INTRODUÇÃO: A angiogênese tem sido proposta como um marcador de prognóstico em uma variedade de tumores incluindo o renal. No avanço da compreensão da biologia molecular do carcinoma de células renais (CCR) os genes CD105 (endoglina), VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 são seletivamente expressos em células endoteliais vasculares sendo estudados como potenciais alvos terapêuticos. OBJETIVOS: Este estudo analisou a expressão destes quatro genes no tecido renal normal e CCR e suas correlações com os fatores prognósticos para a neoplasia. MÉTODOS: Os níveis de expressão de CD105, VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 foram analisados por Reação da Transcriptase Reversa em tempo real (qRT-PCR) em amostras de tumor fresco congelado coletados de 56 pacientes submetidos à nefrectomia parcial ou radical por CCR. Neste estudo foram avaliados os níveis de expressão dos genes em tecidos normais e tumorais e comparados com fatores prognósticos como tamanho tumoral (> ou <= 7 cm), Grau de Fuhrman (1-2 e 3-4) e invasão microvascular (presente ou ausente). RESULTADOS: A análise dos quatro genes demonstrou que CD105 esta subexpresso em 94.7% dos casos e a superexpressão de VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 ocorreu em 53,6%, 85,7% e 64,3% dos casos respectivamente. A expressão de endoglina foi significativamente maior em pacientes com doença metastática (p=0,05) em relação ao grupo sem metástases. Além disso, o gene do VEGFR2 foi associado com estadiamento T, apresentando uma média de expressão maior nos pacientes portadores de doença pT1-2 (p=0,04). CONCLUSÕES: Nossos experimentos demonstraram que a endoglina está subexpressa em carcinoma de células renais em relação com o tecido renal normal e a presença de níveis mais elevados está relacionada à doença metastática. Os genes VEGF, VEGFR1 e VEGFR2 encontram-se superexpressos no CCR e uma maior expressão do gene VEGFR2 está relacionada com estadiamento T1 e T2 / INTRODUCTION: Angiogenesis has been proposed as a prognostic marker in a variety of human malignancies, including renal cancer. Due to a better understanding of the underlying biology of Renal Cell Carcinoma (RCC) the genes expression of CD105 (endoglina), VEGF, VEGFR1 and VEGFR2 that are selectively expressed in vascular endothelial cells are being studied as potential therapeutic targets. OBJECTIVES: This study analyzed the expression of these four genes in normal kidney tissue and RCC and relationship with prognostic factors. METHODS: CD105, VEGF, VEGFR1 and VEGFR2 expression levels were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) in fresh-frozen malignant tissue specimens collected from 56 patients submitted to radical or partial nephrectomy. This study assessed the expression of genes in normal and tumor tissues, and compared with classic prognostic parameters in CCRCC , such as tumor size (larger or smaller than 7 cm) Fuhrman grade (1-2 and 3-4) and microvascular invasion (this or absent). RESULTS: The analysis of these four genes showed that CD105 is subexpressed in 94.7% of cases and the overexpression of VEGF, VEGFR1 and VEGFR2 occurred in 53.6%, 85.7% and 64.3% of cases respectively in tumor tissues compared to controls. The expression of endoglin was significantly higher in patients with metastatic disease (p = 0.05). In addition, VEGFR2 gene was associated with stage T, with an average of expression higher in patients with stage T1-T2 (p = 0.040). Conclusions: These experiments demonstrated that endoglin was underexpressed in RCC compared to normal kidney and the presence of enhanced expression is associated with metastatic disease. VEGF, VEGFR1 and VEGFR2 were overexpressed in the CCRCC and a higher VEGFR2 expression was related with stage T1-2

O papel da angiogênese na patogênese da doença renal crônica é incerto. De um lado, a formação de neovasos no tecido renal pode amenizar a rarefação capilar e a consequente hipóxia. De outro, a neoangiogênese podem suprir o tecido renal de células pró-inflamatórias. Investigamos o efeito do tratamento com sunitinibe (Su), um inibidor dos receptores do VEGF, no modelo de ablação renal de 5/6 (Nx) em ratos. Foram estudados os grupos: S+V, ratos submetidos a cirurgia simulada (S) e tratados apenas com veículo (V); S+Su, ratos S tratados com Su, 4 mg/kg/dia; Nx+V, ratos Nx tratados com V; e Nx+Su, ratos Nx tratados com Su. A administração de Su não provocou qualquer alteração no Grupo S. Sete e 45 dias após a remoção de massa renal, houve expansão do interstício cortical, associada a uma rarefação dos capilares peritubulares e a uma disseminação da hipóxia tecidual, normalmente confinada à região medular externa. Su não agravou essa expansão intersticial. A rarefação capilar e os sinais de hipóxia tampouco foram afetados, sugerindo pouca ou nenhuma atividade angiogênica nesse modelo. Su exacerbou a glomerulosclerose (GS) observada nos animais Nx. Esse efeito não pode ser explicado por uma redução no número ou na integridade dos podócitos, que não diferiram entre os grupos Nx+V e Nx+Su. Da mesma forma, não se encontraram evidências de que o agravamento da GS pelo Su nos ratos Nx tenha sido causado por hipertrofia do tufo glomerular ou proliferação exagerada de suas células. Entretanto, o tratamento de ratos Nx com Su associou-se ao desenvolvimento de microtrombos glomerulares, cuja organização pode explicar o agravamento da GS observado com a droga. Su não afetou a porcentagem de área endotelial no glomérulo, sugerindo que seu possível dano ao endotélio foi eminentemente funcional. A inibição do VEGF tem pouco efeito sobre ratos normais, mas pode afetar seriamente os glomérulos se administrada a animais com dano renal prévio / The role of angiogenesis in the pathogenesis of chronic kidney disease is unclear. Neovessel formation could ameliorate renal damage by mitigating capillary rarefaction and hypoxia. On the other hand, neoangiogenesis could facilitate the access of inflammatory cells to the renal tissue. We investigated the effect of treatment with sunitinib (Su), an inhibitor of VEGF receptors, in the 5/6 renal ablation model (Nx). Adult male Munich-Wistar rats were distributed among groups S+V, rats submitted to sham surgery (S) and treated with vehicle (V); S+Su, S rats treated with Su, 4 mg/kg /day; Nx+V, Nx rats treated with V; and Nx+Su, Nx rats treated with Su. Administration of Su caused no change in Group S. Seven and 45 days after renal mass ablation, there was expansion of the cortical interstitium associated with rarefaction of peritubular capillaries and dissemination of tissue hypoxia, which was confined to the outer medulla in S rats. Su did not worsen interstitial expansion, nor did it affect capillary rarefaction or hypoxia, suggesting that little angiogenic activity exists in this model. Nx animals exhibited glomerulosclerosis (GS), which was aggravated by Su. This effect could not be explained by changes in the number or vitality of podocytes. Worsening of GS by Su treatment could not be ascribed to tuft hypertrophy or hyperplasia, but was associated with the formation, and possible organization, of glomerular microthrombi. Su did not affect the fractional endothelial area in the glomerulus, suggesting functional damage of endothelial cells, rather than reduction of their number. VEGF inhibition has little effect on normal rats, but can seriously affect the glomerular endothelium in animals with previous renal injury

Assim como tecidos normais, tumores possuem uma demanda de nutrientes e oxigênio, suprida através da vasculatura a eles associada que resulta do processo de angiogênese. Fatores pró-angiogênicos são capazes de atrair monócitos, os quais se diferenciam em macrófagos associados a tumores (TAMs). TAMs comumente apresentam fenótipo M2, cujas características são consideradas pró-tumorais, como a promoção da angiogênese e a degradação de matriz extracelular. Estudos indicam que galectina-3 (gal-3), uma proteína pleiotrópica que se liga a ?-galactosídeos, participa do controle da angiogênese e da infiltração de macrófagos M2 na massa tumoral, mas pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos. No presente estudo, utilizamos um modelo de sarcoma induzido por carcinógeno em camundongos selvagens (WT) e knockout para gal-3 (Gal- 3 KO). Comparando os tumores de animais WT e Gal-3 KO, não observamos diferenças no padrão de crescimento tumoral, na área necrótica relativa, na proliferação celular e na quantificação de fibras de colágeno. Demonstramos que, embora ambos os grupos desenvolvam tumores, a angiogênese foi inibida em um microambiente desprovido de gal-3. Entretanto, não houve diferença na produção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). As imagens obtidas in vivo indicaram que gal- 3 também influencia na formação estrutural de vasos adjacentes ao tumor. Além de mediar aspectos morfológicos relacionados à angiogênese, demonstramos que gal-3 também contribuiu para a funcionalidade vascular, pois houve uma redução na velocidade de fluxo sanguíneo nos vasos intratumorais de animais Gal-3 KO. Nossos dados sugeriram que há menos macrófagos no tumor que não expressa gal-3 e, dentre os TAMs, há mais M2 em comparação ao tumor gal-3-positivo. A análise do tecido onde o tumor se desenvolve, na fase inicial da tumorigênese, indicou que a ausência de gal-3 está relacionada a uma maior densidade de macrófagos M2. Considerando que a presença maior de macrófagos M2 nos sarcomas gal-3-negativos não resultou em maior produção de VEGF, mas sim na inibição da angiogênese, nossos resultados apontam para uma participação significativa de gal-3 na mediação da angiogênese pelos macrófagos / As well as normal tissues, tumors require nutrients and oxygen, which are supplied by the associated vasculature that results from the process of angiogenesis. Pro-angiogenic factors are able to attract monocytes and they differentiate into tumor-associated macrophages (TAMs). TAMs commonly exhibit M2 phenotype, which has characteristics considered pro-tumoral, such as angiogenesis promotion and degradation of extracellular matrix. Studies show that galectin-3 (gal-3), a pleiotropic ?-galactosidebinding protein, participates in angiogenesis control and M2 macrophage infiltration into the tumor mass, but little is known about the mechanisms involved. In this work, we established a model of carcinogen-induced sarcoma in wild-type (WT) and gal-3 knockout (Gal-3 KO) mice. Comparing tumors from WT and Gal-3 KO animals, there were no differences in the pattern of tumor growth, relative necrotic area, cell proliferation and collagenous fibers. We demonstrated that, although both groups develop tumors, angiogenesis was inhibited in a microenvironment devoid of gal-3. However, there was no difference in the production of vascular endothelial growth factor (VEGF). The images obtained in vivo indicated that gal-3 also influenced the structural formation of vessels adjacent to the tumor. In addition to mediating morphological aspects related to angiogenesis, we demonstrated that gal-3 also contributes to vascular functionality, since there was a reduction in blood flow velocity in intratumoral vessels from Gal-3 KO animals. Our data suggested that there are fewer macrophages in tumors without gal-3 and, among TAMs, there are more M2 compared to gal-3-positive tumors. Analysis of the tissue where the tumor develops, in early stages of tumorigenesis, indicated that the lack of gal-3 is related to an increased density of M2 macrophages. Since the greater number of M2 macrophages in gal-3-negative fibrosarcomas did not result in increased VEGF production, but inhibited angiogenesis, our results suggest a significant role of gal-3 in regulation of angiogenesis by macrophages

O tumor mamário é a segunda neoplasia maligna mais incidente em cães, com uma elevada taxa de mortalidade. Em cães, constituem aproximadamente 52% de todos os tumores que afetam as fêmeas, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica, sendo que 50% são malignos. As neoplasias, independentemente de suas causas primárias, apresentam distúrbios no controle do ciclo celular, o que acaba gerando um aumento na proliferação celular, perda da diferenciação e formação de massas tumorais. Na gênese das neoplasias mamárias estão envolvidos fatores de natureza genética, ambiental e hormonal. O objetivo deste trabalho foi avaliar &quot;in vitro&quot; o efeito da terapia com célula- tronco da medula óssea canina de feto em tumores mamários canino. Após a avaliação histopatológica os tumores foram divididos em grupos de grau I (adenocarcinoma, sem metástase), grau II (carcinoma com metástase regionais) e grau III (carcinomas com metástases sistêmicas). As células dos tumores mamários caninos (TM) e as células - tronco de medula óssea de feto canina (CTMs) foram caracterizadas antes e após o tratamento utilizando marcadores de proliferação, angiogênese e da resposta inflamatória através da citometria de fluxo. A expressão de marcadores de proliferação celular Ki67 foi maior nas linhagens tumorais dos carcinomas grau III, o mesmo observado para os marcadores que regulam a angiogênese e migração celular como VEGFR1, CD44, COX-2 e EGFR. Foi possível observar nas culturas celulares de TM a redução do potencial elétrico mitocondrial alterando permeabilidade da membrana ativando a caspase 3 e reduzindo a Bcl-2, sugerindo que a CTM apresenta efeitos antitumorais pela indução de apoptose e efeitos antiproliferativos da expressão de COX-2 e IL-6 inibindo a proliferação celular levando ao acúmulo das células na fase G0/G1. . A terapia celular com CTMs proporciona novas expectativas para o tratamento de diversas patologias que acometem diferentes espécies.. Desta forma, os resultados os resultados obtidos pela expressão das TM tratadas com CTM pode apresentar como uma nova perspectiva no tratamento de tumores em cadelas. / The breast tumor is the second most frequent malignancy in dogs, with a high mortality rate. In dogs, they constitute approximately 52% of all tumors affecting female, having a high biological and histomorphological heterogeneity, and 50% are malignant. Neoplasms, regardless of their root causes, have disturbances in cell cycle control, which ends up generating an increase in cell proliferation, differentiation loss and formation of tumor masses. In the genesis of mammary tumors are involved genetic, environmental and hormonal factors nature. The objective of this study was to evaluate &quot;in vitro&quot; the effect of therapy with stem cell-canine bone marrow fetus in canine mammary tumors. After histopathological evaluation tumors were divided into grade I groups (adenocarcinoma without metastasis), grade II (carcinoma with regional metastasis) and grade III (carcinomas with metastatic disease) .The cells of canine mammary tumors (TM) and cells - bone marrow stem canine fetuses (MSCs) were characterized before and after treatment using proliferation markers, angiogenesis and inflammatory response by flow cytometry. The expression of cell proliferation markers Ki67 was higher in tumor cell lines of the carcinomas grade III, the same was observed for markers that regulate angiogenesis and cell migration as VEGFR1, CD44, COX-2 and EGFR. It was observed in TM cell cultures to reduce the electric potential changing mitochondrial membrane permeability by activating caspase 3 and reduces Bcl-2, suggesting that MSC has antitumor effects by inducing apoptosis and antiproliferative effects of COX-2 expression and IL-6 inhibiting cell proliferation leading to an accumulation of cells in G0 / G1 phase. Cell therapy MSCs provides new expectations for the treatment of various pathologies affecting different species. Thus, the results the results obtained by the expression of TM-treated MSC can present as a new approach in the treatment of tumors in dogs..

Propõe-se que a angiogênese represente um importante passo no processo de adesão, implantação, invasão e crescimento das células endometriais, visto que, semelhante aos tumores metastáticos, implantes endometrióticos dependem de neovascularização para se proliferarem. Tal constatação sugere que a supressão do desenvolvimento de vasos sanguíneos por meio da inibição de fatores angiogênicos específicos pode ser uma nova oportunidade terapêutica na abordagem da endometriose. Estudos demonstram um efeito antiangiogênico do propranolol anticancerígeno em diferentes tipos de tumores. Tal achado sugere que o propranolol pode contribuir clinicamente exercendo papel sobre a inibição de neoangiogênese, e tal efeito resultar em um impacto sobre as lesões de endometriose. Foi estudado o efeito do propranolol sobre marcadores de diferenciação (Metalotioneínas MT1 e MT2), invasão (MMP9 e TIMP2), proliferação celular (PCNA) e apoptose (CASP8 - caspase 8) por coloração imunohistoquímica, e também a influência sobre a adesão, motilidade e angiogênese das lesões de endometriose por quantificação da expressão relativa (RQ) por PCR em tempo real dos genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf e Sparc. Foram utilizadas 30 ratas adultas Wistar, fêmeas, virgens que foram submetidas a laparotomia para indução de lesões de endometriose. As ratas foram separadas em três grupos, e sacrificados após 14 dias de tratamento de dose baixa (PB, n = 10) e dose elevada (PA, n = 10) de propranolol; e o grupo de controlo (C, n = 10) sem tratamento. As lesões foram excisadas para análise histológica com o corno uterino contralateral, com confirmação da presença de tecido glandular e estroma endometrial. No presente estudo foi observada uma redução na marcação imunohistoquímica para Metalotioneínas, com 60% de positividade no grupo controle, 10% e 11,1% para o PA, PB, respectivamente (p <0,05). Também observamos uma diminuição na expressão do gene de Pcna (C = 1,04; PA = 0,32; PB = 0,69). Em outros marcadores de imunohistoquímica e quantificação da expressão gênica nas lesões e no tecido uterino não foram observadas diferenças significativas. O tratamento com drogas antiangiogênicas como propranolol oferece novas perspectivas de abordagem terapêutica para pacientes com endometriose. / Since endometrial implants rely on neovascularization to proliferate, in a similar way to metastatic tumors, it is proposed that angiogenesis represents an important step in the process of adhesion, implantation, invasion and growth of ectopic endometrial cells. These findings suggest that the suppression of the development of blood vessels by inhibition of specific angiogenic factors may be a new therapeutic opportunity in endometriosis approach. Studies demonstrate an antiangiogenic anticancer effect of propranolol in different types of tumors. This drug can play a role in the inhibition of neoangiogenesis, which could interfere on the growth of endometriotic lesions. The effect of propranolol on markers of differentiation (Metallothionein, MT1 and MT2), invasion (MMP9 and TIMP2), cell proliferation (PCNA) and apoptosis (CASP8 - caspase 8) was evaluated by immunohistochemical staining, as well as the influence of propranolol on adhesion, motility and angiogenesis of both endometriotic lesions and endometrial tissue through quantification of relative expression (RQ) by real-time PCR of the genes Vegf, Cald1, Pcna, Tnf and Sparc. Thirty Wistar adult rats, females, virgins who underwent laparotomy for induction of endometriosis lesions were used. The rats were divided into three groups, and sacrificed after 14 days of low (BP, n = 10) and high dose treatment (AP, n = 10) of propranolol; and the control group (C, n = 10), untreated. The lesions were excised for histological analysis with the contralateral uterine horn, with confirmation of the presence of glandular tissue and endometrial stroma. In the present study we observed a reduction in immunostaining for Metallothioneins, with 60% positive in the control group, in comparison to 10% and 11.1% for PA and PB, respectively (p <0.05). Furthermore, there was a decrease in expression of Pcna gene (C = 1.04; PA = 0.32; PB = 0.69) which was statistically significant (p<0.05). However, quantification of gene expression regarding other immunohistochemical markers evaluated both in the endometriotic lesions and uterine tissue showed no statistically significant difference. In conclusion, antiangiogenic drugs like propranolol may offer new perspectives for the therapeutic approach of patients with endometriosis.

Os mastócitos, em associação com outras células inflamatórias se acumulam em locais de tumor. Entretanto, pouco é conhecido sobre o papel exato dos mastócitos e de seus mediadores na progressão tumoral e angiogênese. Resultados recentes do nosso laboratório mostraram que a expressão das triptases específicas de mastócitos está correlacionada com a progressão tumoral (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Além do mais, existe uma associação entre mastócitos e a angiogênese tumoral. Então, tornou-se interessante investigar o papel das quimases específicas de mastócitos (mMCP-4 e -5) neste processo. Visto que estas quimases não são disponíveis comercialmente, a primeira etapa deste estudo foi produzir as quimases mMCP-4 e -5 recombinantes. Assim, as sequências dos genes respectivos para mMCP-4 e -5, além das sequências para seis resíduos de His e do sítio suscetível a enteroquinase foram clonadas no vetor de expressão pPIC9. A cepa GS115 de Pichia pastoris foi transformada com o respectivo vetor para mMCP-4 ou -5. Os clones transformados foram crescidos em meio BMMY e induzidos com várias concentrações de metanol para a produção de mMCP-4 ou -5 recombinantes. Depois de 96 horas, o meio foi centrifugado e as quimases mMCP-4 ou -5 foram purificadas do sobrenadante usando resina de níquel. A identidade das proteínas foi confirmada por Western Blotting usando o anticorpo anti-his, assim como os anticorpos anti-mMCP-4 e -5. As proteases foram ativadas pela clivagem do sítio suscetível a enteroquinase por cinco horas, a 22°C. A ativação das enzimas foi confirmada através da degradação de seus substratos específicos. Estes resultados mostram que P. pastoris é um organismo eficiente para a expressão de ambas as proteases. Estas proteases recombinantes se constituem em ferramentas importantes para se elucidar o papel da mMCP-4 ou -5 na angiogênese. / Mast cells, in association with other inflammatory cells, are known to accumulate at tumor sites. However, little is known about the exact role that mast cells and their mediators play in tumor progression and angiogenesis. Recent results from our laboratory have shown that expression of mast cell specific tryptases correlates with tumor progression (de Souza, Jr, PLosOne 7(7): e40790). Furthermore, there is an association between mast cells and tumor angiogenesis. It then became of interest to investigate the role of mast cell specific chymases (mMCP-4 and -5) in this process. Since these chymases are not commercially available, the first step in this study was to produce recombinant mMCP-4 and -5. The gene sequences for these chymases along with the sequence for six His residues and an enterokinase susceptible peptide were cloned into the expression vector pPIC9. The GS115 strain of Pichia pastoris was transformed with the respective vector for either rmMCP-4 or -5. The transformed clones were grown in BMMY media and induced to produce rmMCP-4 or -5 with various concentrations of methanol. After 96 hours, the medium was centrifuged and rmMCP-4 or -5 was purified from the supernatant using nickel-nitrilotriacetic acid agarose beads. The identity of the proteins was confirmed by Western blotting using an anti-his antibody as well as anti-mMCP-4 and -5. These results show that P. pastoris is an efficient organism in which to express both proteases.

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência da aplicação de bevacizumab (Avastin®) sobre a angiogênese corneal. Para tanto ratos Wistar, machos, com idade entre 8 e 10 semanas, pesando 300 a 350g, foram submetidos a cauterização química com nitrato de prata por 10 segundos. Após realização da lesão, cada grupo de 5 animais foi tratado com injeções subconjuntivais de 0,02 ml de bevacizumab (Avastin ®) pela via subconjuntival no momento da lesão, no 3° e 5° dia e submetidos à eutanásia ao 7° dia após cauterização corneal. A rede vascular neoformada foi quantificada após preenchimento do leito vascular com Tinta da China e análise das imagens em sistema computadorizado (Image Pro-Plus®). Para a segunda etapa do experimento, avaliou-se a atividade das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 utilizando-se do mesmo modelo de angiogênese e dos mesmos tempos de tratamento. Transcorridos 7 dias de lesão corneal os animais foram eutanasiados e suas córneas submetidas a zimografia. Os resultados mostraram haver uma inibição da angiogênese quando se compara o grupo controle aos grupos tratados nos diferentes períodos de tempo. Quando a densidade vascular é comparada entre os tempos de aplicação, não se observa diferença estatisticamente significante. Estes resultados em conjunto indicam que o tempo de aplicação não influencia a inibição da angiogênese e que o bevacizumab foi eficiente na redução da formação de vasos quando se compara a densidade vascular do grupo controle. O modelo experimental produziu considerável aumento das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9. Houve uma tendência a diminuição da atividade das MMPs quando bevacizumab foi aplicado no momento da lesão e quando foi aplicado ao 3° dia após cauterização. A atividade das MMPs mostrou-se aumentada quando o tratamento foi realizado no 5° dia. Desta forma pode-se concluir que o bevacizumab foi capaz de inibir a angiogênese corneal, independentemente do período de tratamento e ainda que houve uma tendência a redução da atividade das MMPs carecendo, por enquanto, de mais investigações que possam elucidar a interação deste fármaco com a inibição de sua atividade. / The purpose of this study was to evaluate the effects of the use of the subconjunctival injection of bevacizumab (Avastin®) on angiogenesis and metalloproteinases activities in the rat cornea after cauterization. Wistar male rats, aging 8 to 10 weeks, were used. The animals were divided in four groups: control group (GC) that received subconjunctivally 0,02 ml of 0,9% saline solution; group GO that received subconjunctivally 0,02 ml of bevacizumab just after the lesion; group G3 that received bevacizumab at day 3 after lesion and G5 that received bevacizumab at day 5 after lesion. The animals were euthanized at day 7 after lesion. The new formed vessels were quantified after the China Ink perfusion and photographs were obtained and analyzed in computadorized system (Image Pro-Plus®). The activities of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 were evaluated by zimography in a pool of corneas obtained from animals submitted to the same model and treatment schedule. The results showed an inhibition of angiogesenis when the control group were compared with all treated groups. There were no statistic differences when vascular density was compared between the treated groups. These results may indicate that bevacizumab was able to inhibit corneal angiogenesis and that there was no influence of the injection day. This angiogenesis model promoted an increase of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 activity. Zymography also showed a slight reduction in matrix metalloproteinases activity when bevacizumab were administrated at the injury moment and most significant at day 3. At day 5 zymography showed an increase of the activity of these metalloproteinases. Together these results may indicate that the subconjunctival injection of bevacizumab may have a therapeutic potential as an antiangiogenic agent and that matrix metalloproteinases activity decreased, but not at significant levels, demanding more investigations regarding to the interaction of bevacizumab and activity of matrix metalloproteinases.

Orientador: Valéria Helena Alves Cagnon Quitete / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Montico_Fabio_D.pdf: 8683742 bytes, checksum: b24bef7642e19dd250ce77f07cca65c4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A senescência está associada a modificações hormonais na próstata, resultando em microambiente favorável ao desenvolvimento de lesões neoplásicas. A angiogênese é fundamental para o crescimento tumoral e, na próstata, está sujeita à regulação por andrógenos, sendo sua estimulação um importante evento no estroma reativo associado ao câncer. Assim, a inibição da angiogênese representa terapia promissora no tratamento de neoplasias da próstata. O objetivo deste estudo foi caracterizar aspectos do estroma prostático na senescência e frente a terapias antiangiogênicas e de ablação hormonal, comparando-os com a reação estromal associada a lesões glandulares no modelo TRAMP. Camundongos FVB machos senis (52 semanas) foram submetidos a tratamentos antiangiogênicos com SU5416 (6 mg/kg; i.p.) e/ou TNP-470 (15 mg/kg; s.c.). O bloqueio hormonal foi obtido com finasterida (20 mg/kg; s.c.), isoladamente ou associada a ambos os inibidores. Após 21 dias de tratamento, amostras da próstata dorsolateral foram coletadas para análises morfológicas, imunohistoquímicas e de Western Blotting. A senescência levou à ocorrência de inflamação e de lesões proliferativas na próstata, bem como à maior frequência de células positivas para CD34/VIM e CD34/?SMA e ao aumento de MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1?, FGF-2, CD31, VIM e ?SMA, caracterizando semelhança com o microambiente prostático de camundongos TRAMP. Por outro lado, a endostatina e o TGF-? apresentaram-se elevados somente na senescência, mas não ao longo da progressão tumoral no modelo TRAMP. O tratamento com inibidores angiogênicos levou à recuperação e/ou interrupção das alterações glandulares associadas à senescência, mas efeitos diferenciais foram registrados para as drogas. Enquanto o SU5416 atuou principalmente sobre a remodelação tecidual prostática, reduzindo os níveis de MMP-9, VIM e ?SMA bem como a frequência de células positivas para CD34/VIM e CD34/?SMA, o TNP-470 influenciou sobretudo o IGFR-1, o VEGF e o HIF-1?, promovendo inibição de maior amplitude sobre esses fatores. A associação destes inibidores levou à combinação de tais efeitos diferenciais. A finasterida, isoladamente ou associada aos agentes antiangiogênicos, resultou em diminuição dos níveis de MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1? e FGF-2 em relação aos controles, embora tenha demonstrado tendência em regular positivamente a expressão de fatores pró-angiogênicos. Todavia, ao contrário da inibição da angiogênese, a ablação hormonal não resultou em diminuição do TGF-?. Assim, concluiu-se que a senescência gerou um microambiente de estroma reativo similar ao do modelo TRAMP, com estímulo aos à proliferação celular, remodelação tecidual, angiogênese e transição endotélio-mesenquimal, certamente propiciando condições favoráveis para o desenvolvimento de lesões prostáticas pré-malignas e malignas. Entretanto, a ausência de adenocarcinoma pouco diferenciado e a menor distribuição das lesões neoplásicas em relação a camundongos TRAMP sugeriram um possível papel protetor da endostatina sobre a próstata na senescência. A terapia antiangiogênica foi eficaz em promover efeitos antitumorais e a inibição da neovascularização, sobretudo frente à combinação dos inibidores, sugerindo que a ação diferencial desses agentes nos processos tumorigênicos resulta em espectro de ação mais amplo para o tratamento. Por fim, ressalta-se que os efeitos benéficos do tratamento com finasterida merecem especial atenção, considerando o potencial desta droga em promover o estroma reativo facilitador do desenvolvimento de desordens glandulares / Abstract: Senescence is associated with hormonal changes in the prostate, leading to a permissive microenvironment for the development of neoplastic lesions. Prostatic angiogenesis is an androgen-regulated process which is fundamental for tumor growth and represents an important event in cancer-associated reactive stroma. Thus, angiogenesis inhibition emerges as a promising therapy in the treatment of prostate neoplasms. The aim herewith was to characterize prostatic stroma during senescence and following antiangiogenic and hormonal ablation therapies, comparing the findings with the reactive stroma phenotype associated to TRAMP model glandular lesions. Elderly male FVB mice (52 week-old) were submitted to antiangiogenic treatments with SU5416 (6 mg/kg; i.p.) and/or TNP-470 (15 mg/kg; s.c.). Hormonal blockage was achieved with finasteride administration (20mg/kg; s.c.), either alone or combined to both inhibitors. After 21 days of treatment, dorsolateral prostate samples were collected for morphological, immunohistochemical and Western Blotting analysis. Senescence led to the occurrence of inflammatory foci and proliferative lesions in the prostate, apart from increased frequency of CD34/VIM and CD34/?SMA positive cells and raised levels of MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1?, FGF-2, CD31, VIM and ?SMA, resembling TRAMP mice prostatic microenvironment. On the other hand, endostatin and TGF-? showed higher expression in senescence but not during tumor progression in the TRAMP model. Antiangiogenic treatment resulted in recovery and/or interruption of the senescence-associated glandular changes, showing differential effects for each drug. SU5416 acted mainly on prostatic tissue remodeling, reducing MMP-9, VIM and ?SMA levels as well as the frequency of CD34/VIM and CD34/?SMA positive cells, whereas TNP-470 influenced specially IGFR-1, VEGF and HIF-1?, promoting greater inhibition over these factors. The association between the inhibitors led to synergistic differential effects. Despite presenting a trend to regulate positively pro-angiogenic factor expression, finasteride resulted in decreased MMP-9, IGFR-1, VEGF, HIF-1? and FGF-2 levels relatively to controls, either in isolation or combined to antiangiogenic agents. However, unlike angiogenesis inhibition, hormonal ablation did not lead to decreased TGF-? expression. Thus, it was concluded that senescence created a reactive stroma microenvironment which resembles that verified in the TRAMP model and is characterized by stimulated cell proliferation, tissue remodeling, angiogenesis and endothelial-to-mesenchymal transition. This scenario certainly provided favorable conditions for the development of pre-malignant and malignant prostatic lesions. However, the absence of poor-differentiated adenocarcinoma and the lesser distribution of neoplastic lesions in relation to TRAMP mice suggested a possible protective role of endostatin on the prostate during aging. Antiangiogenic therapy was efficient in promoting antitumor effects and neovascularization inhibition, especially following the combination of inhibitors, suggesting that the differential action of these agents on tumorigenic processes results in a broader spectrum of effects for the treatment. Finally, it is noteworthy that beneficial effects from finasteride treatment must be looked carefully, considering the capacity of this drug to promote a reactive stroma microenvironment favorable to the development of glandular disorders / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Erich Vinicius de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T16:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fiusa_MaiaraMarxLuz_M.pdf: 4773403 bytes, checksum: 75096ce572a7e0682b295f48ac895796 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A neutropenia febril (NF) em pacientes com neoplasias hematológicas é caracterizada pelo alto risco de sepse e choque séptico. Embora a utilização de escores clínicos como o MASCC permita a identificação de pacientes de baixo risco, este escore é menos informativo em pacientes de alto risco, onde se encaixam a maioria dos pacientes com neoplasias hematológicas, além daqueles