose metabolism and food behavior. Results were compared to saline-treated rats. Here we show that citrate treatment inhibited hypothalamic AMPK phosphorylation followed by an inhibition of hypothalamic ACC phosphorylation, indicating lower AMPK activity in this tissue. The AMPK inhibition promoted decrease in food intake, loss of body weight and increased expression of anorexigenic neuropeptides (POMC and CRH). In the citrate group, the glucose uptake was higher than in animals receiving saline according to GTT and hyperinsulinemic-euglycemic clamp. Consistent with these results, in the liver, citrate-treated rats showed also higher phosphorylation of insulin signaling proteins than control rats, reduced AMPK and ACC phosphorylation and increased PEPCK and G6Pase expression. Supported by these results, we suggest that AMPK modulation by citrate can be an important mechanism to understand deregulated glucose metabolism involved in diabetes and obesity. The central effect of citrate in the improvement of peripheral insulin signaling, in the activation of liver glucose production, and in the inhibition of hepatic AMPK was blocked by the ?-adrenergic antagonist. According to these results, we suggest that AMPK modulation by metabolic intermediaries can be an important mechanism controlling the energetic homeostase, diabetes and obesity / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Estudamos o papel de quinases de Plasmodium na modulação, via derivados de triptofano, no ciclo celular do parasita. Foram realizadas análises com melatonina, N-acetilserotonina, triptamina e serotonina, avaliadas através de microscopia e citometria de fluxo. Parasitas deficientes para as proteínas PfNEK2, PfNEK3 e PfMAP1 apresentaram respostas similares ao parasita selvagem enquanto pfpk7- e pfeik1- não apresentaram resposta aos compostos indólicos. Estes dados sugerem envolvimento das quinases PfPK7 e PfeIK1 na transdução de sinal via compostos derivados de triptofano na modulação do ciclo intraeritrocítico em P. falciparum. Ensaios de medidas de cálcio intracelular mostraram que a ausência de pfpk7- leva a uma atenuação na liberação de cálcio promovida por melatonina, sugerindo que a ativação desta quinase é importante no aumento de cálcio citosólico. Estes resultados ampliaram a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam resposta a melatonina. / We evaluated the role of Plasmodium kinases in the modulation, via tryptophan derivatives, of the parasite cell cycle. We performed analysis with melatonin, N-acetylserotonin, tryptamine and serotonin through blood smears and flow cytometry analyzes. Parasites deficient in the proteins PfNEK2, PfNEK3 and PfMAP1 showed similar responses to the wild type while pfpk7- e pfeik1- did not respond to the indolic compounds. This data suggest the involvement of the kinases PfPK7 and PfeIK1 in melatonin signal transduction for cell cycle modulation in P.falciparum. Intracellular calcium measurement assays showed that pfpk7- diminished the ability of melatonin to rise cytosolic calcium concentration, suggesting that this kinase is involved with cytosolic calcium increase. These results expand the understanding of the molecular mechanisms that regulate melatonin-dependent cell cycle modulation.

A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa resultante da expansão clonal de células mielóides positivas para o cromossomo Philadelphia. A patogênese da LMC está associada à expressão do oncogene BCR-ABL1, que codifica a proteína Bcr-Abl com constitutiva atividade da tirosina quinase, promovendo a mieloproliferação exacerbada e a resistência à apoptose das células leucêmicas. Os pacientes com LMC são tratados principalmente com inibidores de tirosina quinase (TKI), mas a resistência aos inibidores e a refratariedade tem sido relatada em alguns pacientes na fase crônica e na maioria dos pacientes em fases avançadas da doença. Assim sendo, continua a ser de suma importância a elucidação da patogênese da LMC e a busca de novos alvos terapêuticos, como os membros da via de sinalização Hippo e reguladores do ciclo celular, da família Aurora quinase. O presente estudo quantificou o nível de expressão de genes que codificam componentes da via de sinalização Hippo (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP e TAZ) e Aurora quinases A e B em: 1) pacientes com LMC em diferentes fases da doença, resistentes ou sensíveis à terapia com mesilato de imatinibe (MI), em indivíduos saudáveis e 2) linhagens celulares HL-60, HL-60.Bcr- Abl tratadas com TKI (imatinibe, dasatinibe e nilotinibe), KCL22 e LAMA84 resistentes e sensíveis ao MI. Os níveis de expressão dos genes alvo foram correlacionados com o índice de prognóstico de Sokal. Os principais resultados revelaram que há alteração nos genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA e AURKB em pacientes com LMC em relação aos controles. Não houve correlação entre o índice de Sokal e a expressão gênica dos genes da via Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 e TAZ, assim como os genes Aurora quinases A e B. Pacientes com LMC em fases avançadas apresentaram maiores valores de expressão dos genes TAZ e AURKB, comparado aos pacientes na fase crônica. Os pacientes resistentes ao TKI apresentaram as expressões dos genes MST1, TAZ e AURKB, significativamente mais elevadas, comparado aos pacientes sensíveis ao MI. Os resultados dos estudos em linhagens celulares indicaram principalmente que a expressão do gene LATS1 pode ser modulada pela atividade de tirosina quinase Bcr-abl e que o oncogene BCR-ABL1 induz a expressão de AURKA, AURKB, LATS1 e TAZ. Em conjunto os dados obtidos revelam que a alteração da expressão dos genes da família Aurora quinase, A e B, e dos genes que codificam proteínas da via Hippo contribui para a patogênese e progressão da LMC. O desenvolvimento de fármacos e/ou a identificação de marcadores tumorais para a via de sinalização Hippo e família Aurora quinase, podem otimizar o tratamento da LMC, aumentando a susceptibilidade das células leucêmicas a apoptose e levando a um melhor prognóstico da doença / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm resulting from clonal expansion of myeloid cells positive for the Philadelphia chromosome. The CML pathogenesis is associated with BCR-ABL1 oncogene expression, which encodes the Bcr-Abl protein with a constitutive tyrosine kinase activity, leading to leukemic cell high proliferation and resistance to apoptosis. CML patients are mainly treated with tyrosine kinase inhibitors (TKI), but some of CML patients in chronic phase are resistant and in advanced phases are refractory to TKI. Thus, it is still relevant to elucidate the CML pathogenesis and seek to new therapeutic targets, including the Hippo signaling pathway members and cell cycle regulatory genes such as those encoding the Aurora kinase family. The present study quantified the RNA expression level of genes encoding components from the Hippo cell signaling pathway (MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, YAP, and TAZ) and Aurora kinase A and B in: 1) CML patients at different stages of the disease, in CML patients resistant or sensitive to imatinib mesylate therapy, healthy individuals and 2) in cell lines HL-60, HL-60.Bcr-Abl treated with TKI (imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib), KCL22 and LAMA84 resistant and sensitive to IM. The RNA expression levels of the target genes were also correlated to the CML Sokal\'s prognostic score values. The main results revealed that there are alterations in the genes MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2, TAZ, AURKA and AURKB in patients with CML in relation to the controls. There was no correlation between the Sokal index and the gene expression of the Hippo, MST1, MOB1B, MOBKL1B, LATS1, LATS2 and TAZ genes, as well as the Aurora kinase genes A and B. Patients with advanced phase CML had higher values of expression of the TAZ and AURKB