O tecido adiposo perivascular (PVAT) da aorta torácica (AT) possui ação anticontrátil (AC). O PVAT da AT e das artérias mesentéricas de resistência (AM) possuem diferentes características. Na obesidade ocorre expansão do PVAT. Nós avaliamos a modulação da contração pelo PVAT da AT e AM em camundongos controles (CT) e obesos (OB) e a participação do sistema renina-angiotensina (SRA), por meio do tratamento com antagonista do receptor AT1 (BRA). PVAT da AT e AM apresentaram ação AC. Ação AC do PVAT das AM, mas não da TA, foi abolida no grupo OB. BRA resgatou a ação AC do PVAT das AM no grupo OB, que foi abolida pelo antagonismo do receptor AT2 e pela inibição da óxido nítrico (NO) sintase (NOS). Em AM, a expressão dos receptores AT1 e AT2 não foi modificada e da NOS endotelial foi aumentada em AM e reduzida no PVAT da AM no grupo OB. BRA aumentou a expressão da eNOS no PVAT das AM nos dois grupos. Assim, concluímos que a obesidade induz disfunção do PVAT de AM e há envolvimento do SRA. BRA corrige a função do PVAT de AM por mecanismo dependente do receptor AT2 e NO. / The perivascular adipose tissue (PVAT) of thoracic aorta (TA) has an anticontractile (AC) action. TA and resistance mesenteric arteries (MA) PVAT have different characteristics. Expansion of PVAT occurs in obesity. We evaluated the modulation of contraction by PVAT of TA and MA in control (CT) and obese (OB) mice and the participation of the renin-angiotensin system (RAS), by treating mice with AT1 receptor antagonist (ARB). PVAT of both TA and MA showed an AC action. The AC action of MA PVAT, but of TA PVAT, was abolished in the OB group. ARB recovered the AC action of MA PVAT in OB group, which was abolished by both AT2 receptor antagonism and nitric oxide (NO) synthase (NOS) inhibition. In MA, the expression of AT1 and AT2 receptors was not changed and the expression of eNOS was increased in MA and reduced in MA PVAT of OB group. ARB increased the expression of eNOS in MA PVAT in both CT and OB groups. In conclusion, obesity induced MA PVAT dysfunction, in which RAS is involved. ARB recovered the MA PVAT function by mechanisms that depend on the AT2 receptor and NO.

A ativação de receptores da imunidade inata nas células do sistema imune, no tecido adiposo e as alterações na microbiota intestinal foram relacionadas aos fenótipos inflamatórios e metabólicos na obesidade. Aqui, nós formulamos a hipótese de que a via MyD88 em determinados tecidos é crítica e determinante nas alterações secundárias a obesidade experimental. Verificamos que camundongos MyD88 nocaute (KO) desenvolvem severa síndrome metabólica e diminuição de IL-1β, TNF-α e IL-6 no tecido adiposo apesar do predomínio de macrófagos de perfil M1. No intestino, observamos menor inflamação e aumento da permeabilidade. A microbiota dos camundongos MyD88 KO induziu resistência à insulina nos camundongos WT. A depleção de MyD88 no tecido adiposo não alterou o perfil metabólico, porém, a depleção de MyD88 nos macrófagos, protegeu os camundongos da síndrome metabólica. No tecido adiposo dos camundongos MyD88 KO obesos, observamos um aumento da expressão de Dectina-1 e IFN-β. Assim, MyD88 desempenha um papel importante no desenvolvimento da obesidade modulando a microbiota e o perfil inflamatório. / Activation of innate immune receptors in immune cells, adipose tissue, and changes in intestinal microbiota were related to inflammatory and metabolic phenotypes during obesity. Here, we hypothesize that MyD88 signaling in certain tissue are critical to those phenotypes observed in obese mice. We observed that MyD88 knockout (KO) mice develop severe metabolic syndrome and decreased IL-1β, TNF-α and IL-6 in adipose tissue despite the predominance of M1 macrophage. In the intestine, we observed decreased inflammation and increased permeability. The microbiota of MyD88 KO mice induced insulin resistance in WT mice. Depletion of MyD88 in adipose tissue did not alter the metabolic profile. However, depletion of MyD88 in macrophages protected mice from metabolic syndrome. In adipose tissue of MyD88 KO obese mice, we observed an increased expression of Dectin-1 and IFN-β. Thus, MyD88 plays an important role in the development of obesity modulating gut microbiota and the inflammatory profile.

Diferentes condições podem alterar as características fisiológicas, metabólicas, nutricionais e morfológicas. Assim, o objetivo desse estudo foi analisar o efeito do treinamento físico, destreinamento e especialmente destreinamento combinado com a suplementação de leucina sobre o peso corporal, composição corporal, homeostase glicêmica e expressão e fosforilação da via de sinalização da proteína alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Quarenta e seis ratos Wistar adultos machos foram divididos em 4 grupos: 31 ratos foram treinados em esteira por 8 semanas e 15 foram usados como controle (ratos sedentários). Destes, 15 ratos foram eutanasiados imediatamene após o treinamento (grupo treinado = 8 e grupo controle =7), 8 continuaram treinando, 16 foram mantidos sem exercícios (grupo destreinado = 8 e grupo destreinado suplementado com leucina = 7), e os 7 ratos restantes foram usados como controle (ratos sedentários) por mais 6 semanas antes de serem eutanasiados. Os animais do grupo destreinado foram alimentados com uma dieta contendo ~18% de proteínas, suplementados ou não com 5% de leucina. A composição corporal, o consumo alimentar, o volume de adipócitos, a glicose de jejum, o teste oral de tolerância à glicose (TOTG), o teste oral de tolerância à insulina (TTI), a atividade da citrato sintase, as concentrações séricas de leptina, adiponectina, aminoácidos e ácidos graxos não esterificados (AGNE) e a expressão e fosforilação da proteína mTOR foram avaliados. Os resultados de peso corporal, gordura corporal, coxins adiposos epididimal e retroperitoneal, volume de adipócitos, consumo alimentar, concentração sérica de leptina e TOTG foram significantemente menores nos animais treinados do que nos sedentários e destreinados (P < 0,05). Nenhuma diferença significante foi observada nos valores de glicemia de jejum, TTI e AGNE entre os três grupos (P > 0,05). Por outro lado, o grupo treinado apresentou valores significantemente mais altos para a atividade da citrato sintase do que os grupos sedentário e destreinado (P < 0,05). Nenhuma diferença significante (P > 0,05) foi identificada na comparação entre os grupos destreinados (com ou sem suplementação de leucina), incluindo a expressão e fosforilação da proteína mTOR. O exercício moderado exerce um efeito protetor sobre a composição corporal e a homeostase glicêmica, enquanto que a interrupção do treinamento físico teve um efeito negativo sobre essas variáveis. Os resultados sugerem que a suplementação crônica de leucina parece não reduzir os efeitos deletérios do destreinamento. / Different conditions may alter physiological, metabolic, nutritional, and morphological characteristics. Thus, the aim of this study was to analyze the effects of training, detraining, and especially detraining combined with leucine supplementation on body weight, body composition, glicemic homeostasis and expression and phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) protein-signaling pathway in epididymal adipose tissue in rats. Fourty-seven male adult Wistar rats were divided into 4 groups: 32 rats were trained on a treadmill for 8 weeks and 15 were used as controls (untrained rats). Of these, 15 rats were euthanized immediately after training (trained group = 8 and control group = 7), 8 continued in training, 16 were caged without exercise (detrained group = 8 and detrained group plus leucine supplementation = 7), and the remaining 7 rats were used as controls (untrained rats) for more 6 weeks before being euthanized. Animals of the detrained groups were fed with a ~18% protein diet supplemented or not with 5% leucine. Body composition, food intake, adipocytes size, fasting glucose, oral glucose tolerance test (OGTT), insulin tolerance test (ITT), citrate synthase activity (CS), serum leptin, adiponectin, amino acids and non-esterified fatty acids (NEFA) concentrations and expression and phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR) protein were measured. Body weight, body fat, epididymal and retroperitoneal fats depots, adipocytes size, food intake, serum leptin concentration and OGTT were significantly lower in trained animals than in untrained and detrained (P < 0.05). No significant differences in the fasting glucose, ITT and NEFA among the three groups were observed (P > 0.05). On the other hand, the trained group showed a significantly higher score in the citrate synthase activity than both untrained and detrained groups (P < 0.05). No significant differences (P > 0.05) were identified in the comparisons between detrained groups (with and without leucine supplementation), including of the mTOR protein expression and phosphorylation. Moderate exercise exerted a protective effect on the body composition and glucose homeostasis while sudden discontinuation of physical training had a negative effect on such variables. Our results suggest that chronic leucine supplementation not seems to decrease the deleterious effects caused by detraining.

As células tronco mesenquimais (MSC) têm capacidade imunossupressora envolvendo diferentes mecanismos. No entanto, ainda não está claro o que desencadeia as diferentes vias de imunorregulação, ou mesmo o que determina a magnitude de sua capacidade supressora. A nossa hipótese é que a intensidade da atividade supressora das MSC esteja vinculada à sua capacidade de desencadear múltiplas vias moleculares, simultaneamente. Utilizamos uma estratégia experimental na qual testamos o efeito das MSC humanas do tecido adiposo (AdMSC), derivadas de diferentes indivíduos, sobre a proliferação de PBMC estimuladas, obtidas do mesmo indivíduo, visando relacionar o efeito supressor com a ocorrência simultânea de modificações imunomoleculares (expressão de mRNA e proteínas), tanto nos linfócitos T como nas AdMSC. Foram comparadas as correlações entre as modificações de expressão gênica e proteica nos ensaios com maior (> 50% inibição de proliferação de linfócitos T) ou menor (<50% de inibição) capacidade supressora. A primeira novidade do nosso trabalho é que durante a atividade supressora das AdMSC, múltiplas moléculas são acionadas, simultaneamente, nos linfócitos T (LT) e nas próprias AdMSC, indicando a importância da ação integrada de múltiplas vias moleculares. Várias dessas modificações de expressão gênica ocorreram de forma dominante (em todos os experimentos), como o aumento da expressão de IDO, ILB e MMP2 nos LT e de diversas moléculas nas AdMSC (entre elas: IDO, HLAG, IL10, PDL1, SEMAD4, MMP9, FASL e várias quimiocinas). Ademais, relatamos diversos novos mecanismos potencialmente envolvidos na atividade supressora das AdMSC humanas, entre eles, a diminuição do número de células T efetoras ativadas, CD4 e CD8 expressando ICOS e CD8 positivas expressando OX40, além do aumento do número de uma população específica de células T reguladoras (CD4+CD25hiFOXP3+) expressando a ectoenzima CD73, importante na geração de adenosina, molécula com atividade imunorreguladora. Descrevemos também outras novas moléculas possivelmente envolvidas nos mecanismos de imunossupressão das AdMSC como SEMA4D, MMP9, CCL22 e RUNX3, cuja expressão aumentou nas AdMSC após o cocultivo e GARP, CTNNB1, IL1B e MMP2, nos LT. Mostramos, pela primeira vez, um perfil imunomolecular diferencial nos ensaios de maior capacidade supressora, com correlações positivas específicas entre os aumentos da expressão gênica, nos dois tipos celulares, envolvendo moléculas como HLAG e CCR4, IL13, IL4, TLR10, IL1B, GARP, S1PR1 e CTNNB1 (-catenina), nos linfócitos T e, nas AdMSC, CCL22 com MMP9 e HLAG com FOXP3. Assim, sugerimos que a magnitude da atividade supressora das AdMSC depende da combinação de múltiplas vias moleculares mobilizadas, simultaneamente, e relacionadas com a indução de um perfil Th2, migração e sobrevida celular, bem como com a atividade imunorreguladora. Além de apontar novas moléculas ao repertório imunomolecular da atividade supressora das AdMSC humanas, trazemos uma contribuição importante, apresentando uma visão mais ampla da rede de interações imunomoleculares envolvida na atividade supressora das MSC / Mesenchymal stem cells (MSC) exhibit immunosuppressive activity operating by a variety of mechanisms. However, it is still unclear what triggers the different immunoregulatory pathways, or what determines the magnitude of their suppressive capacity. We hypothesized that the magnitude of MSC suppressive activity may be related to their capacity to activate multiple pathways, simultaneously. We used an approach in which we tested the effect of different human MSC derived from adipose tissue (AdMSC) over T cell proliferation, using PBMC obtained from a single donor. We determined the relationship between AdMSC suppressive activity and the simultaneous occurrence of immunomolecular changes (mRNA and protein expression) in both AdMSC and T cells, following AdMSC/PBMC interactions. Correlations of gene expression and protein modifications were compared in assays in which AdMSC displayed high (>50% of T cell proliferation inhibition) and low (<50% inhibition) immunosuppressive activity. The first novelty from our work is that multiple molecules are simultaneously activated, in both AdMSC and T cells, indicating the importance of an integrated action of several molecular pathways. Many of these gene expression modifications were dominantly (in all experiments) upregulated, namely: IDO, IL1B and MMP2 in T cells and several molecules in AdMSC such as: IDO, HLAG, IL10, PDL1, SEMAD4, MMP9, FASL, as well as many chemokines. We also report novel mechanisms potentially involved in human AdMSC suppressive activity, such as the decrease in the number of activated T cells, CD4 and CD8 cells expressing ICOS and CD8 positive cells expressing OX40. We also found an increase in the numbers of a specific Treg subpopulation (CD4+CD25hiFOXP3+) expressing the ectoenzime CD73, important in the generation of adenosine, a molecule displaying suppressive activity. Moreover, we report other novel molecules possibly involved