O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.

INTRODUÇÃO: O Sarcoma de Kaposi (SK) é a neoplasia mais frequente dos doentes com Aids. É causada pelo herpes-vírus 8 (HHV-8). As células dendríticas plasmocitóides (CDp) são especializadas na produção de interferon tipo 1 e participam da resposta imune aos vírus. Os receptores \"toll-like\" são os principais receptores de reconhecimento de padrão, sendo que os receptores toll-like (TLR) 3 e 9 têm função no reconhecimento de vírus. O D2-40 é o anticorpo que reconhece a podoplanina, uma proteína transmembrana, presente no endotélio linfático e que tem função na imunidade. OBJETIVO: Demonstrar e comparar os componentes da imunidade inata: CDp e TLR 3 e 9, nas lesões cutâneas de SK associado a Aids e esporádico. Identificar a presença do HHV-8 nas CDp. Verificar o componente endotelial linfático na progressão das lesões de SK e comparar a expressão dos elementos da imunidade inata estudados, nas lesões com menor e maior componente endotelial linfático. MÉTODOS: Estudo retrospectivo de 50 biopsias de pacientes com diagnóstico de SK, todos com comprovação pelo exame histopatológico e demonstração do antígeno nuclear associado à latência (LANA) do HHV-8. Foram avaliados 11 biopsias de SK da forma clássica (SKc), 22 lesões de doentes com Aids (SK-Aids) e de 17 de doentes com Aids submetidos a tratamento com terapia antirretroviral altamente eficaz (SK-Aids/HAART). Os espécimes foram submetidos a exame por técnica imuno-histoquímica para evidenciar a presença de CDp (anticorpo CD303/BDCA-2), a expressão de TLR 3 e 9, bem como de podoplanina (anticorpo D2-40). Foi realizada também técnica de dupla marcação com CD303 e LANA, objetivando a identificação de CDp infectadas pelo HHV-8.Vinte e três espécimes de granuloma piogênico constituíram o grupo controle. A população de CDp e expressão de TLR 3 e TLR 9 também foi comparada nas lesões cutâneas de SK de doentes com e sem comprometimento visceral pela neoplasia; lesões não tumorais (máculo-papulares/placas) foram comparadas às lesões tumorais (nodulares) e de acordo com níveis sanguíneos de linfócitos T CD4+ (menor e igual ou maior que 350 células/mm3). RESULTADOS: As CDp foram mais numerosas nos espécimes de SK-Aids quando comparado com o granuloma piogênico. Foram identificadas CDp infectadas pelo HHV-8. A expressão de TLR 3 foi menor nas lesões de SK, independente da forma epidemiológica, do que no granuloma piogênico. Para todas as outras comparações da densidade de CDp e expressão de TLR 3 e de TLR 9 não houve diferença entre os grupos. Não houve diferença no componente endotelial linfático das lesões máculo-papulares/placas e tumorais do SK, assim como na expressão dos elementos da imunidade inata estudados entre as lesões com maior e menor componente endotelial linfático. CONCLUSÕES: Demonstrou-se pela primeira vez a presença de CDp e a expressão de TLR 3 e 9 em lesões cutâneas do Sarcoma de Kaposi, bem como a infecção de CDp pelo HHV-8 \"in situ\" nos tumores. Os resultados obtidos sugerem a participação das células CDp e do TLR 3 na patogênese das lesões cutâneas do Sarcoma de Kaposi, independente da presença do vírus da imunodeficiência humana. A imunomarcação de SK com o anticorpo D2-40, tanto nas fases precoce como tardia das lesões, confirma a natureza endotelial linfática das células neoplásicas. Esta parece não ter relação com a expressão dos elementos da imunidade inata estudados / Introduction: Kaposi\'s sarcoma (KS) is the most common Aids-associated malignancy. It is caused by human herpesvirus-8. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are professional interferon producing cells, and participate in the immune response against viruses. Toll-like receptors (TLR) are the main pattern recognition receptors, and TLR 3 and TLR 9 participate in the recognition of viruses. Podoplanin, recognized by antibody D2-40, is a transmembrane protein identified on lymphatic endothelial cells with functions inimmunity. Objective: Demonstrate and compare some innate immunity components: pDC, TLR 3 and TLR 9, in cutaneous lesions of Aids-associated Kaposi\'s sarcoma and classic Kaposi\'s sarcoma. Identify the infection of pDC by HHV-8. Compare the lymphatic endothelial component in the course of tumor progression and compare the expression of innate immunity elements in lesions with a predominance of lymphatic endothelial components or not. Methods: Retrospective study of 50 biopsies diagnosed as Kaposi\'s sarcoma withpositive staining for latency-associated nuclear antigen (LANA) of HHV-8. Eleven classic KS, 22 Aids-associated KS and 17 Aids-associated KS from patients undergoing highly active antiretroviral therapy (HAART) were assessed. Paraffinembedded tissue was submitted to immunohistochemistry technique in order to demonstrate pDC (CD303/BDCA-2 antibody), expression of TLR 3, TLR 9 and podoplanin (D2-40 antibody). We performed double staining with CD303 and LANA in order to identify pDC infection with HHV-8. Twenty-three pyogenic granuloma(PG) specimens were analyzed as a control group. Plasmacytoid dendritic cells population, TLR 3 and TLR 9 expressions were compared between patients with and without visceral disease, nodular stageandpatch/plaque stage and according to bloodlymphocytes T CD4 count(=350 cells/mm3). Results: Plasmacytoid dendritic cells density in Aids-associated SK was higher than in PG. We could identify pDC infection by HHV-8. The expression of TLR 3 in all forms of KS was less extensive than PG. All others comparisons about pDC density, TLR 3 and 9expressions were similar. We found no difference in D2-40 expression between nodular and patch/plaque stages. When comparing tumors with extensive expression of D2-40 (>= 50% of cells) and tumors with less expression (<50% of cells), we found no differences in density of pDC and expression of TLR 3 and TLR 9. Conclusion: This is the first time that pDC, TLR 3 and TLR 9 have been demonstrated in skin lesions of KS, as well as the infection of pDC in the lesions. Our results suggest that pDC and TLR 3 participate in the pathogenesis of KS, independently of HIV presence. The positive staining with D2-40 antibody, in all the stages of KS, confirmsthe lymphatic nature of neoplastic cells. It seems that podoplanin is not related to the innate immunity elements studied here

Abstract Cancers of the alimentary tract include many common cancer types, some of which have well-established treatment protocols and relatively good prognosis, such as colorectal cancer, and others, which have generally very poor prognosis. The gastrointestinal canal is colonized by a multitude of bacteria, the effects of which are currently poorly understood. Toll-like receptor 9 (TLR9) in cells of the alimentary tract recognizes the bacterial DNA-fragments and regulates immune functions in the host and the cancer. This thesis examines the function and prognostic significance of Toll-like receptor 9 in oral and esophageal squamous cell carcinoma as well as in esophageal, gastric and colorectal adenocarcinoma. The studies were made using tissue samples from patient cohorts and various cell culture techniques. Our data indicate that high expression of Toll-like receptor 9 in cancer cells associates with metastatic properties in oral and esophageal cancers and poor prognosis in esophageal adenocarcinoma and oral squamous cell carcinoma. Cell culture studies further suggest that TLR9 is functional in alimentary tract cancers and mediates cellular invasion when activated. Based on the results, TLR9 is active in alimentary tract cancers and its expression is related to poor cancer prognosis. Thus, TLR9 may represent a novel therapeutic target in alimentary tract cancers and might provide a link between bacteria and oral and gastrointestinal cancer. / Tiivistelmä Ruuansulatuskanavan syöpiin lukeutuu useita yleisiä syöpätyyppejä, kuten kohtalaisen hyväennusteinen paksusuolen syöpä, jonka hoitokäytäntö on vakiintunut. Toisissa ruuansulatuskanavan syövissä puolestaan ennuste on hyvin huono. Mahasuolikanavaa asuttavat moninaiset bakteerikannat, joiden vaikutuksia ymmärretään vielä kehnosti. Tollinkaltainen reseptori 9 (TLR9) tunnistaa näiden bakteerien DNA-rakenteita ja vaikuttaa yksilön ja syövän immuunivasteeseen. Tämä väitöstutkimus selvittää TLR9:n toimintaa ja ennustevaikutusta suun ja ruokatorven levyepiteelisyövissä, sekä ruokatorven, mahalaukun ja paksusuolen adenokarsinoomassa. Tutkimus toteutettiin käyttäen syöpäpotilaiden kudosnäytteitä sekä soluviljelytekniikoita. Tuloksemme osoittavat, että TLR9:n lisääntynyt ilmentyminen syöpäsoluissa yhdistyy metastasointiin suu- ja ruokatorvisyövissä, sekä korkeaan kuolleisuuteen suun levyepiteelisyövässä ja ruokatorven adenokarsinoomassa. Soluviljelykokeidemme tuloksiin nojaten TLR9 toimii ruuansulatuskanavan syövissä ja sen aktivaatio saa aikaan solujen invasoitumisen. Tutkimustuloksiimme vedoten TLR9 on aktiivinen ja toimiva ruuansulatuskanavan syövissä ja sen ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen. TLR9 saattaa osoittautua uudeksi syöpähoitojen kohteeksi tai yhdistäväksi tekijäksi syövän ja bakteerien välillä ruuansulatuskanavan syövissä tulevaisuudessa.

Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.

Abstract Background and aims: Stage and grade are the most widely used prognostic parameters for renal cell carcinoma (RCC). The clinical course of this disease is not, however, always predictable by traditional prognostic factors. In the era of new molecular targeted therapies a more accurate prognostication of RCC patient survival is important for the individualization of treatment and follow-up of patients. Despite exhaustive research there are still no prognostic biomarkers for RCC in clinical practice. In order to find novel prognostic tissue markers for RCC, we examined the expression of 14 biomarkers involved in carcinogenesis and clarified their prognostic significance in RCC. Material and methods: Out of 189 consecutive patients who underwent surgery for kidney cancer at Oulu University Hospital in the 1990s, 152 patients with histologically verified RCC were included in this study. The stage distribution was 70 (46%), 12 (8%), 51 (34%) and 19 (12%) patients with stages I-IV, respectively. The majority of the tumours (83 tumours, 55%) were nuclear grade II and 5 (3%), 40 (27%) and 22 (15%) of the tumours were grades I, III and IV, respectively. Clinical and follow-up data were obtained from patient records, the Finnish Cancer Registry and on demand from the Population Register Centre of Finland. The biomarkers studied included markers of the oxidative and neuroendocrine systems as well as proteins related to cell adhesion and migration, invasion, metastasis, inflammation and immune responses. The expression of various biomarkers was characterized via immunohistochemical tests of archival tumour material. The staining intensity was compared to clinicopathological parameters and patient RCC-specific survival. Results: The 5-year RCC-specific survival was 77%. The expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) was an independent marker of favourable RCC-specific survival whereas cytoplasmic myosin VI expression was found to be an independent prognostic factor of poor RCC-specific survival. Cell culture experiments showed how cyclooxygenase-2 (COX-2) expression is regulated by HuR in RCC. HuR and COX-2 immunoexpression were also related to decreased RCC-specific survival. Immunostaining of Keap1 was associated with advanced RCC and a marker of a poorer RCC-specific prognosis. The expression of different neuroendocrine markers was evaluated but we could not establish any prognostic value for them. Conclusions: In particular, TLR9, HuR and myosin VI can be regarded as promising novel prognostic biomarkers in RCC. Stage, however, is the most important single prognostic factor for RCC. / Tiivistelmä Munuaissyöpä on vuosikymmenten ajan jatkuvasti yleistynyt. Vaikka se diagnosoidaan nykyisin useimmiten sattumalöydöksenä vatsan alueen kuvantamistutkimuksissa ja hoitomenetelmät ovat viime vuosikymmenten aikana kehittyneet, munuaissyöpäkuolleisuus ei ole laskenut. Munuaissyövän ennusteen määrittäminen voi olla haasteellista. Perinteiset ennustetekijät, levinneisyys ja erilaistumisaste, eivät riitä selittämään kaikkien potilaiden taudinkulkua, eikä munuaissyövälle vielä ole kliinisessä käytössä ennusteellista merkkiainetta. Munuaissyöpähoitojen kehittyessä taudinkulun ennustaminen on yhä tärkeämpää, jotta potilaiden hoito ja seuranta voidaan yksilöidä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli etsiä uusia ennusteellisia kudosmerkkiaineita munuaissyöpäkasvaimille. Väitöskirjatutkimus perustuu 1990-luvulla Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikatun 152 munuaissyöpäpotilaan aineistoon. Lähes puolet aineiston kasvaimista edusti levinneisyysluokkaa I, ja yli puolet munuaissyöpäkasvaimista oli hyvin erilaistuneita (tumagradus I ja II). Tutkimuspotilaista kerättiin kattavat seurantatiedot. Leikkauksessa poistettujen munuaissyöpäkasvainten arkistomateriaalista tutkittiin eri merkkiaineiden ilmenemistä. Tutkitut merkkiaineet käsittivät oksidatiivisen ja neuroendokriinisen järjestelmän merkkiaineita sekä valkuaisaineita, jotka liittyvät keskeisiin syövän ominaisuuksiin, kuten solujen välisiin liitoksiin ja solujen liikkumiseen sekä etäpesäkkeiden syntymiseen. Lisäksi tutkittiin merkkiaineita, jotka liittyvät tulehdusreaktioihin ja immuunipuolustukseen. Väitöskirjatutkimus paljasti useita uusia kudosmerkkiaineita, joiden ilmeneminen munuaissyöpäkasvaimessa on yhteydessä potilaan ennusteeseen. Näistä merkittävimpiä ovat myosiini VI, joka liittyy syöpäkasvainten metastasointiin, sekä immuunipuolustuksessa vaikuttava Tollin kaltainen reseptori 9 (Toll-like receptor 9, TLR9). Molemmat merkkiaineet osoittautuivat itsenäisiksi ennustetekijöiksi munuaissyövässä. Muita ennusteeseen vaikuttavia merkkiaineita ovat tutkimuksen mukaan oksidatiivista stressiä aistiva Keap1 sekä immunologisiin reaktioihin liittyvä syklo-oksigenaasi 2 (COX-2) ja sen ilmenemistä säätelevä HuR.

Abstract Mediators of epithelial permeability, angiogenesis and invasion may serve as prognostic indicators and targets for therapies in esophageal cancer (EC). The expressions of claudins, hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), nitric oxide synthases (iNOS, eNOS, nNOS) and toll-like receptor 9 (TLR9) were evaluated by immunohistochemistry in EC. The results were compared with clinicopathological variables, tumor proliferation and apoptosis. All of the claudins were expressed in most of the cancers. Esophageal adenocarcinomas (EAC) displayed more often increased claudin 3 and 5 expression than esophageal squamous cell carcinomas (ESCC). Loss of claudin 3 expression associated with distant metastases in EC and a tendency in this direction was also observed for claudin 4. Cancers with stronger claudin 4 expression showed increased apoptosis in both EAC and ESCC. HIF-1α was present in most of the ECs and like iNOS more often in ESCC than in EAC. Strong HIF-1α expression tended to associate