genes, compared to the patients in the chronic phase. Patients resistant to TKI had significantly higher MST1, TAZ and AURKB gene expression compared to MI-sensitive patients. The results of the studies in cell lines indicated primarily that the expression of the LATS1 gene can be modulated by the Bcr-abl tyrosine kinase activity and the BCR-ABL1 oncogene induces the expression of AURKA, AURKB, LATS1 and TAZ. Together, the data show that altered expression of Aurora kinase family genes, A and B, and genes coding for Hippo pathway proteins contribute to the pathogenesis and progression of CML. The development of drugs and/or identification of tumor markers for the Hippo signaling pathway and the Aurora kinase family can optimize CML treatment by enhancing the susceptibility of leukemic cells to apoptosis and leading to a better disease prognosis

INTRODUÇÃO: O melanoma primário da cavidade oral é uma neoplasia agressiva, rara e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos da mucosa. Ele representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas. Estudos recentes apontam algumas vias moleculares tem sido encontradas por estarem envolvidas na patogenia dos melanomas. Dentre essas vias destaca-se a via proliferativa da MAPK (mitogen activated protein kinase), esta cascata de sinalização está envolvida no controle do crescimento celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada com um papel importante no desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo. OBJETIVOS: Analisar a expressão proteica e mutação pontual dos componentes da via MAPK e correlacionar com os dados clínicos-histológicos. MATERIAL E MÉTODOS: Através da imunoistoquímica avaliar a expressão proteica dos anticorpos RAS; BRAF; MEK1; MEK2; ERK1 e ERK2 em 35 casos de melanomas orais organizados em matriz (TMA: Tissue Microarray) e através de pirosequenciamento avaliar a mutação pontual dos genes BRAF; NRAS; KRAS em 14 casos de melanomas orais. RESULTADOS: Idade dos pacientes entre 9 e 91 anos, sem predileção por sexo, 75% caucasianos, 71,42% acometeram o palato, 80% com aspecto histológico grau III. A análise da expressão proteica foi: RAS (28,57%); BRAF (82,85%); MEK1 (0%); MEK2 (51,43%); ERK1 (20%)e ERK2 (74,28%). Na análise molecular observamos mutações para BRAF (9/14 casos) e NRAS (2/14 casos). CONCLUSÃO: Todos os aspectos da via MAPK necessita de outras elucidações em melanomas de áreas foto-protegidas e melanomas de mucosa e comparando diferentes populações. Entretanto, os resultados deste presente estudo apontam importante alterações na cascata RAS-RAF-MEK-ERK e estes são indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários da mucosa oral, independente da exposição solar / BACKGROUND: Primary melanoma of the oral cavity is an aggressive and rare neoplasm and originated from the proliferation of malignant melanocytes of the mucosa. It represents approximately 0.2 to 8% of all melanomas. Recent studies indicate some molecular pathways have been found to be involved in the pathogenesis of melanomas. Among these means there is a proliferative MAPK pathway (\"mitogen activated protein kinase\"), this signaling pathway is involved in controlling cell growth, proliferation and migration, and it has been associated with a role in the development and progression of melanoma skin. OBJECTIVES: To analyze protein expression and mutation of components of the MAPK pathway and to correlate with the clinical, histological data. MATERIALS AND METHODS: Using immunohistochemistry to evaluate the protein expression of RAS, BRAF, MEK1, MEK2, ERK1 and ERK2 antibodies in 35 cases of oral melanomas organized array (TMA: Tissue Microarray) and using pyrosequencing to assess the mutation of the BRAF, NRAS, KRAS in 14 cases of oral melanomas. RESULTS: Age of patients between 9 and 91 years, regardless of gender, 75% Caucasian, 71.42% in palate, 80% with histologic grade III. Analysis of protein expression was: RAS (28.57%); BRAF (82.85%); MEK1 (0%), MEK2 (51.43%); ERK1 (20%) and ERK2 (74.28%). Molecular analysis we found BRAF mutations (9/14 cases) and NRAS (2/14 cases). CONCLUSION: All aspects of the MAPK pathway requires further elucidation in melanomas of photo-protected areas and mucosal melanomas and comparing different populations. However, the results of this study indicate important changes in the cascade RAS-RAF-MEK-ERK and these are indicators of poor prognosis in primary melanomas of the oral mucosa, regardless of sun exposure