in AdMSC suppressive activity, once their gene expression was upregulated in AdMSC (SEMA4D, MMP9, CCL22 and RUNX) and in T cells (GARP, CTNNB1, IL1B e MMP2), following AdMSC/PBMC interactions. We also show, for the first time, a differential immunomolecular profile in the assays with high suppressive activity, showing exclusive positive correlations among changes in gene expression, involving multiple molecules, such as HLAG with CCR4, IL13, IL4, TLR10, IL1B, GARP, S1PR1 and CTNNB1 (-catenin) in T cells, and CCL22 and MMP9, with HLAG and FOXP3, in AdMSC. We, therefore, suggest that the magnitude of AdMSC suppressive activity depends on a particular combination of multiple immunoregulatory pathways simultaneously activated and related with the induction of a Th2 profile, cell migration and survival, as well as with immunoregulatory activity. Besides adding new players to the scenario of MSC suppressive activity, we believe our data bring a major contribution to the field, by providing a broader view of the interactive immunoregulatory molecular networks involved in MSC immunologic activities

Dissertação de Mestrado em Nutrição Clínica apresentada à Faculdade de Ciências da Nutrião e Alimentação da Universidade do Porto / Resumo da tese: Enquadramento: A obesidade, ou acumulação excessiva de tecido adiposo (TA), de génese multifactorial, constitui um importante factor de risco para o desenvolvimento e agravamento de outras doenças, em parte devido à desregulação e inflamação do TA. Com o intuito de desenvolver intervenções mais eficazes, incluindo políticas de saúde e opções de tratamento, tem-se procurado identificar substâncias com características capazes de prevenir/tratar a obesidade e suas respectivas comorbilidades. Este estudo focou-se sobre o àcido acetilsalicílico (ASA), devido às suas reconhecidas propriedades anti-inflamatórias, e também no vinho tinto (VT), que se apresenta como uma bebida interessante do ponto de vista nutricional, devido à sua abundância em compostos polifenólicos, com propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e de regulação do ciclo celular. Além disso, foi já descrita a interferência do etanol (EtOH) nos efeitos anti-inflamatórios e metabólicos do ASA. Objectivo: Este trabalho foi realizado com o objectivo de avaliar os efeitos da ingestão prolongada de substâncias anti-inflamatórias (ASA e VT) na biologia do TA, com especial relevo no tamanho de adipócitos, transcrição de marcadores de diferenciação e inflamação e avaliação de marcadores metabólicos e inflamatórios plasmáticos, no Rato. Metodologia: O trabalho foi dividido em duas fases. Na primeira, 4 grupos de ratos Wistar machos foram sujeitos a diferentes regimes de ingestão de líquidos: 1) água (C, controlo; n= 5), 2) solução de EtOH a 13% (v/v, n=5), 3) solução de ASA (10mg/kg do peso corporal, n= 6) e 4 ) ASA (10mg/kg do peso corporal, n= 6) em solução de EtOH a 13% (ASA+EtOH). A segunda fase envolveu 3 grupos de animais aos quis foi fornecido como única fonte de bebida: 1) água (C, controlo; n= 5), 2) 13% solução de EtOH (n=5) e 3) VT (com 13% EtOH, n=4). As bebidas foram fornecidas ad libitum em recipientes escuros. / Thesis abstract: BACKGROUND: Obesity, or the increased accumulation of adipose tissue (AT), is an important risk factor for the development and worsening of other diseases, in part because of the associated metabolic deregulation and low grade inflammatory state. In order to develop more effective interventions, including health policies and treatment options, the identification of substances capable of preventing/treating obesity may be of great help. In this study we focused on acetylsalicylic acid (ASA), because of its recognized anti-inflammatory properties, aud also on red wine (RW), which appears to be an interesting beverage from a nutritional point of view, due to its abundance of polyphenolic compounds, with their antioxidant, anti-inflammatory and cell aycle regulation properties. Also, ethanol (EtOH) has been described to interfere with the anti-inflammatory and metabolic effects of ASA. AIM: This work was carried out to evaluate the effects of ingestion of anti-inflammatory substances (ASA and RW) on the biology of AT, particularly the size of adipocytes, transcription and differentiation markers of inflammation and evaluation of inflammatory and metabolic plasmatic markers in the rat. METHODS: The work was divided into two stages. In the first one, 4 groups of male Wistar rats were subjected to different liauid regimens: 1) water (C, control; n= 5), 2) 13% EtOH solution (v/v, n = 5), 3) ASA solution (10 mg/kg of body weight (n = 6), and 4) ASA (10 mg/kg of body weight, n= 6) in 13% EtOH (ASA+EtOH). The second stage involved 3 groups of animals having as sole drinking source: 1) water, 2) 13% EtOH solution (n= 5), and 3) RW (with 13% EtOH; n=4). The beverages were supplied to the rats ad libitum in dark bottles. Body weight was monitored every 2 to 3 days. Beverages and animal pellet food were renewed every 2 to 3 days.

Orientador: Rogerio Martins Amorim / Resumo: As células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam propriedades antiinflamatórias, imunomoduladoras, neuroprotetoras e neurorregenerativas. Pela capacidade regenerativa limitada do tecido neural, o potencial terapêutico das células-tronco tem sido estudado em várias enfermidades do sistema nervoso central (SNC). Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade, segurança e a resposta a transplantes intratecais sucessivos, de CTM provenientes de diversas fontes em equinos. Para isso, foram avaliados o potencial de transdiferenciação, terapêutico e o co-cultivo com líquido cefalorraquidiano (LCR) de CTM provenientes da medula óssea, tecido adiposo e cordão umbilical. Posteriormente, as CTM foram utilizadas para o transplante por via intratecal (IT) pela cisterna lombo-sacra (LS), atlanto-occipital (AO) e entre as vértebras C1-C2 em animais sadios (GS), totalizando 3 aplicações com intervalo de 30 dias. Adicionalmente as CTM foram rastreadas por cintigrafia após os transplantes pelas via AO e LS. Finalmente, as CTM foram utilizadas para o transplante IT entre as vértebras C1-C2 em animais com incoordenação motora decorrente de Mieloencefalite Equina por Protozoário (MEP) – grupo doente (GD), sob o mesmo protocolo. Todos os animais (GS e GD) foram avaliados por exame clínico e neurológico, análise hematológica e do LCR antes e após os transplantes. Os resultados demonstraram que as CTM provenientes de diversas fontes apresentaram efeitos positivos na presença de LCR,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: José Corrêa de Lacerda Neto / Banca: Ana Liz Garcia Alves / Banca: Cristina de Oliveira Massoco / Banca: Silvana Martinez Baraldi Artoni / Banca: Marcia Rita Fernandes Machado / Resumo: As células-tronco da linhagem mesenquimal representam uma fonte promissora para o tratamento de injúrias do sistema músculo-esquelético de equinos atletas. Objetivou-se com este trabalho avaliar técnicas de coleta e isolamento de células-tronco mesenquimais em equinos, determinar a caracterização morfológica e fenotípica e avaliar o comportamento celular sob diferentes condições de cultivo. Cinco cavalos foram submetidos à coleta de medula óssea do esterno e de tecido adiposo da região glútea. As amostras foram processadas para o isolamento de células mononucleares e cultivadas em dois tipos de meios de cultivo. No vigésimo quinto dia, foi adicionado TGF-β1, mantendo um grupo controle para cada meio. As técnicas de coleta e processamento foram avaliadas por meio de fatores como facilidade de obtenção, viabilidade celular e número de células obtidas. Características morfológicas qualitativas foram avaliadas semanalmente mediante observação das colônias por microscopia óptica de luz invertida. Características fenotípicas foram avaliadas testando-se marcadores de superfície. Os efeitos do TGF-β1 sobre as culturas de células foram determinados por meio de avaliação citoquímica, número de unidades formadoras de colônia e porcentagens de apoptose e necrose. Foram observadas diferenças entre as amostras em fatores como a viabilidade celular após descongelamento, formação de colônias e relação entre necrose e apoptose em meios de cultivo diferentes. O TGF-β1 apresentou um efeito indutor de apoptose e estimulou a formação de colônias e a produção de proteoglicanas sulfatadas confirmando o efeito condrogênico / Abstract: Mesenchymal stem cells could be a new treatment for healing musculo-skeletal injuries of equine athlete. The objectives of this study were: to analyze the harvest and isolation techniques of equine mesenchymal stem cells, to determine morphological and phenotypical characterization and to evaluate cellular behavior in different culture conditions. Five horses had sternal aspirates bone marrow and croup fat tissue harvest. Both of them harvested materials was processed for mononuclear cells isolation and cultivate in two different kinds of culture medium. Twenty-five days later TGF-β1 was add in both culture mediums, remains a control group for each one. The harvest and process techniques were evaluated through some factors like: easily of harvest, cellular viability and cellular number. Morphological qualitative characteristics were described weekly by culture microscopy observation. Phenotypical characteristics were evaluated testing cluster markers. The effects of TGF-β1 on the cells cultures were determined by histological evaluation, number of unit forming colony and relation between necrosis and apoptosis. Differences between bone marrow and fat tissue cells were observed in some factors like: cellular viability after freezing, unity colony forming and relation between necrosis and apoptosis in different mediums culture. TGF-β1showed apoptosis inductor effect and stimulated the unit forming colony and sulfated proteoglicans production confirming the chondrogenic effect / Doutor

A descoberta das células tronco adultas tornou possível a sua aplicação clínica em protocolos de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos para a reparação de órgãos danificados ou pouco funcionais. Neste sentido, são conhecidas muitas fontes diferentes de células tronco adultas, entre elas o tecido epitelial, o tecido muscular e a medula óssea. Recentemente, o tecido adiposo adulto foi reconhecido como uma fonte alternativa, acessível e rica em células tronco mesenquimais (MSCs), também denominadas de células tronco derivadas do tecido adiposo (hADSCs). As hADSCs são as células tronco adultas que apresentam a maior plasticidade, e são facilmente isoladas pela característica de aderência a substratos plásticos. Sob condições específicas de cultivo, as hADSCs podem diferenciar-se em células precursoras osteoblásticas. Dentre as proteínas necessárias para a diferenciação das hADSCs, o papel do complexo minichromosome maintenance (MCM) não é muito bem conhecido. A proteína MCM2 é parte do complexo MCM, fazendo parte do complexo pré-replicativo (pre-RC). Em células proliferativas, o gene MCM2 apresenta alta expressão, sendo que o seu produto gênico está relacionado com os mecanismos de reparação de DNA. Sendo assim, analisamos as mudanças na expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação das hADSCs em diferentes meios de cultura, contendo BMP-4 ou OM. Os genes relacionados com a osteodiferenciação, como osteocalcina (OC), osteopontina (OP) e fosfatase alcalina (ALP) foram analisados por RT-PCR, por PCR em tempo real e citoquímica. Os dados obtidos pelas técnicas citoquímicas e de biologia molecular indicaram uma diminuição da expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação, que pode estar relacionada com danos ao DNA ou senescência nas hADSCs. / The discovery of adult stem cells is a promise field in regenerative medicine and tissue engineering. There are many sources of adult stem cells among which of whom are the skin, muscle and bone marrow. Currently, the adipose tissue has been an alternative source of mesenchymal stem cells (MSCs), termed human adipose-derived stem cells (hADSCs). The MSCs are the most plastic adult stem cells known until now and are easily isolated by adherence in plastic substrates. Under specifics conditions of culture hADSCs can be differentiated in osteoblast cell precursors. Among proteins needed for hADSCs differentiation, the roles of minichromosome maintenance (MCM) complex remains poorly understood. The protein complex MCM2-7 is part of DNA pre-replicative complex (pre-RC), being abundant in proliferating cells and involved in DNA repair mechanisms. In this sense, the Mcm2 is essential for the activity of the MCM complex. Thus, we analysed MCM2 gene expression changes during osteoinduction by culturing hADSCs in different media containing BMP-4 or in osteogenic medium. Genes related to osteodifferentiation, like osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and alkaline phosphatase (ALP) were analysed by molecular and cytochemistry approaches during osteodifferentiation. Interestingly, we observed a decrease in the MCM2 gene level osteoinduction of hADSCs in osteogenic medium, which could be related to an increase in genome damage and senescence in hADSCs.

Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2010 / Bibliografia: f. 60-71 / Introdução: A incidência de insuficiência cardíaca continua aumentando e a doença coronariana é a principal causa. O transplante celular com células tronco surgiu co-mo método de terapia investigacional na insuficiência cardíaca. Seu mecanismo de ação não / Introduction: The incidence of heart failure continues increasing and the coronary disease is the main cause. The cellular transplant with stem cells emerged as a me-thod of investigational therapy in heart failure. Its mechanism of action is not clear-cu

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-21T11:14:44Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881976 bytes, checksum: 4c7cade60beaef34544554064e425c82 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-21T11:14:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881976 bytes, checksum: 4c7cade60beaef34544554064e425c82 (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho foi desenvolvido a partir de dois experimentos descritos em dois capítulos. O primeiro com objetivo de verificar se a adipogênese contribuiria para discrepância no teor de gordura intramuscular presente na carne de animais Nelore comparado a animais Angus em fase de terminação. Objetivou-se ainda investigar se possíveis diferenças na quantidade de células adipo-fibrogênicas presentes no tecido muscular esquelético de animais Angus e Nelore estaria associada à diferença no teor de gordura intramuscular da carne oriunda desses animais. Foram utilizados 6 animais da raça Nelore (peso inicial = 372,5 ± 37,3 kg) e 6 da raça Angus (peso inicial = 382,8 ± 23,9 kg), mantidos sob as mesmas condições experimentais. Os animais foram abatidos no final do período de terminação, e amostras do Longissimus dorsi foram coletadas logo após a sangria, para posterior ánalises de expressão gênica (RT-PCR) e expressão proteica (Western blot). Outras amostras na mesma região muscular foram coletadas 24 horas após o abate, para posterior análise de extrato etéreo e colágeno. Os genes adipogênicos avaliados foram: C/EBPα, PPARγ e Zfp423; Sendo que o PPARγ e Zfp423 também tiveram sua expressão proteica avaliada. Os genes fibrogênicos avaliados foram: COL1A1, COL3A3, FN1, LOX, MMP2, TIMP1, TIMP2, TIMP3 e TGF-β, para o TGF-β também foi realizada expressão de proteína. Além dessas, foram realizadas expressão proteica da SMAD (proteína envolvida na iniciação da fibrogênese) e da PDGFRα (proteína indicadora de células indiferenciadas), comum às vias de sinalização adipogênica e fibrogênica. Não foi observada diferença significativa para expressão gênica dos mRNA adipogênicos e fibrogênicos (P > 0,05). No entanto, houve diferença significativa entre Angus e Nelore para expressão proteica do SMAD (P < 0,05), PPARγ (P < 0,05) e PDGFRα (P < 0,05), em que tais proteínas foram mais expressas nos animais da raça Angus. Embora não tenha sido encontrada diferença para quantificação química de colágeno e sua solubilidade (P > 0,05), houve diferença entre as raças para quantificação química do extrato etéreo, indicando maior deposição de gordura intramuscular em Angus do que em Nelore (P < 0,001). Conclui- se que existe diferença na adipogênese intramuscular entre animais Angus e Nelore, o que contribui para diferenças na quantidade de tecido adiposo intramuscular depositado na carne destes animais. Além disso, a maior expressão de PDGFRα em Angus em relação a Nelore evidencia maior número de células mesenquimais indiferenciadas em músculo esquelético de animais Angus em relação a animais Nelores. Dada à capacidade adipo- fibrogênica das células PDGFRα associado à ausência de diferenças entre as raças quanto à fibrogênese, a maior abundância de células mesenquimais indiferenciadas observada no tecido muscular esquelético dos animais Angus explica a diferença quanto à adipogênese intramuscular entre as raças estudadas. No segundo experimento, objetivou-se avaliar a atividade da calpastatina e expressão de mRNA de possíveis marcadores da maciez da carne no músculo Longíssimus dorsi de Angus e Nelore. Foram utilizados os mesmos animais do experimento anterior. Os animais foram abatidos no final do período de terminação, e amostras do Longissimus dorsi foram coletadas logo após a sangria, para posterior ánalises de expressão gênica (RT-PCR) para calpaína 3 (CAPN3), calpastatina (CAST), caspase 3 (CASP3) e HSP70 (DNAJA1) e também expressão proteica (Western blot) para calpaína e calpastatina. Outras amostras na mesma região muscular foram coletadas 24 horas após o abate, para posterior análise de atividade da calpastatina, força de cisalhamento e índice de fragmentação miofibrilar (IMF). Não houve diferença significativa para expressão gênica da CAPN3, CAST, CASP3 