Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Januaria.pdf: 2695991 bytes, checksum: fea39a26b7b89cfb880fab37ea0fafc6 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / In this research, we aimed to evaluate the digestible lysine levels in pre-starter diets in the histomorphological development of 18-day embryos and newborn chicks. The performance until 21 days and dry matter digestibility and nitrogen balance in pre-starter rations and allometry of digestible and immune organs until 14 days of age. Three experiments were performed in the Avian facilities and in the Preventive Veterinary Medicine Department of the Veterinary and Animal Science College of the Federal University of Goiás, Brazil, with fertile eggs obtained from breeders in different ages and eggs with different weights at the moment of hatching. In experiment 1, effect of breeder ages and egg weights in the internal quality was evaluated during incubation period and its relation with embryo development until hatch. In experiment 2 digestible lysine supplementation in pre-starter diets for chicks hatched from eggs of different breeder ages and in experiment 3 for chicks obtained from eggs with different weights at the first day of hatching period. A total of 320 day-old chicks were allotted in each experiment in a completely randomized design and factorial arrangement 2X4 (breeder age: 34 and 52 weeks or egg weight: 56-65g and 66-72g and digestible lysine levels: 1.1; 1.2; 1.3 and 1.4%). Embryos and newborn chicks were necropsied at 18 days of incubation, at seven and 14 days after hatch, and collected samples of the small intestine (duodenum e jejunum) to prepare histological slides and gastrointestinal organs weighed. At hatch, chicks were weighed and allotted in battery cages from four to seven days of age and the metabolic assay performed in total excreta collection. Performance variables performed were final chick weight, weight gain, feed intake and ffed conversion. Nitrogen balance and nitrogen and dry matter coefficientwere calculated. Villus height and crypt depth were determined in histological sldes of duodenum and jejunum. Data were submmited to variance analysis and polynomial regression performed for digestible lysine levels. In experiment 1, breeder age and egg weight showed negative correlations with Haugh unit and positive correlation to percenual of albumen, yolk and eggshell, with embryo weight at 18 days of incubation and chick weight at hatch. In experiment 2, no interaction was observed between breeder age and digestible lysine levels in pre-starter rations. Chicks from older breeders showed better performance. In experiment 3, performance and digestibility were not affected by the increasing levels of digestible lysine in diets or egg weights at the moment of hatch. / Objetivou-se, com o presente trabalho, avaliar a suplementação de lisina digestível na ração no desenvolvimento histomorfológico de embriões com 18 dias de incubação, pintos neonatos e pintos na fase pré-inicial de produção. Avaliou-se, também, o desempenho das aves até 21 dias de idades e a digestibilidade da matéria seca e balanço de nitrogênio na fase pré-inicial e a alometria dos órgãos do aparelho digestório e sistema imune até 14 dias de vida. Realizaram-se três experimentos no Aviário Experimental e no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás com ovos embrionados provenientes de matrizes com diferentes idades e ovos com diferentes pesos no início da incubação. No experimento 1, avaliou-se o efeito da idade da matriz e peso do ovo na qualidade interna dos ovos. Realizou-se a análise física dos ovos nas duas categorias em estudo (idade de matriz e peso de ovo) e durante a incubação verificou-se o desenvolvimento dos embriões até a eclosão. No experimento 2 foi avaliada a suplementação de lisina digestível em pintos de corte provenientes de matrizes com diferentes idades e no experimento 3 essa mesma suplementação foi testada em pintos de corte provenientes de ovos com diferentes pesos no momento da incubação. Foram utilizados 320 pintos para cada experimento. O delineamento experimental adotado foi DIC e esquema fatorial 2X4 (idade de matriz: 34 e 52 semanas ou peso de ovo: 56-65g e 66-72g e níveis de lisina digestível: 1,1; 1,2; 1,3 e 1,4%). Foram realizadas necropsias em embriões com 18 dias de incubação, em pintos neonatos e depois aos sete e 14 dias de vida das aves, período em que foram coletadas amostras do intestino delgado (duodeno e jejuno) para montagem de lâminas histológicas e pesagem dos órgãos do trato gastrointestinal (TGI). Ao nascimento, as aves foram pesadas e distribuídas em baterias de aço galvanizado e no período de quatro a sete dias foi realizado ensaio metabólico pelo método de coleta total de excretas. As características de desempenho avaliadas foram peso médio final, ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar. Foi determinado o balanço de nitrogênio, o coeficiente de digestibilidade de matéria seca e coeficiente de digestibilidade do nitrogênio. Para histomorfometria, foi verificada a altura de vilo e a profundidade de cripta do duodeno e do jejuno. Os dados foram submetidos à análise de variância e para os níveis de lisina digestível foi aplicada a regressão polinomial. No experimento 1 verificou que a idade da matriz e o peso do ovo têm correlação negativa com a unidade Haugh e correlação positiva com a porcentagem de albúmen, de gema, de casca, com o peso do embrião, com o peso do ovo aos 18 dias de incubação e com peso do pinto ao nascimento. No experimento 2 não se verificou interação entre idade da matriz e níveis crescentes de lisina na ração, os pintos provenientes de matrizes velhas apresentaram melhor desempenho. No experimento 3, o desempenho e a digestibilidade não foram afetados pelos níveis crescentes de lisina digestível na ração ou pelo peso dos ovos no momento da incubação.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-01-30T10:42:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-30T12:42:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-30T12:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / We aimed to evaluate digestible tryptophan level in males and females broilers on pre-initial (one to seven days old) and initial phase (eight to 21 days old) diets. Four experiments were conducted, one with males on pre-initial phase, one with males on initial phase, another with females on pre-initial and one with females on initial phase. The design was completely randomized with four treatments, five replicates with ten animals each, where each repetition consists an experimental unit. In the experiment, tryptophan requirement was determined using diets with different digestible tryptophan levels. A deficient tryptophan diet was formulated, considered the basal diet, which was supplemented with L -tryptophan replacing inert material in order to achieve digestible tryptophan desirable levels. The treatments of experiment 1 consisted of: T1 - 0.209% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.223% digestible tryptophan diet; T3 - 0.235% digestible tryptophan diet; T4 - 0.248% digestible tryptophan diet for male broilers in preinitial phase; Treatments for experiment 2 were: T1 - 0.187% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.200% digestible tryptophan diet; T3 - 0.211% digestible tryptophan diet; T4 - 0.223% digestible tryptophan diet for male broilers on initial phase; Treatments for experiment 3 are: T1 - 0.212% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.225% digestible tryptophan diet; T3 - 0.238% digestible tryptophan diet; T4 - 0.252% digestible tryptophan diet for female chickens cut i n pre-starter; Treatments for experiment 4 are: T1 - diets with 0.186% digestible tryptophan (basal diet); T2 - diet with 0.198% digestible tryptophan; T3 - diet with 0.209% digestible tryptophan; T4 - diet with 0.221% digestible tryptophan for female broiler chickens on initial phase. Diets were formulated with corn, soybean meal, poultry gut meal and bone meal, supplemented with industrial amino acid LLysine, DL-methionine, L-threonine, L-arginine, L-valine, and L-tryptophan. Feed intake, weight gain, feed conversion, as well as nutrients digestibility evaluation was performed. Performance and diet nutrients metabolism data were subjected to variance analysis (ANOVA). Digestible tryptophan levels estimates were made by linear models and quadratic regression at 5% probability. SAS 9.2 was used. After analyzing obtained data, it was found that; amino acid supplementation did not affect broilers of neither sex performance. Digestible tryptophan levels for male broilers on pre-initial phase of 0.209% and on initial phase of 0.187%, and digestible tryptophan levels for female broilers in pre-initial of 0,212% and on initial phase of 0,186% is recommended. / Objetivou-se avaliar o nível de triptofano digestível nas rações de frangos de corte machos e fêmeas nas fases pré-inicial (um a sete dias de idade) e inicial (oito a 21 dias de idade). Foram realizados quatro experimentos, sendo o experimento 1 com machos na fase pré-inicial, experimento 2 com machos na fase inicial, experimento 3 com fêmeas na fase pré-inicial e experimento 4 com fêmeas na fase inicial. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos, cinco repetições e dez animais por repetição, em que cada repetição compreendia a uma unidade experimental. Nos experimentos a exigência de triptofano foi determinada utilizando dietas com diferentes níveis de triptofano digestível. Foi formulada uma ração com deficiência em triptofano, considerada a ração basal, a qual foi suplementada com L-triptofano em substituição ao material inerte com o objetivo de alcançar os níveis de triptofano digestível desejáveis. Os tratamentos do experimento 1 consistiram em: T1 – dieta com 0,209% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,223% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,235% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,248% de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase pré-inicial; Os tratamentos para o experimento 2 foram : T1 – dieta com 0,187% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,200% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,211% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,223% de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase inicial; Os tratamentos para o experimento 3 são: T1 – dieta com 0,212% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,225% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,238% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,252% de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase pré-inicial; Os tratamentos para o experimento 4 consistem em: T1 – dietas com 0,186% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,198% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,209% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,221% de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase inicial. As rações foram formuladas contendo milho, farelo de soja, farinha de vísceras de aves e farinha de carne e osso, suplementada com os aminoácidos industriais L-Lisina, DL-metionina, L-treonina, L-arginina, L-valina, e L-triptofano. Foram avaliados o consumo de ração, o ganho de peso e a conversão alimentar, bem como foi realizada a avaliação da digestibilidade dos nutrientes das rações. Os dados de desempenho e metabolização dos nutrientes da ração foram submetidos à análise de variância (ANOVA). As estimativas dos níveis de triptofano digestível foram efetuadas através dos modelos de regressão linear e quadrática, em nível de 5% de probabilidade. Foi utilizado o programa SAS 9.2. Após análise dos dados obtidos nesse estudo, verificou-se que a suplementação aminoacídica não influenciou o desempenho dos frangos de corte de ambos os sexos. Recomenda-se níveis de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase pré-inicial de 0,209% e na fase inicial de 0,187%, e níveis de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase pré-inicial de 0,212% e na fase inicial de 0,186%.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-03-29T17:45:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tayrone Freitas Prado - 2013.pdf: 757178 bytes, checksum: d6b50701d112877be8caf02e9e4712b0 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-04T10:31:09Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tayrone Freitas Prado - 2013.pdf: 757178 bytes, checksum: d6b50701d112877be8caf02e9e4712b0 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-04T10:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Tayrone Freitas Prado - 2013.pdf: 757178 bytes, checksum: d6b50701d112877be8caf02e9e4712b0 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2013-03-25 / The sheep production in Brazil was always marginal to production of cattle, being the heritage of our colonization. However in recent years the rearing of sheep have been leveraged by demand for lamb meat. So has fetched the production of quality meat, from young animals. To achieve this quality level the intensification of rearing systems with the feedlot finishing is required. However the feedlot finishing is more costly than conventional finishing systems, being necessary to seek food and food additives that bring greater feed efficiency in the system. The purpose of this study was to evaluate the inclusion of amylolytic enzyme (ENZ), protected lysine (LIS), lysophospholipid (LYP) and protected methionine (MET) in a high concentrate diet control (CON) with ground corn meal and cottonseed meal to lambs. We sought to evaluate the ponderal performance at feedlot, quantitative characteristics of the carcass at slaughter, in vitro degradability of dry matter (DIVMS) of the diets and cumulative gas production in vitro. Were used 80 male lambs, not castrated with 20,57 ± 4,33 kg live weight (PV), crossbred Dorper x Santa Ines, being 60 slaughtered at the end of the experiment to evaluate the quantitative characteristics of the carcass. The animals were confined in 20 pens with four lambs each for a period of 64 days and treated twice daily at 7 a.m. and at 5 p.m. In the DIVMS the samples were incubated for 0, 3, 6, 12, 24 and 48 hours at 39°C under anaerobic conditions. Was calculated the degradability of dry matter (MS), estimating the parameters for the construction of degradability curves. The in vitro gas production was determined in the incubation times of 3, 6, 9, 12, 16, 24, 32, 48 and 72 hours, and compared the use of bovine and ovine ruminal fluid. There was no change in the quantitative characteristics of carcass how weight at slaughter (PA), hot carcass weight (PCQ), cold carcass weight (PCF), hot carcass yield (RCQ), cold carcass yield (RCF) and chilling loss (PPR) as result of the use of additives. There was a high correlation of PA with PCQ and PCF. However negative correlations were observed of the PA with RCQ, RCF and PPR, with lower correlation coefficients. Better performances were achieved with feedlot lambs feeding diets with the addition of ENZ and LYP, in the finishing phase. The inclusion of LYP increased DIVMS of diet, and MET decreases this variable. The gas production was greater in sheep inoculum until 48 hours of fermentation, there was no difference in time of 72 hours. The addition of ENZ increased the gases production only until 24 hours of fermentation, but after this period none of the additives tested increased the gases production. / A produção de ovinos no Brasil foi sempre marginal a produção de bovinos, sendo herança da nossa colonização. No entanto nos últimos anos a criação de ovinos tem sido alavancada pela demanda de carne de cordeiro. Assim se tem buscado a produção de carne de qualidade, proveniente de animais jovens. Para se alcançar este patamar de qualidade a intensificação dos sistemas de criação com a terminação em confinamento se faz necessária. Contudo a terminação em confinamento é mais onerosa do que a terminação em sistemas convencionais, sendo necessário que se busque alimentos e aditivos alimentares que tragam maior eficiência alimentar ao sistema. Objetivou-se neste trabalho avaliar a inclusão de enzima amilolítica (ENZ), lisina protegida (LIS), lisofosfolipídeo (LYP) e metionina protegida (MET) em uma dieta de alto concentrado (CON) com milho grão moído e torta de algodão para cordeiros. Buscou-se avaliar o desempenho ponderal no confinamento, características quantitativas da carcaça no abate, degradabilidade in vitro da matéria seca (DIVMS) das dietas e produção cumulativa de gases in vitro. Foram utilizados 80 cordeiros machos, não castrados, com 20,57 ± 4,33 kg de peso vivo (PV) mestiços Dorper x Santa Inês, sendo que 60 foram abatidos ao final do experimento para se avaliar as características quantitativas da carcaça. Os animais foram confinados em 20 baias coletivas com quatro cordeiros cada, por um período de 64 dias, sendo tratados duas vezes ao dia as 7 h e 17 h. Na DIVMS as amostras foram incubadas por 0, 3, 6, 12, 24 e 48 horas a 39°C, em meio anaeróbio. Foi efetuado o cálculo da degradabilidade da matéria seca (MS), estimando os parâmetros para a construção das curvas de degradabilidade. A produção de gases in vitro foi determinada nos tempos de incubação de 3, 6, 9, 12, 16, 24, 32, 48 e 72 horas, sendo comparado o uso de líquido ruminal bovino e ovino. Não foi observada nenhuma alteração nas características quantitativas da carcaça tais como peso de abate (PA), peso de carcaça quente (PCQ), peso de carcaça fria (PCF), rendimento de carcaça quente (RCQ), rendimento de carcaça fria (RCF) e perda pelo resfriamento (PPR) em consequência do uso dos aditivos. Observou-se alta correlação do PA com PCQ e PCF. No entanto correlações negativas foram observadas do PA com RCQ, RCF e PPR, com menores coeficientes de correlação. Melhores desempenhos ponderais podem ser alcançados com cordeiros confinados recebendo dietas com a adição de ENZ e LYP, na fase de terminação. A inclusão de LYP aumentou a DIVMS da dieta, sendo que MET diminui esta variável. A produção de gases foi maior em inóculo ovino até 48 horas de fermentação, não havendo diferença no tempo de 72 horas. A adição de ENZ incrementou a produção de gases somente até 24 horas de fermentação, mas após este período nenhum dos aditivos testados aumentou a produção de gases.

Este estudo teve como objetivo avaliar relações de valina:lisina digestíveis em dietas com teor reduzido de proteína bruta e os efeitos desta redução sobre desempenho e rendimento de carcaça em frangos de corte. Foram utilizados 1200 pintos machos de um dia de idade, seguindo modelo inteiramente casualizado, com seis tratamentos de seis repetições (exceto controle, com 10 repetições), compostos por 30 aves cada. O tratamento controle (T1) foi formulado seguindo os níveis de proteína bruta (PB) e aminoácidos (AAs) recomendados e os demais tratamentos (T2 a T6) tiveram seus níveis de PB reduzidos (4% em relação ao controle) e variaram em função da relação valina:lisina digestíveis, com 5 níveis equidistantes com intervalos de 0,07:1, variando de 0,63:1 e 0,91:1 em dietas até 21 dias, e 0,64:1 e 0,92:1 em dietas após 21 dias, respectivamente. Foram mensurados as seguintes características de desempenho: ganho de peso, consumo de ração, conversão alimentar, viabilidade criatória e índice de eficiência produtiva. Aos 46 dias de idade seis animais por repetição foram abatidos para determinação de rendimento de carcaça e de cortes comerciais. A cama também foi colhida no começo e final do experimento e seus níveis de nitrogênio analisados para determinação do nitrogênio excretado. As diferentes relações valina:lisina digestíveis não influenciaram o desempenho dos animais (P>0,05), porém afetaram o rendimento de peito, com relação ótima de valina:lisina digestíveis de 0,75. A redução proteica piorou o desempenho dos animais (P≤0,05) durante as primeiras três semanas de criação. Porém após este período tal prejuízo no desempenho não é visualizado. / This study aimed to evaluate relationships valine: lysine in diets with reduced content of crude protein and the effects of this reduction on performance and carcass yield of broiler chickens. Male chicks were used in 1200 than a day old, following complete randomized design with six treatments with six replications (except control, with 10 repetitions), composed of 30 chicks each. The control treatment (T1) was formulated following levels of crude protein (CP) and amino acids (AAs) and other recommended treatments (T2 to T6) had reduced levels of CP (4% compared to control) and varied according the ratio valine: lysine with 5 levels of 0,07:1 equidistant intervals ranging from 0,63:1 and 0,91:1 in the diet up to 21 days, and 0.92 0,64:1: 1 after 21 days on diets, respectively. We measured the following performance characteristics: weight gain, feed intake, feed conversion, viability and productive efficiency. At 46 days of age six animals per replicate were slaughtered for determination of carcass and commercial cuts. The bed was also collected at the beginning and end of the experiment and their levels of nitrogen analyzed for nitrogen excreted. The different relationships valine: lysine did not affect animal performance (P> 0.05), but they affected breast yield, compared with optimal valine: lysine 0.75. Reducing protein worsened performance of animals (P ≤ 0.05) during the first three weeks of creation. But after this period such impairment in performance is not displayed.

Protozoários do gênero Leishmania são parasitas digenéticos, com uma fase no tubo digestório de um hospedeiro invertebrado (promastigota), e uma fase parasita intracelular de macrófagos (amastigotas). Estudar a demanda de L-arginina no parasita é interessante, uma vez que o aminoácido é indispensável para a sobrevida do parasita e, ao mesmo tempo, serve de substrato para a produção de óxido nítrico, principal composto microbicida dos macrófagos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis do ponto de vista fisiológico e caracterizar o gene que codifica o transportador do aminoácido, bem como a regulação da sua expressão em resposta a diferentes condições biológicas. Para medir o influxo de L-arginina em fagolisossomos, utilizamos macrófagos J774 infectados com L. (L.) amazonensis e desenvolvemos uma metodologia com citometria de fluxo com sorting para a purificação da organela. Validamos microscopicamente a presença do parasita na organela por sua fluorescência, e avaliamos a integridade da membrana externa dessa com marcador de pH ácido. Paralelamente, o gene que codifica o transportador de arginina do parasita foi caracterizado. Foram encontradas duas cópias em tandem que produzem dois transcritos (5.1AAP3 e 4.7AAP3), cujas regiões 5\'UTR e 3\'UTR são diferentes. Por meio de PCR quantitativo em tempo real, avaliamos a expressão desses transcritos e verificamos que 5.1AAP3 é mais expressa ao longo do desenvolvimento do parasita, com um máximo em fase estacionária. A determinação da meia-vida dos mRNA das duas cópias indicou uma duração de 32,6±5,0min para o mRNA de 4.7AAP3, enquanto que o de 5.1AAP3 não apresentou decaimento até 180min do estudo, evidenciando que a estabilidade maior pode ser a razão de sua maior abundância. A submissão de parasitas à privação de arginina levou a aumento na tomada do aminoácido concomitante ao aumento do transcrito 5.1AAP3. Mutantes nulos de arginase submetidos à privação de arginina respondem com uma taxa de incorporação mais baixa em relação aos parasitas selvagens, e mantém a resposta à privação mesmo com os parasitas em fase estacionária, diferente do observado nos parasitas selvagens. Esse conjunto de resultados nos levou a sugerir que a expressão do transportador pode ser regulada pela estabilidade do mRNA, e que o pool de arginina interno ao parasita pode controlar, num mecanismo de retroalimentação negativo, a expressão de seu transportador. / Protozoan of genus Leishmania are digenetic parasites that present a stage in the life in insect gut (promastigotes) and an intracellular phase (amastigotes) inside vertebrate host macrophages. The study of L-arginine influx consists in an interesting matter, since the amino acid is used on NO production pathway (the main macrophage microbial pathway) but are also important for parasites survival. The aim of this work was to perform a genetic and physiological characterization of the arginine transport in Leishmania (Leishmania) amazonensis. To verify how does the arginine uptake occurs in the phagolisosomes, we used J774 macrophages infected with L. (L.) amazonensis to establish a flow cytometry sorting protocol to purify the organelle. Microscopic validation of organelle integrity was achieved by acidic pH marker treatment and detection of fluorescent parasites. The arginine transporter coding gene was characterized. We found two copies in tandem that produces two transcripts, named 5.1AAP3 and 4.7AAP3, with distinct 5\'UTR and 3\'UTR. By quantitative real time PCR we found that 5.1AAP3 mRNA expression varies along parasite development. This copy was, also, more abundant than 4.7AAP3 mRNA. This last mRNA showed a half-life of 32.6±5.0 min, while the 5.1AAP3 mRNA did not decay until 180min. As response to arginine starvation, wild type parasites increase the uptake of arginine, as well as the abundance of 5.1AAP3 mRNA. Arginase null parasites starvation responses showed lower arginine uptake rates compared to wild type responses. Unlike wild type, the null mutants also respond to starvation in stationary phase. This data set allow us to propose that arginine internal pool can downregulate its transporter expression in a feed-back mechanism.