with positive VEGF immunostaining. In ESCC, both strong HIF-1α expression and VEGF positivity tended to associate with increased microvessel density (MVD). In EAC, tumors showing VEGF positivity associated with increased MVD outside the tumor. Patients with strong HIF-1α expression had more often distant metastases than other patients in EC. There was no VEGF expression in normal esophageal mucosa and T3-4 tumors tended to be more often VEGF positive than T1-2 tumors. The expression of TLR9 was more intensive in dysplasia than in normal epithelium and ESCC and abundant TLR9 expression could serve as a marker of squamous cell high grade dysplasia. Intensive TLR9 expression was associated with higher grade tumors and the presence of nodal and distant metastases in ESCC. EC and its progression may be related to increased angiogenesis regulated by VEGF and HIF-1α. In EC, claudin expression varies along with the histology of the tumor. Claudin expression may be associated with apoptosis or proliferation and contribute to tumor behavior. An association was detected between moderate to strong expression of claudin 3 and a high TLR9 histoscore in ESCC. Altered expression of claudin 3 may result to upregulation of endosomal TLR9. TLR9 may serve as a marker for squamous cell dysplasia and ESCC progression. / Tiivistelmä Solukerrosten läpäisevyyttä, verisuonten uudismuodostusta ja kasvainsolujen liikkuvuutta säätelevät tekijät voivat toimia ruokatorvisyövän ennustetekijöinä ja hoidon kohteina. Tässä tutkimuksessa selvitettiin klaudiinien, hypoksia-indusoituvan tekijän 1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijän A (VEGF), kolmen typpioksidisyntaasin (iNOS, eNOS ja nNOS) sekä tollin kaltaisen reseptorin 9 (TLR9) ilmentymistä ja merkitystä ruokatorvisyövässä immunohistokemiallisin menetelmin. Tuloksia arvioitiin suhteessa proliferaatioon ja apoptoosiin. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät jokaista tutkittua klaudiinia. Ruokatorven rauhassyövässä ilmeni levyepiteelisyöpää useammin klaudiineja 3 ja 5. Klaudiinin 3 vähäinen ilmentyminen oli yhteydessä etäpesäkkeiseen tautiin. Sama suuntaus näkyi klaudiinin 4 kohdalla. Apoptoosia todettiin enemmän kasvaimissa, jotka ilmensivät muita enemmän klaudiini 4:ä. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät HIF-1α:a. Sekä iNOS että HIF-1α ilmentyivät runsaammin levyepiteeli- kuin rauhassyövässä. Tutkimus viittasi yhteyteen voimakkaan HIF-1α:n ilmentymisen ja VEGF:n ilmentymisen välillä. Voimakas HIF-1α:n ilmentyminen ja VEGF:n ilmentyminen vaikuttivat liittyvän ruokatorven levyepiteelisyövän uudissuonituksen lisääntymiseen. Rauhassyövän lisääntynyt uudissuonitus kasvaimen ulkopuolella saattaa liittyä VEGF:n ilmentymiseen. Potilailla, joiden kasvaimissa HIF-1α:n ilmentyminen oli voimakasta, todettiin etäpesäkkeitä muita useammin. VEGF:a ei todettu normaalissa limakalvossa, ja sen ilmentyminen vaikutti olevan yleisempää syvälle kasvavissa kuin pinnallisissa syövissä. TLR9 ilmentyi voimakkaammin levyepiteelin dysplasiassa kuin normaalissa tai kasvainepiteelissä. Huonosti erilaistuvissa ja levinneissä kasvaimissa TLR9 ilmentyi voimakkaammin kuin muissa kasvaimissa. Ruokatorvisyövän synty ja eteneminen voivat liittyä HIF:n ja VEGF:n säätelemään verisuonten uudismuodostukseen. Klaudiinit saattavat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen myös apoptoosin ja proliferaation kautta. Tutkimuksessa todettiin yhteys lisääntyneen klaudiinin 3 ilmentymisen ja voimakkaasti ilmentyvän TLR9:n välillä. Muutos klaudiinin 3 ilmentymisessä saattaa lisätä levyepiteelin läpäisevyyttä johtaen TLR9:n aktivoitumiseen. TLR9 voi vaikuttaa ruokatorven levyepiteelin dysplasian ja syövän syntyyn sekä toimia vaikean dysplasian ja aggressiivisen levyepiteelisyövän merkkiaineena.

Abstract Oral lichen planus (OLP) is a chronic immune-mediated mucosal disease with unknown etiology. According to the current view, the pathogenesis of OLP involves activation of T-cell mediated immunity against the epithelial keratinocytes. A proportion of OLP patients are affected by painful symptoms, and the risk of oral cancer is increased in OLP. There is no curative treatment for OLP. Topical corticosteroids are used most commonly in the management of OLP. However, the evidence base for the effectiveness of any therapy is weak. The objective of this thesis was to study novel aspects of OLP etiopathogenesis and management. An epidemiologic, retrospective case-control study was conducted to determine whether systemic diseases, in particular thyroid diseases, are associated with OLP. In addition, a randomized controlled trial comparing the effectiveness of topical tacrolimus, triamcinolone acetonide and placebo in symptomatic OLP was carried out. Furthermore, immunohistochemical expression of toll-like receptors 4 and 9, hyaluronan and its principal receptor CD44 antigen, hyaluronan synthases 1-3, hyaluronidases 1-2 and cathepsin K was studied in OLP tissue samples and in healthy oral mucosa. The effect of topical tacrolimus on the expression of these molecules in OLP was also studied. The results of the present study showed that a history of hypothyroidism was associated with an approximately twofold risk of having OLP. Furthermore, both tacrolimus and triamcinolone acetonide were more efficient than placebo in reducing the signs and symptoms of OLP. No statistically significant differences were noted in the efficacy between tacrolimus and triamcinolone acetonide. In addition, the expression of the studied molecules was altered in the epithelium or stroma in OLP compared to healthy oral mucosa. Tacrolimus treatment decreased the expression of CD44 antigen in the stroma and the expression of cathepsin K in the epithelium in OLP. In conclusion, the present study extends our knowledge about systemic associated factors and management of OLP. In addition, the results improve our understanding of molecular level changes that occur in OLP. / Tiivistelmä Suun punajäkälä on krooninen immuunivälitteinen limakalvotauti, jonka etiologia on tuntematon. Taudin syntymekanismiin liittyy tämän hetkisen näkemyksen mukaan T-soluvälitteisen immuniteetin aktivoituminen epiteelin keratinosyyttejä vastaan. Suun punajäkälä aiheuttaa osalle potilaista kivuliaita oireita ja lisää suusyövän riskiä. Parantavaa hoitoa tautiin ei ole. Yleisimmin suun punajäkälän oireiden hoidossa käytetään paikallisia kortikosteroidivalmisteita. Kuitenkin eri hoitomuotojen tehosta on vain heikkoa näyttöä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia uusia näkökohtia liittyen suun punajäkälän etiopatogeneesiin ja hoitoon. Epidemiologisessa tapaus-verrokkitutkimuksessa selvitettiin, liittyvätkö yleissairaudet, erityisesti kilpirauhassairaudet, suun punajäkälään. Lisäksi satunnaistetussa kontrolloidussa tutkimuksessa verrattiin paikallisen takrolimuusin, triamsinoloniasetonidin ja lumelääkkeen tehoa oireisesta suun punajäkälästä kärsivillä potilailla. Tutkimuksessa selvitettiin myös tollin kaltaisten reseptorien 4 ja 9, hyaluronaanin ja sen pääasiallisen reseptorin CD44-antigeenin, hyaluronaanisyntaasien 1–3, hyaluronidaasien 1–2 sekä katepsiini K:n immunohistokemiallista ilmentymistä suun punajäkälänäytteissä ja terveessä suun limakalvossa. Lisäksi tutkittiin takrolimuusihoidon vaikutusta näiden molekyylien ilmentymiseen suun punajäkälässä. Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että kilpirauhasen vajaatoimintaan liittyi noin kaksinkertainen riski sairastaa suun punajäkälää. Lisäksi havaittiin, että suun punajäkälässä sekä takrolimuusi että triamsinoloniasetonidi ovat tehokkaampia kuin lumelääke oireiden ja kliinisen taudinkuvan lievittämisessä. Takrolimuusin ja triamsinoloniasetonidin tehossa ei todettu tilastollisesti merkitseviä eroja. Lisäksi suun punajäkälänäytteissä tutkittujen molekyylien ilmentyminen oli muuttunut joko epiteelissä tai stroomassa verrattuna terveeseen limakalvoon. Takrolimuusihoito vähensi CD44-antigeenin ilmentymistä stroomassa ja katepsiini K:n ilmentymistä epiteelissä suun punajäkälässä. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus lisää tietoa suun punajäkälään liittyvistä systeemisistä tekijöistä ja suun punajäkälän hoidosta. Lisäksi löydökset lisäävät ymmärtämystä suun punajäkälässä tapahtuvista molekyylitason muutoksista.