INTRODUÇÃO: Indivíduos com asma possuem infiltração aumentada de células inflamatórias, produção de quimiocinas e hiperresponsividade de vias aéreas. Estes apresentam níveis aumentados de interleucina (IL)-17, importante na regulação da expressão de mediadores inflamatórios e recrutamento de células inflamatórias, outra característica é aumento da atividade da proteína Rho-quinase em suas vias aéreas. A modulação da IL-17 e da proteína Rho-quinase pode ser promissora para o tratamento desta doença. OBJETIVO: Estudar os efeitos dos tratamentos realizados com anticorpo neutralizador anti-IL17 e do inibidor da Rho-quinase, associados ou não, em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 camundongos BALB/c, divididos em 8 grupos (8 animais por grupo): SAL (solução salina); OVA (ovoalbumina), SAL-RHOi (salina e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi (ovoalbumina e inibidor de Rho-quinase), SAL - anti-IL17 (salina e anti-IL17), OVA - anti-IL17 (ovoalbumina e anti-IL17), SAL - RHOi - anti-IL17 (salina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase), OVA - RHOi - anti-IL17 (ovoalbumina, anti-IL17 e inibidor de Rho-quinase). O protocolo de sensibilização e indução da inflamação pulmonar por ovoalbumina teve duração de 28 dias. O Anti-IL17A (clone 50104 - 7,5 ug por dose) foi administrado via intraperitoneal e inibidor de Rho-quinase (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h antes de cada desafio com ovoalbumina (22, 24, 26 e 28 dias). RESULTADOS: Houve um aumento na resistência do sistema respiratório e na elastância, nos marcadores inflamatórios CD4+, CD8+, ROCK1 e ROCK2, IL-1-beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalfa, em vias sinalizadoras NF-kappaB, FOXP-3 e células dendríticas, em marcadores de remodelamento MMP9, MMP12, TIMP1, iNOS, TGF-beta, no conteúdo de isoprostano, decorina, biglicano, fibronectina e fibras colágenas e na expressão gênica de VAChT, IL-17 e arginase, no grupo OVA em comparação com o grupo controle. O tratamento dos animais sensibilizados, de forma individualizada ou a associação dos dois, atenuou estas respostas quando comparados ao grupo sensibilizado com ovoalbumina e não tratado (p < 0,05). O tratamento do inibidor de Rho-quinase associado ao anti-IL17 gerou potencialização do controle da resposta de hiperresponsividade à metacolina, assim como nas vias aéreas a redução do número de células positivas TNF-alfa, IL-4, IL-5 e nos septos alveolares o número de células positivas IL-4, IL-5, TGF-beta, FOXP3, ROCK1 e ROCK2 (p < 0,05). CONCLUSÃO: O tratamento com anti-IL17 associado ao inibidor da Rho-quinase modula a hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, e remodelamento e estresse oxidativo em animais com inflamação pulmonar alérgica crónica / RATIONALE: Individuals with asthma have increased infiltration of inflammatory cells, chemokines production, and airway hyperresponsiveness. Asthmatics have elevated levels of interleukin (IL)-17, which plays an important role in regulating the expression of inflammatory mediators and recruitment of inflammatory cells, these individuals also have increased Rho-kinase protein activity in their airways. The modulation of IL-17 and Rho-kinase protein may be promising for the treatment of this disease. OBJECTIVE: To study the effects of anti-IL17 neutralizing antibody and Rho-kinase inhibitor treatments, associated or not, on mice with chronic allergic lung inflammation. METHODS: Were used 64 BALB/c mice, divided into eight groups (n=8 in each group): SAL (saline-instilled); OVA (exposed-ovalbumin); SAL-RHOi (saline and Rho-kinase inhibitor), OVA-RHOi (exposed-ovalbumin and Rho-kinase inhibitor); SAL - anti-IL17 (saline and anti-IL17), OVA - anti-IL17 (exposed-ovalbumin and anti-IL17); SAL - RHOi -anti-IL17(saline, Rho-kinase inhibitor and anti-IL17), OVA - RHOi - anti-IL17 (exposed-ovalbumin, anti-IL17 and Rho kinase inhibitor). The protocol for sensitization and induction of pulmonary inflammation by ovalbumin has the duration of 28 days. The Anti-IL17A neutralizing antibody (clone 50104-7.5 ug per dose) was administered via the intraperitoneal, and Rho-kinase inhibitor (Y-27632) intranasal (10 mg/kg), 1h before each ovalbumin challenge (22, 24, 26 and 28 day). RESULTS: There was an increase in respiratory system resistence and elastance, in the positive cells evaluated CD4+, CD8+, ROCK1 and ROCK2, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, TNFalpha, TGF-beta, MMP9, MMP12, TIMP1 and isoprostane, decorin, biglican, fibronectin, collagen fibers content, signaling pathways NF-kappaB, FOX-P3, dendrict cells and gene expression of VAChT, IL-17 and arginase in the OVA group compared to the control group. Treatment of the sensitized animals with the Rho-kinase inhibitor or with the anti-IL17 or with the combination of the two, attenuated these responses when compared to the ovalbumin-sensitized and untreated group (p < 0,05). The treatment of the anti-IL17 associated Rho-kinase inhibitor generated potentiation of the hyper responsiveness response to methacholine, as well as in the airways the reduction of the number of TNF-alpha, IL-4, IL-5 positive cells and in the alveolar septa the number of IL-4, IL-5, FOXP3, TGF-beta, ROCK1 and ROCK2 (p < 0.05). CONCLUSION: Anti-IL17 treatment associated with the Rho-kinase inhibitor modulates airway hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in animals with chronic allergic pulmonary inflammation

Estudos recentes demonstram que o Hormônio Tiroideano (HT) é capaz de modular rapidamente o estado de fosforilação de proteínas quinases relacionadas ao processo de hipertrofia cardíaca. Evidências experimentais indicam que a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) seja um alvo importante no controle do crescimento hipertrófico, uma vez que a ativação desta enzima determina ampla variedade de efeitos siológicos, incluindo o controle de proteínas relacionadas à síntese protéica. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram os de avaliar os efeitos do HT sobre a modulação da via de sinalização da AMPK, além de verificar o possível envolvimento desta quinase no modelo de hipertrofia in vitro induzida pelo HT. Os resultados obtidos mostraram que rapidamente este hormônio ativa a AMPK e proteínas relacionadas a esta sinalização. Além disso, a estimulação farmacológica da AMPK atenua a hipertrofia de cardiomiócitos induzida pelo HT. Estes dados sugerem que a AMPK seja uma possível ferramenta terapêutica em doenças cardiovasculares como a hipertrofia cardíaca. / Some studies have shown that Thyroid Hormones (TH) are also able to rapidly modulate the phosphorylation state of protein kinases related to cardiac hypertrophy process by non-genomic actions. In this sense, experimental evidences indicate that AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important target in the control of hypertrophic growth, since the activation of this enzyme determines wide variety of physiological effects, including the control of enzymes related to protein synthesis. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of TH on the modulation of AMPK signaling pathway and to check the possible involvement of this kinase in vitro model of hypertrophy induced by TH. The results showed that this hormone rapidly activates AMPK and related proteins to this signaling. Furthermore, pharmacological stimulation of AMPK attenuated cardiomyocyte hypertrophy induced by TH. These data suggest that AMPK may correspond to a possible therapeutic tool in cardiovascular disease.

Estudos recentes demonstram que o Hormônio Tiroideano (HT) é capaz de modular rapidamente o estado de fosforilação de proteínas quinases relacionadas ao processo de hipertrofia cardíaca. Evidências experimentais indicam que a proteína quinase ativada por AMP (AMPK) seja um alvo importante no controle do crescimento hipertrófico, uma vez que a ativação desta enzima determina ampla variedade de efeitos siológicos, incluindo o controle de proteínas relacionadas à síntese protéica. Dessa forma, os objetivos deste estudo foram os de avaliar os efeitos do HT sobre a modulação da via de sinalização da AMPK, além de verificar o possível envolvimento desta quinase no modelo de hipertrofia in vitro induzida pelo HT. Os resultados obtidos mostraram que rapidamente este hormônio ativa a AMPK e proteínas relacionadas a esta sinalização. Além disso, a estimulação farmacológica da AMPK atenua a hipertrofia de cardiomiócitos induzida pelo HT. Estes dados sugerem que a AMPK seja uma possível ferramenta terapêutica em doenças cardiovasculares como a hipertrofia cardíaca. / Some studies have shown that Thyroid Hormones (TH) are also able to rapidly modulate the phosphorylation state of protein kinases related to cardiac hypertrophy process by non-genomic actions. In this sense, experimental evidences indicate that AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important target in the control of hypertrophic growth, since the activation of this enzyme determines wide variety of physiological effects, including the control of enzymes related to protein synthesis. Thus, the objective of this study was to evaluate the effects of TH on the modulation of AMPK signaling pathway and to check the possible involvement of this kinase in vitro model of hypertrophy induced by TH. The results showed that this hormone rapidly activates AMPK and related proteins to this signaling. Furthermore, pharmacological stimulation of AMPK attenuated cardiomyocyte hypertrophy induced by TH. These data suggest that AMPK may correspond to a possible therapeutic tool in cardiovascular disease.