L'objectif de mon doctorat est de développer une méthode d'analyse des séquences protéiques permettant de cribler, le plus efficacement possible, les alignements non significatifs produits par le logiciel PSI-BLAST afin d'identifier des relations d'homologies lointaines. La stratégie développée repose sur deux étapes de criblage, une première s'appuyant sur les prédictions de structures secondaires, une seconde tirant profit du développement récent de méthodes de comparaison profil/profil performantes. La méthode développée a été initialement calibrée sur une base de données de séquences particulière. Cette base rassemble des séquences de domaines dont les structures sont connues permettant ainsi de contrôler l'existence effective d'homologues lointains. Cette phase a permis d'établir les seuils de détection optimaux permettant une utilisation semi-automatique du programme. Dans une seconde phase, la méthode a été testée sur un ensemble de 100 protéines impliquées dans la signalisation et la réparation des dommages de l'ADN. Au travers de différents exemples, nous montrons les potentialités du programme développé pour des recherches d'homologies lointaines à grande échelle. En particulier, mon étude suggère une nouvelle hypothèse pour comprendre l'origine d'une maladie rare, le syndrome de Nijmejen, provoqué par une mutation dans la protéine Nbs1.

Les travaux présentés dans ce document retracent mes activités de Recherche dans le domaine de la Biologie Cellulaire et Moléculaire, qui m'ont conduit de la Toxicologie Génétique à la Radiobiologie. L'action des génotoxiques sur le patrimoine héréditaire a toujours constitué le fil conducteur de mes activités. A chaque étape de mon parcours, j'ai développé des modèles biologiques destinés à répondre à des thématiques bien précises. <br />Mon travail de recherche a commencé pendant deux ans à Rhône Poulenc (1985 1986) par le test de la réparation de l'ADN in vitro et in vivo (UDS ou unscheduled DNA synthesis) sur hépatocytes de rats Sprague Dawley et Fischer 344. Ce test de « dommages primaires » permet de prédire l'activité génotoxique des xénobiotiques. Dans l'approche in vivo, mon étude mettait en évidence l'importance du métabolisme intestinal dans l'activation métabolique de certains agents génotoxiques indirects (dérivés dinitrotoluène). J'ai ensuite débutée une approche plus fondamentale au CNRS (1988 1992). En utilisant les outils de la Génétique Moléculaire, j'ai créé un nouveau modèle cellulaire exprimant un système de régulation génique qui permet de détecter rapidement les agents modifiant le profil de méthylation de l'ADN au niveau des sites 5'CpG3'. Ces xénobiotiques, à l'origine des « épimutations » et de la dérégulation de l'expression de certains gènes, ont une contribution importante et souvent sous estimée dans la progression tumorale.<br />En 1992, je me suis orienté vers la Radiobiologie au DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum ; Heidelberg, Allemagne) puis au CEA (LRA). Il s'agissait d'adapter à la Radiobiologie le modèle de culture de la peau humaine reconstituée in vitro, destiné auparavant à étudier la physiologie des kératinocytes normaux ou pathologiques. L'objectif était (i) d'irradier les spécimens de peau et d'étudier les effets d'une irradiation sur les kératinocytes et les fibroblastes), et (ii) de mimer in vitro la fibrose radioinduite. Ce modèle de culture alternatif prend en compte les interactions entre cellules épithéliales et mésenchymateuses. Au cours de ce travail, je me suis intéressé à la protéine humaine HSAkin17. Mon activité s'est alors recentrée sur cette protéine. Le développement de nombreuses approches cellulaires et moléculaires au laboratoire (LGR) nous a permis de mettre en évidence l'implication de cette protéine dans la réplication de l'ADN, notamment lorsque la progression des fourches de réplication est bloquée par des dommages non réparés de l'ADN. Nous avons démontré que cette protéine était un composant nécessaire au complexe de réplication de l'ADN et qu'elle avait une activité de reconnaissance des origines de réplication endogènes.<br />Depuis la fin 2003, j'ai développé et valider les vecteurs pEBVsiRNA pour une interférence ARN (RNAi) à très long terme (> 500 jours). Ce travail a été mené sur de nombreux gènes (110 gènes ciblés), essentiellement des gènes de la réparation de l'ADN. Un brevet a été déposé en 2005. Cette approche nous permet maintenant de travailler sur les interconnexions entre les mécanismes de réparation de l'ADN dans des lignées isogèniques. A ce jour, je suis le seul à proposer un tel modèle cellulaire cohérent avec un aussi grand nombre de clones stables, maintenus en culture aussi longtemps. La création de clones silencieux, stables à très long terme, m'a permis de participer à l'élaboration de nouveaux projets de Recherche dans le cadre de nombreuses collaborations, dont certaines seront énoncées dans ce rapport. Par ailleurs, ma démarche a aboutit à une valorisation industrielle.

Augmenter l'autonomie décisionnelle des systèmes spatiaux (satellites, sondes et rovers) soulève de nouveaux problèmes tels que la planification des activités pour accomplir un but, le contrôle de l'exécution du plan, et la surveillance et le diagnostic du système. Nous nous intéressons plus particulièrement à la planification d'une mission et au contrôle de son exécution dans le cadre d'une application avec des contraintes temporelles (rendez-vous avec des fenêtres de visibilité&) et la gestion de ressources limitées (énergie, carburant&). Cette thèse propose un cadre général pour intégrer la planification, l'exécution et l'adaptation réactive d'un plan en exploitant la flexibilité temporelle et le parallélisme des plans produits par un planificateur non linéaire causal basé sur des techniques de satisfaction de contraintes (notamment la représentation des contraintes temporelles est faite sous la forme d'un Simple Temporal Network). Cette approche a été mise en Suvre dans le système IxTeT-eXeC qui se compose d'un exécutif temporel et du planificateur IxTeT, modifié pour améliorer la flexibilité de la représentation des ressources et prendre en compte le contexte d'exécution et la durée de la recherche lors de la planification. L'exécutif contrôle les deux mécanismes d'adaptation du plan (en cas d'échecs ou de nouveaux buts) : (1) une réparation en parallèle de l'exécution de ses parties valides, (2) une replanification complète. IxTeT-eXeC a été intégré dans le niveau décisionnel de l'architecture LAAS, en interaction avec l'exécutif procédural OpenPRS, pour contrôler un robot mobile autonome avec une mission d'exploration.

Le facteur TFIIH est un facteur multi-protéique impliqué, via ses dix sous-unités, dans la transcription des gènes de classe II et dans la réparation de l'ADN. Chez l'homme, des mutations dans les gènes codant pour des hélicases XPB et XPD de TFIIH sont à l'origine de trois maladies: le Xeroderma Pigmentosum, la Trichothiodystrophie et le Syndrome de Cockayne. Au cours de mes études doctorales, je me suis intéressée aux liens entre la structure et la fonction du facteur TFIIH humain. Nous avons observé le complexe TFIIH produit sous forme recombinante dans les cellules d'insectes en microscopie électronique et sa structure est identique à celle du facteur endogène. Nous y avons ensuite intégré les données biochimiques d'interaction protéine-protéine et nous proposons un modèle général de l'architecture du complexe. Afin de comprendre le rôle de TFIIH dans l'initiation de la transcription ou dans la réparation de l'ADN, nous avons développé une nouvelle technologie visant à observer les complexes ADN-protéine en microscopie. Nous avons également déterminé un modèle en cryomicroscopie du facteur TFIIE, qui interagit physiquement avec TFIIH, à une résolution de 1.6nm. Finalement, nous avons obtenu des cristaux de l'homologue de l'hélicase XPD chez une archaebactérie.

Ce travail porte sur la modélisation stochastique et l'estimation paramétrique de l'efficacité des opérations de maintenance corrective et préventive des systèmes réparables complexes. Dans une première partie, les modèles de réparation imparfaite sont classés à l'aide de l'intensité de défaillance d'un processus ponctuel. Cette revue regroupe les modèles existants et en propose de nouveaux. L'étude se focalise ensuite sur les modèles dits a réduction arithmétique de l'âge et de l'intensité, et sur le modèle de Brown-Proschan. Des résultats probabilistes originaux permettent de comprendre le comportement du processus des défaillances de ces modèles et de développer des méthodes statistiques d'estimation de leurs paramètres. Dans une deuxième partie, deux cadres de modélisation sont proposés et étudiés, afin de généraliser ces modèles au cas des différents types de maintenances préventives existants dans la réalité industrielle : maintenances préventives systématiques, planifiées ou conditionnelles. Les modèles généraux proposés permettent d'intégrer la possibilité d'une dépendance entre les instants de maintenance préventive et corrective. Enfin une méthode d'évaluation de l'efficacité globale des différentes opérations de maintenance est développée et illustrée sur un exemple réel issu de l'industrie.

Ces travaux ont pour objectif de proposer une réparation de mise en œuvre simple et adaptée au défaut sur matériaux composites de type « impact faible énergie » très courant au sein des structures aéronautiques. Une méthode d'infiltration de résine dans le dommage est proposée. Après une étude analytique du principe, un banc d'essai a été réalisé pour valider la capacité d'infiltration évaluée notamment par CND. Dans un deuxième temps, une démarche globale (numérique et expérimentale) de validation mécanique des réparations composites est mise en place. Des essais classiques et plus originaux sont proposés pour l'analyse de la ténacité de l'interface réparée à l'échelle du matériau (DCB, ENF, Traction rainurée) puis à une échelle représentative de structure (CAI, re-poinçonnement).

