Orientador: Mario Sergio Palma / Resumo: Os escorpiões são artrópodes da classe Arachnida, ordem Scorpiones. São animais peçonhentos, ou seja, possuem órgão secretório ou glândulas conectadas a um dispositivo de injeção, o qual pode inocular o veneno produzido pela glândula ou células especializadas. O veneno pode ser descrito como sendo uma mistura complexa, contendo muco, sais inorgânicos, moléculas orgânicas de baixa massa molecular, muitos peptídeos neurotóxicos e proteínas. O envenenamento humano por picada de escorpião é um importante problema de saúde pública em vários países tropicais e subtropicais. No Brasil, Tityus serrulatus é uma das espécies mais perigosas, que causam grave envenenamento, podendo levar ao óbito. Em geral, o envenenamento pode causar sintomas de dor, febre, agitação psicomotora, salivação, lacrimejamento, aumento da mobilidade do trato gastrointestinal, insuficiência respiratória e arritmia cardíaca, hipertensão arterial seguida de hipotensão, insuficiência cardíaca, edema pulmonar e choque anafilático. O veneno dos escorpiões tem sido estudado ao longo dos anos, a fim de elucidar seus compostos juntamente com suas sequências e suas funções biológicas. Algumas espécies de escorpiões possuem em seu veneno compostos antimicrobianos, mediadores que ativam os processos inflamatórios, causam a desgranulação de mastócitos, como também, podem ser capazes de induzir quimiotaxia de neutrófilos. Até o presente momento a toxinologia de escorpiões tem concentrado o foco nas neurotoxinas, que são peptídeos contendo entre 30 e 70 resíduos de aminoácidos em suas sequências, com quatro ou cinco pontes dissulfeto em suas estruturas. A despeito de existir muitos pequenos peptídeos (apresentando entre 5 e 20 resíduos de aminoácidos em suas sequências), que apresentam conformações lineares, por não apresentarem pontes ... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Scorpions are arthropods of the class Arachnida, order Scorpiones. They are venonous animals, i. e, they have secretory organ or gland connected to an injection apparatus, which can inoculate the venom produced by specialized cells. The venom can be described as a complex mixture containing mucus, inorganic salts, organic molecules of low molecular mass, many neurotoxic peptides and proteins. The human enenvenoming by scorpion sting is an important problem of public health in many tropical and subtropical countries. In Brazil, Tityus serrulatus is one of the most dangerous species, which cause severe enenvenoming, that can lead to death. In general, the envenoming can cause symptoms of pain, fever, agitation, salivation, lacrimation, increasing motility of the gastrointestinal tract, respiratory failure and cardiac arrhythmia, hypertension followed by hypotension, heart failure, pulmonary edema and anaphylaxis. The venom of scorpions has been studied over the years in order to elucidate their biochemical composition, along with their sequences and biological functions. Some species of scorpions have antimicrobial compounds in their venom, mediators that trigger inflammatory processes, causing mast cell degranulation, and also may be capable of inducing neutrophil chemotaxis. To date, the toxinology of scorpions has concentrated the focus on neurotoxins, which are peptides containing between 30 and 70 amino acid residues in their sequences, with four or five disulfide bonds in their structures. Despite the existence of many small peptides (having between 5 and 20 amino acid residues in their sequences), that have linear conformations for not having disulfide bonds in their structures, this group of toxins has been neglected in the literature, due to the difficulty in isolating and determine molecular structures of these toxins ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-08-01T15:24:21Z No. of bitstreams: 1 2014_FernandaGuillhelmelliCosta.pdf: 579842 bytes, checksum: 0404b162e863343d042b963d2c05c4b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-08-04T13:33:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_FernandaGuillhelmelliCosta.pdf: 579842 bytes, checksum: 0404b162e863343d042b963d2c05c4b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-04T13:33:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_FernandaGuillhelmelliCosta.pdf: 579842 bytes, checksum: 0404b162e863343d042b963d2c05c4b4 (MD5) / O crescente número de indivíduos imunocomprometidos levou ao aumentou da incidência de micoses sistêmicas. As infecções causadas pelo fungo Cryptococcus. neoformans são a maior causa de morte relacionada a fungos em pacientes com AIDS. Este cenário se agrava com o advento de linhagens resistentes a antifúngicos disponíveis bem como a alta toxicidade desses tratamentos aos pacientes. Dessa forma, a busca por novos fármacos mais eficientes e menos tóxicos é de grande urgência. Nesse sentido, o estudo de peptídeos antimicrobianos (AMPs) é promissor, uma vez que essas moléculas possuem como um dos principais alvos a membrana citoplasmática de patógenos de forma que esses organismos estão menos propensos a desenvolver resistência. AMPs são moléculas multifuncionais, apresentando tanto atividade microbicida como imunomodulatória. São peptídeos evolutivamente conservados em diversos grupos de seres vivos e produzidos em diversos tecidos. Nos animais peçonhentos, a produção de diversos AMPs tem sido descrita nas glândulas de peçonha, sendo portanto uma interessante fonte para buscas por novas moléculas microbicidas. Neste trabalho foi caracterizado o efeito antifúngico tanto de AMPs inéditos e AMPs de já descritos na literatura presentes na peçonha de escorpiões contra duas linhagens de C. neofomans. Dos 11 peptídeos testados, sete inibiram o crescimento de C. neoformans das linhagens H99 e B3501, porém nenhum peptídeo mostrou-se mais potente que a anfotericina B. A linhagem B3501 foi mais suscetível à ação de todos os peptídeos com atividade antifúngica comparada à linhagem H99. Observou-se também que a carga residual positiva dos AMPs identificados na peçonha de escorpião pode ser um importante parâmetro para a inibição do crescimento do fungo. Foi mostrado que as células fúngicas com a cápsula mais desenvolvida são mais suscetíveis à atividade inibitória dos AMPs, assim como células melanizadas também apresentam maior suscetibilidade em comparação ás células não melanizadas. É possível que a cápsula e a melanina exerçam um importante papel na atração eletrostática do peptídeo, resultando em uma maior suscetibilidade do fungo. Foi demonstrado também por meio de microscopia eletrônica de varredura que um dos peptídeos, denominado Peptídeo 6, foi capaz de causar danos na morfologia da célula. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The rising number of immunocompromised individuals is leading to an increase in the incidence of systemic mycoses. Infections caused by Cryptococcus neoformans are the major cause of death related to fungi in patients with AIDS. This scenario is aggravated by the advent of resistant strains to available antifungal agents and the high toxicity of these treatments to patients. Thus, the search for new more efficient and less toxic drugs is of great urgency. In this sense, the study of antimicrobial peptides (AMPs) is promising, since the main target of this molecules is the cytoplasmic membrane of pathogens, so these organisms are less likely to develop resistance. AMPs are multifunctional molecules with both microbicidal activity and immunomodulatory properties. These peptides are evolutionarily conserved in diverse groups of organisms and are expressed in various tissues. In venomous animals, the expression of several AMPs have been described in the venom glands and is therefore an interesting source in the search for new microbicide molecules. In this work, the effect of antifungal AMPs present in the venom of scorpions was characterized against two strains of C. neoformans. Seven peptides inhibited the growth of C. neoformans H99 and C. neoformans B3501, although, amphotericin B was more potent than any of the tested peptides. B3501 strain was more susceptible to the inhibitory activity of the tested AMPs than H99 strain. It was observed that the residual positive charge of the scorpion’s AMPs could be an important feature in their ability to induce fungal growth inhibition. It was also shown that yeast cells with larger capsule are more susceptible to the inhibitory activity of the tested AMPs. Fungal melanized cells also showed higher susceptibility compared to non-melanized cells. It is possible that the capsule and melanin play a role in electrostatic attraction of cationic peptide, enhancing the fungal susceptibility to these compounds. Scanning Electron Microscopy analysis revealed that one peptide, nominated Peptide 6, causes damage to cell morphology.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-08T20:32:58Z No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / O escorpião Tityus fasciolatus faz parte da família Buthidae, que contém espécies causadoras de envenenamentos graves em humanos. As moléculas responsáveis pelos efeitos mais severos são conhecidas como neurotoxinas que, em sua maioria, são componentes peptídicos cujos principais alvos são os canais iônicos, os quais são relevantes para o funcionamento dos diversos sistemas orgânicos. Os compostos relacionados aos envenenamentos por peçonhas de escorpiões são conhecidos por agirem com especificidade nos canais iônicos. Os constituintes proteicos de T. fasciolatus foram caracterizados com o auxílio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), com coluna C18 analítica, espectrometria de massa MALDI/ TOF-MS e uma biblioteca transcritômica da glândula de peçonha. Mais de 200 diferentes massas moleculares foram identificadas nas frações cromatográficas, assim como 9.130 transcritos na biblioteca transcritômica, dentre os quais foram identifcados 278 que codificam toxinas. A atividade biológica de três toxinas e de uma fração foram testadas com canais iônicos expressos em oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de Voltage clamp de dois eletrodos. Foram utilizados canais de Na+ de mamíferos hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 e rNav1.8/1. Duas toxinas (Tf3 e Tf4) foram classificadas como -NaScTx (Sodium Scorpion Toxins), por causarem aumento da corrente de Na+ e retardo da inativação rápida do canal. A Tf3 foi ativa em hNav 1.1 à hNav1.7, enquanto a Tf4 agiu apenas nos hNav1.2 e hNav1.7. A fração 63 também apresentou atividade α, sendo sua atividade significativa em hNav1.7. A toxina Tf2 foi identificada como -NaScTx, cuja característica é a ativação dos canais de Na+ em potenciais onde antes os canais estavam em repouso. Dentre os oito canais de Na+ de mamífero testados, a Tf2 foi seletiva para hNav1.3, à concentração de 1M. Além da descrição da atividades dessas toxinas de Na+, este trabalho gerou um acervo de sequências de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, um perfil das massas moleculares associadas aos seus respectivos tempos de retenção, 18 sequências de prováveis NaScTxs e 15 sequências de prováveis KTxs. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tityus fasciolatus is a scorpion belonging to the Buthidae family, known by the species that cause severe evenomation in humans. The molecules responsible for the most severe effects are known as neurotoxins, which are mostly peptide components, targeting ion channels, which are relevant to the functioning of the various organ systems. The compounds responsible for envenomation are usually known to act with specificity on ion channels. The proteic components of T. fasciolatus venom were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), MALDI/TOF mass spectrometry and a transcriptomic library of the venom gland. More than 200 different molecular masses were detected in chromatographic fractions, as well as 9,130 transcripts that encode compounds, among them 278 encode toxins. Two Electrodes Voltage Clamp was used to test the biological activity of three toxins and a fraction in Xenopus laevis oocytes expressing ion channels. The Nav channels used were all mammals, hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 and rNav1.8/1. Two toxins (Tf3 and Tf4) were classified as -NaScTx (Sodium Scorpion toxins), since they cause an increase in Na+ currents and a delay in the rapid inactivation of the channel (Tf3 and Tf4). The Tf3 was active in hNav 1.1 to hNav1.7, while Tf4 affected only hNav1.2 and hNav1.7. Fraction 63 also showed α activity in hNav1.7. Tf2 was identified as β-NaScTx, whose characteristic is the activation of Nav channels at more negative potentials. Among the eight mammal Nav channels tested, Tf2 was hNav1.3 selective, at 1μM. This work led to a collection of sequences of nucleotides and amino acid residues, a molecular mass profile with their respective retention times, and 18 putative NaScTxs and 15 putative KTxs sequences.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-12-09T12:09:31Z No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-12T11:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_DanielNogocekeSifuentes.pdf: 3867252 bytes, checksum: 1ab83f2da043c56aead8d4844f871ec6 (MD5) / Os venenos de serpentes são muito pesquisados pela diversidade de moléculas e suas atividades. Dentre as principais classes de moléculas presentes nesses venenos podem ser destacas PLA2s e neurotoxinas, por possuírem moléculas com ações ocultas, presentes em diferentes sítios das mesmas moléculas. As serpentes da família Elapidae são excelentes representantes desta diversidade, por apresentarem os dois tipos de moléculas. As serpentes brasileiras da família Elapidae estão restritas ao gênero Micrurus, chamadas corais-verdadeiras, pela coloração característica. Micrurus frontalis representa bem esse gênero devido à diversidade de moléculas contidas em seus venenos e alta imunogenicidade, que a levou a ser a principal espécie utilizada na fabricação de soro antielapídico. Este estudo objetivou o isolamento de PLA2s presentes no veneno de Micrurus frontalis, e caracterização de atividades de peptídeos encriptados em suas estruturas primárias. Foram purificadas aproximadamente 30 frações doveneno de M. frontalis por meio de RP-HPLC em coluna semipreparativa, onde as de concentração de fase móvel ACN de eluição maior que 35% em geral apresentavam ao menos uma molecula de massa correspondente à de PLA2s. A fração Mf18 foi escolhida pela pureza e abundancia do componente de massa 13.447,37 Da. Sua estrutura primária foi determinada por Degradação de EDMAN e seqüenciamento de novo após redução, alquilação e digestão com enzima Glu-C. Após comparação com banco de dados de PLA2s presentes em venenos de Elapídeos, a proteína Mf18 foi enquadrada por homologia, na categoria de PLA2s de Classe I, pela presença da alça elapídica característica, número de pontes dissulfeto e comprimento da sequência. Pela conservação da região correspondente à alça ligante ao íon calcio de todas as outras enzimas da Classe I, e pela identidade de seu N-terminal com peptídeos opióides, principalmente encefalina, foram sintetizados 3 peptídeos chamados Elapidorfina-Y, Elapidorfina-W e Elapidorfina-F. Os peptídeos encontrados encriptados na sequência da PLA2 de M. frontalis foram liberados através de síntese em sílica. Após síntese em fase sólida por Fmoc e purificados, as atividades antinociceptivas foram avaliadas pelo ensaio de tailflick e ensaio de formalina. O peptídeo Elapidorfina-Y apresentou significativa atividade antinociceptiva quando comparada ao controle, que se mostrou dependente da dose, do tempo após aplicação e da relação dose X tempo após aplicação. Essa atividade em doses nanoMolares foi comparável aquela obtida com morfina. Nos ensaios de formalina, todos os peptídeos apresentaram atividade antinociceptiva, sendo notadamente maior do que o controle na fase inflamatória para o peptídeo Elapidorfina-W. Muitas proteínas são fontes de peptídeos menores, utilizando para isso diversas formas de serem obtidas, sendo a principal as clivagens de suas sequências mais longas em sítios específicos, dando origem a peptídeos com diversas atividades biológicas, em alvos distintos. Um exemplo dessa possibilidade é o peptídeo Crotalphine que possui atividade antinociceptiva, e a mesma sequência da porção N-terminal da Crotoxina, proteína isolada do mesmoveneno (Crotalus durissus). Os resultados obtidos concordam com o descrito para a própria encefalina, que também é resultado da liberação endógena de um peptídeo por meio de modificações postraducionais da proteína precursora Proencefalina. O presente trabalho mostrou a identificação e caracterização parcial de PLA2 doveneno de Micrurus frontalis e apresentou a atividade antinociceptiva no SNC e periférica de peptídeos liberados de sua sequência por meio de síntese em fase sólida. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Many researches focus on snake venoms due to the diversity of the molecules they possess and their activities. Among the main classes of molecules in these venoms, the PLA2s and neurotoxins are emphasized for pursuing different effects encrypted in each site. The elapidae snakes are excellent representatives of such diversity, because their venoms contain the two kinds of molecules. The brazillian elapidae are restricted to the Micrurus genus also known as the coral-snakes for their characteristic color. Micrurus frontalis well represents this genus for the diversity of molecules and high immunogenicity of its venom that led to its use in the manufacturing of the elapidae antivenom. The objective of this study was to identify, characterize and evaluate the PLA2s present in M. frontalis venom and isolate encrypted peptides with sequences similar to that of bioactive peptides. The initial chromatography step led to the fractionation of the crude M. frontalis venom in approximately 30 fractions by RP-HPLC with C18 semi preparative column. Each fraction that eluted at an ACN mobile phase concentration of 35% and more had at least one molecule with molecular mass corresponding to that of a PLA2. Fraction Mf18 was chosen for its purity and abundance of a component with a mass of 13.447,37 Da, which was then reduced, alkylated had its N-terminal sequenced by EDMAN degradation. The main fraction resulting of refractioning with analytical C18 was digested using a GLU-C V8 enzyme. Each generated enzymatic cleavage fragment was purified and had their primary structure determined by de novo sequencing. After comparisons with online elapidae snake PLA2s databanks, Mf18 protein was placed in the Class I snake PLA2s category due to its similarity, the presence of the elapid loop, the number of disulfide bridges and the sequence length. The high conservation of the region corresponding to the Calcium binding loop among all the Class I snake PLA2s and the identity of this region’s N-terminal to enkephalin’s, led us to use it as a model for the synthesis of three peptides named Elapidorphin-Y, Elapidorphin-W e Elapidorphin-F which only differ in their N-terminal by Y,W and F. Tertiary structure alignment of PLA2s from elapid snakes venoms and mammal pancreas also revealed similarity in the three dimensional structure of this region. After the synthesis, they were purified and had their sequence confirmed my mass spectrometry fragmentation and sequencing. Since the primary and tertiary structures resembles that of the antinociceptive peptide enkephalin, antinociceptive activity was evaluated through the tailflick and the formalin assay. The Elapidorphin-Y peptide presented significant antinociceptive activity when compared to control, dependent on the dose, time after infusion and the relation dose X time. This activity in nanoMolar scale was comparable to that of morphine. In the formalin assays, all the peptides presented antinociceptive activity, and was statistically higher than control in the inflammatory phase for the peptide Elapidorphin-W. The encrypted peptides discovered in a M. frontalis PLA2 sequence were released by solid phase synthesis. Many proteins are sources of smaller peptides, using many different mechanisms to be obtained, among which the main is the cleavage of their sequence at specific sites by endoproteinases originating peptides with diverse activities in various localities. The peptide Crotalphine possesses antinociceptive activity, and in a interesting way presents the same sequence as the Nterminal portion of Crotoxin, a longer PLA2 isolated from the venom of Crotalus durissus, raising the possibility of multiple cleavages after the endogenous synthesis. The obtained results agrees with the described for enkephalin itself, which is also the result of the cleavage from its precursor protein Proenkephalin by different enzymes. In conclusion, the present work showed for the first time the partial sequence of a PLA2 from the venom of M. frontalis and the peripheral and central nervous system antinociceptive activity of peptides released from its sequence by solid phase synthesis.

Orientador: Gilberto de Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T10:06:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bento_AntonioCarlos_D.pdf: 5486208 bytes, checksum: 86e0d68eb8dc5a8d1275f317cfca657e (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: Nesta tese, caracterizamos bioquímica e farmacologicamente três polipeptídeos do veneno da aranha Phoneutria nigriventer. Após o fracionamento parcial do veneno através da filtração em gel de Sephadex G-1 O e cromatografia de troca iônica, obtivemos oito frações com atividade espasmogênica em tecidos arteriais e venosos de coelho e uma fração com atividade edematogênica em pele de coelho. Duas das frações com atividade sobre o músculo liso vascular foram selecionadas para purificação em HPLC e caracterização bioquímica através de eletroforese, determinação da composição de aminoácidos e seqüenciamento da região N-terminal dos polipeptídeos, denominados PNV1 e PNV2. A fração com atividade edematogênica em pele de coelho foi também purificada e o polipeptídeo responsável por esta atividade caracterizado bioquimicamente e denominado PNV3. A atividade espasmogênica do PNV1, PNV2 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada num sistema de cascata. Os coelhos anestesiados, foram exsanguinados e os vasos sanguíneos (artéria pulmonar e veias cava e mesentérica) foram removidos, cortados em espiral e montados para registro isotônico das contrações. O PNV1, PNV2 e as frações obtidas após purificação por HPLC foram liofilizadas, ressuspendidas em H2O deionizada e injetadas na forma de "bolus" sobre os tecidos. A atividade edematogênica do PNV3 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada em coelhos anestesiados e injetados com uma mistura de azul de Evans (0,5 ml/kg, 2,5%) e 1251-albumina (1,5 µCi/kg). As substâncias testadas foram injetadas intradermicamente no dorso dos animais. Após 30 minutos, foi coletado o sangue e o animal sacrificado. A pele dorsal foi removida e os sítios cortados para contagem de radioatividade acumulada. O PNV1, PNV2 e PNV3 possuem massa molecular de 13,9 kDa, 12,1 kDa e 14,5 kDa, com 125, 102 e 132 resíduos, respectivamente. A seqüência N-terminal para os três polipeptídeos foi a seguinte: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET e AVFAIQDQPC, respectivamente. A purificação e caracterização bioquímica destes peptídeos se constitui em ferramentas úteis não apenas para uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos decorrentes do envenenamento humano por Phoneutria nigriventer mas também para a compreensão do papel do sistema calicreína tissular-cininogênio cinina, tendo em vista que nossos resultado sugerem fortemente que o PNV3 é capaz de ativar este sistema / Abstract: This thesis describes the biochemical and pharmacological characterization of three polypeptides from the venom of the spider Phoneutria nigriventer. The fractionation of Phoneutria nigriventer venom by gel filtration on Sephadex G-10-120 provided eight peaks (SI to S-VIII) of which only the first (S-I) was investigated further. lonexchange chromatography of S-I on CM-cellulose-52 yielded 16 fractions (C-I to C-XVI). Of these, Fractions C-VII + VIII and C-X +XI were further purified by reverse phase HPLC to yield two polypeptides (PNV1 and PNV2) with contractile activity. Similar purification of Fraction C-XIII by HPLC resulted in the isolation of the polypeptide with oedematogenic activity (PNV3). Ali three proteins were single chain polypeptides (as shown by SDS-PAGE under reducing conditions) with global amino acid compositions (excluding Trp) of 125, 102 and 132 residues corresponding to molecular weights of 13,900, 12,100 and 14,500 for PNV1, PNV2 and PNV3, respectively. The N-terminal amino acid sequencesof PNV1, PNV2 and PNV3 were: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET, and AVFAIQDQPC. The contractile activity of PNV1 and PNV2 was examined using rabbit arterial and venous vessels. The vessels were mounted in a cascade system and perfused with warm (37°C) and oxygenated (95% O2 + 5% CO2 Krebs' solution. Since the spasmogenic effect of whole Phoneutria nigriventer venom in rabbit vascular smooth muscle is not affected by tetrodotoxin, it is unlikely that sodium channel activation plays a role in these tissues, as it does in both rat phrenic-diaphragm muscle-nerve preparation and guinea-pig isolated atria. Furthermore, the finding that the a-adrenoceptor antagonist phenoxybenzamine does not affect PNV-induced contractions excludes the possibility that Phoneutria nígríventer venom induces endogenous noradrenaline release from autonomic nerve endings present in the vascular walls, as occurs in guinea pig auricles. Phoneutría envenomation is mainly characterized by severe local pain, but it may be accompanied by vascular disturbances such as lung oedema and priapism. Whether these peptides with vascular smooth muscle spasmogenic activity are responsible for the mentioned permeability alterations, it remains to be further investigated. The oedema formation induced by PNV3 was investigated in rabbit skin as the local accumulation of 1251-human serum albumin. Our results showed that PNV3 significantly increased the vascular permeability in the rabbit skin. The increased microvascular permeability induced by whole Phoneutría nígríventer venom in rabbit skin involves local kinin synthesis in response to the activation of tissue (but not plasma) kallikrein-kininogen-kinin system. The biochemical identification of the peptide responsible for this activity in Phoneutría venom might provide a useful tool to further understand the role of tissue kallikrein-kinin system / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Jose Camillo Novello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T20:22:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_DanielaDiogenesde_M.pdf: 3678329 bytes, checksum: b2979d9021832e5cf620da29d174d33d (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: As lectinas constituem um grupo de proteínas que possuem a capacidade de se ligarem especificamente e reversivelmente a determinados carboidratos. Identificadas em vegetais e animais, são também encontradas em venenos ofídicos. Quando isoladas de venenos de serpentes, essas proteínas ligam-se a 'beta¿-galactosídeos e induzem aglutinação de eritrócitos, agregação de plaquetas e são mitogênicas para linfócitos. Uma lectina específica para 'beta¿galactosídeos foi purificada do veneno de Bothrops jararacussu através de cromatografia de afinidade em D-galactose, e foi denominada BjcuL. A análise do perfil de massa molecular em SDS-PAGE a 15% mostrou que BjcuL é um homodímero composto de subunidades de 15kDa. Quando submetido à coloração para carboidratos após SDS-PAGE, a proteína mostrou reação negativa, sugerindo que BjcuL não é uma glicoproteína. BjcuL aglutina eritrócitos tripsinizados de porco e boi, em concentrações mínimas de 0,5 'mu¿g/ml e 2,0 'mu¿g/ml, respectivamente. A hemaglutinaçao de eritrócitos porcinos induzida por 4,0 'mu¿g/ml de BjcuL é inibida especificamente por lactose 0,8 mM, galactose 3,2 mM e rafinose 3,2 mM. EDTA 0,2 mM e EGTA 0,1 mM também inibem a atividade hemaglutinante de BjcuL, o que revela a dependência de cátions divalentes. A associação das subunidades da lectina de B. jararacussu é essencial para sua atividade hemaglutinante, pois BjcuL reduzida com DTT não exibem esta atividade sobre eritrócitos porcinos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Lectins are polyvalent carbohydrate-binding proteins which agglutinate red blood cells. Identified in plants and animals, have also been found in snake venoms. These proteins bind to lactose moieties and induce agglutination of erythocytes, aggregation of platelets and are mitogenic to lymphocytes. A galactose-specific lectin in Bothrops jararacussu venom (BJcuL) was adsorbed on a immobilized D-galactose column and eluted with 0.1 M lactose. On SDS-PAGE, under reducing conditions (0.1 M DTT), the fraction eluted showed a single band of 15 kDa, and under non reducing conditions, a major band of 30 kDa. This protein appeared not to be a glycoprotein because it gave negative reaction to the Schiff¿s reagent following treatment with periodate. Trypsined erythrocytes from pig and cow were agglutinated by BJcuL, with end points of approximately 0.5 'mu¿g/ml and 2.0 'mu¿g/ml, respectively. The hemagglutination of trypsined pig erythrocytes induced by 4.0 'mu¿g/ml of BJcuL was inhibited specifically in the presence of 0.8 mM lactose, 3.2 mM galactose, 3.2 mM raffinose. BJcuL demonstrated a requirement for divalent cation, since 0.2 mM EDTA or 0.1 mM EGTA, completely inactivated the lectin induced hemagglutination activity. The association of subunits via interchain disulfide bonds is essencial for lectin activity, since DTT-reduced BJcuL showed no hemagglutination activity against pig erythrocytes... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T18:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_AlessandradeQueiroz_M.pdf: 16488672 bytes, checksum: 60d60725663ca1fee278966dc0ff2ea0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: É bem conhecida a capacidade dos venenos de serpentes do gênero Bothrops induzirem intensos efeitos locais, tais como edema, hemorragia e necrose. Neste trabalho investigou-se os possíveis mediadores da resposta inflamatória local (edema) e hemorrágica induzida pelo veneno de Bothrops lanceolatus (VBL) em ratos. O edema foi induzido por injeção subplantar de VBL (12,5 - 100 ~g/pata) e quantificado com hidropletismógrafo. Em todas as doses testadas, a resposta edematogênica foi máxima aos 15 minutos, caindo, progressivamente, até desaparecer após 24 horas. As drogas metisergida, ciproheptadina, dexametasona, HOE 140 e associação HOE 140 -metisergida reduziram significativamente a atividade edematogênica induzida pelo VBL (50 ~g), o que não ocorreu com a indometacina e mepiramina. O efeito edematogênico pareceu ser independente da presença de aminas biogênicas ou outras substâncias de baixo peso molecular no veneno, uma vez que a diálise não alterou significativamente este quadro. Investigando a atividade hemorrágica, tratamos o VBL com EDTA. O tratamento inibiu a atividade hemorrágica, bem como reduziu significativamente o edema. Nos animais iIljetados com VBL tratado com EDT~ o edema residual mostrou-se mediado pela serotonina, histamina, bradicinina e possivelmente, metabólitos do ácido araquidônico. A análise histopatológica das patas injetadas com o VBL demonstrou aumento da região dérmica e dos espaços intercelulares, característicos do edema, além da presença de moderado fufiltrado inflamatório e intensa hemorragia. O tratamento prévio dos animais com dexametasona reduziu o infiltrado celular e o edema, sem interferência na atividade hemorrágica. O estudo das patas injetadas com VBL tratado com EDTA demonstrou redução do número de hemáceas extravasculares e do edema, sem aparente alteração do infiltrado leucocitário. Além dos efeitos locais, a injeção subplantar do VBL provocou alterações sistêmicas detectadas nos rins. Os túbulos distais apresentaram diâmetro aumentado; nos túbulos proximais, restos celulares provavelmente de natureza protéica, foram vistos ao lado de vasos sangüíneos congestos. Nos corpúsculos renais houve aumento do espaço capsular de filtração, além de alterações na lobulação do tufo de capilares. O tratamento do veneno com EDTA reverteu alguns dos efeitos glomerulares e tubulares produzidos pelo envenenamento, o que não se observou em animaispré-tratados com dexametasona. "' uo soro anti-VBL parcialmente purificado previamente incubado com o VBL eliminou completamente a atividade hemorrágica e parcialmente a atividade edematogênica do veneno, não demonstrando eficácia superior quando os resultados foram comparados àqueles obtidos com o soro anti-VBL total. A inoculação intravenosa soro anti-VBL total ou parcialmente purificado, imediatamente após injeção do VBL, foi ineficaz na neutralização dos dois fenômenos / Abstract: Phannacological modulation of the rat hind-paw edema induced by subplantar injections of Bothrops lanceolatus venom (BLV) was investigated. The edema induced by subplantar injections of 12.5; 25; 50; 75 and 100 Ilg of BLV was quantified by hydroplethysmography. Wrth all of the venom doses tested, the edematogenic response were maximal within 15 min and disappeared over 24 h. Edema is not due to the presence of edematogenic amines or other small molecules, since dialysis did not change the edema. Part of edema induced by BLV is due to hemorrhagic components (metalloproteinases) since prior incubation of BLV 50 Ilg and 5 mM EDTA for 30 min at room temperature, caused a partia! inhibition of its edematogenic activity. However, liberation of phannacological active substance at the site of injection such as arachidonate metabolites, serotonin and bradykinin may play an important role in the BLV-induced edematogenic effect, since dexamethasone, methysergide and HOE 140 reduced significantlythe edema formation. Histological examination showed that BLV (50 Ilg) caused a marked edema and hemorrhage, characterized by extensive intercellular spaces and presence of extra vascular red blood cells. In addition, there was infiltration of inflammatory cells, particularly neutrophils. The chelating agent EDTA reduced moderately the edema, reduced partially the hemorrhage, but did not affect the presence of inflammatory cells at tOOsite of venom injection. The ability of antiserum to Bothrops lanceolatus venom and of a partially I purified antibody fraction ftom this serum in neutralizing tOOlocal effects produced by BLV in rats was a1so investigated. Preincubation-type experiments showed that BLVinduced edema was neutra1ized by globulin-rich fraction 2 h, or more, afier venom administration. Macroscopically, the hemorrhagic activity was completely neutralized. When BLV-antiserum and the globulin-rich fraction were administered i.v. afier venom injection, no significant edema and hemorrhage neutralization was observed. BLVantiserum and globulin rich fraction neutraIized the venom-induced edema and hemorrhage to similar extents. This finding indicated that the globulin-rich fraction obtained by ammonium sulfate precipitation offers no significant advantages in neutralization compared to the unfractionated antiserum / Mestrado / Mestre em Farmacologia

OGATA, Miriam Camargo Guarnieri, também é conhecido(a) em citações bibliográficas por: GUARNIERI, Miriam Camargo / Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:11:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-14T19:23:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Ana Rafaela Mota Gonzaga.pdf: 2557106 bytes, checksum: 947b0b8999788f6e9f90333ff5ea6877 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CAPES / Crotalus durissus cascavella é uma subespécie endêmica da região Nordeste do Brasil, cuja peçonha difere das demais subespécies do país pela ausência de crotamina e alta concentração de fosfolipases A₂ (PLA₂) ácidas. Neste estudo, duas novas PLA₂s ácidas, denominadas Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂, foram purificadas da peçonha de C. d. cascavella através de duas e três etapas cromatográficas, respectivamente. A pureza e homogeneidade de ambas fosfolipases foram determinadas por SDS-PAGE e espectrometria de massa, apresentando uma banda única e massa de 14.247 Da (Cdca-IPLA₂) e 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Ambas fosfolipases foram ativas sobre 4-nitro-3- ácido octanoil benzóico, apresentando atividade específica de 11,51 ± 0,50 U/mg e 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM e 0,3993 mM e Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ e 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectivamente. Ambas não apresentaram atividade sobre BApNA. A Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade hemaglutinante na dose de 15 μM, enquanto a Cdca- II-PLA₂ apresentou atividade sobre substrato fluorogênico de trombina nas doses de 15 μM e 30 μM. As Cdca-I-PLA₂ e Cdca-II-PLA₂ reduziram a agregação plaquetária induzida por colágeno, adrenalina e ácido araquidônico, porém as duas enzimas (20 μM) não reduziram a agregação quando ADP foi utilizado como agonista. Cdca-I-PLA₂ apresentou atividade dose resposta como agonista de agregação em plaquetas lavadas e reduziu significativamente a atividade agregante plaquetária da trombina. Cdca-I-PLA₂ apresentou maior atividade anticoagulante, prolongando os tempos de protrombina (TP; 30 μM; R = 22) e tromploplastina parcial ativada (TTPa; 30 μM; R = 10), porém não promoveu alteração do tempo de trombina (TT) na dose de 10 μM. Cdca-II-PLA₂ prolongou discretamente o TP (30 μM; R = 2) e TTPa (30 μM; R = 1,5) e significativamente o TT (20 μM; R = 7). Desta forma, nossos resultados sugerem que a Cdca-I-PLA₂ é uma quimerolectina anticoagulante com importante atividade sobre agregação plaquetária, enquanto Cdca-II-PLA₂ possui alta atividade enzimática, inibe tanto a agregação plaquetária quanto a coagulação, agindo como inibidor de trombina por meio da sua ligação com o fibrinogênio. / Crotalus durissus cascavella is ana endemic subspecie from Northeast region of Brazil, whose venom differs from the other subspecies of the country due to the absence of crotamine and high concentration of acidic phospholipase A₂ (PLA₂). In this study, two new acidic PLA₂s, named Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂, were purified from C. d. cascavella venom by two and three chromatographic steps, respectively. The purity and homogeneity of both phospholipases were determined by SDS-PAGE and mass spectrometry, showing a single band and molecular mass of 14.247 Da (Cdca-I-PLA₂) and 14.418 Da (Cdca-II-PLA₂). Both PLA₂s were active on 4-Nitro-3-(octanoyloxy) benzoic, presenting specific activity of 11,51 ± 0,50 U/mg and 26,75 ± 0,15 U/mg, Km = 0,2280 mM and 0,3993 mM and Vmax = 13,15 nmol×min⁻¹mg⁻¹ and 39,68 nmol×min⁻¹mg⁻¹, respectively. Both had no activity on BApNA. The Cdca-I-PLA₂ showed hemagglutinating activity at the dose of 15 μM, while Cdca-II-PLA₂ showed activity on fluorogenic thrombin substrate at the doses of 15 μM e 30 μM. The Cdca-I-PLA₂ and Cdca-II-PLA₂ reduced platelet aggregation induced by collagen, adrenaline and arachidonic acid, but the two enzymes (20 μM) did not reduce aggregation when ADP was used as an agonist. Cdca-I-PLA₂ showed dose response activity as agonist of aggregation in washed platelets and significantly reduced thrombin platelet aggregation activity. Cdca-I-PLA₂ presented higher anticoagulant activity, prolonging prothrombin time (PT; 30 μM; R = 22) and activated partial thromboplastin time (aPTT; 30 μM; R = 10), but did not promote a change in thrombin time (TT) at a dose of 10 μM. Cdca-IIPLA₂ prolonged discreetly the PT (30 μM; R = 2) and the aPTT (30 μM; R = 1.5) and significantly prolonged the TT (20 μM; R = 7). Thus, our results suggest that Cdca IPLA₂ is an anticoagulant chimerolectin with important activity on platelet aggregation, while Cdca-II-PLA₂ has high enzymatic activity, inhibit both platelet aggregation and cloagulation, acting as thrombin inhibitor through its biding to fibrinogen.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-12T15:53:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Habdel Nasser.pdf: 15126039 bytes, checksum: 87f29159443eecef88032880bd6b9dce (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-12-12T15:53:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Habdel Nasser.pdf: 15126039 bytes, checksum: 87f29159443eecef88032880bd6b9dce (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-12T15:53:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Habdel Nasser.pdf: 15126039 bytes, checksum: 87f29159443eecef88032880bd6b9dce (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2007-08-10 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Most of the snakebite incidents in the Amazon region involve the Bothrops atrox, whose venom presents the most potent edematogenic and necrotic activities in the genus. This work describes the studies of isolation of the chemical constituents and antiedematogenic activity of the species Peltodon radicans (Lamiaceae), which is used in the treatment of snakebites and scorpion stings in the region. The extracts presented aliphatic hydrocarbons, 3-OH,-amirin (1), 3-OH,-amirin (2), -sitosterol (3), stigmasterol (4), ursolic acid (5), 2,3,19-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid (tormentic acid, 6), methyl 3-hydroxy,28-methyl-ursolate (7), sitosterol-3-O--D-glucopyranoside (8), and stigmasterol-3-O--D-glucopyranoside (9). The flower extracts presented the largest antiedematogenic activity. This is the first report on the study of the flowers, stem, and roots of this plant. / A maioria dos acidentes com serpentes na região Amazônica envolve a espécie Bothrops atrox, cujo veneno apresenta as atividades edematogênica e necrótica mais potentes no gênero. Este trabalho descreve o estudo do isolamento dos constituintes químicos e da atividade antiedematogênica de Peltodon radicans (Lamiaceae), espécie vegetal que é usada no tratamento de picadas de serpentes e escorpiões na região. O extrato apresentou hidrocarbonetos alifáticos, 3-OH,-amirina (1), 3-OH,-amirina (2), -sitosterol (3), estigmasterol (4), ácido ursólico (5), ácido 2,3,19-tri-hidroxi-urs-12-en-28-óico (ácido tormêntico 6), 3-hidroxi,28-metil-ursolato de metila (7), 3-O--D-glicopiranosíl-sitosterol (8) e 3-O--D-glicopiranosíl-estigmasterol (9). Os extratos das flores apresentaram maiores atividades edematogênicas. Este é o primeiro registro do estudo das flores, caules e raízes dessa planta.

Orientador: Jose Camillo Novello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kassab_BaykiHussein_D.pdf: 1712667 bytes, checksum: 635db4ddccf22f18ef236c2bbd4e53b9 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As lectinas presentes nos venenos ofídicos são classificadas como lectinas tipo-C e são formadas por cadeias polipeptídicas relativas ao CRD (carbohydrate recognition domain) livre, sem domínios adicionais. BJcuL é uma lectina presente no veneno da serpente Bothrops jararacussu, isolada e caracterizada em nosso laboratório. Trata-se de um homodímero, com grande afinidade à galactose e apresenta atividades tóxica sobre células tumorais e endoteliais. Este trabalho teve como proposta: (1) determinar a seqüência completa do cDNA da lectina do veneno da serpente Bothrops jararacussu; (2) desenvolver um sistema de expressão, solubilização e purificação para a produção de BJcuL recombinante; (3) comparar a atividade da BJcuL recombinante com a nativa. Concomitante ao trabalho acima, foi também de nosso interesse: (4) investigar o efeito de BJcuL nativa sobre células tumorais do cólon quanto a proliferação/viabilidade, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). O cDNA-BJcuL foi isolado da biblioteca de cDNA a partir da glândula de veneno de B. jararacussu. A seqüência do cDNA-BJcuL (GenBank acesso No. AY388642); apresentou uma região codificadora de aminoácido correspondente a BJcuL nativa e com um elevado grau de identidade com outras lectinas do tipo-C. O cDNA-BJcuL foi amplificado por PCR e ligado ao vetor de pET15b e usado para transformar E. coli BL21 (DE3). Uma proteína ,insolúvel e inativa, de 18,5 kDa foi expressa após a adição de 1 mM de IPTG. A rBJcuL foi desnaturada com 6 M de uréia, purificada e renaturada em coluna de afinidade, seguida de diálise e cromatografia em gel. A eficiência no processo de renaturação foi confirmada através de ensaios biológicos, dicroísmo circular e análise dos peptídios de rBJcuL. As células tumorais do cólon HT-29 D4 e Caco-2, após a adesão, foram incubadas com BJcuL (0 - 10 mM com 5% de FBS) por diferentes períodos (24, 48 e 72h). Ensaios de proliferação foram feitos usando o Kit BrdU-Elisa e uma interessante diminuição na incorporação de BrdU foi observada em ambas as células. BJcuL (2,5 µM) foi capaz de inibir aproximadamente 50% da proliferação em Caco-2 e 30% em HT-29 D4 em 24h. Este efeito, aparentemente não foi relacionado ao tênue desequilíbrio celular de ROS, cerca de 20% na presença de 2,5 µM de BJcuL, medido em fluorímetro (excitação em 490 nm e emissão a 538 nm) após a adição da sonda DCFH-DA. Ensaios com o reagente MTT confirmaram que BJcuL apresenta fraca citotoxicidade e não é capaz de diminuir a viabilidade dessas células. Com base nos resultados obtidos, buscamos desenvolver um estudo mais detalhado da estrutura molecular de BJcuL e suas funções, por meio da clonagem, seqüenciamento e expressão de rBJcuL, na intenção de fornecer dados para o esclarecimento das particularidades estruturais dessas proteínas / Abstract: Snake venom lectins are classified as C-type lectins and their molecular structure consist in at least one carbohydrate recognition domain - CRD per subunit. BJcuL is a lectin from Bothrops jararacussu snake venom, which have been isolated and characterized in our laboratory. The lactose-binding BJcuL is a homodimer, and show toxic activity on cancer cells and endothelial cell lines. The aim of this work was: (1) to determine the complete cDNA sequence that encode the lectin from B. jararacussu snake venom; (2) to develop a methodology for the expression, solubilization, and purification of recombinant BJcuL; (3) to compare recombinant and native BJcuL activity. In addition to the work described we have investigated (4) native BJcuL effect on colon tumor cells concerning the proliferation and reactive oxygen species production (ROS). The cDNA-encoding BJcuL has been isolated of the cDNA phage library, constructed from B. jararacussu venom glands. The mature protein-coding region was amplified by PCR with specific oligonucleotides, and subcloned into the pET-15b vector to express the recombinant BJcuL in Escherichia coli BL21 (DE3). The deduced amino acid sequence exhibits a high degree of sequence identity with c-type lectins (CTLs) and c-type lectin-like domains (CTLDs). An insoluble and inactive 18.5-kDa protein was overexpressed after 1.0 mM IPTG induction. The recombinant BJcuL was recovered and denatured in a buffer with 6 M urea and purified on a nickel-affinity column. Protein refolding was carried out on this column, during procedure purification, followed by dialysis against CTBS and then by gel filtration for separation of the active dimmer. The refolding process of rBJcuL and the analysis of its structure were confirmed by biological assay, circular dichroism and Maldi-Tof. HT-29 D4 and Caco-2 cells, after adhesion, were treated with BJcuL (0 - 10 mM with 5%FBS) in 24, 48 and 72h. Proliferation assays were performed using BrdU-Elisa kit. An interesting decrease in BrdU incorporation was observed for both cells. At 2.5 µM BJcuL inhibited cell proliferation by approximately 50% for Caco-2 and 30% for HT-29 D4 in 24 h. This effect apparently was unrelated to subtle (20%) cellular redox imbalance induced by 2.5 µM BJcuL. In addiction, BJcuL showed a weak cytotoxic effect on these cell lines, since MTT assay did not show any decrease in cell viability. Together with the results presented, we are interested in a more detailed study of the molecular structure of BJcuL and its functions, through cloning and expression of rBJcuL, intending to clarify the structural particularities of these proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular