Introdution: The ISAAC (International Study of Asthma and Allergies in Childhood) protocol has shown heterogeneous results regarding asthma prevalence around the world in the last twenty years. These figures including the risk factors analysis, are very important for the understanding of asthma epidemiology. Methods: Asthma prevalence and risk factors associated were determinate using ISAAC protocol in public and private schools of Aracaju, Northeast of Brazil. Three thousand and nine students between 13 and 14 years old participated in the study within a random sample of 70 schools using the question about wheezing in the last 12 months. From the initial number of students, 430 adolescents from 35 selected schools were submitted to skin prick test and a questionnaire assessing risk factors. A correlation analysis using chi-square to define p-value and subsequently the multivariated analysis using Poisson regression. The study was approved by local ethical committee and full informed consent for participation was obtained from parents or guardians. Results: Asthma prevalence in Aracaju was 12,8% (data from 2005 showed 18,7%). Indoor allergens sensitization was not associated with current wheezing, but was significant when associated with cumulative asthma and physician diagnosed asthma. The allergens more frequently positively associated were dust mites. Having a dog outside home Prevalence Ratio (PR)=0,93 (CI95% 0,88-0,98); p=0,018 and having an older sibling PR=0,94 (CI95% 0,91-0,98); p=0,005 were defined as a likely protective factor for current wheezing and exposure to second-hand cigarette smoke PR=1,04 (CI95%= 1,00-1,09);p=0,039 was defined as a possible positive risk factor. Conclusion: Current prevalence data is significantly lower than 2005 in Aracaju and reached one of the lowest rates in Brazil s Northeast. The associated factors strengthen smoking association with asthma, besides support the Hygiene Hypothesis. / Intodução: Os instrumentos do estudo ISAAC (International Study of Asthma and Allergies in Childhood) têm revelado, nos últimos 20 anos, dados heterogêneos nos índices de prevalência de asma ao redor do mundo e a repetição dessas medidas associada à análise de fatores associados têm fornecido material fundamental para se conhecer melhor a epidemiologia desta doença. Os objetivos foram estimar prevalência da asma e sua evolução temporal, além de conhecer o perfil local de sensibilização atópica e identificar fatores associados à asma. Métodos: Através dos questionários validados e testes alérgicos, o protocolo ISAAC foi o método usado para detecção de prevalência de asma e análise de risco nas escolas de Aracaju, Sergipe, Brasil. Participaram 3009 alunos de 13 a 14 anos das 70 escolas sorteadas utilizando a questão sobre presença de sibilos nos últimos 12 meses para definição de prevalência de asma. Posteriormente, a partir do contingente inicial, foram sorteados 430 adolescentes de 35 escolas para teste com aeroalérgenos e análise de risco. Trata-se de estudo observacional transversal analítico e para correlação e associação entre variáveis nominais utilizou-se o teste χ2 (qui-quadrado) de Pearson e entre nominais e ordinais utilizou-se o Teste ρ de Spearman. A partir das variáveis selecionadas, para as análises univariada e multivariada entre os possíveis fatores e a asma, utilizou-se da regressão de Poisson modificada com definição de razão de prevalência (RP). Resultados: A prevalência de asma em Aracaju foi de 12,8% (era 18,7% em 2005). A sensibilização a ácaros da poeira foi a de maior prevalência e a atopia não foi um fator significativo associado à asma ativa, mas obteve significância com asma cumulativa e com diagnóstico médico de asma. Definiu-se como fatores de proteção a asma ativa a presença de cão fora do domicílio RP= 0,93 (IC95% 0,88 0,98); p= 0,018 e presença de irmão mais velho RP= 0,94 (IC95% 0,91 0,98); p= 0,005 e como fator de risco a presença de fumantes no domicílio RP= 1,04 (IC95%= 1,00 1,09); p= 0,039. Conclusões: Os dados de prevalência atual são significativamente menores que os de 2005 nesta cidade e atingiu um dos índices mais baixos do nordeste brasileiro. E os fatores associados reforçam o malefício do tabagismo em relação à asma, além de inferirem alguma concordância com a Hipótese da Higiene.

Orientadores : Sonia Maria Alves Bueno, Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_IsaSantos_D.pdf: 749498 bytes, checksum: 83d66753c75e7828fd4a8b858aecf473 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A alergia é uma enfermidade do sistema imunológico que afeta aproximadamente de 20 a 30% da população mundial. Dentre as reações alérgicas, a reação de hipersensibilidade imediata é mediada pelas imunoglobulinas E (IgE). Os indivíduos geneticamente predispostos a manifestar reações por hipersensibilidade imediata e polissensibilizados aos alérgenos ambientais são considerados atópicos e, geralmente, possuem teores de IgE total até 10.000 vezes mais elevados do que as pessoas não-atópicas. O conhecimento das interações entre a IgE e ligantes de afinidade pode levar ao desenvolvimento de novos tratamentos da hipersensibilidade imediata, por exemplo a terapia de adsorção seletiva através de circulação extracorpórea, assim como ao desenvolvimento de métodos de obtenção de IgE purificada, para aplicação nas áreas de diagnóstico, pesquisa molecular, dentre outras. Os adsorventes empregados na terapia de adsorção seletiva, bem como na purificação de IgE, geralmente são anticorpos anti-IgE imobilizados em agarose, os quais são de alto custo e difícil obtenção. Este trabalho avaliou o desempenho de adsorventes alternativos ao Sepharose-anti-IgE, visando a remoção de IgE total e específica aos ácaros Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis de amostras plasmáticas e a preparação de soluções enriquecidas em IgE, como uma das etapas do processo de purificação de IgE. Os adsorventes estudados constituíram-se de lectinas (concanavalina A e Lens culinaris), aminas (poli-L-lisina e aminohexil) e o aminoácido D-triptofano, imobilizados em agarose. Dentre eles, o gel agarose-Lens culinaris mostrou-se o mais promissor para aplicação na terapia de adsorção seletiva de IgE e o gel Sepharose-concanavalina A mostrou-se o mais adequado para ser usado na obtenção de soluções enriquecidas em IgE. Experimentos cromatográficos foram realizados visando estabelecer condições experimentais (velocidade superficial, número de passagens de plasma pela coluna, temperatura e razão entre volume de plasma e volume de leito) mais favoráveis à adsorção de IgE em agarose-Lens culinaris. Posteriormente, essas condições foram utilizadas nos experimentos de simulação in vitro de circulação extracorpórea, nos quais o gel agarose-Lens culinaris removeu de 40,7 a 42,8% de IgE¿s total e específicas. A obtenção da solução enriquecida em IgE foi realizada por meio de duas etapas cromatográficas, empregando-se os princípios de afinidade (colunas agarosejacalina e Sepharose-concanavalina A) e de exclusão por tamanho (permeação em gel). A solução final enriquecida em IgE obtida, continha como principais impurezas, IgA e IgG. Como resultado das duas etapas, 36,6% de IgE foi recuperada e o fator de enriquecimento em IgE, em relação a IgA, IgG, IgM e albumina, foi de 75,8. Apesar do gel Sepharose-anti- IgE apresentar desempenho melhor tanto na remoção quanto na purificação de IgE, os adsorventes agarose-Lens culinaris e Sepharose-concanavalina A apresentam custos mais atrativos / Abstract: Allergy is a disorder of the imune system, affecting approximately 20%-30% of the general population. Among allergic reactions, immediate hypersensitivity is mediated by immunoglobulin E (IgE). Individuals that have a genetic predisposition for responses to immediate hypersensitivity are named atopic and generally have elevated serum IgE concentration, up to 10,000-fold higher than in the normal population. The knowledge of the interactions between IgE and affinity ligands may lead to the development of new methods of treatment for immediate hypersensitivity, for example, IgE selective adsorption therapy through extracorporeal circulation, as well as to new methods for obtaining purified IgE, which is employed in diagnostic and in molecular research. The adsorbents employed in IgE selective adsorption therapy, as well as in IgE purification, are usually antibodies anti-IgE immobilized on agarose, which have high costs and are difficult to obtain. This work assessed the performance of adsorbents (alternative to Sepharose-anti-IgE) for the removal of total IgE and IgE specific for the airbone allergens Dermatophagoides pteronyssinus and Blomia tropicalis from plasma samples, as well as in the production of IgE enriched solutions, considered as a step of IgE purification. The adsorbents studied were lectins (concanavalina A and Lens culinaris), amines (poli-L-lisina e aminohexil) and the aminoacid D-tryptophan, all of them immobilized on agarose. Among them, Lens culinaris-agarose showed the best performance for IgE selective adsorption therapy, and Sepharose¿concanavalin A was considered the most appropriate for the production of IgE enriched solutions. Chromatographic experiments were accomplished in order to determine operating conditions (superficial velocity, number of times the plasma passed through the column, temperature, and ratio of plasma volume to bed volume) more favorable to IgE adsorption on Lens culinaris-agarose. The selected conditions were utilized in in vitro simulation assays of extracorporeal circulation, in which the Lens culinaris-agarose removed from 40.7% to 42.8% of total and specific IgE. The production of IgE enriched solutions was carried out with two chromatographic steps, employing affinity (columns jacalin-agarose and Sepharose-concanavalin A) and size exclusion (gel permeation) principles. The IgE enriched final solution contained IgA and IgG as the major impurities. As a result of both steps, 36.6% of IgE was recovered and the IgE enrichement number concerning IgA, IgG, IgM, and albumin was 75.8. Despite Sepharose-anti-IgE has better performance in removal and purification of IgE, Lens culinaris-agarose and Sepharose-concanavalin A adsorbents have more attractive costs / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutora em Engenharia Quimica

Para elucidar os mecanismos envolvidos na inibição da hipersensibilidade do tipo I em proles murinas mediada pela imunização materna com Ovalbumina (OVA), as proles foram avaliadas quanto aos linfócitos Tγδ produtores de IL-17 (CD27-). A imunização materna com OVA reduziu a expressão de CD27, o que também se refletiu nos pulmões, e a produção de IL-17 por linfócitos Tγδ das proles. A redução da expressão de CD27 também foi evidenciada em linfócitos Tγδ intratímicos das proles após a transferência passiva de anticorpos IgG alérgeno específicos para fêmeas gestantes não imunizadas e in vitro em resposta a estes mesmos anticorpos, efeito que parece envolver a expressão de receptores para IgG expressos por outras células presentes no timo. As evidências obtidas indicam que a imunização materna influi na maturação tímica de linfócitos inibindo a população que colaborara com a inflamação alérgica. Aparentemente, os anticorpos IgG maternos são responsáveis por este fenômeno e a população estudada está envolvida na inibição da inflamação alérgica observada nas proles. / To elucidate the mechanisms involved in inhibition of type I hypersensitivity in murine offsprring mediated by maternal immunization with Ovalbumin (OVA), the offspring were evaluated as IL-17-producing γδT cells (CD27-). Maternal immunization with OVA reduced the expression of CD27, which was also reflected in the lungs, and the production of IL-17 by γδT cells of offspring. Reduction of CD27 expression was also evidenced in intrathymic γδT cells of offspring after passive transfer of allergen-specific IgG antibodies to non-immunized pregnant females and in vitro in response to these same antibodies, effect that seems to involve the expression of IgG receptors expressed by other cells present in the thymus. Evidence obtained indicates that maternal immunization influences the thymic maturation of lymphocytes by inhibiting the population that collaborate with allergic inflammation. Apparently, maternal IgG antibodies are responsible for this phenomenon and the population studied is involved in the inhibition of allergic inflammation observed in offspring.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-24T21:28:26Z No. of bitstreams: 1 Flavia Regina Greiffo.pdf: 886904 bytes, checksum: 4aa27a44bc94c9d06427df1b649e9b9e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T21:28:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia Regina Greiffo.pdf: 886904 bytes, checksum: 4aa27a44bc94c9d06427df1b649e9b9e (MD5) Previous issue date: 2015-03-02 / In the last years, a growing number of studies have demonstrated that the aerobic physical training (APT), performed in the proper intensity, duration and frequency, display several benefits to asthmatic patients, including improvement in quality of life, reduction in the levels of anxiety and depression, improvements in minute ventilation, reduction in the number of crisis, reduction in the levels of exhaled nitric oxide, beyond reduced daily needing of corticosteroids. More recently, was demonstrated for the first time that APT presents a direct anti-inflammatory effect on the airways of asthmatic patient, since that APT reduced the number of eosinophils in the induced sputum of these patients. However, several questions and hypothesis were raised up about the possible mechanism involved in these anti-inflammatory effects of APT for asthma. In this way, a growing number of experimental studies using models of asthma have been published, revealing possible mechanism involved of action APT for asthma. On the other hand, until this moment no study evaluated the effects of APT on the via of purinergic receptors, a family of receptors that present a central role in the physiopathology of asthma. Therefore, the present study aim is to evaluate if the anti-inflammatory effects of APT for asthma is mediate, at least partially, by the inhibition of expression of purinergic receptor P2X7, as well as the extracellular adenosine triphosphate (ATP). Thus, using 40 C57Bl/6 mice, divided in 4 experimental groups (Control, n = 10), (Exercise, n = 10), (Asthma, n = 10) and (Asthma + Exercise, n = 10). The experimental model of asthma (chronic pulmonary allergic inflammation) was induced through the intra-peritoneal injection of ovalbumin solution on days 0, 14, 21 and 42 followed by inhalation of 1%, 3% and 5% ovalbumin, 3x/week, and beginning on 21st day until the 53rd day of experimental protocol. To evaluate the therapeutic effects of APT on the inflammation and on the via of purinergic receptors, the low intensity APT was performed 5x/week, 60 min/session, begining on 27th day of experimental protocol until the 53rd day, when the airways inflammation is already established. Twenty-four hours after the last inhalation and training session, mice were anesthetized, tracheotomized, canuled and the bronchoalveolar lavage was collected and analyzed for the ATP levels and also the total number of cells as well as the differential number of cells. The analysis of hyperresponsiveness was performed. The histological analysis was performed to evaluate and quantify the number of lymphocytes and eosinophils in the airways wall, and also the airway remodeling. The expression of purinergic receptor P2X7 in the lung tissue homogenate was performed using western blotting and also the immunohistochemistry technique. / Nos últimos anos um crescente número de estudos tem demonstrado que o treinamento físico aeróbio (TFA), quando realizado de maneira adequada em termos de intensidade, duração e freqüência, apresenta inúmeros benefícios para o paciente asmático, incluindo melhora na qualidade de vida, diminuição dos níveis de ansiedade e depressão, melhora da ventilação minuto, diminuição do número de crises, diminuição dos níveis de óxido nítrico exalado, além de diminuir a necessidade diária de corticoesteróides. Recentemente, foi demonstrado pela primeira vez que o TFA apresenta um efeito antiinflamatório direto sobre as vias aéreas do paciente asmático, uma vez que o TFA diminuiu o número de eosinófilos no escarro induzido desses pacientes. Entretanto, inúmeras perguntas e hipóteses foram levantadas sobre os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito antiinflamatório do TFA na asma. Nesse sentido, um crescente número de estudos com animais de experimentação em modelos de asma tem sido publicado, os quais têm revelado possíveis vias de atuação do TFA na asma. Entretanto, até o momento não existem publicações sobre os efeitos do TFA sobre a via dos receptores purinérgicos, os quais têm um papel central na fisiopatologia da asma. Portanto, o presente estudo teve com objetivo avaliar se os efeitos antiinflamatórios do TFA na asma é mediado, pelo menos em parte, pela inibição da expressão dos receptores purinérgicos, assim como pela diminuição dos níveis do principal ativador dos receptores purinérgicos, a adenosina trifosfato (ATP) extracelular. Para isso, foram utilizados 40 camundongos C57Bl/6 divididos em 4 grupos experimentais (n=10 / cada) Controle, Exercício, Asma e Asma + Exercício. O modelo de asma (inflamação pulmonar alérgica crônica) foi induzido por meio de injeção intra-peritoneal com ovalbumina nos dias 0, 14, 28 e 42 seguidos por inalação com solução de ovalbumina (1, 3 e 5%) três vezes por semana, a partir do dia 21 até o dia 53 do protocolo experimental. Com o intuito de avaliar o efeito terapêutico do TFA sobre a inflamação e sobre a via dos receptores purinérgicos, o TFA de baixa intensidade foi realizado 5x/semana, 60 minutos/sessão, iniciando no dia 27 do protocolo experimental até o dia 53, quando a inflamação das vias aéreas já estava estabelecida. Vinte e quatro horas após a última inalação e sessão de treinamento, os animais foram anestesiados, traqueostomizados, canulados e o lavado broncoalveolar foi coletado e analisado para os níveis de ATP e também para o número de células totais e contagem diferencial. A avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 foi realizada no homogenato do tecido pulmonar por meio da técnica de western blotting, e também nos cortes histológicos por meio da técnica de imunohistoquímica. Através da técnica de histologia foi quantificado o número de linfócitos e eosinófilos nas vias aéreas, assim como o remodelamento brônquico. A hiperresponsividade brônquica das vias aéreas foi avaliada através do sistema Buxco. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com a literatura, uma vez que o TFA reduz a inflamação crônica das vias aéreas. Nossos resultados também sugerem que o TFA atua na via dos receptores purinégicos diminuindo a inflamação pulmonar.

Tesis por compendio / [EN] About 10 % of all adverse drug reactions are due to allergies, with ß-lactam antibiotics causing the majority of the episodes. Although the actual incidence remains unknown, individuals suspected of being allergic to a drug end up being prescribed with other medications that are less effective, more expensive or harmful. Consequently, a correct diagnosis is key to reduce the derived economic costs and proceed to an adequate 'delabeling' of the population. At present, clinical approaches to diagnose allergies to ß-lactam antibiotics are based on in vivo and in vitro tests. These tests present limited clinical performances since they are invasive, dangerous, and provide false positives and/or negatives. Moreover, the diagnostic sensitivity is far from what is expected, possibly because the epitopes that cause the allergic episodes are still not well detected. In this respect, the preparation of antigens has commonly been determined by the direct attachment of antibiotics to carrier molecules through the formation of an amide bond between amino lysine groups of the carrier molecule and the carboxylate group of the antibiotic. Even so, specific IgE are barely detected with such antigens. This dissertation addresses the synthesis of haptens and the generation of antigens to ß-lactam antibiotics, which develop a more reliable in vitro diagnosis of allergies to these drugs. The evaluation of the antigens has been carried out by means of multiplex in vitro tests based on compact disc technology. This research begins by focusing on the synthesis and preparation of penicillin antigens. To this end, first, the effect of the incorporation of aliphatic spacer arms in the chemical structure of penicillin has been approached, considering the possibility that a better molecular recognition is obtained by moving the hapten away from the carrier protein. Thirteen haptens derived from benzylpenicillin and amoxicillin were synthesized in order to prepare antigens with human serum albumin. The evaluation of the antigens revealed that even though they were immunogenic and were detected by the raised IgG antibodies, they were not detected by specific IgE from allergic patients. Additionally, the next approach considered the cationization of the carrier proteins, human serum albumin and histone. The modification of carboxylate groups of the protein to amino groups allow for an increase of the molar hapten/protein ratio. This strategy led to the generation of five antigens, four of which (only those histone-based antigens), did increase the sensitivity of the assay. Concretely, specific IgE has been determined in sera from allergic patients at low concentrations (LOD = 0.07 IU/mL) with a diagnostic specificity of 100 % and a sensitivity of 60 and 31 % for benzylpenicillin and amoxicillin, respectively. That means a 60 % improvement in the diagnostic sensitivity when compared to the in vitro reference test. Subsequently, the idea of preparing minor antigens based on penicillin metabolites was approached. Penicilloic, penilloic, penicillic, and 6-aminopenicillanic acids, together with penicillamine, were therefore conjugated to the carrier proteins human serum albumin and histone. Except penilloic acid, the rest of antigens were selectively detected when testing a set of serum samples from allergic patients. The diagnostic specificity obtained was 100 %, 94 % in the case of penicillic acid, and the sensitivity was between 67 and 100 %. Another approach was focused on the production of antigens for other families of ß-lactam antibiotics. The generation of antigens for cephalosporins, carbapenems, monobactams or ß-lactam inhibitors is essential, since in vitro tests for the detection of allergies to these antibiotics are not commercially available. Therefore, the results obtained after the preparation of major and minor antigens for the antibiotics cefuroxime, cefotaxime, ceftriaxone, meropenem, and aztreonam were evaluated. / [ES] Alrededor del 10 % de las reacciones adversas a medicamentos son debidas a alergias, siendo los antibióticos ß-lactámicos los que más episodios alérgicos ocasionan. Aunque la incidencia real sigue siendo desconocida, los individuos sospechosos de presentar alergia a algún medicamento acaban siendo prescritos con otros medicamentos, menos efectivos, más caros o perjudiciales. Así pues, un correcto diagnóstico resulta clave para disminuir los costes económicos derivados y proceder a un adecuado 'desetiquetado' de la población. En la actualidad, las pruebas de diagnóstico de alergias a antibióticos ß-lactámicos se basan en ensayos in vivo e in vitro. Estos ensayos muestran bajas prestaciones, ya que son invasivos y peligrosos y proporcionan falsos positivos y/o negativos. Además, la sensibilidad diagnóstica está lejos de ser la esperada, posiblemente porque aún no se ha conseguido reconocer todos los epítopos causantes de los episodios alérgicos. En este sentido, la preparación de antígenos se ha basado hasta el momento, en mayor medida, en la unión directa de los antibióticos a las moléculas portadoras mediante la formación de un enlace amida entre los grupos amino de las lisinas de la molécula portadora y el grupo carboxilato del antibiótico. Aun así, las IgE específicas son vagamente detectadas con estos antígenos. En esta tesis se ha abordado la síntesis de haptenos y la generación de determinantes antigénicos a antibióticos ß-lactámicos con los que poder realizar un diagnóstico in vitro más fiable de alergias a estos fármacos. La evaluación de los mismos se ha llevado a cabo mediante ensayos in vitro multiplex basados en tecnología de disco compacto. Esta investigación comienza centrándose en la síntesis y preparación de antígenos de penicilina. Para ello, en una primera fase se ha estudiado el efecto de la incorporación de brazos espaciadores alifáticos en la generación de antígenos, considerando la posibilidad de que se obtenga un mejor reconocimiento molecular al alejar el hapteno de la proteína portadora. Se sintetizaron trece haptenos derivados de bencilpenicilina y amoxicilina con los que se prepararon antígenos con la proteína albumina de suero humano. La evaluación de los antígenos reveló que a pesar de ser suficientemente inmunogénicos y ser reconocidos por anticuerpos IgG de conejo, éstos no fueron reconocidos por IgE específicas de muestras de pacientes alérgicos. Así bien, por otro lado, la estrategia de cationización de las proteínas albumina de suero humano e histona fue abordada teniendo en cuenta que la modificación de grupos carboxilatos de la proteína a grupos amino aumenta la relación molar hapteno/proteína. Esta estrategia permitió la generación de 5 antígenos, 4 de los cuales (los antígenos de histona), esta vez sí, incrementaron la especificidad de la respuesta inmunológica obtenida, reconociendo IgE específicas. Concretamente, se han determinado IgE específicas en suero de pacientes alérgicos a bajas concentraciones (LOD = 0.07 IU/mL) con una especificidad diagnóstica del 100 % y una sensibilidad del 60 y 31 % para bencilpenicilina y amoxicilina, respectivamente, mejorando la sensibilidad un 60 % en comparación con el ensayo in vitro de referencia. A pesar de las mejoras obtenidas con las estrategias llevadas a cabo, se estudiaron otras vías no clásicas para la síntesis de nuevos haptenos con mayor diversidad química. Este enfoque se basa en la generación de antígenos en librerías químicas de compuestos con diversidad estructural para encontrar nuevos haptenos biológicamente activos. Dichas estrategias, hasta el momento, no han sido empleadas para la generación de antígenos y el análisis de muestras de suero de pacientes alérgicos. Con el fin de incorporar diversidad estructural, se sintetizaron, mediante la técnica combinatoria diversity-oriented synthesis, 22 compuestos de los precursores de las penicilinas y cefalosporinas, ácido 6-aminopenicilánico y ácido 7-amino-desacetoxicefalosporánico, respectivamente, y de los antibióticos amoxicilina y ampicilina. Su evaluación con el inmunoensayo in vitro basado en disco compacto ha demostrado que la incorporación de diversidad permite el reconocimiento de epítopos causantes de episodios alérgicos. Concretamente, se observó que estos antígenos eran capaces de detectar anticuerpos tipo IgG e IgE específicos procedentes de suero de conejos inmunizados y de suero humano de pacientes alérgicos, siendo especialmente selectivos los determinantes de amoxicilina y ampicilina. Concretamente, se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 79 % y una especificidad diagnóstica del 100 % / [CA] Al voltant del 10% de les reaccions adverses a medicaments són degudes a al·lèrgies, sent els antibiòtics ß-lactàmics aquells que més episodis al·lèrgics ocasionen. Encara que la incidència real continua sent desconeguda, els individus sospitosos de presentar al·lèrgia a algun medicament acaben sent prescrits amb altres medicaments, menys efectius, més cars o perjudicials. Així doncs, un correcte diagnòstic resulta clau per a disminuir els costos econòmics derivats i procedir a un adequat 'desetiquetatge' de la població. En l'actualitat, les proves de diagnòstic d'al·lèrgies a antibiòtics ß-lactàmics es basen en assaigs in vivo i in vitro. Aquests assaigs mostren baixes prestacions, ja que són invasius i perillosos i proporcionen falsos positius i/o negatius. A més a més, la sensibilitat diagnòstica està lluny de ser l'esperada, possiblement perquè encara no s'ha aconseguit reconéixer tots els epítopes causants dels episodis al·lèrgics. En aquest sentit, la preparació d'antígens s'ha basat fins al moment, en major mesura, en la unió directa dels antibiòtics a les molècules portadores mitjançant la formació d'un enllaç amida entre els grups amino de les lisines de la molècula portadora i el grup carboxilat de l'antibiòtic. Així i tot, les IgE específiques són vagament detectades amb aquests antígens. En aquesta tesi s'ha abordat la síntesi d'haptens i la generació de determinants antigènics a antibiòtics ß-lactàmics amb els quals poder realitzar un diagnòstic in vitro més fiable d'al·lèrgies a aquests fàrmacs. La seua avaluació s'ha dut a terme mitjançant assaigs in vitro multiplex basats en tecnologia de disc compacte. Aquesta investigació comença centrant-se en la síntesi i preparació d'antígens de penicil·lina. Per a això, en una primera fase s'ha estudiat l'efecte de la incorporació de braços espaiadors alifàtics en la generació d'antígens, considerant la possibilitat que s'obtinga un millor reconeixement molecular en allunyar l'haptè de la proteïna portadora. Es van sintetitzar tretze haptens derivats de bencilpenicil·lina i amoxicil·lina amb els quals es van preparar antígens amb la proteïna albúmina de sèrum humà. L'avaluació dels antígens va revelar que malgrat ser prou immunogènics i ser reconeguts per anticossos IgG de conill, aquests no van ser reconeguts per IgE específiques de mostres de pacients al·lèrgics. Així bé, d'altra banda, l'estratègia de cationització de les proteïnes albúmina de sèrum humà i histona va ser abordada tenint en compte que la modificació dels grups carboxilats de la proteïna a grups amino augmenta la relació molar hapten/proteïna. Aquesta estratègia va permetre la generació de 5 antígens, 4 dels quals (els antígens d'histona), aquesta vegada sí, van incrementar l'especificitat de la resposta immunològica obtinguda, reconeixent IgE específiques. Concretament, s'han determinat IgE específiques en sèrum de pacients al·lèrgics a baixes concentracions (LOD = 0.07 IU/mL) amb una especificitat diagnòstica del 100 % i una sensibilitat del 60 i 31 % per a bencilpenicil·lina i amoxicil·lina, respectivament, millorant la sensibilitat un 60 % en comparació amb l'assaig in vitro de referència. Malgrat les millores obtingudes amb les estratègies dutes a terme, es van estudiar altres vies no clàssiques per a la síntesi de nous haptens amb major diversitat química. Aquest enfocament es basa en la generació d'antígens en llibreries químiques de compostos amb diversitat estructural per a trobar nous haptens biològicament actius. Aquestes estratègies, fins al moment, no han sigut emprades per a la generació d'antígens i l'anàlisi de mostres de sèrum de pacients al·lèrgics. Amb la finalitat d'incorporar diversitat estructural, es van sintetitzar, mitjançant la tècnica combinatòria diversity- oriented synthesis, 22 compostos dels precursors de les penicil·lines i cefalosporines, àcid 6-aminopenicilànic i àcid 7-amino-desacetoxicefalosporànic, respectivament, i dels antibiòtics amoxicil·ina i ampicil·lina. La seua avaluació amb l'immunoassaig in vitro basat en disc compacte ha demostrat que la incorporació de diversitat permet el reconeixement d’epítops causants d'episodis al·lèrgics. Concretament, es va observar que aquests antígens eren capaços de detectar anticossos tipus IgG i IgE específics procedents de sèrum de conills immunitzats i de sèrum humà de pacients al·lèrgics, sent especialment selectius els determinants d’amoxicil·lina i ampicil·lina. Concretament, es va obtindre una sensibilitat diagnòstica del 79 % i una especificitat diagnòstica del 100 %. / This work was supported by the H2020 program (project COBIOPHAD, grant agreement No. 688448 awarded to A.M.), being an initiative of the Photonics Public Private Partnership; Agencia Estatal de Investigación Agencia Estatal de Investigación (CTQ2016-75749-R, FEDER) (PID2019-110713RB-I00, FEDER) awarded to S.M.; Generalitat Valenciana (PROMETEO/2020/094 awarded to A.M. & S.M.); program UPV-La FE 2019 (P105 VALBIOAL awarded to S.M & E. I-E.); and the National Institute of General Medical Sciences (GM-1R35GM127045 awarded to S.L.S.). E.P.M. was supported by a FPU fellowship from the Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (FPU15/01738 and EST18/00360). B.K.H. was supported by a fellowship from the National Science Foundation (DGE1144152 and DGE1745303). The authors acknowledge the Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, Valencia, Spain, which provided the samples from both allergic patients and controls. / Peña Mendizabal, E. (2022). Synthesis and Evaluation of Antigenic Determinants for ß-lactam Allergy Diagnosis [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182979 / TESIS / Compendio

Allergy, as one of the worldwide most frequent pathologies, belongs to illnesses with constantly growing incidence among young children. In genetically predisposed individuals, dendritic cells are able to polarize the immune response of Th2 in contact with the allergen. Postnatal probiotic supplementation could be one the preventive measure to prevent the development of allergic diseases. It has been shown that introduction of selected probiotic strains or mixtures can prevent development of allergy. In this diploma thesis, the capacity of probiotic strain Escherichia coli O83:K24:H31 (E. coli O83) to support maturation of dendritic cells (DC) and polarization of immune responses was tested. Introduction of this probiotic vaccine called Colinfant Newborn appears to be suitable preventive measure, lowering allergy incidence in children with predisposition to development of allergy. The aim of this diploma thesis was to observe capacity of E. coli O83 to support maturation of the two main subpopulations of dendritic cells (myeloid dendritic cells - mDC and plasmacytoid dendritic cells - pDC) in cord blood of newborns of healthy mothers (children with relatively low risk for allergy development) and allergic mothers (children with relatively high risk for allergy development). To achieve this goal,...

Allergy as one of the most frequent pathologies worldwide belongs to illnesses with constantly increasing incidence even amongst young children. It develops in genetically predisposed individuals whose dendritic cells (DC) are, after contact with allergen, able to polarize the immune response predominantly to Th2, while Th1 response is supressed. One of the possible preventive measures to avoid an allergic disease developement could be an early postnatal supplementation of chosen probiotic bacterial strains or their mixtures. One of them is a well characterized strain Escherichia coli O83:K24:H31 (E. coli O83). Administering of this probiotic vaccine called Colifant Newborn is showing to be an effective prophylaxis to decrese the incidence of allergies in children with predisposition to their developement. The aim of my diploma thesis was to experimentally confirm the capacity of E. coli O83 to support maturation of two main subpopulations of newborn DC available from cord blood: myeloid dentritic cells - mDC and plasmacytoid dentritic cells - pDC. This DC subpopulations were isolated from cord blood of children born to healthy (non-allergic) mothers who had a low risk of allergy development or from children of allergic mothers who had an increased risk of allergy development. Subsequently, after...

INTRODUÇÃO: A importância da resposta mecânica do parênquima pulmonar na fisiopatologia da asma tem sido recentemente reconhecida. O óxido nítrico é um mediador que controla o tônus muscular liso das vias aéreas, porém este efeito no parênquima pulmonar periférico ainda não foi previamente investigado. Nossa hipótese é que a inibição crônica das óxido nítrico sintases por meio do tratamento com L-NAME (falso substrato para todas as óxido nítrico sintases) pode modular a mecânica do parênquima pulmonar, o recrutamento eosinofílico e o remodelamento da matriz extracelular em modelo de inflamação alérgica crônica pulmonar em cobaias. MÉTODOS: Os animais foram expostos a sete inalações com soro fisiológico ou com ovoalbumina em doses crescentes (1~5mg/ml - 4 semanas) e tratadas ou não com L-NAME (60 mg/kg/ por dia /por animal) na água de beber. Setenta e duas horas após a sétima inalação os animais foram anestesiados, exsanguinados e a mecânica oscilatória do parênquima pulmonar foi medida na condição pré e após desafio (0.1%). Utilizando a técnica de morfometria foram avaliadas a densidade de eosinófilos, o número de células nNOS e iNOS positivas, a densidade de actina, das fibras colágenas e das fibras elásticas bem como a proporção de volume de 8-iso-PGF2 no septo alveolar. RESULTADOS: Os animais que foram expostos à ovoalbumina apresentaram um aumento da resistência e da elastância tecidual (resposta basal e após desafio antigênico), na densidade de eosinófilos, no número de células nNOS e iNOS positivas, na densidade de fibras colágenas e de fibras elásticas bem como na expressão de 8-isoPGF2 no septo alveolar comparativamente aos grupos controles (p<0,05). O tratamento com L-NAME em animais expostos à ovoalbumina atenuou todas as respostas de mecânica do tecido pulmonar periférico (p<0, 01), reduziu o número de células nNOS e iNOS positivas (p<0.01), o conteúdo de fibras elásticas (p<0,001) e de 8-iso-PGF2 no septo alveolar (p<0,001). No entanto, este tratamento não afetou o número total de eosinófilos e o conteúdo de fibras colágenas. Este trabalho sugere que o óxido nítrico contribui para a constrição do parênquima pulmonar e para a deposição de fibras elásticas neste modelo. Estes efeitos foram associados à ativação de iNOS e nNOS em células do parênquima distal e aumento na via do estresse oxidativo / The importance of lung tissue mechanical responses in asthma pathophysiology has been recently recognized. Although nitric oxide (NO) is a mediator that controls smooth muscle tonus control in the airways, its effects on lung tissue responsiveness has not been previously investigated. We hypothesized that chronic nitric oxide synthase inhibition by L-NAME (false substrate for all nitric oxide synthases) treatment may modulate lung tissue mechanics, eosinophilic recruitment and extracellular matrix remodeling in a model of chronic pulmonary allergic inflammation. Guinea pigs were submitted to seven normal saline or ovalbumin exposures with increasing doses (1~5mg/mL-4weeks) and treated or not with L-NAME in drinking water. Seventy-two hours after the seventh inhalation the animals were anesthetized, exsanguinated, and oscillatory mechanics of lung tissue strips was performed in baseline condition and after ovalbumin challenge (0.1%). Using morphometry, we assessed the density of eosinophils, the number of iNOS and nNOS-positive cells, the density of actin, the collagen and elastic fibers content and the volume proportion of 8-iso-PGF2 in the alveolar septa. Ovalbumin-exposed animals presented an increase in baseline and maximal tissue resistance and elastance responses, eosinophil density, in the number of iNOS and nNOS positive cells, in the amount of collagen and elastic fibers and in the volume proportion of 8-iso-PGF2 in the alveolar septa compared to controls (p<0.05). L-NAME treatment in ovalbumin-exposed animals attenuated all lung tissue mechanical responses (p<0.01), reduced the number of iNOS and nNOS positive cells (p<0.01), elastic fiber content (p<0.001) and 8-isoPGF2 in the alveolar septa (p<0.001). However, this treatment did not affect the total number of eosinophils and collagen deposition. These data suggest that NO contributes to distal lung parenchyma constriction and to elastic fibers deposition in this model. These effects were associated to iNOS and nNOS activation in pulmonary parenchyma and with an increase in oxidative stress pathway activation

A prevalência de sintomas de asma, broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE), hiperresponsividade brônquica (HRB) e alergia em atletas que praticam modalidades de alto rendimento e longa duração tem aumentado nas últimas décadas e tem sido estudada principalmente em atletas de inverno e nadadores. No entanto, a prevalência de sintomas de asma e alergia e os mecanismos inflamatórios envolvidos no BIE que ocorre em corredores de longa distância permanecem pouco conhecidos. Objetivos: O presente estudo tem como objetivo avaliar a prevalência de sintomas de asma e alergia em corredores de longa distância de elite e investigar os mecanismos inflamatórios envolvidos no BIE nos atletas sem histórico de asma. Casuística e Métodos: Este estudo foi realizado em duas fases: na Fase I, foi avaliada a prevalência de sintomas de asma e alergia em 201 corredores de longa distância, através da aplicação dos questionários ISAAC e AQUA©. Na Fase II, foram avaliados os mecanismos inflamatórios envolvidos no BIE de 40 corredores que não apresentaram sintomas de asma na Fase I e que foram selecionados aleatoriamente. Nesta fase, os atletas compareceram ao laboratório em três momentos, com intervalo máximo de duas semanas entre cada visita, e foram submetidos às seguintes avaliações 1º) escarro induzido e teste cardiopulmonar máximo, 2º) broncoprovocação por metacolina e, 3º) óxido nítrico no ar exalado (FeNO), metabólitos LTE4 e 9alfa, 11beta-PGF2 e teste de hiperventilação eucápnica voluntária (HEV). Resultados: A prevalência de sintomas de asma e alergia foi de 6,5% e 60,5%, respectivamente. Ao analisar as questões do AQUA©, observou-se alta frequência de sintomas de BIE (62,3%) e rinite (56,6%). Os sintomas de alergia não foram associados a variáveis como gênero, idade, experiência em corridas de longa distância, volume de treinamento semanal e desempenho em provas de meia maratona e maratona. Verificou-se ainda que a prevalência de BIE foi de 27,5%. Quando comparados os atletas BIE+ e BIE- não foram observadas diferenças nos valores de VEF1 absoluto, nas medidas antropométricas, nas características de treinamento e também no desempenho. Os atletas BIE+ relataram mais sintomas de alergia (p=0,03), se mostraram mais responsivos à metacolina (p=0,01), apresentaram maior porcentagem de eosinófilos no escarro (p=0,03) e níveis mais elevados de FeNO (p < 0,001*) quando comparados aos atletas BIE-. Os níveis urinários de LTE4 e 9alfa, 11beta-PGF2 basais e após 60 minutos do teste de HEV foram similares entre os grupos BIE+ e BIE-, no entanto, ao comparar os níveis destes mediadores antes e após o teste de HEV, observou-se uma diminuição nos níveis de LTE4, apenas nos atletas BIE- (p=0,04). Conclusões: Corredores de longa distância apresentam elevada prevalência de sintomas de alergia e BIE e baixa prevalência de sintomas de asma. Além disto, os atletas BIE+ referem mais sintomas de alergia, são mais hiperresponsivos à metacolina, apresentam um padrão inflamatório eosinofílico e elevados níveis de FeNO embora sem diferenças nos níveis basais dos metabólitos do mastócito / An increased prevalence of asthma and allergic symptoms, exercise-induced bronchoconstriction (EIB) and bronchial hyperresponsiveness (BHR) has been observed in elite and endurance athletes, especially winter sports athletes and swimmers. However, the occurrence of allergy symptoms and the inflammatory mechanisms involved in the EIB that occurs in long distance runners remains poorly known. Objectives: the aims of the present study were to assess the prevalence of symptoms of asthma and allergy in long distance runners and to investigate possible inflammatory mediators involved in the EIB that occurs in those without asthma history. Methods: This cross sectional study was performed in two phases. In Phase I, the prevalence of symptoms of asthma and allergy was assessed in 201 long distance runners using ISAAC and AQUA© questionnaires. In Phase II, 40 athletes were randomly selected among those who did not present asthma history and they performed the following measurements: induced sputum, cardiopulmonary exercise testing, methacholine bronchoprovocation challenge, exhaled nitric oxide (FeNO), urinary collection to quantify LTE4 and 9alfa, 11beta-PGF2 metabolites and eucapnic voluntary hyperventilation test (EVH). Results: The prevalence of asthma and allergy symptoms was 6.5% and 60.5%, respectively. In addition, we observed a high frequency of EIB symptoms (62.3%) and rhinitis (56.6%). Allergy symptoms were not associated with anthropometric characteristics, running experience, weekly training volume and best half-marathon and marathon performance. The prevalence of EIB was 27.5% and no difference in baseline lung function, anthropometric data as well as training and performance characteristics was observed between athletes with (EIB+) and without (EIB-) EIB. EIB+ athletes reported more allergy symptoms (p=0.03) and were more resposive to methacholine (p=0.01) than EIB- athletes. A higher percentage of eosinophils in the induced sputum (p=0.03) and levels of FeNO (p < 0.001*) were observed in EIB+ athletes. However, there was no difference in the urinary levels of LTE4 and 9alfa, 11beta-PGF2 either at baseline or after EVH test. Conclusions: Long distance runners have a high prevalence of allergy symptoms and EIB and a low prevalence of asthma symptoms. Moreover, EIB+ athletes report more symptoms of allergy and present airway hyperresponsiveness, eosinophilic inflammation and increased levels of exhaled nitric oxide, without difference in the baseline levels of mast cell metabolites

INTRODUÇÃO: A rinite alérgica é uma condição clínica comum que apresenta sintomas diversos num significante número de pacientes, deteriorando a qualidade de vida daqueles refratários aos tratamentos usuais (anti-histamínicos e corticosteróides nasais tópicos). Apresentando princípios curativos similares, a imunoterapia sublingual e a homeopatia podem reduzir os sintomas e a necessidade de medicamentos na rinite alérgica, embora a eficácia e a efetividade de ambas terapêuticas não sejam ainda suficientemente conhecidas. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade clínica do tratamento homeopático individualizado prolongado, comparativamente ao placebo, em adultos portadores de rinite alérgica perene. MÉTODOS: Um total de 41 pacientes com rinite alérgica perene foi alocado numa primeira fase duplo-cego e placebo-controlada durante seis meses, sendo tratada com doses sublinguais semanais de medicamentos homeopáticos individualizados ou placebo. Após esta fase inicial fechada, todos os pacientes foram convidados a participar de uma segunda fase controlada aberta, em que receberiam tratamento homeopático pelo período máximo de 36 meses, e os resultados foram comparados com a melhora da fase inicial. O escore dos sinais e sintomas, a necessidade de medicamentos de resgate e a qualidade de vida foram mensurados por questionários e avaliações clínicas pessoais, aplicadas por um mesmo avaliador independente, antes e após cada fase. As doses dos medicamentos homeopáticos e de resgate utilizados, assim como os efeitos colaterais, foram documentados num diário pessoal. Os desfechos clínicos primário e secundários foram, respectivamente, os escores dos sinais e sintomas alérgicos específicos e gerais. Títulos da IgE total foram mensurados antes e após cada fase. RESULTADOS: Após os seis meses da fase placebo-controlada inicial, na análise por protocolo de todos os pacientes incluídos no estudo, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos ativo e placebo nos escores clínicos, na utilização de drogas de resgate, na qualidade de vida e nos títulos da IgE total. Entretanto, as análises dos subgrupos da segunda fase mostraram uma crescente e significativa melhora nos desfechos clínicos primário e secundários após 12 meses de tratamento homeopático individualizado, comparativamente à variação de melhora dos mesmos pacientes na fase inicial fechada. Diferença significativa na qualidade de vida foi observada apenas após o segundo ano de tratamento homeopático. CONCLUSÃO: Neste estudo, o tratamento homeopático foi acompanhado de um significante efeito placebo. A efetividade da homeopatia pôde ser observada após 12 meses da terapêutica, apresentando efeito preventivo de longa duração após 36 meses de tratamento homeopático individualizado. / INTRODUCTION: Allergic rhinitis is a common clinical condition which presented several symptoms in a significant number of patients, deteriorating the quality of life in those resistant to the usual treatments (antihistamines and topical nasal corticosteroids). Presenting similar curative principles, sublingual immunotherapy and homeopathy can reduce symptoms and medication requirements in allergic rhinitis, although the efficacy and effectiveness of both therapeutics are not still sufficiently known. OBJECTIVES: The objective of this study was to evaluate clinical effectiveness of prolonged individualized homeopathic treatment, compared with placebo, in adults with perennial allergic rhinitis. METHODS: A total of 41 adults with perennial allergic rhinitis were enrolled in a first double-blind placebo-controlled phase for six months, and treated on a weekly basis with sublingual doses of single individualized homeopathic medicines or placebo. After this closed initial phase, all patients were invited to participate in an open label controlled phase, in that they would receive homeopathic treatment for the maximum period of 36 months, and the results were compared with the improvement of the initial phase. Signs and symptoms scores, rescue medication requirements and quality of life were assessed by questionnaires and personal clinical evaluation by a same independent researcher, before and after each phase. Applied homeopathic and rescue drugs dosage, and side effects were documented by diary cards. Primary and secondary clinical outcome were, respectively, specific and general allergic signs and symptoms scores. Total IgE titles were performed before and after each phase. RESULTS: After six months of placebo-controlled phase, analyzing all patients included in the study per protocol, we observed no significant difference between treatment and placebo groups in primary and secondary clinical outcomes, use of rescue drugs, quality of life and total IgE. However, second phase subgroups analysis showed a significant and growing improvement of clinical symptoms after 12 months of individualized homeopathic treatment, comparatively to the same patients\' variation in closed initial phase. Significant difference in quality of life score were observed only after second homeopathic treatment year. CONCLUSION: In this study, homeopathic treatment was accompanied by a significant placebo effect. Effectiveness of homeopathy could be seen after 12 months of therapy, presenting preventive effect of long duration after 36 months of individualized homeopathic treatment.