Le système de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) est impliqué dans la cytotoxicité du cisplatine, puissante drogue anticancéreuse qui interagit avec l'ADN. Nous avons étudié in vitro certaines étapes clé des mécanismes moléculaires qui relient le fonctionnement du système de réparation MMR avec la cytotoxicité de cette drogue. Notre étude s'est focalisée sur l'interaction entre l'ADN platiné et la protéine MutS du système MMR impliquée dans les étapes d'initiation de la réparation. Trois points ont été abordés dans cette étude : i) la reconnaissance par MutS des lésions du cisplatin et des composés de lésion du cisplatine (formés lorsqu'une base non complémentaire est incorporée en face de l'une des deux purines pontées par le platine) ii) l'étape d'initiation de la réparation régulée par la fixation d'ATP et d'ADP par la protéine MutS iii) l'étude d'un dérivé du cisplatine (DACH-platine) ne présentant pas de résistance croisée avec le cisplatine. Les principaux résultats ont été obtenus par des techniques électrophorétiques et par résonance plasmonique de surface. Notre étude montre que MutS joue le rôle d'un senseur des lésions du cisplatine et que l'ADN platiné peut jouer le rôle d'un cofacteur dans la régulation biochimique de l'activité de MutS en présence de nucléotides régulateurs. Nos résultats suggèrent que les composés de lésion des adduits majoritaires du cisplatine pourraient être les lésions critiques impliquées dans la cytotoxicité du cisplatine via le système MMR.

La peau est la première barrière de protection de l'organisme face aux agressions de l'environnement incluant notamment les radiations UV solaires, responsables de nombreux dommages sur l'ADN. Afin de prévenir l'apparition de lésions et de maintenir l'intégrité du génome, la cellule a mis en place des systèmes de protection avec la réponse pigmentaire, et de réparation avec le mécanisme du NER (nucleotide excision repair). Le NER est un mécanisme complexe et versatile, conservé au cours de l'évolution, qui repose sur l'action coordonnée d'acteurs protéiques dont les mutations conduisent à l'apparition de syndromes d'hyper-sensibilité aux UV. Ainsi, parallèlement à la régulation transcriptionnelle UV induite dépendante du facteur USF-1 (Upstream Stimulating Factor 1) des gènes clés de la pigmentation, nous avons étudié l'induction transcriptionnelle potentielle de gènes codant pour les acteurs du NER. Par une approche combinant expériences in-vivo (RT-QPCR et ChIP) et in-vitro (EMSA, luciférase essais), nous impliquons le facteur USF-1 dans l'induction transcriptionnelle de gènes codant deux acteurs des étapes de reconnaissance des lésions UV-induites par le NER. L'utilisation de souris invalidées pour le gène USF-1 confirme le modèle observé. L'ensemble de ces données obtenues au cours de ma thèse vient compléter la liste des gènes cibles du facteur de transcription USF-1 et élargit son réseau d'implication en réponse aux UV. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel du facteur USF-1 dans le processus tumoral des cancers cutanés UV-induits.

Les mécanismes de l'emphysème pulmonaire, caractérisé par la destruction des alvéoles pulmonaire, sont incomplètement connus. L'hypothèse défendue par cette thèse est qu'une altération des systèmes d'alvéologénèse et de réparation alvéolaire portés par les fibroblastes pulmonaires contribue au développement des lésions au cours de cette maladie. Les travaux présentés ici ont permis d'établir que les fibroblastes pulmonaires cultivés in vitro à partir de poumon emphysémateux présentaient un phénotype altéré dans le sens d'une perte de leur capacité à participer à la régénération et à la réparation des alvéoles : Ces cellules sécrétaient à un niveau faible ou non stimulable le Hepatocyte Growth Factor et le Keratinocyte Growth Factor (KGF), qui ciblent les cellules épithéliales et endothéliales de l'alvéole. De plus, l'expression par ces cellules de l'élastine, le composant majeur de la matrice extracellulaire pulmonaire, n'était pas induite par l'acide tout-trans rétinoïque, stimulus central de l'alvéologénèse, du fait d'une faible expression de Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 (CRABP2). Le rôle du KGF dans l'homéostasie de l'alvéole a été démontré dans le modèle d'emphysème induit par l'élastase in vivo : Les souris traitées par le KGF avant l'instillation d'élastase étaient protégées de l'emphysème. Les souris dont le gène de CRABP2 était inactivé de façon globale n'étaient pas sensibilisées vis-à-vis de l'emphysème dans ce modèle. Les données physiopathologiques présentées dans ce mémoire pourraient contribuer à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'emphysème.

L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées