Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.

La chaîne invariante (Ii) agit à titre de chaperon dans l’assemblage et le trafic des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII). Chez l’humain, les deux isoformes prédominantes, p33 et p35, diffèrent par la présence d’un motif di-arginine (RXR). Ce dernier permet la rétention de p35 au réticulum endoplasmique (RE) jusqu’à son masquage par une molécule de CMHII. La chaîne invariante forme des trimères auxquels s’associent successivement jusqu’à trois dimères αß de CMHII résultant en la formation de pentamères, heptamères et nonamères. Toutefois, la stœchiométrie exacte des complexes Ii-CMHII qui quittent le RE et le mécanisme permettant le masquage du motif RXR demeurent un sujet de débats. Dans un premier temps, nous avons examiné par une approche fonctionnelle la stœchiométrie des complexes formés autour de p33 et de p35. Nous avons observé que p35 engendre la formation de complexes nonamériques (αßIi)3 et permet l’incorporation de différents isotypes de CMHII autour d’un même trimère de p35 alors que p33 facilite la formation de pentamères (αß)1Ii3. Lors de l’étude du masquage du motif RxR par les CMHII, nous avons montré que son inactivation requiert une interaction directe (en cis) entre les sous-unités p35 et CMHII, résultant en une rétention des trimères de p35 insaturés au RE. Aussi, nous avons observé que contrairement aux complexes p33-CMHII, les complexes p35-CMHII sont retenus au RE lorsque coexprimés avec la protéine NleA de la bactérie Escherichia coli entérohémorragique. Comme l’expression de NleA interfère avec la formation des vésicules COPII responsable de l’export du RE, nous supposons que la sortie du RE des complexes p35-CMHII dépend des vésicules COPII alors que la sortie des complexes formés autour de l’isoforme p33 est indépendante de la formation de ces vésicules. La trimérisation d’Ii représente la toute première étape dans la formation des complexes Ii-CMHII. Deux domaines d’Ii permettent la formation de trimères; le domaine de trimérisation (TRIM) et le domaine transmembranaire (TM). Nous nous sommes intéressés à la nécessité de ces domaines dans la trimérisation de la chaîne et la formation subséquente de complexes avec les CMHII. Nous avons démontré que le domaine TRIM n’est pas essentiel à la trimérisation de la chaîne, à la formation de pentamères et de nonamères ainsi qu’au trafic adéquat de ces complexes Ii-CMHII dans la cellule. En absence des domaines TM d’Ii et des CMHII, nous avons observé la formation de complexes pseudo-nonamériques. Ceci suppose que la présence de ce domaine n’est pas un prérequis à la formation de nonamères. En conséquence, la présence d’un seul domaine de trimérisation de Ii est requise pour la formation de trimères et de complexes nonamériques. L’ensemble de nos résultats démontrent que la fonction de p35 n’est pas redondante à celle de p33. p35 influence de manière distincte le trafic des CMHII puisqu’il affecte la stœchiométrie des sous-unités incorporées aux complexes Ii- CMHII. / The invariant chain (Ii) assists in the folding and trafficking of MHC class II molecules (MHCII). Four different isoforms of the human Ii have been described (p33, p35, p41 and p43). The main isoforms, p33 and p35, differ by the presence of a di-arginine (RXR) endoplasmic reticulum (ER) retention motif in p35. This motif is inactivated upon binding of MHCII. In the ER, p33 and p35 assemble into trimers before associating with MHCII. The sequential binding of up to three MHCII αß dimers to Ii trimers results in the formation of pentamers, heptamers and nonamers. However, the exact stoichiometry of the Ii-MHCII complex and the mechanism allowing shielding of the ER retention motif remain a matter of debate. To shed light on these issues, we chose a functional approach to examine the stoichiometry of complexes formed around the p33 and p35 isoforms. We showed that p35 promotes formation of nonameric complexes (αßIi)3 while formation of pentameric complexes (αß)1Ii3 was observed for p33. We then showed that formation of nonameric complexes can result in the inclusion of distinct MHCII isotypes around a single trimeric p35 scaffold. When answering the question wetter masking of the p35 RXR motif by MHCII results in the formation of nonamers, we showed that the actual inactivation of motif requires a direct cis-interaction between p35 and the MHCII, precluding ER egress of unsaturated p35 trimers. Interestingly, as opposed to p33-MHCII complexes, p35-MHCII complexes remained in the ER when co-expressed with the NleA protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli. Expression of this bacterial protein is thought to interfere with the formation of COPII vesicles, leading to the conjecture that p35-MHCII and p33-MHCII complexes exit the ER in a COPII-dependant and COPII-independent manner, respectively. The trimerization of Ii represents the very first step in the formation of Ii-MHCII complex. Two domains of Ii, the trimerization domain (TRIM) and the transmembrane (TM) domain have been shown to trigger the trimerization of the chain. We focused our attention on the requirement of the two trimerization domains in Ii self-association and in the formation of pentameric and nonameric complexes. We showed that the TRIM domain of Ii is not essential for the chain’s trimerization, formation of pentamers and nonamers and for proper traffic with MHCII molecules. In absence of the Ii and MHCII TM domains, we observed the formation of a nonamer-like structure hereby suggesting that the presence of this domain is not a prerequisite for nomamer complex formation. Consequently, our results showed that either Ii trimerization domains are sufficient for Ii trimer formation and nonameric complex trafficking. Taken together, our results demonstrate that the function of the p35 isoform is not redundant, influencing distinctively MHCII trafficking as the subunit stoichiometry of oligomeric Ii/MHCII complexes is affected by p35.

Das HIV-1 Tat-Protein hemmt die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms durch Konkurrenz mit dem 11S Regulator/PA28 um die Bindungsstelle am Proteasom. Aus den kinetischen Daten und durch Strukturvergleiche geht hervor, dass die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 des Tat-Proteins für den Effekt auf das 20S Proteasom verantwortlich sind und die REG/Tat-Proteasom-Bindungsstelle bilden. Eine in der 11S Regulator alpha-Untereinheit (REG alpha) identifizierte vergleichbare Struktur wird von den Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239 gebildet. Durch eine Mutation der REG alpha Aminosäuren Glu235 und Lys236 zu Ala geht die Fähigkeit des REG alpha die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms zu stimulieren verloren, während die Bindungsfähigkeit an den 20S Komplex erhalten bleibt. Die Bindungsstelle in REG alpha ist für die verstärkte Präsentation eines Epitops des Cytomegalovirus pp89 durch MHC Klasse I essentiell. Das Tat-Protein und das Tat-Peptid 37-72 unterdrücken die 11S-Regulator vermittelte Antigenpräsentation des pp89 Epitops. Im Gegensatz dazu weist das Tat-Peptid mit Mutation der Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 zu Ala keine Reduktion der Antigenpräsentation auf. / The HIV-1 Tat protein inhibits the peptidase activity of the 20S proteasome and competes with the 11S regulator/PA28. Kinetic assays and structural comparison found amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 of Tat to be responsible for the effects on proteasomes, forming the REG/Tat-proteasome-binding site. A similar site identified in the 11S regulator alpha subunit (REG alpha) consists of the residues Glu235, Lys236 and Lys239. Mutation of the REG alpha amino acids Glu235 and Lys236 to Ala resulted in a REG alpha mutant that lost the ability to activate the 20S proteasome even though it still binds to the 20S complex. The site in REG alpha is needed to enhance the presentation of a cytomegalovirus pp89 protein-derived epitope by MHC class I molecules. Full-length Tat and the Tat peptide 37-72 suppressed 11S regulator-mediated presentation of the pp89 epitope. In contrast, a Tat peptide with mutation of amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 to Ala was not able to reduce antigen presentation.

Die Einwanderung von T-Zellen in ein Gewebe wird durch selektive Wechselwirkungen mit vaskulären Endothelzellen kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob Interaktionen zwischen Lebersinusendothelzellen (LSEC) und CD4+ T-Zellen die gewebespezifische Migration von CD4+ T-Zellen beeinflussen und damit Relevanz für den Verlauf spezifischer Immunantworten haben. Die Präsentation von Antigenen durch zytokinaktivierte LSEC erhöhte die Adhäsion und Transmigration antigenspezifischer CD4+ T-Zellen. Die Daten deuten auf eine Rolle des Lebersinusendothels bei der entzündungsinduzierten, antigenabhängigen Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in das Lebergewebe hin. Eine antigenabhängige Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC sowie deren Bereitstellung von Retinolsäure induzierte die Expression von darmspezifischen Homingrezeptoren auf CD4+ T-Zellen. LSEC-aktivierte CD4+ T-Zellen migrierten in das Darmgewebe von C57BL/6-Mäusen. Die Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass LSEC einen darmspezifischen Homingphänotyp und damit die Migration von in der Leber aktivierten CD4+ T-Zellen in den Darm induzieren. Die Bereitstellung von Chemokinen durch LSEC mittels Transzytose und Immobilisierung verstärkte die Transmigration von CD4+ T-Zellen durch das Endothel. Die Gabe eines Inhibitors der endothelialen Chemokintranszytose während einer Concanavalin A-induzierten Autoimmunhepatitis supprimierte den Verlauf der Hepatitis und führte zu einer verminderten Migration von aktivierten CD4+ T-Zellen in das Lebergewebe. Diese Daten weisen dem Lebersinusendothel eine aktive Beteiligung in der chemokinabhängigen Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in die Leber zu. In der vorliegenden Arbeit wurde die Modulation der gewebespezifischen Migration von CD4+ T-Zellen über Antigenpräsentation und Chemokinbereitstellung durch das Lebersinusendothel gezeigt und damit weitere spezifische Aspekte in der Funktion der Leber als immunologisches Organ beschrieben. / T-cell immigration into a tissue is controlled by selective interactions with vascular endothelial cells. The present study addressed the question if interactions between liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) and CD4+ T cells influence the tissue-specific migration of CD4+ T cells and thus have relevance for the course of specific immune responses. Antigen presentation by cytokine-activated LSEC increased adhesion and transmigration of antigen-specific CD4+ T cells. These results indicate an involvement of LSEC in the inflammation-induced, antigen-specific migration of CD4+ T cells into the liver tissue. Antigen-specific activation of naive CD4+ T cells by LSEC and their supply of retinoic acid induced expression of gut-specific homing receptors on CD4+ T cells. LSEC-activated CD4+ T cells migrated into the intestine of C57BL/6 mice. The findings presented here imply that LSEC induce a gut-specific homing phenotype resulting in migration of liver-activated CD4+ T cells into the intestine. The active supply of chemokines by LSEC via transcytosis and immobilization enhanced transmigration of CD4+ T cells. Administration of an inhibitor of the endothelial chemokine transcytosis during Concanavalin A-induced autoimmune hepatitis suppressed hepatitis and resulted in reduced migration of activated CD4+ T cells into the liver tissue. The data show the impact of LSEC on the chemokine-dependent recruitment of CD4+ T cells into the liver. In the present study the modulation of the tissue-specific migration of CD4+ T cells by LSEC via antigen presentation and supply of chemokines was demonstrated. Thus, additional functional aspects concerning the immunologic functions of the liver were described.

Auch unter physiologischen Bedingungen finden sich T-Zellen und andere Leukozyten nicht nur in den Sinusoiden, sondern auch im Parenchym der Leber. Da die Leber u. a. verschiedene Aufgaben für das Immunsystem übernimmt (z. B. Deletion aktivierter T Zellen, Induktion peripherer Toleranz), könnte die Akkumulation der T-Zellen in der Leber - neben der immunologischen Überwachung der Leber - Voraussetzung für ihre Modulation sein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Leber-sinusoidalen Endothelzellen (LSEC), der Barriere zwischen Blut und Leber-Parenchym, auf CD4+ T-Zellen untersucht. Zum einen zeigte sich, dass die LSEC sowohl die spontane Transmigration der T-Zellen, als auch ihre Chemotaxis zu CXCL9 und CXCL12 effizienter unterstützen als andere Endothelien. Eine endotheliale Aktivierung durch die Chemokine wurde als Mechanismus ausgeschlossen. Dagegen schien eine effiziente Präsentation der Chemokine auf der luminalen LSEC-Oberfläche nach Aufnahme von abluminal für die gesteigerte Transmigration der T Zellen verantwortlich zu sein. Die LSEC könnten somit in vivo an der Rekrutierung von T-Zellen in die Leber beteiligt sein, indem sie eine rasche Wanderung der T-Zellen aus dem Blut ins Parenchym und möglicherweise auch zurück in die Zirkulation zulassen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die LSEC fähig sind, naive CD4+ T-Zellen in vitro Antigen-spezifisch zu aktivieren. Im Vergleich zu professionellen APZ war hierfür eine höhere Antigen-Dosis notwendig, die Expansion schwächer und es waren kaum Effektorzytokin-Produzenten detektierbar. Diese konnten jedoch durch Restimulierung mit professionellen APZ induziert werden (reversibler Phänotyp), was auf einen unreifen Differenzierungsstatus der T-Zellen schließen ließ. Es bleibt zu prüfen, in welchem Maße die Aktivierung naiver CD4+ T-Zellen durch LSEC in vivo stattfindet und diese durch LSEC aktivierten CD4+ T-Zellen funktionelle Bedeutung, z. B. regulatorische Kapazität, für das Immunsystem besitzen. / The liver plays a major role for the metabolism, but it is also of general importance for the immune system, e.g. for the deletion of activated T cells or the induction of peripheral tolerance. Under physiological conditions T cells and other leukocytes can be found in the liver, in the sinusoids as well as in the parenchyma. This hepatic accumulation of T cells might be due to immunosurveillance, but it would also be a prerequisite for modulation of T cells by hepatic cells. The present study investigated two different aspects of the interaction of liver sinusoidal endothelial cells (LSEC), the barrier between the sinusoidal lumen and the hepatic parenchyma, and CD4+ T cells. In the first part of the study it could be demonstrated that LSEC support the spontaneous transmigration of CD4+ T cells as well as their chemotaxis to CXCL12 and CXCL9 more efficiently than other endothelial cells. Whereas a direct endothelial activation by chemokines could be excluded the efficient chemokine presentation at the luminal LSEC surface (after abluminal uptake) might be responsible for the enhanced T cell transmigration. The findings suggest that LSEC might be involved in the recruitment of T cells by supporting a rapid transendothelial migration. The second part of the study focused on the characteristics of LSEC in the context of antigen presentation. LSEC were able to prime and expand naïve CD4+ T cells in vitro but less effective than professional APC as proven by weaker expansion of cells, a requirement for higher antigen concentration and the lack of cytokine producing T cells. The “immature effector” phenotype of the CD4+ T cells primed on LSEC was reversible since it could be overcome by restimulation on professional APC. In conclusion these data suggest that antigen presentation by LSEC results in activation but incomplete differentiation of CD4+ T cells.

Die effiziente Präsentation von Tumorepitopen stellt einen kritischen Faktor zur Eliminierung von Tumorzellen durch die CD8+ cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) vermittelte Immunantwort dar. Eine wichtige Rolle spielt in diesem Zusammenhang die effiziente Generierung von Tumorepitopen durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS). Veränderungen von Komponenten des UPS, die an der Degradation und Prozessierung von Antigenen beteiligt sind, können daher zur Immunevasion von Tumorzellen gegenüber CTL führen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei unterschiedliche UPS-assoziierte Immunevasionsmechanismen des malignen Melanoms identifiziert, die auf einer ineffizienten Präsentation des immundominanten Tumorepitops Melan-A26-35 basieren. Ein Mechanismus beruht auf den unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften von Proteasomsubtypen, deren Expression durch INFgamma induziert wird. Proteasomen, die einerseits die Immunountereinheiten beta1i und/oder beta2i beinhalten, oder anderseits mit dem Proteasomaktivator 28 (PA28) assoziiert sind, führen zu einer drastisch reduzierten Generierung des Tumorepitops Melan-A26-35. In beiden Fällen ist dies auf eine ineffiziente Prozessierung des N-Terminus des Epitops zurückzuführen. Der andere Immunevasionsmechanismus steht im Zusammenhang mit der ER-assoziierten Degradation (ERAD), die den retrograden Transport von Proteinen aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) ins Cytosol zur proteasomalen Degradation beinhaltet. Durch Immunselektion mittels Melan-A26-35-spezifischen CTL wurden cytolyseresistente Melanomzellen identifiziert, deren Resistenz auf eine defiziente ER-assoziierte Degradation zurückzuführen ist. Dieser Defekt beruht auf einer verminderten Expression von ERAD-Komponenten, deren Reduktion die Verfügbarkeit des Antigens Melan-A zur proteasomalen Degradation und Generierung des immundominanten Epitops Melan-A26-35 wesentlich limitiert. / Efficient presentation of tumor epitopes by MHC class I molecules on the cell surface is a prerequisite for the elimination of tumor cells by cytotoxic CD8+ T lymphocytes. The generation of these epitopes requires the degradation and processing of proteins by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore alterations of UPS components can lead to tumor escape from immune recognition as a result of decreased epitope generation. In the present thesis two different UPS connected immune escape mechanisms of melanoma cells were identified. Both are based on an impaired generation of the immunodominant epitope Melan-A26-35 derived from Melan-A/MART-1 tumor antigen. One mechanism is mediated by the expression of different INFgamma-inducible proteasome immunosubunits leading to the formation of intermediate proteasome subtypes, which differ in their cleavage site preferences. Purified proteasomes harboring the immunosubunits beta1i and/or beta2i show a dramatic decrease in the generation of the Melan-A26-35 epitope. In addition, the INFgamma induced association of proteasomes with the proteaosome activator 28 (PA28) results in a reduced epitope generation. Both mechanisms are induced by an inefficient processing of the epitope’s N-terminus. The second immune escape mechanism is caused by defects of the ER-associated degradation pathway (ERAD). ERAD mediates the transport of ER-proteins back to the cytosolic compartment for proteasomal degradation. Via immunselection of tumor cells with Melan-A26-35 specific CTL, cytolysis resistant cells were identified. Resistance to CTL mediated lysis was shown to be connected to a decreased expression of ERAD components. This defect of the ERAD pathway limits the availability of the Melan-A protein and as consequence the generation of the immunodominant Melan-A26-35 epitope by proteasomes.

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine and human pathogen causing meningitis and septicemia. Recent studies suggest that S. suis possesses several virulence factors, including the capsular polysaccharide, which enable this pathogen to modulate dendritic cell (DCs) functions. DCs are key immune cells that bridge innate and adaptive immunity. Moreover, the difficulties in developing an effective vaccine suggest that S. suis interferes with the T-cell dependent response. The main objective of the project was to evaluate the effect of S. suis on CD4+ T-cell activation, as well as on the antigen presentation ability of DCs. We investigated the CD4+ T-cell memory response in an in vivo mouse model. A poor central memory response was obtained following primary and secondary infections with S. suis, thus suggesting that the adaptive immune response against this pathogen is limited. The major histocompatibility complex (MHC) class II is central to the antigen presentation pathway. We thus investigated in vitro and in vivo the expression of these molecules on DCs. We observed a modulation in the expression of MHC-II by S. suis. Transcriptional analysis of genes involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of MHC-II suggests that S. suis downregulates synthesis of MHC-II molecules and promotes their lysosomal degradation. This strategy, in which the CPS would play only a partial role, might allow S. suis to evade the T-cell dependent adaptive response. Overall, these results provide new insights into the comprehension of the adaptive immune response during the infection by S. suis.

La présentation d'antigène par les molécules d'histocompatibilité majeure de classe I (CMHI) permet au système immunitaire adaptatif de détecter et éliminer les agents pathogènes intracellulaires et des cellules anormales. La surveillance immunitaire est effectuée par les lymphocytes T CD8 qui interagissent avec le répertoire de peptides associés au CMHI présentés à la surface de toutes cellules nucléées. Les principaux gènes humains de CMHI, HLA-A et HLA-B, sont très polymorphes et par conséquent montrent des différences dans la présentation des antigènes. Nous avons étudié les différences qualitatives et quantitatives dans l'expression et la liaison peptidique de plusieurs allotypes HLA. Utilisant la technique de cytométrie de flux quantitative nous avons établi une hiérarchie d'expression pour les quatre HLA-A, B allotypes enquête. Nos résultats sont compatibles avec une corrélation inverse entre l'expression allotypique et la diversité des peptides bien que d'autres études soient nécessaires pour consolider cette hypothèse. Les origines mondiales du répertoire de peptides associés au CMHI restent une question centrale à la fois fondamentalement et dans la recherche de cibles immunothérapeutiques. Utilisant des techniques protéogénomiques, nous avons identifié et analysé 25,172 peptides CMHI isolées à partir des lymphocytes B de 18 personnes qui exprime collectivement 27 allotypes HLA-A,B. Alors que 58% des gènes ont été la source de 1-64 peptides CMHI par gène, 42% des gènes ne sont pas représentés dans l'immunopeptidome. Dans l'ensemble, l’immunopeptidome présenté par 27 allotypes HLA-A,B ne couvrent que 17% des séquences exomiques exprimées dans les cellules des sujets. Nous avons identifié plusieurs caractéristiques des transcrits et des protéines qui améliorent la production des peptides CMHI. Avec ces données, nous avons construit un modèle de régression logistique qui prédit avec une grande précision si un gène de notre ensemble de données ou à partir d'ensembles de données indépendants génèrerait des peptides CMHI. Nos résultats montrent la sélection préférentielle des peptides CMHI à partir d'un répertoire limité de produits de gènes avec des caractéristiques distinctes. L'idée que le système immunitaire peut surveiller des peptides CMHI couvrant seulement une fraction du génome codant des protéines a des implications profondes dans l'auto-immunité et l'immunologie du cancer. / Antigen presentation by major histocompatibility complex class I (MHCI) molecules allows the adaptive immune system to detect and eliminate intracellular pathogens or abnormal cells. Immune surveillance is executed by CD8 T cells that monitor the repertoire of MHCI-associated peptides (MAPs) presented at the surface of all nucleated cells. The primary human MHCI genes, HLA-A and HLA-B, are highly polymorphic and consequentially demonstrate differences in antigen presentation. We investigated qualitative and quantitative differences in expression and peptide binding. Using quantitative flow cytometry we establish clear hierarchy of expression for the four HLA-A,B allotypes investigated. Our results are consistent with an inverse correlation between expression and peptide diversity although further work is necessary to solidify this hypothesis. The global origins of the MAP repertoire remains a central question both fundamentally and in the search for immunotherapeutic targets. Using proteogenomics, we identified and analyzed 25,172 MAPs isolated from B lymphocytes of 18 individuals who collectively expressed 27 HLA-A,B allotypes. While 58% of genes were the source of 1-64 MAPs per gene, 42% of genes were not represented in the immunopeptidome. Overall, we estimate the immunopeptidome presented by 27 HLA-A,B allotypes covered only 17% of exomic sequences expressed in subjects’ cells. We identified several features of transcripts and proteins that enhance MAP production. From these data we built a logistic regression model that predicts with high accuracy whether a gene from our dataset or from independent datasets would generate MAPs. Our results show preferential selection of MAPs from a limited repertoire of gene products with distinct features. The notion that the immune system can monitor MAPs covering only a fraction of the protein coding genome has profound implications in autoimmunity and cancer immunology.

Les lymphocytes B jouent un rôle central dans l’immunité humorale par leur capacité à présenter des antigènes aux lymphocytes T, à sécréter des cytokines et à se différencier en plasmocytes produisant des anticorps. Ces fonctions peuvent être induites par leur stimulation in vitro. Par leur aptitude à présenter des antigènes indépendamment de la spécificité du récepteur des lymphocytes B (BCR), les lymphocytes B peuvent être utilisés comme cellules présentatrices d’antigènes (antigen-presenting cells, APC) afin d’induire la réponse cellulaire des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques spécifiques. L’immunité cellulaire est cruciale pour prévenir les infections contre certains virus et en immunothérapie du cancer. L’objectif général de ces travaux est d’étudier la biologie des lymphocytes B. Plus particulièrement, nous souhaitons comprendre et améliorer leur fonction de présentation d’antigène afin d’utiliser les lymphocytes B comme source alternative d’APC. Dans la première partie de ces travaux, notre attention s’est portée sur la compréhension du mécanisme de présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH-I) par lequel un épitope de la protéine gp100 du mélanome, inséré dans une nanoparticule pseudo-virale (VLP) composée de la protéine de surface du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV), est présenté par les lymphocytes B. Cette VLP est une plateforme vaccinale capable de stimuler le système immunitaire sans l’aide d’adjuvant et facilite la présentation croisée de l’épitope inséré, de façon indépendante de l’activité du protéasome. Les résultats obtenus démontrent que l’apprêtement de l’épitope inséré dans la nanoparticule s’effectue selon une voie de présentation croisée vacuolaire qui dépend de l’activité de la cathepsine S, de l’acidification des lysosomes et requiert l’induction de l’autophagie. Ainsi, nous avons défini plus précisément le mécanisme de présentation croisée par lequel les lymphocytes B apprêtent et présentent un épitope inséré dans la VLP de PapMV. Par la suite, nous avons cherché à améliorer le protocole d’activation in vitro permettant d’amplifier et d’induire les fonctions de présentation d’antigènes des lymphocytes B, dans le but d’utiliser ces cellules pour activer les réponses cellulaires des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Les stimulations in vitro des lymphocytes B par le CD40 ligand (CD40L) et l’interleukine (IL)-21 ou la combinaison de l’IL-4 et l’IL-21 au lieu de l’activation standard avec le CD40L et l’IL-4 ont été évaluées. Nos résultats ont approfondi nos connaissances de la biologie des lymphocytes B. Nous avons démontré que la stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et l’IL-21 augmente leur prolifération, mais mène à leur différenciation en plasmocytes sécrétant des anticorps. Au contraire, la stimulation avec le CD40L et l’IL-4 induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. La stimulation des lymphocytes B avec le CD40L et la combinaison de l’IL-4 et de l’IL-21 augmente leur prolifération, mène seulement faiblement à leur différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps, mais induit efficacement leur fonction de présentation d’antigènes. Nous avons démontré pour la première fois que cette méthode permet de générer des APC puissantes capables d’induire la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques in vitro. Nos résultats nous permettent de postuler que ces cellules pourraient être capables de mener à une réponse cellulaire in vivo. En tant qu’APC efficaces, les lymphocytes B pourraient être utilisés dans une stratégie vaccinale ou être employés comme APC afin d’améliorer les traitements d’immunothérapie du cancer par transfert adoptif de lymphocytes T. Ainsi, les travaux présentés dans cette thèse ont porté tant sur la compréhension des mécanismes de présentation croisée d’un épitope inséré dans la VLP de PapMV par les lymphocytes B, que sur l’amélioration de la méthode permettant d’induire leur fonction de présentation d’antigènes pour activer les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Ces travaux de recherche fondamentale ont permis de contribuer à des avancées sur les connaissances de la biologie des lymphocytes B. Ils offrent de nouvelles pistes de réflexion quant aux utilisations biotechnologiques des lymphocytes B comme source alternative d’APC pour des applications de recherche fondamentale et clinique telles que la vaccination et les traitements d’immunothérapie du cancer. / B lymphocytes are central to humoral immunity due to their ability to present antigens to T cells, secrete cytokines and to differentiate into antibody-producing plasma cells. These functions can be induced by their in vitro stimulation. Being able to present antigens independently of the specificity of their B cell receptor (BCR), B cells can be used as antigen-presenting cells (APC) to induce specific cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. Cellular immunity is crucial to prevent infections against viruses and in cancer immunotherapy. The main aim of this thesis is to study B cell biology. Specifically, we aim to deepen our understanding of their antigen presentation function and improve this function to use B cells as an alternative source of APC. First, we focused on deciphering the class I major histocompatibility complex (MHC-I) cross-presentation mechanism by which an epitope from gp100 melanoma protein, inserted in a virus-like particle (VLP) made of the coat protein of the papaya mosaic virus (PapMV), is presented by B cells. This VLP is a vaccine platform able to stimulate the immune system with no adjuvant and mediate a proteasome independent cross-presentation of the inserted epitope. Our results show that the inserted epitope is processed through a vacuolar pathway dependent on cathepsin S activity, lysosome acidification and requires the induction of autophagy. Thus, we provide a more detailed characterization of the mechanism used by B cells to process and cross-present an epitope inserted in PapMV VLP. Secondly, we aimed to improve the in vitro activation protocol used to expand B cells and induce their antigen presentation functions to use these cells to trigger cytotoxic CD8+ T cell cellular responses. We evaluated the in vitro stimulation of B cells with CD40 ligand (CD40L) and interleukin (IL)-21 or the combination of IL-4 and IL-21 instead of the standard activation method based on CD40L and IL-4. Our results deepen our knowledge of B cell biology. We showed that stimulating B cells with CD40L and IL-21 increases their proliferation but leads to their differentiation in antibody-producing plasma cells. In comparison, the stimulation with CD40L and IL-4 efficiently induces their antigen presentation function. The stimulation of B lymphocytes with CD40L and the combination of IL-4 and IL-21 increases their proliferation, weakly leads to their differentiation in antibody-secreting cells but is very efficient in inducing their antigen presentation function. We show for the first time that this method can generate potent APC able to induce cytotoxic CD8+ T cell responses in vitro. Our results allow us to hypothesize that these cells could be capable of triggering cellular immunity in vivo. As efficient APC, B cells could be used in a vaccination strategy or be employed as APC to improve cancer immunotherapy treatments such as adoptive cell transfer of T lymphocytes. Thus, the work presented in this thesis provides a deeper understanding of the antigen cross-presentation pathway by which B cells process and present an epitope inserted in PapMV VLP. It also reports an improved method to induce antigen presentation function of B cells to stimulate cytotoxic CD8+ T cells. This research work constitutes a leap forward in fundamental B cell research by increasing our knowledge of B cell biology. It also brings new opportunities regarding biotechnological uses of B cells as an alternative source of APC for fundamental and clinical applications such as vaccination and cancer immunotherapy treatments.

CD1 Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Lipidpräsentation und T-Zell-Aktivierung. CD1d fungiert als Restriktionselement für NKT-Zellen, eine T-Zell-Untergruppe, die nach Erkennung von Glykosphingolipide (GSL), IFN-gamma und IL-4 produziert. NKT Zellen steuern folglich anschliessende Immunantworten. Den meisten infektiösen Mikroorganismen mangelt es jedoch an GSL-Antigenen zur Stimulation von NKT-Zellen. Der Wirtsorganismus hat daher einen Mechanismus entwickelt, der die Aktivierung der NKT-Zellen dennoch gewährleistet. NKT-Zellen erkennen auch endogene GSL, die in dendritischen Zellen (DZ) infolge von Toll-like-Rezeptor (TLR)-Stimulation durch Pathogene produziert werden. Bislang war unklar, wie genau TLR-Aktivierung zur Produktion von Selbst-GSL-Antigenen führt. Ziel dieser Arbeit war es die Verknüpfung der beiden Prozesse aufzudecken. Diese Dissertation zeigt, dass alpha-Galaktosidase A (a-Gal A) als lysosomales Schlüsselenzym für den konstitutiven Abbau von Selbst-GSL-Antigenen in DZ fungiert. NKT-Zellen antworteten auf CD1d-restringierte Antigene, die von DZ, denen a-Gal A-Aktivität fehlte, präsentiert wurden. Ferner expandierten NKT-Zellen nach adoptiven Transfer in a-Gal A-defiziente Mäuse in Abhängigkeit von CD1d-Expression im Wirtsorganismus. Diese Arbeit zeigte auch, wie GSL-Antigene dem Abbau durch a-Gal A entkommen und für die NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen verfügbar werden. Unter normalen Bedingungen wurden die GSL durch a-Gal A abgebaut. TLR-vermittelte Signale führten jedoch zu Inhibierung der a-Gal A-Aktivität in DZ und resultierten somit in einer GSL-Akkumulation in den Lysosomen. Wir identifizierten einen neuen Regulationsmechanismus der NKT-Zell-Aktivierung bei Infektionen, der auf der Induktion von lysosomalen GSL-Antigenen durch TLR-vermittelte Hemmung der a-Gal A-Aktivität beruht. Diese Dissertation beantwortet fundamentale Fragen der NKT-Zell-Biologie und ebnet den Weg dieses System für therapeutische Ansätze zu nutzen. / CD1 molecules are pivotal for lipid presentation to T lymphocytes. Notably, CD1d functions as a restriction element for NKT cells, a T-cell lineage that produces IFN-gamma and IL-4 following recognition of glycosphingolipids (GSL). Consequently, NKT cells exert decisive regulatory functions on downstream immune responses. Most microbes potentially causing infection of the host lack GSL antigens to stimulate NKT cells. However, facing this challenge, the host developed a mechanism to ensure NKT-cell activation. This pathway exploits the property of NKT cells to react with self GSLs produced in dendritic cells (DCs) stimulated by pathogens through Toll-like receptors (TLR). How TLR engagement leads to production of self GSL antigens remains elusive. The aim of this study was to provide a mechanistic link between these two processes. Here, we identified alpha-galactosidase A (a-Gal A) as a key lysosomal enzyme required for constitutive degradation of self GSL antigens in DCs. Accordingly, NKT cells exposed to DCs lacking a-Gal A activity were activated in the context of CD1d-presented antigens. In addition, NKT cells underwent robust expansion upon transfer to a-Gal A-deficient mice that required CD1d expression by the host. This study further addressed the critical question as to how GSL antigens escape degradation by a-Gal A, and thus become available for presentation to NKT cells in infection. Accordingly, we found that TLR signaling targeted a-Gal A activity for negative regulation in DCs. Consequently, GSLs degraded by a-Gal A in steady-state conditions were induced in lysosomes. Based on these findings, we propose a new pathway that warrants the activation of NKT cells in infection by self GSL antigens induced through TLR-mediated inhibition of a-Gal A activity. Overall, this dissertation answers fundamental questions in the NKT field, and paves the way toward exploring this antigen presentation axis for therapeutic use.