e DNAJA1 (P > 0,05). Apesar da atividade da calpastatina ter sido maior em Nelore do que em Angus (P = 0,0292), não houve diferença para a expressão proteica da calpastatina e nem da calpaína (P > 0,05). No entanto, observou- se diferença significatica para o índice de fragmentação miofibrilar (P = 0,0051), em que a carne de Angus apresentou maior IMF que a do Nelore. Conclui-se que embora haja diferença na atividade da calpastatina entre os dois grupos genéticos estudados, não se é verificado diferença quanto a abundancia dessas proteínas na carne de Nelore e Angus. No entanto, o maior índice de fragmentação miofibrilar dos Angus indica maior degradação miofibrilar post – mortem e consequentemente carne mais macia do que Nelore. A ausência de diferença na expressão da caspase e da HSP70 aqui encontrada, deve ser melhor investigada a fim de esclarecer melhor a importancia destas proteínas no amaciamento da carne de bovinos Nelore e Angus. / This work presents two experiments that were described separately in chapters. The first trial was conducted to evaluate if the difference between Angus and Nellore on intramuscular fat content after finishing period can be explained by adipogenesis. In addition, was evaluated if discrepancy of intramuscular fat content in beef from Nellore and Angus is associated with differences on amount of intramuscular adipo/fibrogenic cells. Six Nellore (initial body weight = 372.5 ± 37.3 kg) and six Angus (initial body weight = 382.8 ± 23.9 kg) were confined at the same experimental conditions. At the end of finishing period, the animals were slaughtered and longissimus muscle samples for quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot were collected just after exsanguination. Longissimus muscle samples for ether extract and collagen assays were obtained at the same carcass region after 24 hours chilling. The qPCR were performed to evaluate mRNA expression of adipogenic genes (C/EBPα, PPARγ and Zfp423) and fibrogenic genes (COL1A1, COL3A3, FN1, LOX, MMP2, TIMP1, TIMP2, TIMP3 and TGF-β). Western blot assays were performed to evaluate protein expression of adipogenic markers (PPARγ and Zfp423), the fibrogenic marker TGF-β and genes related with both pathways (SMAD and PDGFRα). No differences (P > 0.05) were observed for mRNA expression of neither adipogenic nor fibrogenic markers. However, the breed affected (P < 0.05) protein expression of SMAD, PPARγ and PDGFRα, which were greater in Angus than Nellore. Although meat collagen content and solubility did not differ (P > 0.05) among breeds, Angus meat presented greater (P < 0.001) ether extract content than Nellore, proving greater intramuscular fat in Angus beef. In conclusion, the Angus enhanced adipogenesis contribute to greater intramuscular fat content of this breed in contrast to Nellore cattle. In addition, Angus higher PDGFRα expression likely indicate greater muscle content of undifferentiated mesenchymal cells than Nellore. Our data suggest that although PDGFRα cells have adipo/fibrogenic capacity, fibrogenesis is not different among breeds thus greater density of undifferentiated mesenchymal cells in Angus explain the greater adipogenesis compared to Nellore. The second trial aimed to evaluate calpastatin activity and gene expression of meat tenderness markers of longissimus muscle from Angus and Nellore. The same animals from the first trial were used. At the end of finishing period, the animals were slaughtered and longissimus muscle samples for quantitative real-time PCR (qPCR) and Western blot were collected just after exsanguination. The qPCR were performed to evaluate mRNA expression of calpain 3 (CAPN3), calpastatin (CAST), caspase 3 (CASP3) and HSP70 (DNAJA1). Protein expression (Western blot) of calpain and calpastatin were also evaluated. Longissimus muscle samples for calpastatin activity, Warner-Bratzler shear force and myofibrillar fragmentation index (MFI) assays were obtained at the same carcass region after 24 hours chilling period. The mRNA expression of CAPN3, CAST, CASP3 and DNAJA1 genes did not differ (P > 0.05) among breeds. Although Nellore calpastatin activity was greater (P = 0.0292) than Angus, no difference was observed (P > 0.05) among breeds for calpastatin and calpain protein expression. The MFI differ (P = 0.0051) among breeds, which was greater in Angus than Nellore beef. In conclusion, although calpastatin activity is different among breeds the calpastatin and calpain protein abundance are not. Beef from Angus presents greater postmortem myofibril proteolysis and consequently greater tenderness than Nellore beef. Furthermore, the absence of HSP70 and caspase expression differences needs further investigation to better clarify the role of these proteins on meat tenderness.