El desenvolupament post-embrionàri dels insectes està controlat per dos hormones, les esteroidals i l’hormona juvenil (HJ). La 20-hidroxiecdisona (20E), és la principal hormona esteroidal dels insectes, indueix i controla el procés de la muda. En canvi, l’HJ determina la naturalesa d’aquesta muda. En presencia d’HJ, el pic de 20E produeix una muda entre estadis juvenils. En canvi, quan desapareix l’HJ, la 20E indueix una muda a l’estadi adult. A nivell molecular, la 20E actua mitjançant la unió a un heterodímer format per dos membres de la família dels receptors nuclears, el receptor d'ecdisona (EcR) i ultraespiracle (USP). El receptor activat inicia una cascada gènica de resposta a la 20E coneguda com a model d’Ashburner. Els gens activats per la 20E són principalment receptors nuclears, com ara E75, HR3, HR4 i Ftz-F1 i factors de transcripció, E74 o BR-C. Aquest via de senyalització ha estat àmpliament estudiada en insectes holometàbols com D.melanogaster, pel contrari, la caracterització dels mecanismes moleculars d'acció dels ecdisteroides en els insectes hemimetàbols, o de desenvolupament directe, és pràcticament inexistent. La caracterització de la funció i mecanismes d’acció d’aquestes hormones en insectes hemimetàbols permetrà entendre els canvis que s’han produït en aquestes vies que han permès l’evolució fins a una metamorfosi completa. La panerola Blattella germanica s'utilitza com a model per estudiar el desenvolupament, hemimetàbol. Prèviament, i amb l'objectiu d'estudiar la cascada gènica de resposta a la 20E a B. germanica, s'han clonat i caracteritzat els dos membres del receptor de la 20E en aquest insecte (BgEcR-A i BgRXR) i els receptors nuclears BgE75, BgHR3, BgHR4 i BgFTZ-F1 i el factor de transcripció Br-C. Gràcies al silenciament de l'expressió gènica mitjançant RNAi in vivo s'han pogut estudiar les funcions d'aquests gens, i s'ha demostrat l’existència d’un eix gènic que regula els processos controlats per la 20E. En la present tesi doctoral s’ha clonat i caracteritzat l’últim gens primerenc que manca a B.germanica, el factor de transcripció E74. A més, també s’ha clonat i caracteritzat Seven Up, un receptor nuclear que regula la via de senyalització de la 20E en insectes holometàbols. Així, s’ha clonat dos isoformes d’E74 anomenades BgE74A i BgE74B i s’ha demostrat que són necessàries per tal que es produeixi correctament l’ècdisi. La interferència d’aquest factor durant la darrera fase nimfal produeix problemes greus en el desplegament de les ales i tegmines, en la integritat de les quetes i en les estructures d’adhesió i afecta el procés de pigmentació. L’enzim dopa decarboxilasa (BgDdc) està implicat en pigmentació i la seva interferència durant la sisena fase nimfal fa que emergeixin adults amb pigmentació més clara. BgE74 és necessari perquè BgDdc s’expressi correctament. S’han clonat dos isoformes del receptor nuclear Seven up: BgSvpA i BgSvpB. Les seves funcions no són redundants. BgSvpB regula la síntesi d’HJ en els corpora allata durant l’estadi adult de B.germanica a traves de la regulació de dos gens claus de la via, BgHMG-S i BgHMG-R. A més, BgSvpB és necessari per al desenvolupament dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. La interferència del receptor nuclear produeix una clara disminució en la divisió cel•lular dels corpora allata durant la darrera fase nimfal. Aquestes dues funcions de BgSvpB s’ha demostrat que són independents. / In insects, post-embryonic development is under the control of ecdysteroids and juvenile hormones. At the molecular level, 20-hydroxyecdysone (20E) acts through binding to its receptor, a heterodimer of the ecdysone receptor (EcR) and Ultraspiracle (USP). Both proteins belong to the nuclear receptor family. Once 20E binds to its receptor, activates a subset of genes that mediate and amplify the hormonal response. The mechanism of action of ecdysteroids in hemimetabolan insects is poorly understood. To study at the molecular level the 20E response, the Ecdysone receptor (BgEcR-BgRXR), and the nuclear receptors, BgHR3, BgFTZ-F1, BgHR4 and E75A-D of the hemimetabolan insect Blattella germanica have been cloned and characterized using RNAi in vivo. Here, first we report the cloning of two isoforms of E74 from the hemimetabolous direct developing insect Blattella germanica, namely BgE74A and BgE74B. Although BgE74 knockdown nymphs ecdysed properly into adults, they all showed clear deficiencies in the extension of the fore- and hindwings, as well as malformations in their leg bristles and locomotor structures. In addition to the described morphological abnormalities, all BgE74 knockdown nymphs that molted into adults presented defects in the cuticle pigmentation. The expression of BgDdc, an enzyme involved in insect cuticle pigmentation, was reduced in the BgE74 knockdowns. Secondly, we have cloned and characterized two isoforms of Seven-up, another nuclear receptor involved in 20E response in Drosophila, and named them BgSvpA and BgSvpB. Surprisingly, using RNAi in vivo we show that BgSvpB is not related with 20E action but is necessary to produce juvenile hormone (JH) in the corpora allata during the adult stage, through the regulation of two key enzims of JH biosynthesis, BgHMG-S and BgHMG-R. Moreover, BgSvpB is required for cell proliferation of the corpora allata during nymphal development.

