Orientador: João Aristeu da Rosa / Banca: Maria Tercilia Vilela de Azeredo Oliveira / Banca: Marcos Takashi Obara / Resumo: Estima-se que 6 a 7 milhões de pessoas estejam infectadas com Trypanosoma cruzi no mundo, a maioria na América Latina, sendo a transmissão vetorial responsável ainda por, aproximadamente, 80% dos casos. Atualmente são descritas 151 espécies de triatomíneos agrupadas em cincos tribos formadas por 18 gêneros. O gênero Rhodnius conta com 19 espécies de potenciais vetores, podendo veicular T. cruzi e Trypanosoma rangeli. É considerado um dos gêneros taxonomicamente mais complexos da subfamília Triatominae, devido as semelhanças morfológicas e a distribuição geográfica que podem se sobrepor entre algumas de suas espécies dificultando seu estudo, apesar das diversas técnicas empregadas para sua distinção. Com o desenvolvimento atual das técnicas moleculares tornou-se possível a caracterização de espécies de triatomíneos por meio de marcadores mitocondriais e nucleares, tendo essa se tornado uma variável a mais para a taxonomia dos triatomíneos, assim como a já utilizada morfologia e a recentemente popularizada morfometria geométrica. A adição de novas variáveis possibilita que dados já existentes possam ser comprovados e/ou corrigidos. Neste trabalho foram obtidos subsídios que ampliam o conhecimento e que agregados aos já existentes podem proporcionar uma diferenciação mais minuciosa e precisa de espécies englobadas no gênero Rhodnius, de modo a contribuir para estabelecer uma classificação mais apropriada. A obtenção dos dados foi conduzida, por meio de estudo molecular, utiliza... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Worlwide, it is estimated that 6 to 7 million people are infected with Trypanosoma cruzi, mostly in Latin America and the vector transmission is still responsible for approximately 80% of the cases. There are currently 151 described species of triatomine, grouped into five tribes, formed by 18 genres. The Rhodnius genre includes 19 species, which can transmit T. cruzi and Trypanosoma rangeli. It is considered one of the most complex taxonomically genera of Triatominae, due to its morphological similarities and geographical distribution that may overlap among some species hindering their study, despite the various techniques used for their distinction. With the current development of molecular techniques it has become possible to characterize triatomine species through mitochondrial and nuclear markers, this became one more toll for the taxonomy of triatomines, just as the already used morphology and recently popularized geometric morphometry. The addition of new variables enables the verification and or correction of existing data. This work has generated valueable data that amplify the knowledge which in addition to the existing may provide a more accurate differentiation of species included in the genre Rhodnius, in order to help establish a more appropriate classification. Data collection was performed by DNA analysis, using mitochondrial markers - cytochrome b and cytochrome oxidase I, in addition to morphological parameters, as, median process of pygophore, the anterolat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

La presente tesis comprende una revisión del desarrollo de Rhodnius prolixus (Stähl, 1859); anotación de genes del desarrollo temprano y estudios de expresión y funcionales de dos de esos genes. El objetivo general ha sido aportar datos que contribuyan a establecer redes génicas como blanco de la evolución de la forma en los insectos. Los objetivos específicos fueron: Identificar y anotar en el genoma de R.prolixus genes ortólogos a los genes HOX de Drosophila melanogaster (Meigen, 1830); caracterizar el cluster HOX y determinar la función de genes HOX mediante genómica funcional. Se identificaron 70 genes, la mayoría de ellos correspondientes al grupo de TF con homeobox. Se analizaron, curaron y anotaron 26 secuencias; incluyendo a los ocho HOX canónicos. Se logró demostrar que los genes HOX de R.prolixus están agrupados en un cluster y se plantean cinco agrupamientos probables. Los ensayos funcionales se realizaron usando un gen HOX ‒scr‒ y un activador HOX ‒caudal‒ involucrado en el establecimiento del eje anteroposterior. Para ello, se pusieron a punto las técnicas de hibridación in situ de embriones completos ‒WMISH‒ y de ARNi parental. La expresión de scr mostró un patrón acorde a lo esperado en relación a las observaciones hechas en otros insectos. La ARNi mostró variantes en comparación con especies relacionadas, pero se ajusta muy bien a lo esperado. La expresión de caudal muestra las siguientes similitudes con respecto a otras especies estudiadas: (1) actúa tempranamente como gen de efecto materno, (2) se expresa en la región posterior del huevo en estado de blastodermo, (3) los efectos de la ARNi son semejantes a los encontrados en otros insectos de banda germinal corta. Sin embargo, en estados de banda germinal, los resultados de expresión difieren respecto a otras observaciones, esto puede estar en relación con mecanismos de sañalización aún no descriptos para este gen. / This thesis deals with the embryology of Rhodnius prolixus (Stähl, 1859), the establishment of functional techniques in this new developmental model (whole mount in situ hybridization ‒WMISH‒ and parental RNAi), the annotation of early developmental genes, and the functional assay for two of those genes, Sex combs-reduced (Rp-Scr) and caudal (Rp-cad). The aim of the investigation is to contribute to define and understand the basic components of developmental genetic networks that are target of evolutionary processes that shape insect morphology. The goals are to indentify and annotate orthologs to the HOX genes of Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) in the R .prolixus genome, characterize the HOX cluster and determine the HOX function in R. prolixus by means of functional genomics. Seventy genes were identified, mostly homeobox-containing transcription factors. Twentysix sequences were analysed in detail, cured and annotated, including the eight canonical HOX. The results showed that the HOX genes of R. prolixus are clustered and five plausible organizations were proposed. The functional assays were performed by using the HOX gene Rp-Scr and the activator Rp-cad , involved in the anteroposterior axis patterning. Rp-Scr expression was similar to other insects. Rp-Scr RNAi showed some variants compared to related species, but it was in agreement with its known function, which was relevant to validate the techniques developed. Rp-cad expression showed that (1) it function early as a maternal gene, (2) it is expressed in the posterior of the egg in blastoderm stage, (3) the RNAi effects shows a posterior-to-anterio effect. In the germband stage, the expression suggests a long distance signalling mechanism at work.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-03-21T11:26:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1278550 bytes, checksum: c271b17eabe8ba087f6b1cde6cb236e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T11:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1278550 bytes, checksum: c271b17eabe8ba087f6b1cde6cb236e2 (MD5) Previous issue date: 2015-09-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Triatomíneos são artrópodes hematófagos transmissores do Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli. É sabido que o comportamento alimentar e a transmissão de patógenos por estes vetores variam entre as diferentes espécies e são dependentes, direta ou indiretamente, de moléculas bioativas da saliva que auxiliam na interação vetor-parasito-hospedeiro. Neste sentido, caracterizamos e comparamos o repertório sialoproteômico de três importantes espécies dos principais gêneros de triatomíneos das Américas: Rhodnius prolixus, Triatoma lecticularia e Panstrongylus herreri, identificando 221 proteínas, sendo 69 de R. prolixus, 100 de T. lecticularia e 52 de P. herreri. Dentre os principais achados, encontramos a alta prevalência de nitroforinas em R. prolixus (68%) e de lipocalinas em T. lecticularia (79%) e P. herreri (49%). Neste contexto, as proteínas mais significativas por spot de R. prolixus, T. lecticularia e P. herreri mais abundantes, apresentando expressiva diferença entre as outras, foram Nitrophorin-4 (28,7%), Salivary lipocalin 5 (65,2%) e Putative triabin (20,5%), respectivamente. Outro achado significativo foi a única molécula presenta nas três espécies estudadas, a proteína não categorizada T1HT34, a qual atuaria como elo proteico entre elas, identificando-se como paráloga da Putative fry-like conserved. Os dados encontrados pela caracterização pelo Gene Ontology, vieram a corroborar achados anteriores, evidenciando-se todas as funções identificadas como beneficiadas pelo repasto sanguíneo dos triatomíneos. / Triatomine bugs are blood-sucking arthropods transmitters of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli. It is known that eating behavior and the transmission of pathogens by these vectors vary between different species and are dependent, directly or indirectly, of bioactive molecules in saliva that help in vector-parasite-host interaction. In this sense, characterize and compare the sialoproteômico repertory of three important species of major triatomine genera of the Americas: Rhodnius prolixus, Triatoma lecticularia and Panstrongylus herreri, identifying 221 proteins, 69 of R. prolixus, 100 T. lecticularia and 52 P. herreri. Among the main findings, we found a high prevalence of nitroforinas in R. prolixus (68%) and lipocalin in T. lecticularia (79%) and P. herreri (49%). In this context, the most significant protein per spot R. prolixus, T. lecticularia and P. herreri most abundant, with significant difference among others, were Nitrophorin-4 (28.7%) Salivary lipocalin 5 (65.2%) and Putative triabin (20.5%), respectively. Another significant finding was the single molecule presents the three species studied, not categorized protein T1HT34, which would act as a protein link between them, identifying themselves as paráloga of Putative fry-like conserved. The data obtained by the characterization by the Gene Ontology, came to corroborate previous findings, showing up all the functions identified as beneficiaries of the blood meal of the insects.

Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-02T21:21:04Z No. of bitstreams: 1 daniele_p_castro_ioc_bp_0003_2009.pdf: 3267511 bytes, checksum: 7b658c7e6da7e158039b1155918729e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-02T21:21:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniele_p_castro_ioc_bp_0003_2009.pdf: 3267511 bytes, checksum: 7b658c7e6da7e158039b1155918729e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Nesta tese, foram investigados fatores que interferem no desenvolvimento dos parasitas, Trypanosoma cruzi e T. rangeli, no inseto-vetor, Rhodnius prolixus, com a administração de substâncias extraídas de Physalis angulata, fisalinas, bem como fatores relacionados a microbiota bacteriana intestinal do inseto, como Serratia marcescens. As fisalinas B, D, F e G administradas junto ao sangue alimentar não alteraram a fisiologia de ninfas de 5° estádio de R. prolixus, entretanto quando inoculados com T. rangeli ou Enterobacter cloacae b12 causaram alta mortalidade. Nos insetos tratados com fisalina B e infectados com parasita observou-se diminuição na formação de microagregados de hemócitos e produção de óxido nítrico. As fisalinas B e F reduziram a atividade de lisozima e a fisalina D reduziu a atividade antibacteriana, ambas de insetos inoculados com bactéria. Insetos tratados com as fisalinas B, D, F e G exibiram reduç§es significativas na atividade fagocitária. O tratamento dos insetos com as fisalinas B, F e G e inoculação de bactéria ocasionou menor contagem na formação de microagregados de hemócitos e o tratamento com as fisalinas B e F menor n·mero de hemócitos circulantes na hemolinfa. As atividades de fagocitose e microagregação de hemócitos inibidas pelo tratamento oral com fisalina B foram revertidas pela inoculação de ácido. O tratamento dos insetos com fisalina B não alterou a atividade da PLA2, porém aumentou a atividade de PAF-AH. Noutro enfoque da interação inseto-parasita, foram estudados os efeitos citotóxicos da S. marcescens. Ensaios in vitro, de incubação da bactéria com T. cruzi ou T. rangeli juntamente com o carboidrato D-manose (0,2M) resultaram na proteção dos parasitas da adesão e da lise de S. marcescens (variantes SM365 e RPH) numa relação dose dependente. Entretanto, a D-manose não interferiu na atividade hemolítica das variantes SM365 e RPH de S. marcescens. Enquanto com estas variantes a adesão das bactérias ao parasita ocorria em apenas alguns segundos, a variante DB11 não aderiu e não lisou o parasita. A adesão bacteriana é densa e compacta e ocorre por finos filamentos que com o tempo se desenvolve formando biofilme em volta da superfície do parasita lisado. Portanto, concluímos que dentre os fatores que interferem na interação entre inseto e T. cruzi e T. rangeli estudados, podemos citar as fisalinas e S. marcescens por suas atividades imunosupressoras e lítica contra os parasitas, respectivamente. Enquanto a fisalina B atua diminuindo os níveis de análogo de PAF (iPAF) na hemolinfa e elevando os níveis de PAF-AH, com ação inibitória sobre o sistema imune de R. prolixus, a bactéria S. marcescens lisa parasitas resultando em formação de biofilme, os quais regulam, direta ou indiretamente, o desenvolvimento do parasita no inseto vetor / In this thesis, we investigated factors affecting the development of the parasite, Trypanosoma cruzi and T. rangeli in the insect vector, Rhodnius prolixus, with the administration of substances extracted from Physalis angulata, physalins as well as factors related to intestinal bacterial microbiota of the insect, such as Serratia marcescens. Physalins B, D, F and G given by the blood feeding did not alter the physiology of fifth instar nymphs of R. prolixus, however, when inoculated with T. rangeli or Enterobacter cloacae b12 caused high mortality. In insects treated with physalin B and infected with parasites observed decrease in the formation of microaggregates of hemocytes and production of nitric oxide. Physalins B and F decreased the activity of lysozyme and physalin D reduced the antibacterial activity of both insects inoculated with bacteria. Insects treated with physalins B, D, F and G § s exhibited significant reduction in phagocytic activity. Treatment of insects with physalins B, F and G and inoculation caused lower counts of bacteria in the formation of hemocyte microaggregates and treatment with physalins B and F minor · n number of circulating hemocytes in the hemolymph. The activities of hemocyte phagocytosis and microaggregation inhibited by treatment with oral physalin B were reversed by the injection of acid Treatment of insects with physalin B did not affect PLA2 activity, but increased the activity of PAF-AH. In another approach to insect-parasite interaction, we studied the cytotoxic effects of S. marcescens. In vitro assays, incubation of bacteria with T. or T. cruzi rangeli together with the carbohydrate D-mannose (0.2 M) resulted in protection of parasites adhesion and lysis of S. marcescens (SM365 and RPH variants) in a dose dependent. However, the D-mannose did not affect the hemolytic activity of SM365 and RPH variants of S. marcescens. While these variants with bacteria from