submetidos a esquemas intensivos de quimioterapia. Ao mesmo tempo, a aplicação de biomarcadores de gravidade como a procalcitonina, validados em pacientes não-neutropênicos, é controversa em pacientes com NF. A quebra da barreira endotelial é um elemento chave no choque séptico, de modo que proteínas envolvidas neste processo são candidatos atrativos como biomarcadores de gravidade na sepse. Neste estudo, avaliamos prospectivamente o valor da dosagem de VEGF-A, sFlt-1, Ang-1 e Ang-2 como biomarcadores da evolução para choque séptico em 120 pacientes com NF. Pacientes internados nas enfermarias de Hematologia e Transplante de Medula Óssea do HC da UNICAMP para tratamento de NF entre março de 2011 e 2012 foram convidados a participar. As amostras foram coletadas na manhã seguinte à entrada no estudo, junto com a coleta de exames de rotina. O estudo foi desenhado com o objetivo de mimetizar as condições de coleta e processamento das amostras, que seriam encontradas na prática clínica real. Foi avaliada a evolução para choque séptico e mortalidade em 28 dias. Os resultados foram comparados com marcadores de prognóstico clássicos como proteína C reativa, e escores MASCC e SOFA. No total, 99 pacientes preencheram os critérios de inclusão, dos quais 19,8% evoluíram com choque séptico. Não foram observadas diferenças clínicas e demográficas entre os pacientes com NF não-complicada e choque séptico, exceto pelo escore SOFA, significativamente mais elevado no segundo grupo. Os níveis de VEGF-A e sFlt-1 foram semelhantes entre os dois grupos. Em contraste, os níveis séricos de Ang-2 estavam aumentados em pacientes com choque séptico, ao passo que os níveis séricos de Ang-1 estavam diminuídos. Considerando o papel antagônico destas angiopoietinas na regulação da permeabilidade endotelial, a relação Ang-2/Ang-1 foi calculada, como indicador de desequilíbrios na concentração destes moduladores, que pudessem indicar um estado mais ou menos propenso à queda da barreira endotelial. De fato, um aumento na relação Ang-2/Ang-1 foi encontrada em pacientes com choque séptico (5,29 - variação de 0,58 a 57,14) em relação aos pacientes com NF não-complicada (1,99 - variação de 0,06 a 64,62; P=0,01). Na análise univariada e multivariada, a relação Ang-2/Ang-1 provou ser um fator de risco independente para o desenvolvimento de choque séptico e mortalidade em 28 dias. Desta forma, concluímos que a elevação dos níveis séricos de Ang-2 e da relação Ang-2/Ang-1 está associada ao risco aumentado de choque séptico e mortalidade em pacientes com NF, mesmo quando coletada sob condições próximas àquelas encontradas a prática clínica / Abstract: Febrile neutropenia (FN) in patients with hematologic malignancies is characterized by a high risk of sepsis complications and septic shock. Although the use of clinical scores such as the MASCC allows the identification of low-risk patients, this score is much less informative in high-risk patients, a category in which most patients with hematologic malignancies, and those undergoing intensive chemotherapy regimens, fit in. At the same time, the use of classical biomarkers such as procalcitonin in non-neutropenic patients is controversial in patients with FN. Endothelial barrier breakdown is a key element in septic shock, so that proteins involved in this process are attractive candidates as biomarkers of sepsis severity. In this study, we prospectively evaluated the value of VEGF-A, sFlt-1, Ang-1 and Ang-2 serum levels as biomarkers of progression to septic shock in 120 patients with FN. Patients hospitalized in the Hematology and Bone Marrow Transplantation in-patient units of a university hospital (HC-UNICAMP) for the treatment of FN between March 2011 and March 2012 were invited to participate. Samples were collected in the following morning after study entry, along with the collection of routine labs. The study was designed to mimic the conditions of blood sample collection and processing that would be encountered in "real-world" clinical practice. Clinical outcomes were (1) progression to septic shock and (2) death within 28 days from fever onset. Results were compared with classical prognostic markers such as C-reactive protein, and MASCC and SOFA scores. In total, 99 patients met the inclusion criteria, of which 19.8% progressed to septic shock. No differences clinical and demographic differences were observed between patients with uncomplicated-FN or septic shock, except for a higher SOFA scores in the latter group. Levels of VEGF-A and sFlt-1 were similar between the two groups. In contrast, serum levels of Ang-2 were increased in patients with septic shock, whereas serum levels of Ang-1 were decreased in these patients. Considering the antagonistic role of angiopoietins 1 and 2 in regulating endothelial permeability, the Ang-2/Ang-1 ratio was calculated as an indicator of imbalances in the concentration of these modulators. In fact, a high Ang-2/Ang-1 ratio was found in patients with septic shock (5.29 - range 0.58 to 57.14) compared to patients with uncomplicated FN (1.99 - range 0.06 to 64.62, P = 0.01). In univariate and multivariate analysis, the Ang-2/Ang-1 ratio proved to be an independent risk factor for the development of septic shock and for 28-day sepsis-related mortality. Thus, we concluded that a high Ang-2/Ang-1 ratio is associated with increased risk of septic shock and mortality in patients with FN, even when collected under conditions close to those encountered in real-world clinical practice / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

OBJETIVO: Investigar o efeito da expressão de RNAm dos SMADs e de microRNAs (miRNAs) que possuem o TGFB1 como alvo na expressão gênica (RNAm e proteína) de TGF-&#946;1 e seu papel na fisiopatologia da angiogênese em pacientes com mielofibrose (MF) e trombocitemia essencial (TE). MÉTODOS: Foram incluídos 21 pacientes com MF primária (MFP), 21 com MF pós-TE (MFPTE) e 24 com TE, além de 98 indivíduos controles pareados de acordo com gênero e idade com os pacientes. As análises realizadas no sangue periférico foram: quantificação das concentrações plasmáticas e de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2; quantificação de RNAm de SMADs 1 a 7 e de miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, e 590- 5p; e detecção das mutações JAK2V617F (com quantificação alélica), MPLW515K/L e CALR. Em 26 biópsias de medula óssea dos pacientes, foram determinados o grau de microvasculatura (angiogênese estimada - CD34), a imunoexpressão de TGF-b1 ativo, TGF-&#946;1 latente e c-MPL. RESULTADOS: As concentrações de TGF- &#946;1 plasmático foram semelhantes entre os pacientes e controles, enquanto o VEGFA plasmático foi maior em todos os grupos de pacientes comparados aos seus controles. O FGF2 plasmático também foi maior em todos os grupos de pacientes, e a expressão de seu RNAm foi maior nos pacientes com TE do que em seus controles. As expressões de SMADs e de miRNAs foram semelhantes entre pacientes e controles. TGF-&#946;1 e FGF2 plasmáticos apresentaram correlações positivas nos pacientes com MFP, e correlações negativas nos seus controles, assim como nos controles de MFPTE. Em todos os grupos estudados foi observada correlação positiva entre TGF-&#946;1 e VEGFA plasmáticos. Além disso, foram demonstrados diferentes perfis de correlações entre a expressão gênica de TGF-&#946;1 e os diversos SMADs e miRNAs em cada grupo de pacientes e controles. Os pacientes com MFP com maior angiogênese (de acordo com a mediana da concentração plasmática de VEGFA e FGF2) apresentaram maiores concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1 do que aqueles com menor angiogênese. A angiogênese medular estimada (CD34) não foi diferente entre os três grupos de pacientes estudados. Além disso, não foram encontradas correlações entre a imunoexpressão de CD34 e as expressões de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2 medulares nem em leucócitos de sangue periférico, ou a concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1, VEGFA e FGF2. As imunoexpressões de TGF-b1 ativo, TGF-&#946;1 latente e c-MPL foram semelhantes entre os três grupos de pacientes. As frequências das mutações avaliadas foram similares às descritas na literatura. Os pacientes com MFPTE portadores de mutação CALR apresentaram menores concentrações plasmáticas de VEGFA e FGF2 do que os JAK2V617F positivos, enquanto os pacientes com TE portadores de mutação CALR exibiram menores concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1 do que os portadores de JAK2V617F. CONCLUSÕES: O presente trabalho permitiu confirmar a correlação positiva entre o TGF-&#946;1 com outros dois marcadores de angiogênese (VEGFA e FGF2). As expressões de SMADs e de miRNAs estudados foram semelhantes entre pacientes e controles, visto não haver diferenças na expressão gênica de TGF-&#946;1. Entretanto, disparidades encontradas nas correlações entre a expressão gênica de TGF-&#946;1 e diferentes SMADs e miRNAs nos pacientes e controles poderiam indicar que a regulação da expressão gênica de TGF-&#946;1 nas doenças estudadas seja distinta da apresentada nos indivíduos sem essas doenças. / AIM: To investigate the effects of the expression of SMADs mRNA and microRNAs (miRNAs) that target TGFB1 in TGF-&#946;1 gene expression (mRNA and protein) and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis (MF) and essential thrombocythemia (ET) patients. METHODS: Twenty-one primary MF (PMF), twenty-one MF post-ET (MPET) and twenty-four ET patients were included, besides 98 controls matched for gender and age with patients. In peripheral blood were assessed: TGF-&#946;1, VEGFA and FGF2 plasmatic levels and mRNA quantification; SMADs 1 to 7 mRNA quantification and miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, and 590-5p quantification; and detection of JAK2V617F (and allele burden), MPLW515K/L and CALR mutations. Estimated angiogenesis (microvessel grade - CD34), active TGF-b1, latent TGF-&#946; and c-MPL immunoexpression were determined in 26 bone marrow biopsies. RESULTS: Plasmatic TGF-&#946;1 levels were similar in patients and controls, while all the patients groups had higher plasmatic VEGFA than controls. Plasmatic FGF2 was higher in all the patients groups, and its mRNA expression was higher in ET patients than in controls. No differences in SMADs and miRNAs expression were found between patients and controls. There was a positive correlation between plasmatic TGF-&#946;1 and FGF2 in PMF, and a negative correlation between these variables in their controls, as well as in MPET controls. In all studied groups, there was a positive correlation between plasmatic TGF-&#946;1 and VEGF. In addition, different profiles of correlations were demonstrated between TGF-&#946;1 gene expression and the several SMADs and miRNAs studied in each group of patients and controls. PMF patients with higher angiogenesis (according to the median of VEGFA and FGF2 plasma levels) had higher plasmatic TGF-&#946;1 levels than those with lower angiogenesis. Estimated angiogenesis (CD34) in bone marrow biopsies were not different among PMF, MPET and ET patients. Moreover, there were no correlation between CD34 immunoexpression and TGFB1, VEGFA and FGF2 mRNA bone marrow or peripheral blood expression or plasmatic levels, as well as latent TGF-&#946;1, active TGF-b1, and c-MPL immunoexpression were similar in patients studied groups. The frequencies of evaluated mutations were similar to previously reported. MPET patients harboring CALR mutations had lower plasmatic VEGFA and FGF2 than JAK2V617F mutated, while ET patients carrying CALR mutations had lower plasmatic TGF-&#946;1 than JAK2V617F mutated. CONCLUSIONS: This study confirmed the positive correlation among TGF-&#946;1 and two other markers of angiogenesis (VEGFA and FGF2). SMADs and miRNAs expressions were similar between patients and controls, since there were no differences in TGF-&#946;1 gene expression between patients and controls. However, disparities found in the correlations between TGF-&#946;1 gene expression and different SMADs and miRNAs in patients and controls may indicate that TGF-&#946;1 gene expression regulation in studied diseases is distinct from those presented by individuals without these diseases.