En los insectos, las diferentes transiciones que se producen a lo largo del desarrollo, tanto embrionario como post-embrionario, se encuentran reguladas por pulsos de ecdisteroides, en particular por la 20 hidroxiecdisona (20E). Esta señal se transduce mediante factores de transcripción de la família de los receptores nucleares, en concreto, la 20E se une al heterodímero formado por el receptor de la ecdisona (EcR) y el producto del gen ultraespiraculo (USP) y, una vez unida, activa una pequeña serie de genes tempranos, que, a su vez, amplifican esta señal mediante la inducción de los denominados genes tardíos que controlan la respuesta biológica a la hormona. Dentro de esta cascada génica, cabe destacar el eje funcional formado por los receptores nucleares EcR-HR3-FTZ F1 el cual interviene en la coordinación de las mudas larvarias, así como en el inicio de la metamorfosis en Drosophila melanogaster. Es importante subrayar que no se conoce si la jerarquía de factores nucleares inducidos por la 20E también existe y opera en insectos más primitivos con un desarrollo hemimetábolo como es nuestro insecto modelo Blattella germanica. En la presente tesis doctoral iniciamos la caracterización del eje funcional EcR-HR3-FTZ F1 en el dictióptero Blattella germanica. Así pues, hemos llevado a cabo el clonaje de los ortólogos de los receptores nucleares HR3 y FTZ-F1 en B. germanica obteniendo tres isoformas de HR3 (BgHR3 A, BgHR3 B1 y BgHR3 B2) y dos de FTZ F1 (BgFTZ F1A y BgFTZ F1B). Hemos caracterizado los patrones de expresión de estos transcritos y del receptor de la ecdisona (BgEcR A), que se había clonado previamente en nuestro laboratorio, en las dos últimas fases ninfales así como durante la embriogénesis de B. germanica. Además, analizamos el papel regulador que estos receptores nucleares desempeñan durante el desarrollo ninfal de B. germanica, y especialmente en el proceso de la muda. Para ello, hemos utilizado la técnica del RNA de interferencia (RNAi) in vivo mediada por la inyección intraabdominal de RNAs de doble cadena (dsRNA) de cada uno de los genes a estudiar. Cuando estos dsRNAs eran inyectados en hembras recién emergidas a sexto estadio ninfal, la mayoría de las ninfas interferidas no eran capaces de completar la écdisis y morían transcurridas 24-48 h. El análisis fenotípico de estos individuos mostró que presentaban duplicación de las estructuras de origen ectodérmico y que presentaban alteraciones en los niveles de ecdisteroides hemolinfáticos. No obstante, un cierto porcentaje de las ninfas tratadas con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 eran capaces de completar la muda imaginal, esto nos permitió estudiar procesos que se ven afectados por estos dos factores de transcripción durante la vida adulta. Los individuos interferidos con dsBgEcR A que mudaban a adulto presentaban claros defectos en la extensión de los dos pares de alas, por su parte, las ninfas tratadas con dsBgFTZ F1 también presentaban alas mal posicionadas, aunque correctamente extendidas. El segundo fenotipo observado en todos los individuos tratados con dsBgEcR A y dsBgFTZ F1 que mudaban a adulto es que la glándula protorácica no degeneraba. Ampliamos el análisis funcional de cada uno de los receptores nucleares que estamos analizando, BgEcR A, BgHR3 y BgFTZ F1 al periodo embrionario de B. germanica. El análisis de los embriones interferidos para BgEcR A y BgFTZ F1 mostró que estos individuos progresaron hasta las 48 h de desarrollo embrionario, presentando, sin embargo, considerables malformaciones que impidieron su posterior desarrollo. Mientras que aquellos que eran silenciados para BgHR3, que fueron capaces de progresar hasta las 96 h de desarrollo, presentaron defectos en el desarrollo de la región cefálica, desde un nivel poco severo en el que únicamente se apreció una cierta reducción o pérdida de los lóbulos cefálicos hasta embriones que presentaban la pérdida de todos los segmentos cefálicos. / Ecdysteroids control molting in insects. The active form of ecdysteroids, 20 hydroxyecdisone (20E), exerts its function through the activation of a small set of transcription factors. In turn, these genes induce the expression of a larger set of other genes that control the biological response to the hormone. The orphan nuclear receptors EcR, HR3 and FTZ F1 have been shown to act as crucial members of the 20E-regulatory hierarchy in coordinating molting in the holometabolous insects Drosophila melanogaster and Manduca sexta. However, little is known on the role of these factors on primitive insects. Here, we report the cloning and characterization of BgHR3 and BgFTZ F1 in the hemimetabolous species Blattella germanica. Moreover, we use in vivo RNAi mediated by double-strand RNA (dsRNA) treatment to define BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during molting in B. germanica. When dsRNAs were injected at the beginning of the last larval instar, treated larvae had normal appearance and movements until the end of the instar. However, by the molting time most of them did not molt, became motionless and became arrested. Phenotypic analysis reveal that treated specimens had two pairs of mouth appendages, double tubular tracheae and produce a new cuticle. Moreover, the dsBgHR3-treated animals have higher ecdysteroids levels, whereas those of dsBgEcR A and dsBgFTZ F1-treated are lower than controls. Some of the nymphs treated with dsBgEcR A and dsBgFTZ F1 progressed through a complete molting. Interestingly, these knockdowns showed defects in wing extension and the prothoracic gland did not degenerated. Also, we have studied BgEcR A, BgHR3 and BgFTZ F1 functions during B. germanica embryogenesis. Using RNAi parental we found that dsBgEcR-A and dsBgFTZ-F1 treated animals progress up to the 12% of development and resulted in germ bands showing severe phenotypes. While, those interfered with dsBgHR3 could progress up to the 25% of development but they shown defects in the cephalic regions which ranged in severity from reduction or loss of cephalic lobes to the complete loss of the cephalic segments.

El procés de regeneració permet als organismes refer parts o teixits del seu cos que han sofert algun dany. Els discs imaginals de Drosophila melanogaster, primordis larvaris de les estructures adultes, tenen capacitat de promoure processos de cicatrització i proliferació, regenerant el teixit i donant lloc a estructures adultes completament normals. Hem estudiat el perfil d’expressió de discs d’ala a 0, 24 i 72h de regeneració. Els resultats obtinguts mostren un enriquiment significatiu de l’expressió de Factors de Transcripció lligats a importants vies de senyalització com Wingless (Wg), Notch (N) i Jun N-terminal Kinasa (JNK). Mitjançant la cerca computacional de motius d’unió d’AP-1 (factor de transcripció de la via de la JNK) en els promotors dels gens amb canvis d’expressió, hem descrit els gens diana d’aquesta la via procés durant la regeneració. Entre aquests gens es troba cabut (cbt), l’expressió del qual augmenta durant les primeres 24h i disminueix a les 72h, recuperant els seus nivells basals. Hem confirmat aquests resultats per qRT-PCR i amb tècniques d’hibridació in situ, demostrant a més, que l’increment de l’expressió de cbt està associat a cèl•lules del blastema. També hem comprovat que l’expressió de cbt augmenta per sobreactivació de la via de la JNK en el disc d’ala, tal i com s’havia vist prèviament en embrió. Mitjançant la tècnica EMSA hem validat la unió in vitro de les proteïnes Jun i DFos (que formen el dímer AP-1) a la seqüència predita en el promotor del gen cbt confirmant la regulació directe de la via de la JNK. L’anàlisi de discs mutants per cbt indica que l’expressió d’aquest gen és necessària per al tancament de la ferida i proliferació durant la regeneració. Cabut (Cbt) és un factor de transcripció Zn finger de la família dels Krüpple like Factors i els seus ortòleg en vertebrats són els gens TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). Aquest gen s’ha descrit com a modulador de les vies Dpp i JAK/STAT en el disc d’ala. Una aproximació per descriure les funcions d’un factor de transcripció com Cbt és determinar els seus gens diana. Amb aquest objectiu hem realitzat un ChIP-Seq amb un anticòs contra la proteïna Cbt. Els resultats obtinguts mostren que Cbt es troba localitzat principalment als promotors dels gens. Aquest estudi ha reportat 2060 gens diana de Cbt en el disc d’ala. Les categories funcionals GO associades a aquest grup de gens són: Regulació de la transcripció, cicle cel•lular, desenvolupament dels discs imaginals i desenvolupament neuronal. També hem trobat un enriquiment en gens lligats a vies de senyalització com la JNK, Wg i N. L’anàlisi de les seqüències de les dianes de Cbt i altres estudis publicats apunten els factors Sin3A i GAF com a possibles cofactors de Cbt. Finalment hem analitzat el paper de Cbt en la regulació de la via de N, els resultats obtinguts mostren que Cbt regula positivament la via de N promovent el creixement i la formació del marge Dorso/Ventral del disc d’ala. Per tal d’establir quins factors de transcripció s’uneixen al promotor de cbt i regulen la seva expressió, hem realitzat un cribratge a gran escala utilitzant la tècnica de Yeast-One-Hybrid, que permet descriure la unió de factors de transcripció a una seqüència concreta. Hem obtingut factors de transcripció lligats al desenvolupament neural, a la segmentació i a la resposta immune amb capacitat d’unir-se al promotor de cbt. Aquestes dades no només ens donen informació sobre la regulació de Cbt sinó que també suggereixen la seva implicació en aquests processos. En conjunt el nostre treball mostra que Cbt regula el creixement i l’homeòstasi del disc d’ala durant el desenvolupament. I que quan es produeix un dany en aquest teixit l’expressió de Cbt incrementa, de manera depenent de la via de la JNK, per garantir la restauració del teixit perdut. / Regeneration is the ability to rebuild a body part that has been damaged or amputated. Drosophila imaginal discs are able to undergo wound healing and regenerative growth after ablation. Genome-wide expression profiling of regenerating wing discs at 0, 24 and 72 hours after fragmentation have revealed a significant enrichment of transcription factors and chromatin regulators. To identify JNK target genes among the differentially expressed genes we performed a computational search of AP-1 binding sites in the promoter regions of these gens. Among them we identified cabut (cbt), the Drosophila ortholog of TGFβ Inducible Early Genes (TIEG). During regeneration cbt expression is induced between 0 and 24 and down-regulated between 24 and 72 hours, suggesting a tight and controlled mechanism of regulation. qRT-PCR and in situ hybridization experiments confirmed cbt expression changes and highlighted that cbt upregulation is associated to cells located in the blastema region. Moreover the analysis of regenerated cbt mutant discs demonstrated that cbt upregulation is required for wound healing and growth during regeneration. Cbt is a Zn finger transcription factor related to JNK and Dpp pathways, but few is known about its target genes. In order to identify Cbt target genes in development, we performed a Cbt ChIP-Seq analysis of wing discs from larvae III. This study reveal that Cbt is located mostly in the promoter regions of its target genes. We identified 2060 Cbt target genes which were related to functional categories such imaginal disc development, transcription regulation, neuron development or cell cycle. Furthermore several Cbt target genes were associated to signaling pathways like JNK, Wg or Notch (N). The analysis of cbt targets and previous reports pointed the factors GAF and Sin3A as a possible cofactors of Cbt. Finally, genetic interactions between cbt and N mutants demonstrated that Cbt regulates positively N signaling contributing to growth and Dorso/Ventral wing margin regulation. Although we have demonstrated that JNK is upstream of cbt, there is no much data available about cbt regulation in normal development. To approach this question we performed a high throughput Yeast-One-Hybrid screening that allowed us to defined factors that bind to cbt proximal promoter. The identified factors were related to immune response, neuron development and segmentation. Our results contributed to decipher cbt regulation network and suggested possible new roles for Cbt. In summary Cbt regulates growth and homeoastasis of wing disc during development. However in front of injury cbt is upregulated in a JNK dependent manner to ensure complete regeneration.

La Transició Epiteli-Mesènquima és el mecanisme pel qual les cèl·lules epitelials generades en regions particulars, poden dissociar-se de l'epiteli i migrar cap a nous destins, gràcies a uns canvis morfològics que transformen les cèl·lules epitelials en cèl·lules mesenquimals. Aquest procés fonamental durant el desenvolupament, també és rellevant en la progressió de tumors epitelials malignes i en tots dos casos les cèl·lules perden cohesió i adhesió i guanyen mobilitat. Aquests processos morfogènics impliquen una reorganització important del citoesquelet que serà incompatible amb un estat proliferatiu actiu, fins que les cèl·lules necessitin colonitzar un nou territori.Snail és un factor clau en la regulació dels processos EMT, tant en el desenvolupament com en la progressió tumoral gràcies a la seva capacitat de reprimir directament la transcripció de gens epitelials i promoure l'expressió de gens mesenquimals. Uns clons estables de dues línies cel·lulars epitelials, generats en el nostre grup proliferaven més lentament a l'expressar Snail de manera que ens vam proposar descriure el mecanisme utilitzat per Snail per fer disminuir la taxa de proliferació cel.lular al ser expressat ectòpicament en cèl.lules en cultiu que havien patit una EMT.Els resultats d'aquesta tesi indiquen que Snail bloqueja el cicle cel·lular al ser expressat en cèl·lules epitelials fent que disminueixin els nivells de proteïna CDC25A, fosfatasa que pot activar els complexes CDK-ciclina implicats en la progressió per diverses etapes del cicle. Els nostre estudi suggereix que Snail reté el mRNA de CDC25A al nucli, impedint que sigui exportat i traduit.

A Saccharomyces cerevisiae, un increment de la temperatura comporta diversos efectes deleteris en l’organització interna de la cèl∙lula i indueix una inducció ràpida, massiva i transitòria d’expressió gènica, que es controla principalment pels factors de transcripció Hsf1 i Msn2/4. En aquest estudi, fent servir un crivatge genètic a gran escala, hem identificat el conjunt d’activitats que es requereixen per a l’adaptació cel∙lular a l’estrés tèrmic. A més, hem trobat que el complex de desacetilació d’histones de Rpd3 és un component essencial per a l’adaptació i la supervivència a l’estrés tèrmic, i que es requereix per a l’adequada regulació de l’expressió gènica. Concretament, Rpd3 es necessita per a l’activació dels gens depenents de Msn2/4 en resposta a estrés tèrmic. A més, hem trobat que és el complex gran de Rpd3, però no el petit, el qui media l’adaptació cel∙lular. Un increment en l’osmolaritat externa activa la quinasa activada per estrés (SAPK) Hog1, que és essencial per induir diverses respostes adaptatives, com la regulació de l’expressió gènica. Hog1 controla al menys cinc factors de transcripció. Aquí ensenyem que els factors de transcripció Rtg1 i Rtg3 regulen l’expressió d’un conjunt de gens en resposta a estrés osmòtic, d’una manera depenent de Hog1. En resposta a estrés osmòtic, Hog1 es requereix per a l’acumulació nuclear del complex de transcripció de Rtg1/3. Un cop al nucli, Hog1 es recluta als promotors i la seva activitat es requereix per a la unió de Rtg1/3 a la cromatina. A més, la fosforilació de Rtg3 per Hog1 és un pas important per a l’adequada activació transcripcional. / In Saccharomyces cerevisiae, increases in temperature lead to deleterious effects on the internal organization of the cell, and lead to a massive and transient induction of gene expression, mainly controlled by Hsf1 and Msn2/4 transcription factors. In this study, by using a genome‐wide genetic screen, we identified the network of essential activities required for cell adaptation to heat stress. Moreover, we found that the Rpd3 histone deacetylase (HDAC) complex is an essential component for adaptation and survival to heat stress and it is required for proper regulation of gene expression. Specifically, Rpd3 is needed for activation of the Msn2/4‐dependent genes in response to heat stress. Moreover, we found that the large, but not the small Rpd3 complex mediates cell adaptation. Increases in the extracellular osmolarity activate the Hog1 stress‐activated protein kinase (SAPK), which is essential for the induction of diverse osmoadaptive responses, such as regulation of gene expression. At least five transcription factors have been shown to be controlled by Hog1. Here we show that the Rtg1 and Rtg3 transcription factors regulate the expression of a set of genes upon osmostress in a Hog1‐dependent manner. In response to osmostress, Hog1 is required for the nuclear accumulation of the Rtg1/3 transcription complex. Once in the nucleus, Hog1 is recruited at promoters and its activity is required for the binding of Rtg1/3 to chromatin. Moreover, Rtg3 phosphorylation by Hog1 is an important step for proper transcriptional activation.

La salinidad y el estrés hídrico son los factores más importantes que limitan la producción de trigo duro, sobre todo en regiones áridas y semiáridas, como la región Mediterránea. El trigo duro es uno de los principales cultivos en el sur y este de la Cuenca Mediterránea, donde se cultiva frecuentemente en condiciones de secano y si es posible con riego deficitario, a menudo con agua de poca calidad, que junto a una elevada evapotranspiración, puede provocar una progresiva salinización del terreno. En este sentido, la mejora genética de trigo duro para una mejor adaptación a estas condiciones de estrés es una de las pocas alternativas viables. El objetivo general de esta Tesis es estudiar las bases fisiológicas y moleculares de las diferencias genotípicas en crecimiento potencial y tolerancia a la salinidad y el estrés hídrico. En un primer estudio (Experimento 1) publicado en “Functional Plant Biology” se investigó qué criterio fenotípico de selección era el más adecuado para seleccionar genotipos de trigo duro que crecieran mejor en condiciones de salinidad continuada. De esta forma se determinó la importancia de los isótopos estables como criterios eficientes para seleccionar genotipos tolerantes y susceptibles a la salinidad. Posteriormente, se realizó un segundo estudio (Experimento 2) donde se evaluó el efecto de la salinidad en la composición isotópica del carbono (δ13C) y el nitrógeno (δ15N) de genotipos de trigo duro y de dos amfiploides (un tritordeo y un triticale). Este trabajo está publicado en la revista “Journal of Experimental Botany”. En este segundo ensayo, la salinidad se aplicó durante la floración y el llenado del grano durante unas pocas semanas. Los resultados de este trabajo representaron la puesta a punto del estudio del comportamiento fisiológico del trigo duro durante la fase reproductiva y bajo diferentes combinaciones de salinidad y riego. Como continuación de los dos Experimentos (1 y 2) y en vista de los resultados obtenidos en el uso de las firmas isotópicas como criterio de evaluación bajo condiciones salinas, se planteó evaluar el uso combinado de la composición isotópica del carbono (δ13C), oxígeno (δ18O) y el nitrógeno (δ15N) en materia seca para observar las respuestas genotípicas de plantas de trigo duro sometidas a diferentes combinaciones de salinidad. Como contribución original, se elaboró un modelo conceptual de las tres firmas isotópicas juntas (δ13C, δ18O, δ15N) junto con características del metabolismo nitrogenado para explicar las diferencias genotípicas en tolerancia a distintas condiciones de salinidad y estrés hídrico. También se evaluaron las características fotosintéticas en relación con las firmas isotópicas y las actividades de enzimas clave del metabolismo nitrogenado. (Trabajo Publicado en la revista “New Phytologist”). Además de los resultados anteriores obtenidos, en esta Tesis se comparó la eficiencia de las firmas isotópicas del carbono, oxígeno y nitrógeno mediante dos vías: muestras de materia seca y muestras de fracción soluble en genotipos de trigo duro para la evaluación de diferencias genotípicas en tolerancia a diferentes condiciones de salinidad y regimenes hídricos. Posteriormente se analizó la respuesta genética de plantas de trigo duro a la salinidad evaluando el nivel de transcripción de genes específicos asociados a tolerancia a salinidad y estrés hídrico, junto a otros que codifican para enzimas claves del metabolismo nitrogenado. También se han estudiado las relaciones entre estas tasas de transcripción, las diferencias genotípicas en crecimiento, firmas isotópicas y actividades de enzimas del metabolismo nitrogenado. El trabajo ha mostrado la eficacia de los isótopos estables de carbono y del nitrógeno como herramientas de evaluación de la respuesta del trigo duro frente a la salinidad. / Inadequate irrigation for long term and under conditions of high evapotranspiration demand, combined with the use of poor water quality and the lack of adequate drainage frequently induces the salinization of arable land causing a significant increase in the area affected by salinity. Salinity is an environmental factor that limits in a remarkable manner the production of crops in many parts of the world, but especially in arid and semiarid regions like the Mediterranean. Under these conditions, which is often grown durum wheat improvement for tolerance to salinity under irrigation deficit may be one of the strategies to alleviate this problem. This Thesis shows that isotope compositions of carbon (δ13C), oxygen (δ18O), and nitrogen (δ15N) and the concentration of nitrogen in dry matter are potentially and effective criteria for discriminating between different growing conditions and between genotypes tolerant or susceptible to salt. Furthermore, the results of this study reflect the importance of nitrogen metabolism in tolerance to salinity. Additionally, this thesis develops a model relating genotypic tolerance to different conditions of salinity and drought with the signatures of the three isotopes (C, O, N), together with photosynthetic and transpiration exchanges and parameters key of nitrogen metabolism such as nitrogen concentration and activities of the glutamine synthetase and nitrate reductase. Finally, we study the relationship between the expression of genes potentially key in the tolerance to salinity and drought and genotypic variability in response to different combinations of these stresses.

En el llevat Saccharomyces cerevisiae els canvis en les condicions osmòtiques del medi extracel.lular són sensades per la MAP cinasa Hog1, la qual permet dur a terme l'adaptació cel.lular mitjançant la modulació de l'expressió gènica, de la traducció i de la progressió del cicle cel.lular. A l'inici d'aquest projecte de tesi, els mecanismes pels quals Hog1 controla l'expressió gènica no eren del tot coneguts. El nostre objectiu va ser caracteritzar el mecanisme molecular pel qual Hog1 modula la transcripció en resposta a estrès osmòtic. Hem aconseguit demostrar que el reclutament de Hog1 als promotors sensibles a estrès osmòtic per part del factor de transcripció és essencial per al reclutament i activació de la RNA polimerasa II, mecanisme que podria estar conservat en les cèl.lules eucariotes. També hem identificat noves activitats remodeladores de cromatina implicades en la resposta gènica a osmoestrès mediada per Hog1. Vàrem realitzar un cribatge genètic per identificar mutacions que provoquessin osmosensibilitat i una reducció en l'expressió de gens de resposta a estrès osmòtic. Aquest cribatge ens va permetre identificar nous reguladors de la transcripció mediada per osmoestrès: la histona deacetilasa Rpd3 i els complexes SAGA i mediador. Els nostres resultats permeten, doncs, definir un important paper per a Rpd3, SAGA i mediador en la inducció gènica mediada per Hog1, i han estat importants per assolir una millor visió de com les cinases activades per estrès regulen la iniciació de la transcripció. / In Saccharomyces cerevisiae, changes in the extracellular osmotic conditions are sensed by the HOG MAPK pathway, which elicits the program for cell adaptation, including modulation of gene expression, translation and cell-cycle progression. At the beginning of this PhD Project, the mechanisms by which Hog1 was controlling gene transcription were not completely understood. Our main objective was to characterize the molecular mechanisms by which the Hog1 MAPK modulates transcription upon osmostress. We have shown that anchoring of Hog1 to osmoresponsive promoters by the transcription factor is essential for recruitment and activation of RNA polymerase II, a mechanism that might be conserved among eukaryotic cells. In addition, we identified novel chromatin modifying and remodelling activities involved in the Hog1-mediated osmostress gene expression. We performed a genome-wide genetic screening searching for mutations that render cells osmosensitive and displayed reduced expression of osmoresponsive genes. Rpd3 histone deacetylase, SAGA and Mediator complexes were identified as novel regulators of osmostress-mediated transcription. Thus, our results define a major role for Rpd3, SAGA and Mediator in the Hog1-mediated osmostress gene induction, and have been important to achieve a better view of how a SAPK regulates transcription initiation.

En aquest treball es presenta l'evolució molecular i estudi funcional de gens localitzats a les duplicacions segmentàries de la regió 7q11.23, implicada en la Síndrome de Williams-Beuren (SWB). S'ha datat l'aparició d'aquestes duplicacions en els últims 25 milions d'anys d'evolució i s'ha proposat un model evolutiu amb reordenaments específics i mecanismes de generació. Correlacions clínico-moleculars en els pacients amb la SWB han permès determinar que l'haploinsuficiència per NCF1, un gen localitzat a les duplicacions, és un factor protector per hipertensió. S'ha proposat un model patogènic per la hipertensió, implicant l'oxidasa NAD(P)H i estrès oxidatiu, suggerint que noves estratègies terapèutiques podrien ser utilitzades. A més, s'ha caracteritzat parcialment la funció de GTF2IRD2, un altre gen de les duplicacions. GTF2IRD2 interacciona amb altres factors de transcripció relacionats, té una localització subcel·lular variable i no s'uneix a ADN. Aquests resultats contribueixen a conèixer millor els mecanismes mutacionals i patogènics de la SWB. / This work presents the molecular evolution along with the functional analysis of the genes located in the segmental duplications flanking the 7q11.23 region, involved in Williams-Beuren syndrome (WBS). The generation of the segmental duplications has been dated to the last 25 million years of evolution and an evolutionary model with specific rearrangements and mechanisms has been proposed. Clinical-molecular correlations in WBS patients have allowed to determine that haploinsufficiency at NCF1, a gene located in the duplications, is a protective factor for hypertension. A pathogenic model for hypertension has been proposed, implicating NAD(P)H oxidase and oxidative stress, and suggesting that novel therapeutic strategies could be used. In addition, the functional characterization of another gene of the duplications, GTF2IRD2, has been partially achieved. GTF2IRD2 has been shown to interact with other related transcription factors, to display variable subcellular localization and to lack DNA binding properties. These results contribute to a better knowledge of the mutational and pathogenic mechanisms of the WBS.

