Submitted by Katiane Souza (katyane.souza@gmail.com) on 2016-06-05T16:39:15Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4186223 bytes, checksum: 3758454784531cdb854ab4f824e31065 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-05T16:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4186223 bytes, checksum: 3758454784531cdb854ab4f824e31065 (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brazil has 47 endemic species of strawberry guava (Psidium spp.), being an important center of genetic diversity of this genus. In the Caatinga biome, the occurrence of the species P. schenckianum Kiaersk, P. guineense Swartz. (most often) and Psidium grandifolium Mart. have been reported. These species have great potential for economic exploitation of the fruit, which is rich in vitamin C and can be consumed fresh or processed in the form of juices, sweets, jams, jellies and ice cream. It also presents outstanding antimicrobial activity, pharmacological and antioxidant as well as essential oils. In addition, strawberry guava are the main sources of resistance to nematode (Meloidogyne enterolobii), which is the main pathogen of guava (P. guajava). This resistance can be transferred to the Paluma guava (cv. GP). However, the strawberry guava is endangered in its natural environment and presents limitations in vegetative propagation by conventional methods, making impossible cloning the resistant plants. Micropropagation is a viable propagation technique of species susceptible to extinction and difficult vegetative propagation. Protocols allowing the cloning of this species for future studies should be improved. Thus, the aim of this research is to develop a protocol for micropropagation of Psidium spp., determining the culture medium, conditions of gas exchange, type of explant and concentration of growth regulators. Seedlings of three access of strawberry guava and cultivar guava paluma (cv.GP) were grown under the following conditions: JADS culture medium, MS and WPM to determine the culture medium; and medium JADS sealed with lids without membrane (SM), one membrane (1M) and two membranes (2M) with carbon dioxide exchange rates (TTCO2) 14; 21 and 25 μL L-1, respectively, to determine the best seedling growth in TTCO2 Psidium spp. After this, different explants of Brazilian guava trees were transferred to regeneration media with different concentrations of indolbutyric acid (IBA): 0, 2.46, 4.92 and 9.84 mM in rooting induction and benzyladenine (BA): 0.0, 2.2 and 4.44 mM; BA + naphthaleneacetic acid (NAA): 2.22 uM BA + 0.054 uM ANA; and 4.44 uM BA + 0.054 uM ANA in regeneration shoots of the following explants: nodal and apical segments in semi-solid culture, stem segments in liquid culture, organogenesis internodal segments, and leaf sections in semi-solid cultureof a P. guineense access and induction of organogenesis in liquid culture using root segments of a P. schenckianum access and three accessions of P. guineense. Seedlings of strawberry guava and cv. GP showed better growth in JADS culture medium. TTCO2 (25 μL L-1) resulted in the growth of seedlings with improved morphophysiological and anatomical characteristics and biosynthesis of compounds of reserve in leaves from both species (P. guineense and P. guajava). This condition is the most indicated for the development in in vitro propagation protocols of Psidium spp. It was not necessary the addition of IBA in the rooting of shoots. Shoots were obtained with and without addition of plant hormones in stem segments, apical segments, nodal and root segments in P. guineense accesses from direct organogenesis, maintaining the same ploidy of the seedlings of this species. In stem segments, the greater number of shoots was observed with 2.22 and 4.44 mM of BA. Shoots were elongated, rooted and acclimatized with 100% survival, showing that the in vitro regeneration protocol established is efficient. This is the first micropropagation protocol established to strawberry guava / O Brasil possui 47 espécies endêmicas de araçazeiros (Psidium spp.), constituindo-se num importante centro de diversidade genética do gênero. No bioma Caatinga, já foram reportadas a ocorrência das espécies Psidium schenckianum Kiaersk., P. guineense Swartz. e P. grandifolium Mart., com maior frequência das duas primeiras. Estas espécies apresentam grande potencial de uso de seus frutos, por serem ricos em vitamina C, podendo ser utilizado no consumo in natura ou industrializado, na forma de sucos, doces, compotas, geleias e sorvetes. Apresenta ainda, marcante atividade antimicrobiana, farmacológica e antioxidante além de possuir grande quantidade de óleos essenciais. Além disso, os araçazeiros são as principais fontes de resistência ao nematoide (Meloidogyne enterolobii), principal patógeno que acomete a goiabeira (P. guajava), a qual pode ser transferida para a goiabeira Paluma (cv. GP). Contudo, os araçazeiros encontram-se em risco de extinção em seus ambientes naturais e apresentam dificuldades na propagação vegetativa pelos métodos convencionais, impossibilitando a clonagem das plantas resistentes. A micropropagação é uma técnica viável para propagação de espécies passíveis de extinção e de difícil propagação vegetativa, devendo-se desenvolver protocolos que possibilitem a clonagem desta espécie para estudos futuros de melhoramento. Dessa forma, objetivou-se com a presente pesquisa desenvolver um protocolo para micropropagação de Psidium spp., determinando o meio de cultura, condições de trocas gasosas, tipo de explante e concentração de fitorreguladores. Plântulas de três acessos de araçazeiros e da cultivar de goiaba Paluma (cv. GP), foram crescidas nas seguintes condições: meios de cultura JADS, MS e WPM para determinação do meio de cultura, e em meio de cultura JADS, vedados com tampas sem membrana (SM), uma membrana (1M) e duas membranas (2M) com taxas de trocas de dióxido de carbono (TTCO2) de 14; 21 e 25 μL L-1, respectivamente, para determinar a melhor TTCO2 no crescimento de plântulas de Psidium spp. Após determinada estas condições, diferentes explantes de araçazeiros foram induzidos a regeneração in vitro, utilizando diferentes concentrações de ácido indolbutírico (AIB) (0; 2,46; 4,92 e 9,84 μM) na indução de rizogênese; benziladenina (BA) (0,0; 2,2 e 4,44 μM) e BA + ácido naftalenoacético (ANA) (2,22 μM BA + 0,054 μM ANA e 4,44 μM BA + 0,054 μM ANA) na regeneração de brotos dos seguintes explantes: segmentos nodais e apicais em meio de cultura semi-sólido, segmentos caulinares em meio de cultura líquido, organogênese de segmentos internodais, e secções foliares em meio de cultura semi-sólido, de um acesso de P. guineense e indução de organogênese em meio de cultura líquido, utilizando segmentos radiculares de um acesso de P. schenckianum e três acessos de P. guineense. As plântulas de araçazeiro e da cv. GP apresentaram melhor crescimento em meio de cultura JADS. Maiores TTCO2 (25 μL L-1), resultaram no crescimento das plântulas com melhores características morfofisiológicas e anatômicas, e na biossíntese de compostos de reservas nas folhas de ambas as espécies (P. guineense e P. guajava), sendo esta condição a mais indicada para o desenvolvimento de protocolos de propagação in vitro de Psidium spp. Não foi necessária adição de AIB no enraizamento das brotações. Foram obtidas brotações com e sem adição de fitorreguladores, em segmentos caulinares, segmentos apicais, nodais e, em segmentos radiculares nos acessos de P. guineense, a partir de organogênese direta, mantendo a mesma ploidia das plantas oriundas de sementes desta espécie. Em segmentos caulinares, maior número de brotações foi observado com 2,22 e 4,44 μM de BA. As brotações foram alongadas, enraizadas e aclimatizadas com 100% de sobrevivência, permitindo inferir que o protocolo de regeneração in vitro estabelecido é eficiente. Este é o primeiro protocolo de micropropagação estabelecido para araçá.

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. / Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. / Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.

La perspective de la culture de variétés transgéniques pose, pour de multiples raisons, le problème de la ségrégation de filières de production basées sur la même espèce dans les paysages agricoles : demande d'une filière « sans OGM » ; coexistence de productions alimentaires et non alimentaires… La réglementation européenne fixe un seuil de présence fortuite d'OGM au-delà duquel un produit, même issu d'une variété non-OGM, doit être étiqueté comme contenant des OGM. La Commission européenne a émis des recommandations sur l'adoption de pratiques favorisant la coexistence entre cultures OGM et non-OGM de façon à ce que les agriculteurs puissent garder la liberté de choisir le mode de production qu'ils souhaitent. Dans ce contexte, il est important de pouvoir estimer a priori le taux d'impuretés OGM dans les récoltes de parcelles non-OGM, en fonction de leur organisation spatiale et du climat, mais aussi de comprendre et prédire l'effet de modifications de pratiques agricoles sur ce taux. L'expérimentation peut apporter des éléments de connaissances des phénomènes, la modélisation s'avère cependant plus pertinente pour répondre aux demandes d'aide à la décision (principalement publique) pour des situations agricoles et climatiques diversifiées. L'objectif de la thèse est donc de dégager un cadre méthodologique générique pour le développement de modèles de flux biologiques combinant de façon dynamique modélisation, évaluation et expérimentation. Le travail de thèse a consisté en la conception et l'évaluation du modèle MAPOD qui simule les flux de gènes chez le maïs à l'échelle du paysage. Ce modèle est basé sur une fonction de dispersion individuelle qui dépend de paramètres biologiques et climatiques et qui calcule une probabilité de fécondation en un point (x, y) en fonction de la distance à la source émettrice de pollen (pollinisation efficace). Il comporte un module de dynamique de floraison qui rend compte des conséquences des synchronismes ou asynchronismes de floraison entre champs sur les taux d'OGM dans les récoltes. Le modèle permet de déterminer l'effet de la distribution spatiale des parcelles de maïs, des caractéristiques variétales, du climat et des itinéraires techniques sur les taux de pollinisation croisée. MAPOD a été mis au point à partir de données de la littérature et d'expérimentations menées par le GEVES. Cette première version a été évaluée grâce à un second jeu de données provenant du GEVES. Elle a aussi fait l'objet d'une analyse de sensibilité. Les résultats obtenus ont permis de définir les pistes d'amélioration de l'algorithme. La qualité prédictive de MAPOD a ensuite été estimée grâce à des données issues de suivis effectués pendant 5 ans dans des parcelles d'agriculteurs en Catalogne, région où le maïs Bt est cultivé à grande échelle. La pertinence des décisions prises grâce aux sorties du modèle a aussi été caractérisée. MAPOD a été utilisé pour simuler différents scénarios d'introduction de variétés OGM dans les systèmes de culture européens. L'efficacité de mesures individuelles de coexistence a été testée. Ensuite, c'est l'effet de combinaison de pratiques qui a été simulé, aboutissant à l'établissement de tables de décision en fonction du contexte de culture. À l'échelle du bassin de collecte, l'efficience des stratégies de ségrégation (spatiale, temporelle) pouvant être mises en place par les organismes de collecte-stockage a aussi été étudiée grâce au modèle. Enfin, les sorties de MAPOD ont servi comme support pour la mise au point d'un outil d'aide à la décision à destination des agriculteurs et de leurs conseillers. / Consumer demand for food free of GMOs is growing and if production standards are to be met, food and non-food chains must be separated. Indeed, European Commission regulations 1829/2003 and 1830/2003 stipulate that food and feed thought to be GMO-free but found to be containing more than a 0.9% portion of an adventitious presence of authorized GMOs have to be distinguished, traced and labelled as such. Moreover, to ensure that producers have a choice a choice among differing types of production, the European Commission has issued recommendations that permit the coexistence of non-GM and GM crops. This poses the problem of how to deal with coexistence in an agricultural supply chain dedicated to handling a single crop species. To help in the elaboration of coexistence rules, and then assess their feasibility and their consequences as well as for setting up monitoring and control schemes, specific field experiments, even if necessary, are not sufficient as their predictive value remains restricted to a given context. It is necessary to be able to forecast the fate of GM crops at the landscape level taking into account the various cropping systems and agricultural practices that may occur across Europe. The key to forecasting spread and behaviour of GM plants and seeds as well as their impacts under a wide range of agro-ecosystems is modelling. Models reproduce the functioning of agro-systems and take into account the relevant factors and processes as well as their interactions. They thus make it possible to simulate the behaviour of agro-systems in non-observed situations and on a long term basis.This doctoral thesis establishes a methodological framework for the development of biological flow models thanks to the dynamic interactions of modelling, evaluation and experimentation. In a first phase, the work involved the design of the MAPOD® model developed in relationship to literature and varietal experiments carried out by GEVES. MAPOD® simulates gene flow between maize crops at the landscape scale. It is based on an individual dispersal function which depends on biological and climatic parameters. It calculates the probability of fecundation at a (x, y) point as a function of distance from the pollen emitter (efficient pollination). Its flowering dynamics module makes it possible to take into account of the consequences of flowering time - lags on GM adventitious presence in harvests. MAPOD® evaluates the effect of the spatial distribution of maize plots, varietal characteristics, and climate as well as agricultural practices on cross-pollination. In this investigation, in a second phase the initial version of MAPOD® was evaluated with another dataset provided by GEVES. Ways to improve the algorithm were thereby defined. In a third phase, the predictive quality of MAPOD® was estimated by comparing model outputs to cross-pollination rates which were obtained by monitoring farmers' fields in Catalonia (Spain) over a 5-year period. The relevance of decisions made according to model output was also evaluated.In a fourth phase, MAPOD® was used to simulate different scenarios involving the introduction of GM varieties into European cropping systems. The efficiency of individual coexistence measures was tested. Afterwards, the effect of combining different types of practices was simulated, leading to a set of decision-support tables elaborated according to the cropping context. At the scale of the collecting basin, with the enhanced version of MAPOD®, the efficiency of segregation strategies (spatial or temporal) that could be implemented by collecting and storing organisations was also studied. Lastly, model outputs were used as a basis for the design of a decision-support tool for use by farmers and extension workers.

A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse agronômico no genoma das plantas e pode ser empregada na tentativa de obter plantas resistentes a doenças. No entanto, para se obter uma planta transgênica é necessário primeiramente estabelecer um procotolo eficiente de regeneração de plantas in vitro. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a organogênese in vitro e a transformação genética de limão Volkameriano e laranja azeda com um fragmento do gene da capa protéica do CTV. Para a organogênese in vitro utilizou-se, como explante, segmento internodal, obtido de planta cultivada em casa-de-vegetação, segmento de epicótilo, coletado de plântula cultivada in vitro e segmento de cotilédone associado ao hipocótilo obtido de semente introduzida in vitro. Esses explantes foram mantidos em meio de cultura EME suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L- 1), sendo incubados sob fotoperíodo de 16 h de luz ou em condições de escuro por 30 dias e então transferidos para fotoperíodo de 16 h de luz. A avaliação foi realizada após 45 dias de cultivo, determinando-se o número de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A caracterização anatômica do processo de regeneração foi realizada por meio de cortes histológicos. Pela análise dos dados foi possível verificar que a organogênese in vitro ocorreu a partir dos três tipos de explantes testados, sendo que, nas duas espécies em estudo, os melhores resultados foram obtidos com o cultivo de segmento de cotilédone associado ao hipocótilo. As concentrações de BAP que estimularam as melhores taxas de regeneração foram de 1,0 e 1,5 mg L-1, para limão Volkameriano, e 0,5 e 1,0 mg L-1 para laranja azeda. A incubação dos explantes em ausência de luz favoreceu a regeneração in vitro. Pela análise histológica foi possível observar que o processo de regeneração, a partir dos três tipos de explantes testados, ocorreu por meio de organogênese indireta. O protocolo de desenvolvimento estabelecido durante os experimentos de organogênese in vitro foi utilizado para a transformação genética dessas espécies via Agrobacterium, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201, com um fragmento do gene da capa protéida do CTV, em uma construção gênica do tipo hairpin. As gemas de limão Volkameriano e laranja azeda identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS foram enxertadas in vitro em citrange Carrizo. A confirmação da transformação genética foi realizada pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento de 671 pb, correspondente a parte do gene amplificada. / Genetic transformation permits the introduction of agronomically important genes in plant genome and can be utilized in order to produce disease resistant plants. However for the recovery of transgenic plants is required to establish an efficient in vitro plant regeneration protocol. In this work the aim was to study an in vitro organogenesis and the genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with a sequence of the CTV coat protein gene. For in vitro organogenesis explant internodal segments collected from plants cultivated in greenhouse, epicotyl segments obtained from in vitro cultivated seedlings and cotyledon fragment with hypocotyl attached obtained from in vitro germinated seed were used as explant. These explants were cultured in EME medium supplemented with benzilaminopurine (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L-1). Cultures were maintained under a 16 h photoperiod or in the dark for 10 d and then transferred to a 16 h photoperiod. The evaluation was performed 45 d after the incubation determining the number of responsive explant and the number of buds per explant. The anatomical characterization of in vitro regeneration process was carried out through histological analyses. The in vitro organogenesis occurred in the three types of explant tested, however cotyledon fragment with hypocotyl attached showed higher morphogenetic potential in both species. The best responses of regeneration were obtained when the medium was supplementation with 1,0 e 1,5 mg L-1 BAP for the Volkamer lemon and 0,5 e 1,0 mg L-1 BAP for the sour orange. The incubation in darkness favored the in vitro regeneration. The histological analyses showed that the regeneration process occurred through indirect organogenesis in the three types of explants tested. The developed protocol was use for genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with Agrobacterium, containing pCAMBIA 2201 plasmid with a sequence of CTV coat protein gene, in a hairpin construction. Volkamer lemon and sour orange shoots identified as transgenic by histochemical test GUS were micrografted into Carrizo citrange. PCR analysis were performed after micrografted showing the presence of the 671 pb fragment of the transgene.

O gênero Passiflora é um excelente modelo para estudos de transição de fase, pois há diferenças morfológicas evidentes entre as plantas nas fases juvenil, adulta vegetativa e adulta reprodutiva. Há relatos de que quando se introduzem ápices de plantas adultas de Passiflora edulis, quer estejam na fase vegetativa ou reprodutiva, em condições de cultivo in vitro, observa-se a regressão à fase juvenil. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar as modificações morfológicas envolvidas na reversão à juvenilidade de ápices caulinares adultos de P. edulis quando cultivados em meio de cultura sem adição de reguladores de crescimento além de avaliar o efeito de reguladores de crescimento no intuito de evitar a reversão à juvenilidade no cultivo in vitro de P. edulis. O trabalho foi desenvolvido a partir da combinação da técnica da micropropagação in vitro e microscopia eletrônica de varredura, sendo dividido em três experimentos: o cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM sem reguladores de crescimento e análise de amostras em microscópio eletrônico de varredura, cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM com reguladores de crescimento e cultivo in vitro de ápices caulinares em meio MSM adicionados com BAP na concentração de 10?M com análises de amostras em microscópio estereoscópico. Através de micrografias eletrônicas e imagens estereoscópicas, foi possível caracterizar as fases do desenvolvimento de P. edulis, demonstrando os caracteres morfológicos assim como a manutenção das estruturas cultivadas in vitro. Não foi possível observar o rejuvenescimento in vitro quando ápices caulinares foram cultivados em meio ½ MS ou MSM sem adição de reguladores de crescimento. O rejuvenescimento de ápices caulinares adultos de P. edulis foi obtido a partir do cultivo em meio MSM com adição de 10?M de BAP. Entretanto, o rejuvenescimento foi parcial, pois nem todas as características foram revertidas. A formação de folhas lanceoladas in vitro e o desenvolvimento de brotos adventícios in vitro caracterizaram a reversão à juvenilidade em P. edulis. O meio MSM suplementado com 10 ?M de BAP foi favorável ao desenvolvimento de gemas axilares, além de facilitar a indução do rejuvenescimento dos ápices caulinares. Logo, a reversão à juvenilidade foi alcançada sob as condições in vitro adotadas / The genus Passiflora is an excellent model for phase transition studies because there are obvious morphological differences between plants in the juvenile, adult vegetative and adult reproductive phases. It has been reported that when introducing shoot tips of adult plants of Passiflora edulis, whether in the vegetative or reproductive phase, under in vitro culture conditions, regression to the juvenile phase is observed. The general objective of this work was to characterize the morphological changes involved in the reversion to juvenility of adult shoot tips of P. edulis when grown in culture medium without addition of growth regulators in addition to evaluating the effect of growth regulators in order to avoid reversion to juvenility in the in vitro cultivation of P. edulis. The work was developed from the combination of in vitro micropropagation and scanning electron microscopy, and was divided in three experiments: in vitro culture of shoot tips in MSM medium without growth regulators and analysis of samples in scanning electron microscope; in vitro culture of shoot tips in MSM medium with growth regulators and in vitro culture of shoot tips in MSM medium added with BAP at the concentration of 10?M and analysis of samples under a stereoscopic microscope. Through electronic micrographs and stereoscopic images, it was possible characterize the phases of the development of P. edulis, demonstrating the morphological traits as well as the maintenance of the structures cultivated in vitro. In vitro rejuvenation could not be observed when shoot tips were grown in ½ MS or MSM medium without addition of growth regulators. The rejuvenation of P. edulis adult shoot tips was obtained from the cultivation in MSM medium with the addition of 10?M BA. However, the rejuvenation was partial, since not all the characteristics were reversed. The formation of in vitro lanceolated leaves and the development of in vitro adventitious shoots characterized the reversion to juvenility in P. edulis. The MSM medium supplemented with 10?M BA was favorable to the development of axillary buds, in addition to facilitating the induction of the rejuvenation of the shoot tips. Therefore, the reversion to juvenility was achieved under the in vitro conditions adopted

Die vorliegende Arbeit liefert neue Kenntnisse über das Konkurrenzverhalten der Sprossscheitelschichten bei der Blattmesophyllbildung und trägt dadurch zum Verständnis der Entwicklungsgeschichte höherer Pflanzen bei. Weißbunte Pflanzen von Peperomia serpens SW. LOUD, Sedum rubrotinctum R. T. CLAUSEN, Pedilanthus tithymaloides (L.) POIT. und Plectranthus coleoides BENTH wurden verwendet, um den Bau des Sprossscheitels und die chimärische Natur des Laubblattes zu analysieren. Durch die Untersuchungen zum Bau des Sprossscheitels und zur Blattanatomie wurden die Anzahl initialer Sprossscheitelschichten und die periklinalchimärische Natur der untersuchten Pflanzen bestätigt. Mit Hilfe von Mittelwertvergleichen der Mächtigkeit L2- und L3-bürtiger Mesophyllgewebe wurde die Beteiligung genetisch verschiedener internaler Sprossscheitelschichten an der Bildung des Blattmesophylls bei Sedum rubrotinctum, Pedilanthus tithymaloides und Peperomia serpens erfasst. Die Existenz histogenetisch grüner L2- oder L3-bürtiger Gewebe verursacht eine Zunahme der Blattquerschnittfläche (Sedum rubrotinctum) und eine Vergrößerung der Blattmesophyllhöhe (Peperomia serpens und Pedilanthus tithymaloides). Es wurden Regenerationsversuche an Blattstecklingen der Periklinalchimäre von Peperomia serpens und Sedum rubrotinctum durchgeführt. Durch In-vivo-Provozierung von Adventivsprossen an Blattstücken und achselknospenfreien Sprossen gelang es, die zwei untersuchten heterohistischen Musterpflanzen von Peperomia serpens ('GGW' und 'GWG') in grüne und weiße Nachkommen zu zerlegen. An Blattstecklingen bildeten sich in der Mehrzahl L3-bürtige Regenerate (ca. 75 %). Eine Beteiligung der L2-bürtigen Gewebe bei der Regeneration war an den Blattrandexplantaten zu beobachten. Das L1-bürtige Hypoderm konnte nur in der In-vitro-Blattregeneration deutlich seine Fähigkeit zur Adventivsprossbildung zeigen. Die Blattregenerationsergebnisse bei Peperomia serpens demonstrieren deutlich, dass sich alle drei Sprossscheitelschichten (L1, L2, L3) an der Blattmesophyllbildung beteiligen können. An Blattstecklingen von Periklinalchimären bei Sedum rubrotinctum bildeten sich grüne, weiße und neue chimärische Adventivsprosse. Aus den Regenerationsergebnissen lässt sich die entscheidende Rolle der L2-bürtigen Gewebe bei der Adventivsprossbildung ablesen. Die Regenerationsergebnisse sprechen dafür, dass die Bildung der Adventivsprosse durch die Beteiligung der L2- und L3-bürtigen Gewebe hervorgerufen wurde und die L1-bürtigen Gewebe an der Adventivsprossbildung nicht beteiligt sein konnten. Demzufolge sind tiefer liegende Gewebe (L2- und L3-bürtige) des Laubblattes beider Arten bei der Bildung der Adventivsprosse entscheidender als die L1-bürtige Epidermis. Das Ausmaß der Beteiligung an der Adventivsprossbildung bei Peperomia serpens und Sedum rubrotinctum wird nicht von der genetischen Herkunft (weiß oder grün) des L2- bzw. L3-bürtigen Gewebes gesteuert, sondern durch die Lage und damit durch die Abstammung der Gewebe aus der entsprechenden Sprossscheitelschicht bestimmt. Die abschließenden Untersuchungen an Plectranthus coleoides, dessen Chlorophyll- und Ploidiechimären quantitativ analysiert wurden, verdeutlichen die Erkenntnisse über die Beteiligung der Sprossscheitelschichten an der Bildung des Blattmesophylls. Es wurde deutlich, dass die Gewebekonkurrenz im Beisein einer doppelten Markierung nicht lagebedingt sein kann, sondern aufgrund verschiedener Ploidiestufen stattfindet. / The studies presented in this thesis provide new insights into the competitive reaction of the shoot apical layers during the foliar mesophyll formation and thus contribute to understanding of plant development. The variegated plants of Peperomia serpens SW. LOUD, Sedum rubrotinctum R. T. CLAUSEN, Pedilanthus tithymaloides (L.) POIT. and Plectranhus coleoides BENTH were used to analyse the cellular organisation of shoot apex and the histogenetic constitution of the leaf. Shoot apex and leaves structural analyses confirm the number of initial shoot apical layers and the periclinal chimeric nature of investigated plants. Quantitative analysis of foliar mesophyll of Sedum rubrotinctum, Peperomia serpens and Pedilanthus tithymaloides have been used to deduce patterns of meristem layers intercellular interaction during mesophyll formation. The expression of the histogenetic green meristem layer (L2 or L3) causes a increase of "mesophyll area" (Sedum rubrotinctum) and a enlargement of "mesophyll height" (Peperomia serpens and Pedilanthus tithymaloides) in leaves. Four periclinal chimeric forms of Peperomia serpens ('GGW' and 'GWG') and of Sedum rubrotinctum ('GGW' and 'GWG'), each of which possesses normal green cell layers but a genetically different chlorophyll-deficient cell layer, were utilized to study the effect of genotype on the ability of the cell layers of in vivo and in vitro leaf cutting to regenerate adventitious shoots and to analyse the competition between apical layers and their derivatives in the plant ontogeny. Among the in vivo adventitious shoots of the leaf cuttings and leaf of Peperomia serpens, shoots were green, white and variegated. The L3-derived cell layer is alone responsible for the formation of ca. 75 % of adventitious shoots. The relative significant contribution of L2-derived cell layers to mesophyll formation increases in margin of leaf. The L1-derived hypoderm in foliar mesophyll of Peperomia serpens were apparently incapable of shoot regeneration of in vivo leaf cutting, yet in both periclinal forms clearly produced green shoots in vitro. Results demonstrate that all initial apical meristem layers in Peperomia serpens can contribute with different ability to foliar mesophyll formation. Adventitious shoots were in vivo induced on leaf of periclinal chimeric plants of Sedum rubrotinctum. Plants derived from leaf culture were three types: green, white and variegated. Among the adventitious shoots of green- and white-margined leaf of Sedum rubrotinctum, most adventitious shoots (ca. 90 %) were L2-derived, a few were L3-derived. Results demonstrate that the L1 derivatives can not contribute to foliar mesophyll formation. According to these results the internal tissues (L2- and L3-derived cell layers) of leaf are more competitive than the epidermis. The lineage of adventitious shoot is not controlled by the genetic origin of L2- and L3-derived tissues, but by the position of these derived tissues according to the shoot apical meristem layer. The last experiments on Plectranthus coleoides which have combined quantitative analysis of variegated- leaf chimeras with quantitative analysis of cytochimeras have begun to shed more light on the contribution of apical meristem layers to foliar mesophyll formation. It has revealed how the ploidy degree of apical layers derivatives in a cytochimera control leaf cell fate more than their position in the meristem.

Embora desfrute de inegável importância econômica, os citros estão sujeitos a muitos problemas sanitários sendo alguns, limitantes para o cultivo como é o caso das doenças causadas por vírus. A morte súbita dos citros é uma doença relacionada à combinação copa/ porta-enxerto e manifesta sintomas na região da enxertia sobre porta-enxertos intolerantes. Embora sua etiologia não tenha sido determinada, há indicações que a causa da MSC esteja relacionada a uma estirpe do vírus da tristeza dos citros (CTV), a um vírus do gênero Marafivirus, ou a uma associação entre eles. Uma vez que a transformação genética têm sido considerada como uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus e estudar a regeneração e obtenção de plantas in vitro de laranja azeda, via organogênese, visando futuros trabalhos de transformação genética. Experimentos para indução da organogênese in vitro foram realizados avaliando-se citocininas (BAP, TDZ e CIN), em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação com ANA, condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), meios de cultivo e explantes (provenientes de plantas germinadas in vitro e de plantas mantidas em estufa). Além disso, avaliou-se o enraizamento dos brotos regenerados. Para a transformação genética, explantes de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' foram inoculados e co-cultivados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene da replicase do Marafivirus (em seqüência sense e antisense interligadas por um íntron). A construção gênica foi elaborada a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e terminador NOS, contendo ainda o gene de seleção nptII. A transformação foi confirmada por análises de PCR e \'Southern blot\'. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e \'northern blot\'. A adição de BAP, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN ao meio de cultivo, assegurou maior formação de gemas adventícias em segmentos de epicótilo de laranja azeda. Entretanto, TDZ não se mostrou favorável a essa resposta, que também é afetada pela ausência de luz. Os explantes provenientes do cultivo in vitro mostraram-se mais favoráveis à resposta organogênica. O enraizamento das brotações de laranja azeda regeneradas foi obtido no meio MT com metade da concentração de sais, sem ou com auxinas. Foi possível obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e de laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus utilizando-se segmentos internodais como explantes. A análise de \'Southern blot\' confirmou a integração de um a quatro eventos de inserção do transgene no genoma das plantas. A transcrição do gene da replicase do Marafivirus e do gene nptII foi observada por RT-PCR. / In spite of great economic importance, the citrus industry is affected by many phytopathological problems some, limiting its cultivation such as virus-caused diseases. The citrus sudden death disease is related to scion/rootstock combinations and manifests symptoms in the grafting area of intolerant rootstocks. Although its etiology has not been determined, there are indications that the cause of MSC might be related to a strain of the Citrus tristeza virus (CTV), to a virus of the Marafivirus group, or to an association of both viruses. Since the genetic transformation has been considered as an auxiliary tool to programs of citrus improvement, the objectives of this work were to obtain transgenic plants of the Rangpur lime and Valencia sweet orange containing the Marafivirus replicase gene and study the in vitro regeneration of sour orange plants through organogenesis, aiming for future work in genetic transformation. Experiments for induction of in vitro organogenesis were carried out evaluating citocinins (BAP, TDZ and KIN), in different concentrations, separately or in combination with NAA, lighting conditions (photoperiod of 16 hours and darkness for 30 days), cultivation media and explants (coming from in vitro germinated plants and from green house cultivated plants). Besides this, rooting of the regenerated shoots was evaluated. For the genetic transformation, Rangpur lime and Valencia sweet orange explants were inoculated and co-cultivated with the EHA-105 Agrobacterium tumefaciens strain containing the Marafivirus replicase gene (in sense and antisense sequence linked by an intron). The genetic construct used derived from the pCAMBIA 2201 plasmid, driven by the 35S promoter and NOS terminator, containing the selection nptII gene. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and northern blot. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with NAA, and in combinations with KIN, assured a greater formation of adventitious buds in sour orange epicotyl segments. However, TDZ was not favorable to this response, that is also affected by the absence of light. Explants coming from in vitro cultivation were more favorable to the organogenic response. Rooting of sour orange regenerated shoots was obtained in MT medium with half the salt concentration, with or without auxin. It was possible to obtain transgenic Rangpur lime and Valencia sweet orange plants containing the Marafivirus replicase gene using internodal segments as explants. The Southern blot analysis confirmed the integration of one to four copies of the transgene in the plant genome. The transcription of the Marafivirus replicase gene and the nptII gene was observed by RT-PCR.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Disturbance is an important phenomenon affecting plant lives and shaping plant strategies in disturbed habitats. A variety of ecological concepts on individual plant response to injury has been proposed for specific natural ecosystems or growth forms. In central Europe, man-made habitats are often cases of disturbed places, so the aim of the thesis was to apply four chosen concepts on them. The thesis is composed of four original studies performed in two model ecosystems: recurrently disturbed ruderal place and regularly mown central European meadow. The occupying of the aboveground space after a disturbance event was studied here either as renovation of biomass or architecture. Regenerative strategies in herbs occupying disturbed habitats were described and confronted with concepts proposed originally for ecosystems subjected to natural disturbance regimes.