Le but principal d'un essai de phase I en oncologie est d'identifier, parmi un nombre fini de doses, la dose à recommander d'un nouveau traitement pour les évaluations ultérieures, sur un petit nombre de patients.Le critère de jugement principal est classiquement la toxicité. Bien que la toxicité soit mesurée pour différents organes sur une échelle gradée, elle est généralement réduite à un indicateur binaire appelé "toxicité dose-limitante" (DLT). Cette simplification très réductrice est problématiqu, en particulier pour les thérapies, dites "thérapies ciblées", associées à peu de DLTs.Dans ce travail, nous proposons un score de toxicité qui résume l'ensemble des toxicités observées chez un patient. Ce score, appelé TTP pour Total Toxicity Profile, est défini par la norme euclidienne des poids associés aux différents types et grades de toxicités possibles. Les poids reflètent l'importance clinique des différentes toxicités.\\ Ensuite, nous proposons la méthode de recherche de dose, QLCRM pour Quasi-Likelihood Continual Reassessment Method, modélisant la relation entre la dose et le score de toxicité TTP à l'aide d'une régression logistique dans un cadre fréquentiste.A l'aide d'une étude de simulation, nous comparons la performance de cette méthode à celle de trois autres approches utilisant un score de toxicité : i) la méthode de Yuan et al. (QCRM) basée sur un modèle empirique pour estimer, dans un cadre bayésien, la relation entre la dose et le score, ii) la méthode d'Ivanova et Kim (UA) dérivée des méthodes algorithmiques et utilisant une régression isotonique pour estimer la dose à recommander en fin d'essai, iii) la méthode de Chen et al. (EID) basée sur une régression isotonique pour l'escalade de dose et l'identification de la dose à recommander. Nous comparons ensuite ces quatre méthodes utilisant le score de toxicité aux méthodes CRM basées sur le critère binaire DLT. Nous étudions également l'impact de l'erreur de classement des grades pour les différentes méthodes, guidées par le score de toxicité ou par la DLT.Enfin, nous illustrons le processus de construction du score de toxicité ainsi que l'application de la méthode QLCRM dans un essai réel de phase I. Dans cette application, nous avons utilisé une approche Delphi pour déterminer avec les cliniciens la matrice des poids et le score de toxicité jugé acceptable.Les méthodes QLCRM, QCRM, UA et EID présentent une bonne performance en termes de capacité à identifier correctement la dose à recommander et de contrôle du surdosage. Dans un essai incluant 36 patients, le pourcentage de sélection correcte de la dose à recommander obtenu avec les méthodes QLCRM et QCRM varie de 80 à 90% en fonction des situations. Les méthodes basées sur le score TTP sont plus performantes et plus robustes aux erreurs de classement des grades que les méthodes CRM basées sur le critère binaire DLT.Dans l'application rétrospective, le processus de construction du score apparaît faisable facilement. Cette étude nous a conduits à proposer des recommandations pour guider les investigateurs et faciliter l'utilisation de cette approche dans la pratique.En conclusion, la méthode QLCRM prenant en compte l'ensemble des toxicités s'avère séduisante pour les essais de phase I évaluant des médicaments associés à peu de DLTs a priori, mais avec des toxicités multiples modérées probables. / The aim of a phase I oncology trial is to identify a dose with an acceptable safety level. Most phase I designs use the Dose-Limiting Toxicity (DLT), a binary endpoint, to assess the level of toxicity. DLT might be an incomplete endpoint for investigating molecularly targeted therapies as a lot of useful toxicity information is discarded.In this work, we propose a quasi-continuous toxicity score, the Total Toxicity Profile (TTP), to measure quantitatively and comprehensively the overall burden of multiple toxicities. The TTP is defined as the Euclidean norm of the weights of toxicities experienced by a patient, where the weights reflect the relative clinical importance of each type and grade of toxicity.We propose then a dose-finding design, the Quasi-Likelihood Continual Reassessment Method (QLCRM), incorporating the TTP-score into the CRM, with a logistic model for the dose-toxicity relationship in a frequentist framework. Using simulations, we compare our design to three existing designs for quasi-continuous toxicity scores: i) the QCRM design, proposed by Yuan et al., with an empiric model for the dose-toxicity relationship in a Bayesian framework, ii) the UA design of Ivanova and Kim derived from the "up-and-down" methods for the dose-escalation process and using an isotonic regression to estimate the recommended dose at the end of the trial, and iii) the EID design of Chen et al. using the isotonic regression for the dose-escalation process and for the identification of the recommended dose.We also perform a simulation study to evaluate the TTP-driven methods in comparison to the classical DLT-driven CRM. We then evaluate the robustness of these designs in a setting where grades can be misclassified.In the last part of this work, we illustrate the process of building the TTP-score and the application of the QLCRM method through the example of a paediatric trial. In this study, we have used the Delphi method to elicit the weights and the target toxicity-score considered as an acceptable toxicity measure.All designs using the TTP-score to identify the recommended dose had good performance characteristics for most scenarios, with good overdosing control. For a sample size of 36, the percentage of correct selection for the QLCRM ranged from 80 to 90%, with similar results for the QCRM design. Simulation study demonstrates also that score-driven designs present an improved performance and robustness compared to conventional DLT-driven designs. In the retrospective application of erlotinib trial, the consensus weights as well as the target-TTP were easily obtained, confirming the feasibility of the process. Some guidelines to facilitate the process in a real clinical trial for a better practice of this approach are suggested.The QLCRM method based on the TTP-endpoint combining multiple graded toxicities is an appealing alternative to the conventional dose-finding designs, especially in the context of molecularly targeted agents.

Les pesticides de nouvelle génération sont le plus souvent épandus à de faibles doses et en mélange. Peu d’études se sont intéressées jusqu’à présent à l’effet de ces mélanges sur la biodégradation et la toxicité de chaque pesticide et/ou métabolite. Le but de ces travaux de thèse était d’étudier les voies de biotransformation de chacun des trois herbicides d’un mélange constitué de mésotrione (β-tricétone), nicosulfuron (sulfonylurée) et S-métolachlore (chloroacétanilide) utilisé sur les cultures de maïs, ainsi que la toxicité (test Microtox ® ) des herbicides et de leurs métabolites, seuls et en mélanges. L’identification des métabolites de la mésotrione chez la souche Bacillus megaterium Mes11 et une étude de protéomique différentielle ont suggéré l’implication de nitroréductases dans la première étape de la biotransformation de cet herbicide, rôle confirmé ensuite par la caractérisation structurelle et fonctionnelle de deux enzymes capables de transformer la mésotrione : les nitroréductases NfrA1 et NfrA2, appartenant à la sous-famille NfsA-FRP des Nitro-FMN réductases. La voie de biotransformation du nicosulfuron a, quant à elle, été étudiée chez la souche Pseudomonas fluorescens SG-1 isolée à partir de sol agricole, capable de transformer cet herbicide par co-métabolisme. Cette biotransformation conduit à la formation de deux métabolites majoritaires issus du clivage de la liaison sulfonylurée du nicosulfuron, l’un deux (l’ADMP, 2-amino-4,6-diméthoxypyrimidine) présentant une toxicité 20 fois supérieure à celle de la molécule mère. Nous avons également étudié qualitativement et quantitativement la biotransformation de la mésotrione et du nicosulfuron par la souche Mes11 séparément ou en mélange, et en présence ou non de S-métolachlore Les résultats ont montré un effet négatif de la mésotrione sur la biotransformation du nicosulfuron et un effet positif du S-métolachlore sur la biotransformation de la mésotrione. Tous les mélanges d’herbicides testés ont montré des effets synergiques pour la toxicité vis-à-vis de A. fischeri, tandis que les mélanges de métabolites (avec ou sans S-métolachlore) étaient majoritairement synergiques ou antagonistes. La dernière partie des travaux de thèse est focalisée sur le développement d’une technique préventive de traitement de la pollution par les pesticides d’origine agricole (bioprophylaxie). Nous avons fait la preuve de concept de cette technique par une étude en microcosmes de sol. L’épandage simultané de l’herbicide 2,4-D (acide 2,4-dichlorophénoxyacétique) et de la souche Cupriavidus necator JMP134 capable de le minéraliser a en effet permis de réduire le temps de demi-vie de ce composé d’un facteur 3, tout en conservant son activité herbicide. / The new-generation pesticides are often sprayed at low dosages and in mixtures. Up to now, a few studies focused on the effect of these mixtures on the biodegradation and the toxicity of each pesticide and/or metabolite. The aim of this Ph.D. work was to study the biotransformation of each herbicide of a mixture composed of mesotrione (β-triketone), nicosulfuron (sulfonylurea) and S-metolachlor (chloroacetanilide) applied on maize crops, as well as the toxicity (Microtox® test) of the herbicides/metabolites alone or in mixture. The identification of mesotrione metabolites by the strain Bacillus megaterium Mes11 and a differential proteomic approach suggested the role of nitroreductases in the first step of mesotrione biotransformation. This was confirmed by the structural and functional characterization of two enzymes able to biotransform mesotrione: the NfrA1 and NfrA2 nitroreductases, belonging to the NfsA-FRP sub-family of Nitro-FMN reductases. The biotransformation pathway of nicosulfuron has been elucidated for the strain Pseudomonas fluorescens SG-1 isolated from an agricultural soil and able to co-metabolically biotransform nicosulfuron. Two major metabolites resulting from the cleavage of the sulfonylurea bridge were identified, one of them (ADMP, 2-amino-4,6-dimethoxypyrimidine) presenting a 20-fold higher toxicity than the parent compound. The simultaneous biotransformation of mesotrione and nicosulfuron by the strain Mes11 was also qualitatively and quantitatively studied, showing a negative effect of mesotrione on nicosulfuron biotransformation, and a positive effect of S-metolachlor on mesotrione biotransformation. All parent compound mixtures tested resulted in synergistic effects towards A. fischeri, while metabolite mixtures (with or without S-metolachlor) were mostly synergistic or antagonistic. The last part of the PhD work was devoted to the development of a preventive technique for the treatment of pollutions caused by agricultural pesticides (bioprophylaxis). We made the proof of concept of this method by using a soil microcosm study. The simultaneous spreading of 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) herbicide and the strain Cupriavidus necator JMP134 able to mineralize it allowed a 3-fold reduction of 2,4-D half-life in soil, while preserving its herbicide activity.

L'objectif de cette thèse est d'améliorer la compréhension de la toxicité de diverses nanoparticules de synthèse (ENPs) pour l'homme et l'écosystème. Les travaux réalisés s’appuient sur la combinaison de données toxicologiques et d’un modèle environnemental - le modèle USEtox. En tant qu'élément important de l'évaluation de l'impact du cycle de vie, le facteur de caractérisation (CF) a été utilisé, dans ce travail, comme indicateur de toxicité pour l'homme et l'écosystème. Pour avoir accès aux courbes dose-réponse et à différentes données toxicologiques, des expériences in vitro ont été réalisées en exposant des neutrophiles porcins fraîchement isolés à trois types de nanoparticules de synthèse. Les modifications morphologiques, les taux de mortalité et la chimioluminescence des neutrophiles ont été évaluées. De plus, pour estimer le temps de persistance des nanoparticules de synthèse dans l'écosystème eau douce, un modèle basé sur la science des colloïdes a été développé. Il prend en compte les comportements spécifiques des nanoparticules de synthèse et inclut des recommandations sur le choix des paramètres hydrologiques régionaux. Enfin, une enquête documentaire exhaustive a été réalisée pour recueillir les données écotoxicologiques de diverses nanoparticules de synthèse. Dans le cadre du modèle USEtox, le CF toxicologique non cancérogène pour cuivre NPs et les CF écotoxicologiques pour 14 ENPs sont recommandés. Ces valeurs des CF pourraient être utiles à l'avenir pour évaluer les impacts environnementaux des produits contenant des ENPs. / The objective of this thesis is to improve understandings of toxicity of various engineered nanoparticles (ENPs) to human and ecosystem. It is realized via coordinating toxicological data and a scientific consensus environmental model -- the USEtox model. As an important element in life cycle impact assessment, the characterization factor (CF) is employed as a toxicity indicator for human and ecosystem in this work. To obtain the firsthand dose-response phenomena and human toxicological data, in vitro experiments have been conducted by exposing freshly isolated porcine neutrophils to three kinds of ENPs (i.e. copper, nickel and aluminum oxide nanoparticles). The morphologies, mortality rates, and chemiluminescence, of neutrophils are observed or monitored. Additionally, to estimate the persistence time of ENPs in freshwater ecosystem, a fate model on the basis of colloid science is developed. It takes nano-specific behaviors of ENPs into account and includes recommendations of regionalized hydrological parameters. Finally, a comprehensive literature survey is accomplished to collect the ecotoxicological data of various ENPs. Under the framework of USEtox model, the non-carcinogenic human toxicological CFs for Copper NPs and the ecotoxicological CFs for 14 ENPs are recommended. These CF values could be useful in the future when evaluating the environmental impacts of products containing ENPs.

Les composés perfluorés (PFC) de formule chimique générale CF3-(CF2)n-SO3- ( sulfonates) ou CF3-(CF2)n-1-CO2- (acides) sont des polluants organiques émergents, dont la persistance, la bioaccumulation et la toxicité sont maintenant considérées préoccupantes au plan sanitaire et environnemental. L'objectif de notre recherche a été de mettre en évidence les effets cancérogènes in vitro et le mécanisme d'action impliqué lors de l'exposition pendant 7 jours de cellules embryonnaires de hamster Syrien (SHE) aux principaux représentants perfluorés, le sulfonate de perfluorooctane (PFOS), le perfluorooctanoate (PFOA), et à leur substitut, le sulfonate de perfluorobutane (PFBS). Le test de transformation cellulaire dans sa version standard ou selon un protocole de type initiation-promotion a permis de détecter les substances cancérogènes de profil initiateur ou promoteur de tumeur. La génotoxicité des PFCs a été explorée par le test Comet en conditions alcalines. PFOS a présenté un profil cancérogène non génotoxique de type initiateur aux concentrations de 0,37 et 3,7 µM (p<=0,01), coïncidant avec les concentrations sériques des travailleurs exposés au PFOS. L'activation des gènes PPARs a été observée après 7 jours d'exposition au PFOS, avec une induction plus importante et plus précoce (dès 24 heures d'exposition) du gène ppar-bêta/gamma aux concentrations transformantes (p<=0,05). PFOA appliqué seul n'induit pas la transformation néoplasique des cellules SHE. Par contre, il induit la transformation des cellules présensibilisées par un initiateur. Il agit selon un profil cancérogène non génotoxique de type promoteur de tumeur aux concentrations de 3,7 x 10-4 à 37 µM. Ces concentrations coïncident avec les concentrations sériques mesurées dans les populations professionnellement et non professionnellement exposées. PFBS ne s'est révélé ni initiateur, ni promoteur de tumeur. La mise en cause de ces PFCs dans l'augmentation des cancers de la vessie (pour le PFOS) et celui de la prostate (pour le PFOA) chez les travailleurs exposés ne peut être exclue / Perfluorinated compounds (PFCs) is a collective name for fluorinated surfactants and polymers with the general structure CF3-(CF2)n-SO3- (sulfonates) or CF3-(CF2)n-1-CO2- .(acids). This group is characterized by a high persistence, bioaccumulation and long term toxicity which are rising environmental and public health concerns. In the present work, we analyzed the in vitro carcinogenic potential of the two major PFCs, perfluorooctane sulfonate (PFOS), and perfluorooctanoic acid (PFOA), and their substitute, perfluorobutane sulfonate (PFBS). Cell transformation assays were carried out on Syrian hamster embryo (SHE) cells in a 7 day-treatment using the standard and the initiation-promotion protocols. Genotoxicity was tested using the comet assay. PFOS was not genotoxic on SHE cells, but it induced cell transformation at non cytotoxic concentrations 0,37 and 3,7 µM (p<=0,01). These concentrations coincided with serum PFOS concentrations measured in occupationally exposed workers. An increased expression of PPARs was registered after 7 days. The ppar-beta/gamma mRNA appeared to increase rapidly (24 hours after PFOS treatment) at concentrations closely related to cell transformation (p<=0,05). PFOA was inactive alone, but induced cell transformation of SHE cells pre-initiated with benzo(a)pyrene (BaP). Therefore PFOA was shown to act as a tumor promoter and a non genotoxic carcinogen at a large range of concentrations (3,7 x 10-4 à 37 µM). This range of concentrations covered seric concentrations in non-occupationally exposed and occupationally exposed populations. PFBS was negative alone and on BaP-pretreated SHE cells. For this reason, its use as a substitute for PFOS appears to be justified. To conclude, the cell transforming potenty of PFOS and PFOA denotes in vitro carcinogenic potential. Consequently, the hypothesis of their implication in human cancer recorded in occupationally exposed populations cannot be ruled out

Parmi les stratégies visant à réduire l’utilisation de pesticides, l’augmentation de l’efficacité des matières actives par du design de formulations ou par l’utilisation de cocktails de pesticides, épandus chacun à plus faible dosage, est une piste très suivie. Cependant, l’influence de mélanges de molécules sur le devenir, le comportement et la toxicité de chacune d’elle individuellement n’a été que rarement décrite. Nous avons donc étudié l’impact des formulations et du mélange d’un herbicide, la mésotrione, et d’un fongicide, le tébuconazole, sur leur biodégradation respective, en termes de cinétiques et de modulations de voies métaboliques de dégradation, mais aussi sur la croissance de différents microorganismes dégradant ou non. Un schéma général de biodégradation de la mésotrione commun à de nombreux microorganismes, Gram positif et négatif, a été proposé conduisant, dans nos conditions, à l’accumulation d’un métabolite, l’AMBA. L’étude comparée avec la formulation (Callisto®) a montré une forte influence des adjuvants sur la cinétique de biodégradation de la mésotrione, allant d’une forte inhibition pour les souches Gram positif testées jusqu’à une stimulation pour une souche d’E. coli. Pour le tébuconazole, seules 3 souches se sont montrées capables de dissiper ce fongicide et de nouveaux métabolites ont pu être mis en évidence. L’utilisation de la formulation (Balmora®) conduit à des effets variables sur sa biodégradation en fonction de la souche et de la concentration. Cependant, les adjuvants présentent toujours un effet inhibiteur, souvent même fort, sur la croissance des microorganismes testés, en particulier sur les souches bactériennes Gram positif, qui se sont toujours révélées plus sensibles. Les études sur le mélange de ces deux pesticides, purs ou formulés ont mis en évidence la complexité des phénomènes : effets inhibiteurs, neutres et souvent stimulation des cinétiques de biodégradation de chaque pesticide que le microorganisme testé dégrade ou non le composé en question ; effet synergique du mélange de pesticides, purs ou formulé, sur la toxicité. / Among the strategies aiming to reduce the use of pesticides, the increase in active ingredient efficiency by formulation design or pesticide mixture (each one being spread at a lower dose) is a well-established approach. Nevertheless, the effect of chemical mixture on the fate, behaviour and toxicity of each compound has not been widely studied. The impact of formulation and mixture of a herbicide, mesotrione, and a fungicide, tebuconazole, on their own biodegradation, in terms of kinetics and metabolic pathway, but also on microbial growth of several microbial strains degrading- or not was studied. A biodegradative pathway for mesotrione common to several Gram-positive and Gram-negative bacteria was proposed, leading under our conditions, to the accumulation of AMBA metabolite. The comparison with the formulation Callisto® showed a high effect of additives on the kinetics of mesotrione biodegradation, ranging from a strong inhibition for the Gram positive strains to stimulation for a strain of E. coli. For tebuconazole, only three bacteria were found capable of dissipating this fungicide and new metabolites were identified. The use of the formulation Balmora® lead to variable effects on tebuconazole biodegradation according to the strain and its concentration. Nevertheless, the additives always had an inhibitory effect on microbial growth, in particular on Gram positive bacteria. Studies on mixtures of both pesticides, pure or formulated, showed the complexity of the processes involved: variable effects but often increase of the pesticide biodegradation although the microorganism studied did or did not degrade them; a synergic toxic effect of pure or formulated pesticide mixture on microbial growth.

Ces dernières années, les énormes progrès réalisés en nanotechnologie ainsi qu’en science des matériaux ont conduit à la préparation de nombreuses nouvelles nanoparticules sans réellement connaître l’ensemble des propriétés associées à leurs dimensions. La première partie de notre travail vise à évaluer les risques et les problèmes associés aux nanomatériaux, en termes de toxicité, en utilisant des nanoparticules de ZnO. Nous avons tout d’abord étudié la capacité de ces nanoparticules à générer des espèces réactives d’oxygènes (EROs) sous irradiation UV en utilisant trois types des quantum dots (QDs) comme modèles, ZnO, ZnO dopé avec des ions Cu2+ et ZnO avec des ions Cu2+ adsorbés à sa surface. Les trois types des QDs ont montré une forte capacité à générer des EROs mais ceux modifiés par les ions Cu2+ en périphérie sont les plus producteurs. Ces QDs inhibent également le plus fortement la croissance de la bactérie E. coli. La toxicité n’est cependant pas dépendante des EROs photo-produits ni du zinc (+2) libéré par les QDs et montre qu’un mécanisme plus complexe doit être considéré. Dans une second partie, nous avons tenté d’améliorer l’activité photocatalytique de nanobâtonnets de ZnO en les associant à de l’oxyde de graphène réduit (rGO). Des nanocomposites ZnO/rGO ont été préparés par voie solvothermale et utilisés pour la phototodégradation du colorant Orange II comme modèle de polluant. Les résultats obtenus montrent que le photocatalyseur ZnO/rGO est très efficace sous irradiation solaire ou visible et qu’il est peu sensible à des variations de pH ou à la présence de perturbateurs dans le milieu. Finalement, le photocatalyseur est très stable et peut être réutilisé plus de dix fois sans perte notable d’activité. / In recent years, tremendous advances in nanotechnology and materials science have led to the synthesis of many new nanoparticles without really knowing all the properties associated with their dimensions. The first part of our work aims to evaluate the risks and problems associated with nanomaterials, in terms of toxicity, using ZnO nanoparticles. We first studied the ability of these nanoparticles to produce reactive oxygen species (ROS) under UV irradiation using three ZnO-based quantum dots (QDs) as models, ZnO, ZnO doped with Cu2+ ions and ZnO with chimisorbed Cu2+ ions at their periphery. The three QDs have a strong capacity of generating ROS but those modified with Cu2+ at their surface were found the be the highest producers. These dots were also found to inhibit more markedly the growth of the E. coli bacteria. The toxicity does neither depend on the amount of photo-generated ROS nor on the amount of Zn(+2) leaked by the QDs, thus indicating that a more complex mechanism should be considered. In a second part, we tried to improve the photocatalytic efficiency of ZnO nanorods by associating these nanomaterials with reduced graphene oxide (rGO). ZnO/rGO composites were prepared by a solvothermal method and applied for the photodegradation of Orange II used as model pollutant. Results obtained demonstrate that the ZnO/rGO photocatalyst is highly efficient under solar and under visible light irradiation and weakly sensitive to pH changes and to the presence of perturbators in the reaction medium. Finally, the photocatalyst is stable and can be reused up to ten times without significant loss of catalytic activity.

L’adaptabilité des cellules aux changements environnementaux repose sur leur capacité à mettre en place des complexes enzymatiques qui régulent leurs différentes voies métaboliques. Ces complexes protéiques nécessitent des cofacteurs (hème et métaux) comme le cuivre. En effet, le cuivre est un oligoélément essentiel pour la survie des organismes vivants, il est notamment présent dans des complexes tels que la cytochrome c oxydase de la chaine respiratoire aérobie. Cependant, l’excès de Cu est aussi néfaste pour la cellule. Il génère du stress oxydatif responsable de divers dommages cellulaires. Il est donc nécessaire aux cellules de contrôler la prise en charge du cuivre afin d’assurer la régulation de sa concentration intracellulaire. Dans ce travail, nous avons étudié le système de tolérance au cuivre chez Rubrivivax gelatinosus. J’ai identifié plusieurs gènes impliqués dans ce système, un de ces gènes code pour un transporteur de cuivre CopA (homologue aux ATP7A/ATP7B de l’homme). Les autres gènes codent pour : un régulateur de ce système sensible aux variations du cuivre CopR et deux protéines solubles (CopI et CopJ) fortement induites dans des conditions d’excès de cuivre. J’ai également montré que malgré l’homologie de séquence entre les pompes à cuivre CopA et CtpA (identifiées auparavant au laboratoire) ; elles remplissent deux rôles physiologiques différents dans la cellule. CopA est vitale pour la tolérance au Cu alors que CtpA a un rôle dans l’insertion du Cu au sein des cuproprotéines. Par ailleurs, j’ai montré qu’en absence de CopA, la toxicité du cuivre est plus importante dans les conditions de croissance en microaérobie ou en photosynthèse anaérobe. En effet, l’excès du Cu affecte la voie de biosynthèse des porphyrines (hèmes et bactériochlorophylles) reflété par l’accumulation d’un intermédiaire de cette voie, la coproporphyrine III. Cette accumulation résulte de l’effet de l’excès du cuivre sur la coproporphyrine III oxydase (HemN) probablement en déstabilisant son cluster [4Fe-4S]. Ces résultats sont soutenus par le fait que l’effet toxique du cuivre sur les tétrapyrolles n’est pas observé à forte aération en raison de la substitution de HemN par une enzyme à centre bimétalliques HemF. Cette dernière tolère et utilise l’oxygène, notre étude suggère qu’elle tolère aussi le cuivre. Les résultats obtenus sur les cibles du cuivre en anaérobie au cours de cette étude ainsi que celle publiés par Macomber (Macomber and Imlay 2009), suggèrent que les métaux ont pu éventuellement jouer un rôle dans l’émergence des enzymes à clusters bimétalliques lors du passage à une atmosphère oxygénique permettant une adaptation à l’augmentation de la toxicité de certains métaux. L’ensemble des résultats obtenus à partir de l’analyse des différents mutants au cours de cette étude sur la tolérance au cuivre chez R. gelatinosus me permet de proposer un modèle d’efflux du cuivre différent de celui d’E. coli. Je propose d’attribuer un rôle crucial aux protéines solubles CopI et CopJ qui fixeraient probablement le cuivre grâce aux nombreux résidus histidines et méthionines. Leurs rôles seraient soit de séquestrer le cuivre au niveau du périplasme, soit de l’oxyder ou encore de l’excréter vers un système d’efflux de la membrane externe afin de le chasser de la cellule. / The ability of Rubrivivax to adapt to its environment (aerobic versus anaerobic) relay on its ability to assemble different complexes involved respiration or photosynthesis pathways. These complexes require cofactors such as heme or chlorophylls, and metals such as magnesium, iron and copper. In particular, copper (Cu) is an essential trace element required for the assembly and the activity of the cytochrome c oxidase in the aerobic respiratory chain. Excess Cu however, is toxic and can originate in various cellular damages. In the absence of a tight control of copper entrance in the cells, bacteria have evolved different efflux systems to control copper concentration within the cytoplasm and the membrane. Very few data are available on the copper homeostasis systems in photosynthetic bacteria. We therefore studied the copper homeostasis system in Rubrivivax gelatinosus to understand how these microorganisms can deal with excess copper. In this work, I have identified several genes involved in copper tolerance. Central to this system, the P1B-type Cu⁺-ATPase CopA plays a major role in copper tolerance and translocates copper from the cytoplasm to the periplasm. The outlet of copper in the periplasm varies depending on the species. Cu can be sequestrated, oxidized or released outside the cells. Here I describe the identification CopI, a periplasmic protein present in many proteobacteria including Pseudomonas and Cupriavidus and show its requirement for copper tolerance in Rubrivivax under both aerobic and anaerobic conditions. Expression of both CopA and CopI is induced under excess copper and is regulated by CopR, a MerR regulator sensitive to changes in copper concentration. Rubrivivax genome encodes two P1B-type Cu⁺-ATPases, CopA and CtpA. My work confirmed that despite the sequence homology between these copper ATPases, they fulifill two different physiological roles in the cell. CopA is vital for tolerance to Cu while CtpA has a role in the insertion of Cu within cuproproteines. Furthermore, I showed that excess copper in the copA⁻ null mutant resulted in a substantial decrease of the cytochrome c oxidase and the photosystem under microaerobic and anaerobic conditions together with the extrusion of coproporphyrin III. Analyses of the mutant indicated that copper targeted the tetrapyrrole biosynthesis pathway at the level of the coproporphyrinogen III oxidase HemN and thereby affects the heme and chlorophyll containing complexes, the oxidase and the photosystem. These results, as well as published work by Macomber (Macomber and Imlay 2009) suggest that Cu target the 4Fe-4S clusters and that this metal may have played a role in the emergence of bimetallic enzymes to replace 4Fe-4S clusters during the appearance of oxygen in the atmosphere.Analyses of CopI expression and the copI⁻ null mutant, demonstrate that CopI is required for copper tolerance, and in the absence of an E. coli Cus-like copper efflux system in R. gelatinosus, my results strongly suggest that CopI is the major copper handling protein within the membrane. Altogether, my results allowed me to draw a comprehensive picture of the copper tolerance system within the purple photosynthetic bacterium Rubrivivax gelatinosus and probably other proteobacteria that possess a homologue of copI gene.

Dans l'industrie, les poudres de carbure de silicium (SiC) sont élaborées principalement par le procédé Acheson. Durant ce procédé multi-étapes, les poudres subissent diverses opérations pouvant être à l'origine de la dissémination de poussières inhalables dans l'environnement de travail. Jusqu'à présent, la toxicité des poudres de SiC n'a été que très peu étudiée avec des résultats contradictoires soulignant l'intérêt d'évaluer l'activité biologique de poudres de SiC par une approche pluridisciplinaire. Dans une première partie, l'activité biologique de poudres de SiC produites industriellement par le procédé Acheson a été évaluée. Par suite, des modifications de la surface de ces particules par le biais de traitements thermiques oxydants ont permis de mettre en évidence l'influence de la surface des particules dans la réponse cellulaire. Pour finir et compléter l'étude, nous avons étendu le sujet au cas des nanoparticules de SiC, synthétisées par pyrolyse laser et voie sol-gel.<br />Pour évaluer l'activité biologique des particules de SiC, des tests In Vitro sur des macrophages de culture (RAW 264.7) ont été réalisés en étudiant différents domaines de la réponse cellulaire (état d'inflammation, mort cellulaire, stress oxydant) en relation avec les propriétés physico-chimiques des particules (taille, surface, morphologie, structure cristallographique, chimie, état de surface, activité radicalaire).<br />Les résultats, illustrés suivant un modèle vecteur, soulignent que les particules industrielles de SiC sont principalement caractérisées par une activité modérée de l'état inflammatoire, aucun effet cytotoxique et un impact significatif sur le stress oxydant. Des différences en fonction de la taille des particules ont été observées ainsi qu'une forte capacité des particules à générer directement des radicaux libres (HO•, COO•-). Après modification de la surface des particules par traitement thermique oxydant, la réponse cellulaire se caractérise par une forte augmentation de l'état d'inflammation et de la cytotoxicité. Enfin, un stress oxydant significatif est observé avec les nanoparticules de SiC, bien supérieur à celui observé avec les particules industrielles de SiC.

Les nanotechnologies génèrent un engouement assimilable à une révolution technologique. Le domaine de l'environnement est concerné car les nanoparticules (NPs) apportent des solutions à plusieurs problèmes de pollution. Par exemple, nous avons montré la forte capacité de rétention de l'As (8As/nm2) par des NPs d'oxydes de fer (6nm). Ceci est lié à leur grande surface spécifique et à leur forte réactivité de surface due à la présence de sites d'adsorption inédits et à la diminution significative de l'énergie de surface lors de l'adsorption. <br />Mais des questions se posent sur l'impact (éco)toxicologique engendré par la forte production de NPs. Une classification de l'(éco)toxicité des nano-oxydes en fonction de leurs propriétés redox a été proposée. Alors que des NPs chimiquement stables (γFe2O3) en milieux biologiques ne montrent aucune toxicité, des NPs ayant un pouvoir oxydant (CeO2) ou réducteur (Fe°) sont cytotoxiques pour Escherichia coli et génotoxiques pour les fibroblastes humains.

Les nanotechnologies génèrent un engouement assimilable à une révolution technologique. Le domaine de l'environnement est concerné car les nanoparticules (NPs) apportent des solutions à plusieurs problèmes de pollution. Par exemple, nous avons montré la forte capacité de rétention de l'As (8As/nm2) par des NPs d'oxydes de fer (6nm). Ceci est lié à leur grande surface spécifique et à leur forte réactivité de surface due à la présence de sites d'adsorption inédits et à la diminution significative de l'énergie de surface lors de l'adsorption. <br />Mais des questions se posent sur l'impact (éco)toxicologique engendré par la forte production de NPs. Une classification de l'(éco)toxicité des nano-oxydes en fonction de leurs propriétés redox a été proposée. Alors que des NPs chimiquement stables (γFe2O3) en milieux biologiques ne montrent aucune toxicité, des NPs ayant un pouvoir oxydant (CeO2) ou réducteur (Fe°) sont cytotoxiques pour Escherichia coli et génotoxiques pour les fibroblastes humains.