Neste trabalho foi realizada a síntese de amidas, bem como de ácidos e ésteres borônicos, derivados dos aminoácidos L-cistina e L-cisteína, através de rota sintética simples, curta e de baixo custo, com o intuito de busca e a identificação de novo(s) inibidor(es) do proteassomo 20S. Esta classe de compostos possui estrutura que permite a inserção de diversos grupos funcionais, o que confere versatilidade e a construção de biblioteca de compostos que contém partes hidrofílicas e hidrofóbicas importantes para posterior avaliação inibitória. Para tanto, empregou-se rota sintética química convencional e rota biocatalisada para a formação da ligação amida. Os compostos derivados de L-cisteína foram obtidos via síntese clássica de peptídeos a qual forneceu os compostos desejados em rendimentos de até 85%. Por outro lado, tentativas de obtenção das amidas via biocatálise não se mostraram efetivas. Já amidas derivadas de L-cistina foram obtidas em rendimentos de até 79%, via síntese tradicional e até 100% de conversão através de rota biocatalítica. A inserção do átomo de boro nas estruturas se deu utilizando-se metodologias sintéticas já bem estabelecidas na literatura. Os ésteres borônicos derivados de L-cisteína foram obtidos em bons rendimentos (até 78%), enquanto que não foi possível obter-se compostos de boro derivados de L-cistina. Por sua vez, os compostos contendo ácido borônico na estrutura foram sintetizados via reação de hidrólise dos respectivos ésteres borônicos, em rendimentos moderados (até 34%). Após a obtenção dos compostos contendo grupamentos organoboro realizou-se avaliação inibitória dos mesmos frente ao proteassomo 20S. Valores de IC50 iguais a 52 µM foram obtidos para composto derivado de L-cisteína contendo grupamento éster borônico, que se mostraram inibidores moderados e reversíveis. Ácidos borônicos se mostraram sem capacidade de inibir o proteassomo 20S. Adicionalmente, realizaram-se estudos de modelagem molecular com a finalidade de elucidar os resultados obtidos experimentalmente. Inicialmente realizaram-se cálculos de modelagem molecular através da realização de docking de alguns compostos e após geração de modelo farmacofórico. De maneira geral observou-se que os inibidores derivados da L-cisteína não ocupam a mesma cavidade que o fármaco bortezomibe, o que pode explicar a diferença na atividade dos compostos frente à inibição do proteassomo 20S. Também se observou que, tendo-se a interação dos inibidores com a enzima, a vizinhança do átomo de boro tem grande influência na capacidade inibitória, uma vez que estes grupamentos determinam qual a região da cavidade do proteassomo 20S será ocupada pelo inibidor. / In our study, amides, boronic acids and esters derivatives from L-cysteine and L-cysteine were synthesized by simple, short and inexpensive synthetic route, in order to search for new inhibitor(s) of the 20S proteasome. This class of compounds has a structure that allows inclusion of various functional groups, giving it versatility and allowing the construction of library compounds containing hydrophilic and hydrophobic moieties, important for further evaluation. To this end, we used conventional chemical synthetic route and biocatalysis for peptide bond formation. The compounds derived from L-cysteine were obtained by classical synthesis of peptides which provided the desired compounds up to 85% yields. On the other hand, attempts to obtain the amides via biocatalysis were not effective. However, amides derived from L-cystine were obtained with up to 79% yields via chemical synthesis and conversion up to 100% using biocatalytic route. The insertion of the boron atom in the structures was possible using synthetic methodologies well established in literature. Boronic esters derived from L-cysteine were obtained in good yields (up to 78%), whereas it was not possible to obtain boron compounds derived from L-cystine. In turn, compounds containing boronic acids in the structure were synthesized by hydrolysis reaction of the respective boronic esters in moderate yields (up to 34%). With organoboron compounds in hand, we turned our attention to inhibitory assessment against the 20S proteasome. IC50 up to 52 µM were obtained when L-cysteine boronic ester derivatives were evaluated. These compounds are moderate and reversible inhibitors. L-cysteine boronic acids derivatives have shown not ability to inhibit the 20S proteasome. Additionally, molecular modeling studies were carried out in order to elucidate the results obtained experimentally. Initially molecular modeling calculations were carried out by performing docking experiments of some compounds. Generation of pharmacophoric model calculations was also executed. In general, it was observed that inhibitors derived from L-cysteine do not occupy the same cavity that drug bortezomib, which may explain the difference in the activity of compounds against the inhibition of 20S proteasome. We also observed that, with the interaction of inhibitors and enzyme, the side chains around boron atom has a great influence on inhibitory capacity, since these groups determine which region of the 20S proteasome cavity is occupied by the inhibitor.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

Neste trabalho descrevemos o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional de uma L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, proteína esta denominada BjussuLAAO. O isolamento foi realizado pela combinação de três etapas cromatográficas, utilizando filtração molecular em Sephadex G-75, seguida de cromatografia de afinidade em Benzamidina-Sepharose, seguida pela última etapa cromatográfica, realizada com interação hidrofóbica em Fenil-Sepharose. A BjussuLAAO é uma proteína com massa molecular de 61 kDa e pI 5,8, e apresentou alta similaridade sequencial com as LAAOs já isoladas dos venenos de serpentes. A enzima BjussuLAAO induziu edema apenas na maior dose (100 ?g/animal), não apresentou atividade miotóxica, também não apresentou atividade hemorrágica, mesmo nas doses mais elevadas. A BjussuLAAO, demonstrou ter efeito coagulante e ação fibrinogenolítica e, mesmo utilizando inibidores de metaloproteases e serino proteases, continuou apresentando tal atividade, demonstrando assim não existir contaminantes destas classes de proteínas na amostra. As atividades mais interessantes do ponto de vista farmacológico, onde podemos visualizar a BjussuLAAO como um futuro fármaco, foram as atividades antitumoral, bactericida e antiparasitária. Esta apresentou, em baixas concentrações, citotoxicidade sobre células tumorais, ação leishmanicida e tripanocida, demonstrando assim ser uma substância candidata a fármaco multifuncional. / In this research we described the isolation and biochemical, structural and functional characterization of an L-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu venom, named BjussuLAAO. The purification was carried out through three chromatography steps, using a molecular filtration on Sephadex G-75, followed by an affinity chromatography on Benzamidine-Sepharose, and finally a hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose. BjussuLAAO is a protein with a molecular mass of 61 kDa and pI 5.8. This protein showed high sequencial similarity with other LAAOs from snake venoms. BjussuLAAO induced edema only in the highest dose (100 ?g/animal), did not show any myotoxic or hemorrhagic activity. BjussuLAAO, showed clotting and fibrinogenolitic activity, even in the presence of metalloproteases and serino-proteases inhibitors. The more interesting pharmacological activities, where from we can look a future application, were the anti-tumoral, bactericide, leishmanicidal and tripanocidal actions. The enzyme displayed a bactericide effect too, showing to be a multifunctional drug.

Este trabalho consiste em uma introdução teórica dos princípios de difração de raios-X e em métodos de determinação de estruturas moleculares e cristalinas aplicados a dois complexos de metal-aminoácido: Cobre (II) bis (D,L-alaninato) mono-hidratado e Cobre(II) bis (L-valinato) mono-hidratado. O complexo Cu(D,L-ala)2&#183H2O tem fórmula química Cu(H2NCHCO2CH3)2&#183 H2O e cristaliza no sistema monoclínico, grupo espacial C2/c com a= 12,087(3)&#197, b= 9,583(3)&#197, c= 8,973(3)&#197, &#946= 110,85(2)&#176, dcalc= 1,762 g/cm3, Z= 4, F(000) 532(elétrons). Foram utilizadas 737 reflexões independentes com I &#62 3&#948(I), que resultaram em um fator R final 0,032. Nesta estrutura, cada íon cobre (II), localizado em um centro de inversão, está ligado ao nitrogênio da amina e a um dos oxigênios carboxilatos de duas moléculas de alanina relacionadas por simetria em um arranjo planar cristalograficamente perfeito. Dois átomos de oxigênio de moléculas de água relacionadas por simetria completam uma configuração de octaedro alongado em volta do cobre. O átomo de oxigênio da molécula de água está em um vértice comum a dois octaedros vizinhos e está fortemente ligado por ponte de hidrogênio a oxigênios carboxilatos de duas moléculas vizinhas. Para o complexo Cu(L-val)2&#183H2O de fórmula química Cu(H2NCHCO2CH(CH3)2)2&#183H2O, a cristalização se deu no sistema monoclínico, grupo espacial C2, com a= 21,314(5)&#197, b= 9,586(2)&#197, c= 7,417(2)&#197, &#946= 108,89(2)&#176, dcalc= 1,454g/cm3, Z= 4, F(000) 660(elétrons). Esta estrutura foi resolvida usando 1605 reflexões independentes com I &#62 3&#948(I). A cadeia lateral do aminoácido não pode ser localizada devido à desordem ocupacional, o que resultou em um fator R final 0,12. O íon cobre (II) está coordenado a duas moléculas de valina no centro de uma unidade ligante praticamente planar N2O2, que forma a base de uma pirâmide quadrada um pouco distorcida com um átomo de oxigênio da água no ápice. Os íons cobre (II) pentacoordenados estão dispostos em camadas paralelas ao plano bc. Cada molécula Cu (L-val)2&#183H2O está ligada dentro da camada por um par de pontes de hidrogênio relativamente fortes entre o átomo de oxigênio da água e oxigênios carboxilatos de duas moléculas vizinhas. / This work consists of a theoretical introduction to the X-ray diffraction principles and methods of molecular and crystal structure determination applied to two metal-aminoacid complexes: Bis (D,L-alaninato) copper (II) monohydrate and Bis (L-valinato) copper (II) monohydrate. The complex Cu(D,L-ala)2&#183H2O has chemical formula (H2NCHCO2CH3)2&#183 H2O and crystallizes in the monoclinic space group C2/c, with a=12,087(3)&#197, b= 9,583(3)&#197, c= 8,973(3)&#197, &#946= 110,85(2)&#176, dcalc= 1,762 g/cm3, Z= 4, F(000) 532(electrons). 737 independent reflections with I &#62 3&#948(I) resulted in a final R-factor 0,032. The Cu (II) ion, at an inversion center, is bonded to the amine nitrogen and to one of the carboxylate oxygen of two symmetrically related alanine molecules in a crystallographically perfect planar arrangement. Two centro-symmetrically related water-oxygen atoms complete an elongated configuration around copper. The water oxygen is at a common apical corner of neighboring coordination octahedral and it is strongly hydrogen-bonded to carboxylate oxygens of other two neighboring molecules. The complex Cu(L-val)2&#183 H2O, with chemical formula Cu(H2NCHCO2CH(CH3)2)2&#183H2O, crystallizes in the monoclinic space group C2 with a=21,314(5)&#197, b= 9,586(2)&#197, c= 7,417(2)&#197, &#946= 108,89(2)&#176, dcalc= 1,454g/cm3, Z= 4, F(000) 660(electrons). The structure was solved employing 1605 independent reflections with I &#62 3&#948(I). The aminoacid side chain could not be located in the electron density map due to positional disorder, which resulted a final R-factor 0,12. The Cu (II) ion is in a cis coordination with two valine molecules at a center of an approximately planar N2O2 ligand set, which forms the basis of a somewhat distorted square pyramid with a water oxygen at its apex. The five-fold coordinated cooper ions are arranged in two-dimensional sheets parallel to the BC plane. Each Cu (L-val)2&#183 H2O molecule is linked within a sheet by a pairo f relatively strong O(N)-HO hydrogen bond with carboxylate oxygens of two neighboring molecules.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:48:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia_Antonia_Bartolomeu_Agustini.pdf: 975575 bytes, checksum: 5ae91eb501ea2fda179a5f66ab648bc2 (MD5) Previous issue date: 2010-12-10 / With the objective of determining the requirement of digestible threonine for laying hens from 50 to 66 and 75 to 90 weeks of age, two experiments were conducted at the Center for Experimental Stations of the Federal Technological University of Paraná, Campus Dois Vizinhos. A total of 150 Brown Shaver hens semiheavily a completely randomized design (CRD) submitted to a basal diet containing 2850 kcal / kg, 15.4% CP supplemented with 0.460, 0.490, 0.520, 0.550 and 0.580% of L-threonine (98%), which provided 0.000, 0.027, 0.058, 0.089 and 0.120% of threonine, respectively. The parameters evaluated were feed intake, threonine intake, feed/dozen eggs, feed/egg mass, egg weight, egg mass, percentage of egg components (yolk, shell, albumen, shell thickness and shell weight per unit surface area - PCSA), internal egg quality (Haugh unit, yolk index and albumen index) and specific gravity. In experiment 1, the requirement for threonine was, 520% in the diet, corresponding to 601 mg threonine/hen/day. In experiment 2, to provide the best performance and quality of eggs, hens do not require more than 0.525% of threonine, a consumption of 654.86 mg of threonine/bird/day / Com o objetivo de determinar a exigência nutricional de treonina digestível para poedeiras semipesadas no período de 50 a 66 e 75 a 90 semanas de idade, dois experimentos foram conduzidos no Núcleo de Estações Experimentais da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campus Dois Vizinhos. Para este fim, foram utilizadas 150 poedeiras Shaver Brown semipesadas num delineamento inteiramente casualizado (DIC) submetidas à uma ração basal contendo 2.850 Kcal EM/Kg, 15,4% de PB, suplementada com 0,460, 0,490, 0,520, 0,550 e 0,580% de L-treonina digestível (98%), que forneceu 0,000; 0,027; 0,058; 0,089 e 0,120% de treonina digestível, respectivamente. Os parâmetros avaliados foram o consumo de ração, consumo de treonina, conversão alimentar/dúzia de ovos, conversão alimentar/massa de ovos, peso de ovos, massa de ovos, porcentagem dos componentes dos ovos (gema, casca, albúmen, espessura de casca e peso da casca por unidade de superfície de área - PCSA), qualidade interna dos ovos (unidade Haugh, índice de gema e índice de albúmen) e gravidade específica. No experimento 1, a exigência de treonina digestível foi de 0,520% na ração, que corresponde a 601 mg de treonina/ave/dia. No experimento 2, para proporcionar os melhores resultados de desempenho e de qualidade de ovos, as poedeiras não exigem mais que 0,525% de treonina digestível, para um consumo de 654,86 mg de treonina digestível/ave/dia