adhering to the parasite occurred in only a few seconds, the variant has not adhered DB11 and not lysed the parasite. The bacterial adhesion is dense and compact and thin filaments occurs with time forming biofilm grows around the surface of the parasite lysate. Therefore, we conclude that among the factors that influence the interaction between insect and T. and T. cruzi rangeli studied, we can cite physalins and S. marcescens for their immunosuppressive and lytic activities against the parasites, respectively. While physalin B acts by decreasing the levels of PAF analogue (IPAF) in the hemolymph and raising levels of PAF-AH, with an inhibitory effect on the immune system of R. prolixus bacteria S. marcescens smooth parasites resulting in biofilm formation, which regulate, directly or indirectly, the development of the parasite in the insect vector.Desfazer edições

Made available in DSpace on 2014-05-29T12:32:35Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69316.pdf: 16389099 bytes, checksum: 74eb72078f131d9d9be7efc37391f1e6 (MD5) 69316.pdf.txt: 484412 bytes, checksum: 46c33af71747059817ce7b4a20b609af (MD5) 69316.pdf.jpg: 1433 bytes, checksum: 084dde94865696f7af0cab1566875cf5 (MD5) Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical negligenciada que representa um grave problema de saúde pública. Assim, compreender a biologia da interação T. cruzi-hospedeiros constitui um grande desafio, uma vez que o ciclo de vida deste parasito exige um repertório de adaptações para garantir sua dispersão em hospedeiros vertebrados e invertebrados. O presente estudo demonstra o potencial das proteínas com propriedade de ligação à heparina (PLHs) em atuar no ciclo biológico do T. cruzi. Durante este trabalho foi oportuno isolar uma fração de proteínas hidrofóbicas com propriedade de ligação à heparina, com massas moleculares entre 70 kDa e 59 kDa em formas epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi por cromatografia de afinidade à heparina. A presença destas proteínas na superfície celular destes parasitos foi confirmada por ressonância plasmônica de superfície. Tais ensaios também foram decisivos na determinação da especificidade e estabilidade da ligação das PLHs a heparina, heparam sulfato (HS) e condroitim sulfato (CS). Os ensaios de competição realizados indicaram que a interação entre PLHs e GAGs pode influenciar a adesão dos epimastigotas à superfície de células epiteliais do trato intestinal de Rhodnius prolixus O envolvimento de GAGs na invasão de amastigotas em cardiomiócitos, célula alvo da infecção pelo T. cruzi, também foi demonstrado através de ensaios de competição com 20 \03BCg/ml de GAGs solúveis, incluindo heparina, HS, CS, dermatam sulfato (DS) e queratam sulfato (KS). Uma drástica redução no nível de infecção foi evidenciada apenas com heparina e HS, atingindo 82% e 65% de redução da invasão, respectivamente. Ensaios com células deficientes em GAGs (CHO-745) corroboraram o importante papel destes componentes de matriz extracelular no processo de reconhecimento e invasão de amastigotas. Na continuidade deste estudo, avançamos na caracterização bioquímica de PLHs, na determinação da expressão e distribuição espacial destas proteínas em tripomastigotas. As análises por citometria de fluxo revelaram que PLHs são abundantes na superfície de tripomastigotas, clone Dm28c, e a detecção destas proteínas por imunofluorescência indireta revelou uma localização predominante na membrana flagelar do parasito. Com os ensaios de zimografia realizados neste trabalho, revelamos que as PLHs de tripomastigotas tem atividade de protease sobre gelatina em uma ampla faixa de pH (5,5 - 8,0). A sensibilidade destas enzimas a presença de inibidores de serino protease indicam que as PLHs de tripomastigotas têm propriedades similares à tripsina. O conjunto de resultados deste trabalho aponta para o importante papel das PLHs em todas as etapas do ciclo biológico do T. cruzi a partir de eventos de adesão e invasão celular, através do reconhecimento de glicosaminoglicanos sulfatados / Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is a neglected tropical disease that causes a serious public health problem. Thus, understanding the biology of the T. cruzi-hosts interaction is a major challenge, since the life cycle of this parasite requires a repertoire of adaptations to ensure their dispersion in vertebrate and invertebrate hosts. The present study demonstrates the potential of proteins with heparin-binding property (HBPs) to act in the biological cycle of T. cruzi. During this study, it was opportune to isolate a hydrophobic protein fraction with property to bind to heparin, with molecular weights ranging from 70 kDa to 59 kDa, in epimastigotes and trypomastigotes of T. cruzi by heparin affinity chromatography. The presence of these proteins on the cell surface of these parasites was confirmed by surface plasmon resonance. These assays were also decisive in determining the specificity and stability of the binding of HBPs to heparin, heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS). The competition assays indicated that the interaction between HBPs and GAGs can influence the adhesion of the epimastigote to the surface of epithelial cells of the intestinal tract of Rhodnius prolixus. The involvement of GAGs in the invasion of amastigotes in cardiomyocytes, target cell of T. cruzi infection, was also demonstrated by competition assays with 20 μg/ml of soluble GAGs, including heparin, HS, CS, dermatan sulfate (DS) and keratan sulfate (KS). A drastic reduction in the level of infection was observed only with heparin and HS, reaching 82% and 65% reduction of the invasion, respectively. Experimental assays using cells deficient in GAGs (CHO-745) corroborated the important role of extracellular matrix components in the recognition and invasion of amastigotes. In continuation of this study, we advanced in the biochemical characterization of HBPs and also determined the expression and spatial distribution of these proteins in trypomastigotes. The flow cytometric analysis revealed that HBPs are abundant at the surface of trypomastigotes, Dm28c clone, and the detection of these proteins by indirect immunofluorescence revealed a predominant location in the flagellar membrane of the parasite. With the zymography assays conducted in this work, we revealed that HBPs of trypomastigotes have proteinase activity on gelatin in a wide pH range (5.5 - 8.0). The sensitivity of these enzymes in the presence of serine proteinase inhibitors indicates that HBPs of trypomastigotes have properties similar to trypsin. All together, the results of this study points out to the important role of HBPs at all stages of the life cycle of T. cruzi from events of adhesion and cell invasion, through the recognition of sulfated glycosaminoglycans

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 debora_mattos_ioc_mest_2014.pdf: 25027935 bytes, checksum: 36794f8df745a06c2879690ef1660179 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A susceptibilidade de Rhodnius prolixus ao T. rangeli depende da cepa do parasita e das interações moleculares no intestino e na hemocele do vetor. T. rangeli pode modular a resposta imune do vetor, preparando o hospedeiro à invasão e a sobrevivência dos parasitas na hemocele, superando assim as adversidades encontradas nos diferentes órgãos do inseto. Neste trabalho, são discutidos os mecanismos destas interações, destacando também o papel da microbiota intestinal e outros mecanismos importantes para o desenvolvimento do parasita. Inicialmente nossas investigações foram realizadas para comparar aspectos da imunidade celular e humoral de ninfas de 4º e 5º estádio de R. prolixus em resposta a uma infecção oral com a cepa Macias de T. rangeli. Na infecção oral em 4º estádio (acompanhamento em longo prazo), não foi observada diferença na mortalidade e muda ao comparar com os insetos controle não infectados. Constatou-se um número aumentado de flagelados no intestino das ninfas de 5º estádio durante o curso da infecção. Também, não houve alteração significativa na contagem de microagregados hemocitários (nódulos) em infecções de 4º estádio, enquanto em ninfas infectadas em 5º estádio houve um aumento no número de nódulos. Por outro lado, não houve diferença no número de hemócitos em ambas as infecções Demonstramos nos dois tipos de infecção oral com T. rangeli em R. prolixus, em comparação com os insetos controle não infectados, que o intestino médio atenuou a atividade de fenoloxidase, aumentou as atividades antibacterianas testadas in vitro contra Serratia marcescens, e alterou a expressão relativa de genes que codificam para defensinas (DefA, DefB, DefC), prolixicina e lisozimas (LisAe LisB). Isto sugere a influência destas atividades sobre a contagem de unidades formadoras de colônias, encontradas diminuídas no trato digestivo do inseto. Em uma segunda etapa do estudo, foram comparadas as respostas de defesa em ninfas de 5º estádio de R. prolixus inoculadas com T. rangeli, cepas Macias e H14. A cepa Macias de T. rangeli não aumentou a mortalidade desses insetos, apresentou capacidade de sobreviver e se multiplicar na hemolinfa, aumentou o número de hemócitos, e induziu alta atividade de fenoloxidase. Em contraste, estes mesmos parâmetros medidos em insetos inoculados com a cepa H14 de T. rangeli foram diferentes daqueles encontrados com inoculação de insetos usando a cepa Macias. Conclui-se que R. prolixus responde de forma distinta frente a vias de infecção oral ou por inoculação com T. rangeli, sugerindo que a capacidade infectiva deste protozoário, pode ser alterada por modulação do sistema imune do vetor

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:20:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcio_pavan_ioc_dout_2013.pdf: 7677814 bytes, checksum: c5a9a9ecaffcd4315201bdc148114cd6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / As dificuldades para a interrupção definitiva da transmissão vetorial do Trypanosoma cruzi decorrem primariamente de eventos de reinfestação por populações silvestres de triatomíneos das casas previamente tratadas com inseticidas e, de maneira secundária, do contato esporádico do homem com vetores infectados que habitam o peridomicílio e o ambiente silvestre. A escrutinização das regiões potenciais de transmissão endêmicas ou hipoendêmicas depende da correta diagnose das espécies vetoras e dos seus limites de ocorrência geográfica. No caso de espécies crípticas, a identificação taxonômica deve ser feita principalmente por métodos moleculares de baixo custo e eficientes, que a partir dos quais seja possível gerar resultados simples de interpretar. A diagnose correta dos vetores é útil para a determinação regional dos riscos potenciais de transmissão vetorial da doença em seres humanos. Contudo, o desenvolvimento de novas estratégias de controle mais eficazes depende do entendimento acerca dos padrões biológicos, ecológicos e evolutivos que estão envolvidos nos processos de domiciliação e especiação desses vetores. Estes padrões estão inseridos em um contexto espacial e temporal complexo, que só pode ser compreendido quando estudos em diferentes escalas geográficas e históricas são realizados. Neste contexto, o complexo de espécies crípticas R. prolixus e R. robustus s.l. serve como um importante modelo, por ser um grupo bem estudado, de filogenia conhecida e ocorrência geográfica previamente estimada Nesta tese foi avaliado o status taxonômico dessas espécies e as possíveis barreiras naturais ao fluxo gênico entre as linhagens determinadas com base em (1) análises filogenéticas, utilizando um marcador mitocondrial (Cytb) e cinco marcadores nucleares (ITS-2, period, timeless, cryptochrome2-I6, cryptochrome2-I8; (2) biogeográficas, utilizando duas calibrações geológicas do relógio molecular relaxado; (3) populacionais, analisando 10 loci de microssatélites; e (4) de comportamento, medindo as atividades locomotoras e estimando o período endógeno do relógio circadiano. Adicionalmente, foi identificado um marcador em um gene nuclear de cópia única (TPS165) que separa as espécies crípticas e de diferentes importâncias epidemiológicas: R. prolixus (imporância primária) e R. robustus s.l. (importância secundária). Ao todo, foram analisados 254 espécimes de R. prolixus e R. robustus s.l. As amostras de R. robustus foram obtidas após duas coletas ao longo de transectos que representam áreas contíguas de ocorrência das linhagens crípticas R. robustus III e IV, e R. robustus II, III e IV, de acordo com o que se conhece sobre a distribuição destes táxons. R. prolixus é uma espécie distinta de R. robustus s.l. e, portanto, válida. R. robustus s.l. é um complexo parafilético de, pelo menos, sete linhagens, das quais três parecem representar três espécies distintas \2013 R. barretti, R. robustus I e R. robustus V. A partir do resultado filogenético incongruente com base na topologia das árvores filogenéticas dos genes analisados das quatro linhagens restantes, R. robustus II, III, IV e sp. nov. representam um complexo de espécies in status nascendi As populações ancestrais de R. prolixus e R. robustus s.l. sofreram cladogêneses decorrentes de eventos geológicos amazônicos ocorridos entre o Mioceno Superior e o Pleistoceno Médio (entre 7 e 0,5 Maa). Apesar de os resultados filogeográficos, genealógicos e populacionais serem em parte concordantes com a hipótese de que R. prolixus e R. robustus s.l. se originaram na região do Orinoco e se diferenciaram possivelmente devido às modificações naturais na região pan-amazônica promovidas pelas \201Eincursões marinhas\201F do Mioceno, as datações obtidas para os eventos cladogenéticos das linhagens são concordantes com os períodos glaciais em que as florestas tropicais úmidas teriam sido reduzidas a \201Erefúgios\201F, durante o Plioceno e Pleistoceno / One of the current challen ges for the interruption of Trypanosoma cruzi transmission relies primarly on re - infestation events of insecticide - treated houses by sylvatic populations of triatomines and secondarily on the sporadic contact between infected sylvatic triatomines and susceptible humans. The scrutinization of regions with endemic or hypoendemic transmission depends on accurate species identification and its geographical boundaries. In the case of cryptic species, devising of simple, efficient and cost - effective methods for their identification is needed. Biological, ecological and evolutionary processes that can be involved in vectorial domiciliation and speciation are also relevant for th e development of innovative surveillance/ control strategies. These processes are embedded in a complex spatial and temporal context, which can be appreciated when historical and geographical approaches are considered in different scales. In this context, the cryptic species complex R. prolixus and R. robustus s.l. serves as a good model, as it is an extensive - studied group, with well - known phylogeny, and its geographical limits were previous estimated. During this thesis the taxonomic status of these linea ges were evaluated and also possible natural barriers for gene flow were determined, based on the following analyses: (1) phylogene tic, using one mitochondrial ( Cy t b) and five nuclear markers ( ITS - 2, period , timeless , cryptochrome 2 - I6, cryptochrome 2 - I8); ( 2) biogeographical, using a „relaxed‟ molecular clock with two geological calibrations; (3) population genetics, analyzing 10 microsatelite loci; and (4) behavioral, measuring locomotor activities and estimating the circadian clock periods. Moreover, it was describe d a non - coding, single - copy nuclear DNA fragment that contains a single - nucleotide polymorphism (SNP) with the potential to distinguish the important domestic Chagas disease vector , Rhodnius prolixus , from members of the sylvatic Rhodnius robus tus cryptic lineages complex . Two hundred and fifty four specimens of R. prolixus and R. robustus s.l. were obtained. R. robustus s.l. sampling were conducted along transects which cross areas of contiguous geographic distribution among R. robustus III and IV, and R. robustus II, III, and IV, based on the previous knowledge about lineages bondaries. R. prolixus is a is a paraphyletic assemblage of , at least, seven different lineages , three of which seem to be different species – R. barretti , R. robus tus I, and R. robustus V. Phylogenetic results of R. robustus II, III, IV, and n.sp. showed incongruent topologies on gene trees, and thus they represent a complex of species in status nascendi . Ancestral populations of R. prolixus and R. robustus s.l. cla dogenesis have probably occurred during geological events between Late Miocene and Middle Pleistocene ( 7 - 0.5 Mya). Although phylogeographical, genealogical, and population results partially agree with the predictions that R. prolixus and R. robustus s.l. w ere originated in the Orinoco biogeographical area and speciated during „mar ine incursions‟ of the Miocene E poch, „relaxed‟ clock analyses showed recent splits estimations, which coincides with the glacial time that occurred the fragmentation of moist fore sts in „refuges‟ during Late Pliocene and Early/Middle Pleistocene.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:16:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cecilia_vieira_ioc_dout_2015.pdf: 5478933 bytes, checksum: 82e22f21a3f655c7a35e09359316e42f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Rhodnius prolixus é um dos principais insetos vetores de Trypanosoma cruzi e de Trypanosoma rangeli na América Latina. A produção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) no trato digestivo ou corpo gorduroso do inseto é vital para evitar a proliferação de microrganismos patogênicos além de manter a homeostasia da microbiota nativa. O presente trabalho focou na modulação da imunidade humoral do intestino médio de R. prolixus desafiados oralmente com a bactéria Gram-positiva Staphylococcus aureus e Gram-negativa Escherichia coli, além de seus tripanosomatídeos naturais T. rangeli e T. cruzi, considerando a influência do desenvolvimento dos parasitas sobre a microbiota intestinal. Em condições normais, a região anterior do intestino médio houve maior abundância de transcritos de genes de lisozimas (lis) e defensinas (def), enquanto na posterior, do gene da prolixicina (prol). Insetos alimentados com bactérias Gramnegativas apresentaram maior quantidade de transcritos de defC e prol, enquanto a ingestão de bactérias Gram-positivas induziu a expressão de defA e defB no intestino médio A infecção por T. rangeli cepa Macias diminuiu a atividade fenoloxidásica, os níveis de expressão de lisozimas e prolixicina, ao mesmo tempo em que induziu aumento de atividade antibacteriana e dos níveis de defensina C no tubo digestivo do inseto, também modificando a composição de bactérias nativas. Além disso, foi verificado que as diferentes cepas de T. cruzi Dm 28c e Y modulam a resposta imune e a microbiota no intestino médio de R. prolixus de forma variável. T. cruzi Dm 28c induziu um aumento na expressão de genes de defensina C e uma diminuição da expressão de genes de prolixicina, reduzindo drasticamente a população bacteriana cultivável. Em contraste, T. cruzi Y não foi capaz de induzir a expressão de AMPs no intestino médio nem de reduzir consideravelmente a microbiota neste mesmo órgão. Nossos resultados sugerem que R. prolixus em resposta a ingestão de microrganismos, modula diferencialmente a expressão de AMPs pelas células epiteliais do intestino que acarreta a redução da microbiota e um favorecimento do desenvolvimento de T. rangeli e T. cruzi, dependendo do genótipo do parasita / Rhodnius prolixus is a major vector of Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi , in Latin America. T he production of antimicrobial peptides (AMPs) in the midgut of the insect is vital to control possible infection, and to maintain the microbiota already present in the digestive tract. This work focuses on the modulation of the humoral im mune responses of the midgut of R. prolixus orally challenged with Gram positive and Gram negative bacteria as well with T. rangeli Macias strain, T. cruzi Dm 28c and Y strain, considering the influence of the parasite s on the intestinal microbiota . Our re sults showed that the anterior midgut contents of control insects contain a higher inducible antibacterial activity and AMPs transcript abundance than those of the posterior midgut. Insects orally fed with Gram - negative bacteria presented higher amount of defC and prol transcripts, while the ingestion of Gram - positive induced defA and defB expression in the midgut. T. rangeli Macias strain successfully colonized R. prolixus midgut through a decreasing in PO activities , prolixicin and lysozyme levels, while at the same time in duc ed an increase in antibacterial activity and upregulated defC levels in the insect anterior midgut. T. rangeli infection also diminishes the amount of cultivable gut bacteria as well modif ied the composition of indigenous microo rganisms. Furthermore, different T. cruzi strains present distinct profile s of immune system and microbiota modulation in R. prolixus midgut, where T. cruzi Dm 28c was able to induce an increase in defensin C genes and a depression in prolixicin genes, whi le drastically reduce the cultivable bacteria population. In the other hand T. cruzi Y was not competent to induce AMPs expression in the gut or considerably reduce the microbiota in the anterior midgut. Our findings suggest that R. prolixus modulates AMP gene expression upon ingestion of bacteria and tripanosomatids with patterns that are distinct and dependent upon the species of the invading pathogen. Besides, t he trypanosome ability to induce immune peptides in epithelial cells seems to favor its development in the insect digestive tract by decreasing intestinal microbiota , depending on the parasite genotype

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-26Bitstream added on 2014-06-13T20:36:32Z : No. of bitstreams: 1 ferreirafilho_jcr_me_arafcf.pdf: 627816 bytes, checksum: b1c11f69fc69c2ac25f9a07f076cafa8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os membros da subfamília Triatominae são vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Eles compreendem 144 espécies agrupadas em 18 gêneros e são encontrados principalmente nas Américas, desde o sul dos Estados Unidos ao sul da Argentina e Chile. Essencialmente a identificação desses insetos tem sido baseada na descrição comparativa da morfologia de indivíduos adultos incluindo as estruturas da genitália masculina e feminina, aspectos gerais do corpo como cabeça, tórax, antena e coloração, entre outros. Entretanto a distinção por critérios morfológicos apresenta limitações para caracterização de espécies do gênero Rhodnius devido às semelhança entre elas, especialmente entre R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, espécies conhecidas como “grupo prolixus”. Nesse estudo as técnicas de biologia molecular, sequenciamento do gene 16S e PCR-RFLP, foram utilizados para caracterização de sete espécies de Rhodnius. Os produtos do sequenciamento do gene 16S das espécies R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, e R. sp geraram alinhamento de 380 pares de bases com 48 sítios polimórficos. A visualização das bandas geradas pelas enzimas de restrição BstUI, HhaI, RsaI and Mbol com as sete amostras de Rhodnius possibilitou distingui-las com exceção de R. prolixus, R. neglectus e R.robustus. Os dois métodos feitos para as mesmas amostras confirmaram a validade da utilização do método PCR-RFLP para identificação de R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, uma vez que o gene 16S já é um marcador estabelecido para as espécies de Rhodnius e as duas metodologias apresentaram os mesmos resultados, confirmaram também o trabalho realizado por Naegele et al. 2006 em que a técnica de PCR-RFLP distinguiu R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus / The members of the subfamily Triatominae are vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, which is the etiologic agent of Chagas disease. They consist of 144 species grouped into 18 genera and are found mainly in the Americas, from the southern United States to southern Argentina and Chile. Essentialy, the identification of these insects has been based on the comparative description of the morphology of adult specimens, including the structures of both the male and female genitalia, general body features like head, thorax, antennae and color, among others. However, this method is not particularly useful in the characterization of species belonging to the genus Rhodnius because they are very similar morphologically, specially R. prolixus, R. domesticus, R. robustus, R. neglectus, and R. nasutus, which are known as “prolixus complex”. In this study molecular biology techniques, such as sequencing of 16S gene and PCR-RFLP, was used to contribute to the characterization of seven species of Rhodnius. The products of the sequencing of the 16S species R. brethesi; R. nasutus, R. nasutus, R. neglectus, R. pictipes; R. prolixus, R. robustus, and R. sp generated a alingment of 380bp with 48 polymorphic sites. The visualization of the bands arising from the use of restriction enzymes BstUI, HhaI, RsaI and Mbol with samples of seven species of Rhodnius possible to distinguish them except for R. prolixus, R. neglectus and R.robustus. The two methods performed in parallel for the same samples confirmed the validity of using the enzymatic method for specific identification of R. brethesi, R. nasutus, R. pictipes e R. sp, since the 16S gene is already an established marker for it and the two methods showed the same results, confirmed too the work performed by Naegele et al.2006 that the PCR-RFLP technic distinguished R. stale, R. pictipes, R. Prolixus and R. domesticus