The aim of this thesis is the characterization of a protein involved in apoptosis. Our group has identified an early step common to different forms of intrinsic apoptosis stimuli. This step requires de novo synthesis of a novel Cyclin, Cyclin O, that upon apoptosis induction in lymphoid cells forms active complexes, primarily with Cdk2. Cyclin O expression precedes glucocorticoid and gamma radiation-induced apoptosis in vivo in mouse thymus and its overexpression induces apoptosis in cultured cells. Knocking down the endogenous expression of Cyclin O by shRNA leads to the inhibition of glucocorticoid and DNA damage-induced apoptosis while leaving CD95 death receptor mediated apoptosis intact. This data demonstrates that apoptosis induction in lymphoid cells is one of the physiological roles of Cyclin O and it does not act by perturbing a normal cellular process such as the cell cycle. In addition we have identified c-Myb a substrate of Cdk2-Cyclin O complexes and we show that c-Myb is downregulated during apoptosis of lymphoid cells. / L'objectiu d'aquesta tesi és la caracterització d'una proteïna involucrada en l'apoptosi. El nostre grup ha identificat un pas primerenc comú en diversos estímuls apoptòtics de la ruta intrínseca. Aquest pas requereix la síntesi de novo d'una nova Ciclina, Ciclina O, que quan s'indueix apoptosi en cèl·lules limfoides forma complexes actius majoritàriament amb Cdk2. L'expressió de la Ciclina O és prèvia a l'apoptosi induïda per glucocorticoids i radiació gamma i la seva sobreexpressió indueix apoptosi en cultius cel·lulars. La baixada dels nivells d'expressió de la Ciclina O endògena amb shRNA provoca una inhibició de l'apoptosi induïda per glucocorticoids o agents que danyen el DNA, mentre que l'apoptosi mediada pel receptor CD95 es manté intacta. Aquests resultats demostren que la inducció d'apoptosi en cèl·lules limfoides és una de les funcions fisiològiques de la Ciclina O i que no es deu a una pertorbació de processos cel·lulars normals com ara el cicle cel·lular. A més a més, hem identificat c-Myb com a substrat dels complexes Cdk2-Ciclina O i demostrem que els nivells de c-Myb baixen durant l'apoptosis de cèl·lules limfoides.

[EN] This thesis work contributes to the field of the {Automatic Speech Recognition} (ASR). And particularly to the {Interactive Speech Transcription} and {Confidence Measures} (CM) for ASR. The main goals of this thesis work can be summarised as follows: 1. To design IST methods and tools to tackle the problem of improving automatically generated transcripts. 2. To assess the designed IST methods and tools on real-life tasks of transcription in large educational repositories of video lectures. 3. To improve the reliability of the IST by improving the underlying (CM). Abstracts: The {Automatic Speech Recognition} (ASR) is a crucial task in a broad range of important applications which could not accomplished by means of manual transcription. The ASR can provide cost-effective transcripts in scenarios of increasing social impact such as the {Massive Open Online Courses} (MOOC), for which the availability of accurate enough is crucial even if they are not flawless. The transcripts enable search-ability, summarisation, recommendation, translation; they make the contents accessible to non-native speakers and users with impairments, etc. The usefulness is such that students improve their academic performance when learning from subtitled video lectures even when transcript is not perfect. Unfortunately, the current ASR technology is still far from the necessary accuracy. The imperfect transcripts resulting from ASR can be manually supervised and corrected, but the effort can be even higher than manual transcription. For the purpose of alleviating this issue, a novel {Interactive Transcription of Speech} (IST) system is presented in this thesis. This IST succeeded in reducing the effort if a small quantity of errors can be allowed; and also in improving the underlying ASR models in a cost-effective way. In other to adequate the proposed framework into real-life MOOCs, another intelligent interaction methods involving limited user effort were investigated. And also, it was introduced a new method which benefit from the user interactions to improve automatically the unsupervised parts ({Constrained Search} for ASR). The conducted research was deployed into a web-based IST platform with which it was possible to produce a massive number of semi-supervised lectures from two different well-known repositories, videoLectures.net and poliMedia. Finally, the performance of the IST and ASR systems can be easily increased by improving the computation of the {Confidence Measure} (CM) of transcribed words. As so, two contributions were developed: a new particular {Logistic Regresion} (LR) model; and the speaker adaption of the CM for cases in which it is possible, such with MOOCs. / [ES] Este trabajo contribuye en el campo del {reconocimiento automático del habla} (RAH). Y en especial, en el de la {transcripción interactiva del habla} (TIH) y el de las {medidas de confianza} (MC) para RAH. Los objetivos principales son los siguientes: 1. Diseño de métodos y herramientas TIH para mejorar las transcripciones automáticas. 2. Evaluar los métodos y herramientas TIH empleando tareas de transcripción realistas extraídas de grandes repositorios de vídeos educacionales. 3. Mejorar la fiabilidad del TIH mediante la mejora de las MC. Resumen: El {reconocimiento automático del habla} (RAH) es una tarea crucial en una amplia gama de aplicaciones importantes que no podrían realizarse mediante transcripción manual. El RAH puede proporcionar transcripciones rentables en escenarios de creciente impacto social como el de los {cursos abiertos en linea masivos} (MOOC), para el que la disponibilidad de transcripciones es crucial, incluso cuando no son completamente perfectas. Las transcripciones permiten la automatización de procesos como buscar, resumir, recomendar, traducir; hacen que los contenidos sean más accesibles para hablantes no nativos y usuarios con discapacidades, etc. Incluso se ha comprobado que mejora el rendimiento de los estudiantes que aprenden de videos con subtítulos incluso cuando estos no son completamente perfectos. Desafortunadamente, la tecnología RAH actual aún está lejos de la precisión necesaria. Las transcripciones imperfectas resultantes del RAH pueden ser supervisadas y corregidas manualmente, pero el esfuerzo puede ser incluso superior al de la transcripción manual. Con el fin de aliviar este problema, esta tesis presenta un novedoso sistema de {transcripción interactiva del habla} (TIH). Este método TIH consigue reducir el esfuerzo de semi-supervisión siempre que sea aceptable una pequeña cantidad de errores; además mejora a la par los modelos RAH subyacentes. Con objeto de transportar el marco propuesto para MOOCs, también se investigaron otros métodos de interacción inteligentes que involucran esfuerzo limitado por parte del usuario. Además, se introdujo un nuevo método que aprovecha las interacciones para mejorar aún más las partes no supervisadas (ASR con {búsqueda restringida}). La investigación en TIH llevada a cabo se desplegó en una plataforma web con el que fue posible producir un número masivo de transcripciones de videos de dos conocidos repositorios, videoLectures.net y poliMedia. Por último, el rendimiento de la TIH y los sistemas de RAH se puede aumentar directamente mediante la mejora de la estimación de la {medida de confianza} (MC) de las palabras transcritas. Por este motivo se desarrollaron dos contribuciones: un nuevo modelo discriminativo {logístico} (LR); y la adaptación al locutor de la MC para los casos en que es posible, como por ejemplo en MOOCs. / [CA] Aquest treball hi contribueix al camp del {reconeixment automàtic de la parla} (RAP). I en especial, al de la {transcripció interactiva de la parla} i el de {mesures de confiança} (MC) per a RAP. Els objectius principals són els següents: 1. Dissenyar mètodes i eines per a TIP per tal de millorar les transcripcions automàtiques. 2. Avaluar els mètodes i eines TIP per a tasques de transcripció realistes extretes de grans repositoris de vídeos educacionals. 3. Millorar la fiabilitat del TIP, mitjançant la millora de les MC. Resum: El {reconeixment automàtic de la parla} (RAP) és una tasca crucial per una àmplia gamma d'aplicacions importants que no es poden dur a terme per mitjà de la transcripció manual. El RAP pot proporcionar transcripcions en escenaris de creixent impacte social com els {cursos online oberts massius} (MOOC). Les transcripcions permeten automatitzar tasques com ara cercar, resumir, recomanar, traduir; a més a més, fa accessibles els continguts als parlants no nadius i els usuaris amb discapacitat, etc. Fins i tot, pot millorar el rendiment acadèmic de estudiants que aprenen de xerrades amb subtítols, encara que aquests subtítols no siguen perfectes. Malauradament, la tecnologia RAP actual encara està lluny de la precisió necessària. Les transcripcions imperfectes resultants de RAP poden ser supervisades i corregides manualment, però aquest l'esforç pot acabar sent superior a la transcripció manual. Per tal de resoldre aquest problema, en aquest treball es presenta un sistema nou per a {transcripció interactiva de la parla} (TIP). Aquest sistema TIP va ser reeixit en la reducció de l'esforç per quan es pot permetre una certa quantitat d'errors; així com també en en la millora dels models RAP subjacents. Per tal d'adequar el marc proposat per a MOOCs, també es van investigar altres mètodes d'interacció intel·ligents amb esforç d''usuari limitat. A més a més, es va introduir un nou mètode que aprofita les interaccions per tal de millorar encara més les parts no supervisades (RAP amb {cerca restringida}). La investigació en TIP duta a terme es va desplegar en una plataforma web amb la qual va ser possible produir un nombre massiu de transcripcions semi-supervisades de xerrades de repositoris ben coneguts, videoLectures.net i poliMedia. Finalment, el rendiment de la TIP i els sistemes de RAP es pot augmentar directament mitjançant la millora de l'estimació de la {Confiança Mesura} (MC) de les paraules transcrites. Per tant, es van desenvolupar dues contribucions: un nou model discriminatiu logístic (LR); i l'adaptació al locutor de la MC per casos en que és possible, per exemple amb MOOCs. / Sánchez Cortina, I. (2016). Confidence Measures for Automatic and Interactive Speech Recognition [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61473