The banana is a major fruit grown by small and medium producers in the state of Alagoas. Most plantations are located in the region of forest and coastline, with favorable conditions for the development of diseases. This study aimed to make the lifting of the diseases in areas of the banana plantation of Alagoas and evaluate the alternative control of moko (Ralstonia solanacearum). The first stage was conducted during the years 2006 and 2007, making up visits and collection of plant material infected in 60 areas producing of banana, fourteen municipalities in the state. The material collected was subjected to procedures for identification of pathogens associated with plants. Detaching to the diseases caused by fungi and nematodes, and identified Yellow Sigatoka (Pseudocercospora musae); Deightoniella spot (Deightoniella torulosa) and Cordana spot (Cordana musae), a widespread occurrence; Chloridium spot (Chloridium musae), only in areas with shading and combined with other leaf spots; Exosporella spot, observed in Santana do Mundaú; fitonematoses caused by Rhadophulus similis, Helicotylenchus multicinctus and Pratylenchus sp., detected only in some municipalities; Panama disease (Fusarium oxysporum f.sp. cubense ) Found in four areas in the south of the state and Moko (R. solanacearum), in three areas. The alternative control of moko was the second stage of work, bearing in mind the significant losses that this disease causes the production of bananas. In the first experiment, isolates of rizobactérias were confronted, in the BDA, with a isolated of R. solanacearum, the method of streaks and incubated at 28 º C for 72 hours. Isolates RAB7, C110, C25, R14, HLT2, HRT4 and C11 induced a significant reduction in the growth of R. solanacearum. The bacteria selected in vitro were tested in the Banana plantlets, which had its roots wounds and immersed in the suspension of bacteria (108 cfu / mL) for a period of 20 minutes. Then, the seedlings were transplanted into pots with sterile substrate and incubated in a greenhouse, for 48 hours, when infestation of the substrate with a suspension of R. solanacearum (108 cfu / mL). According to statistical analyses the isolated RAB7 proved to be an interesting bacterial antagonist, followed by isolated C110, C25 and HLT2. In the second experiment, initially, it was evaluated different concentrations of essential oils of citronela, eucalyptus citriodora, clove and ginger: 1.25%, 3.5%, 3.75% and 5% and extracts of clove, ginger, cinnamon and melon (são-caetano): 5%, 10%, 15% and 20%, measuring up the halo of inhibition of bacteria after 48 hours of assembly of the experiment. The treatments involving eucalyptus oil and extracts of melon of San Caetano, clove and cinnamon did not differ from the witness. The extract of ginger, oils of citronela, clove and ginger differed significantly the level of 5%, inhibiting the growth of R. solanacearum, in all concentrations tested, stressing that the oil of clove, followed by extracts of ginger. Banana plantlets trees were sprayed with concentrations that showed better performance in vitro: oils of citronela, clove and ginger (3.75%) and extract of ginger (20%) up to 10 ml / plant. Eight days after the plantlets were inoculated with the pathogen (108 cfu / mL). The citronela oil provided the best result, with 100% control of the disease, however, caused fitotoxidez the plants. The oil and ginger extract, were similar in effectiveness to control moko (50%), oil and clove had lower efficiency (25%). In the third experiment, were tested organic residues, 10 and 20% (v / v): cassava raspas, shellfish gravels, chicken litter, banana leaves and ginger. In vitro, cassava raspas (10%) reduced the number of colonies and halos of inhibition. Significant results were further observed with ginger 20%, shellfish gravels, banana leaves (10 and 20%). In the experiment "in vivo" the substrate sterilized was infested with the pathogen (108 cfu / mL), mixed waste selected in vitro and incubated for 20 days. Banana plantlets were transplanted in pots with the treatments. Ginger and banana leaves (10%) had low rates of infection of the plants (25%) while the shellfish gravels (10 and 20%) presented, respectively, 75 and 50% symptoms of wilt. / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / Doenças da bananeira (musa spp.) no estado de Alagoas e controle alternativo do moko (Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.). A banana é uma das principais frutas cultivadas por pequenos e médios produtores no estado de Alagoas. A maioria dos plantios está localizada na zona da mata e litoral, com condições favoráveis ao desenvolvimento de doenças. Este trabalho teve como objetivos realizar o levantamento das doenças da bananeira em áreas de plantio de Alagoas e avaliar o controle alternativo do moko (Ralstonia solanacearum). A primeira etapa foi conduzida durante os anos de 2006 e 2007, fazendo-se visitas e coleta de material vegetal infectado em 60 áreas produtoras de banana, em quatorze municípios do estado. O material coletado foi submetido a procedimentos para identificação dos patógenos associados às plantas. Destacaram-se as doenças causadas por fungos e nematóides, sendo identificadas a sigatoka amarela (Pseudocercospora musae); a mancha de Deightoniella (Deightoniella torulosa); a mancha de Cordana (Cordana musae), todas de ocorrência generalizada; a mancha de Chloridium (Chloridium musae), somente em áreas com sombreamento excessivo e associada a outras manchas foliares; a mancha de Exosporella (Exosporella sp.) observada em baixa freqüência; as fitonematoses causadas por Rhadopholus similis, Helicotylenchus multicinctus e Pratylenchus sp., detectado apenas em alguns municípios; o mal do Panamá (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) encontrado somente em quatro áreas no sul do estado e o moko (Ralstonia solanacearum), em três áreas.O controle alternativo do moko constituiu a segunda etapa do trabalho, tendo em vista as perdas significativas que esta doença provoca na produção da banana. No primeiro experimento, isolados de bactérias foram confrontados, em meio BDA, com um isolado de R. solanacearum, pelo método de estrias e incubados a uma temperatura de 28ºC durante 72 horas. Os isolados RAB7, C110, C25, R14, HLT2, HRT4, C11 induziram uma significativa redução do crescimento de R. solanacearum. As bactérias selecionadas in vitro foram testadas em mudas de bananeira, que tiveram suas raízes feridas e imersas na suspensão bacteriana (108 cel/mL), por um período de 20 minutos. Em seguida, as mudas foram transplantadas para vasos com substrato esterilizado e incubadas em casa de vegetação, por 48 horas, quando ocorreu a infestação do substrato com uma suspensão de R. solanacearum (108 cel/mL). De acordo com as análises estatísticas o isolado RAB7 mostrou-se um antagonista bacteriano, seguidos pelos isolados C110, C25 e HLT2. O isolado R14 apresentou a menor porcentagem de redução da severidade da doença. No segundo experimento, inicialmente, foram avaliadas diferentes concentrações de óleos essenciais de citronela, eucalipto citriodora, cravo-da-índia e gengibre: 1,25%; 3,5%; 3,75% e 5% e de extratos de cravo-da-índia, gengibre, canela e melão de São Caetano: 5%, 10%, 15% e 20%, medindo-se o halo de inibição da bactéria após 48 horas. O óleo de eucalipto e os extratos de melão-de-são-caetano, cravo-da-índia e canela não diferiram da testemunha. O extrato de gengibre, os óleos de citronela, de cravo e de gengibre diferiram significativamente da testemunha, inibindo o crescimento de R. solanacearum,em todas as concentrações testadas, destacando-se o óleo de cravo como o melhor tratamento, seguido por extrato de gengibre. Mudas de bananeira foram pulverizadas com as concentrações que apresentaram melhor desempenho in vitro: óleos de citronela e cravo (3,75%), óleo de gengibre (3,75%) e extrato de gengibre (20%), aplicando-se 10 ml da solução por planta. Oito dias após, as mudas foram inoculadas com o patógeno (108 cel/mL). O óleo de citronela proporcionou o melhor resultado, com 100% de controle da doença, porém as folhas das plantas com esse tratamento apresentaram sintomas de fitotoxidez. O óleo e o extrato de gengibre foram semelhantes na eficiência de controle do moko (50%), e o óleo de cravo apresentou menor eficiência (25%). No terceiro experimento foram testados os resíduos orgânicos raspas de mandioca, cascalhos de marisco, cama-de-frango, folhas de bananeira e gengibre nas concentrações de 10 e 20 % v/v. O melhor resultado foi observado no tratamento com raspas de mandioca 10 % com redução no número de colônias e presença de maior número de halos de inibição. Resultados significativos foram, ainda, observados nos tratamentos com gengibre 20% e cascalho de marisco e folhas de bananeira (10 e 20%), onde também houve aparecimento de halos de inibição. No experimento in vivo o substrato esterilizado foi infestado com o patógeno (108 cel/mL), misturado aos resíduos, secos e triturados, selecionados in vitro e incubado por 20 dias, em sacos de polietileno. Mudas de bananeira foram transplantadas para vasos com os tratamentos. Nos substratos contendo raspas de gengibre (10%) e folhas de bananeira (10%v/v) as plantas apresentaram baixos índices de infecção (25%) enquanto que nos tratamentos com cascalhos de marisco (10 e 20 %v/v) apresentaram, respectivamente, 75 e 50% de sintomas de murcha, demonstrando que houve diferença entre as dosagens. O tratamento com raspas de mandioca não diferiu da testemunha, com 100% das mudas apresentando sintomas de murcha e morte.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vera.pdf: 2531477 bytes, checksum: 5a02810a0fd91027af8891fb7a147973 (MD5) Previous issue date: 2002-02-28 / The characterization of the plasmid pLK39.was the aim of work.pLK39 was isolated from a endophytic Gram-negative, bactéria isolated from leaves form Solanum lycocarpum (Lobeira). In order to obtain a selection marker which would characterization in Escherichia coli the kanamycin, resistence gene from pUC4K. was subcloned into the PstIsite of pLK39. The characterization of PLK39 was basedon studies of stability, incompatibility, determination of the copy number and through DNA sequencing. The stability was carried out in Escherichia coli XL10 cells. Cells transformed with pLK39 were inoculated in Lúria broth containing Kanamycin (50μg/ml) during24 hours. After 24 hours of incubation one sample of the culture was in medim with and without selective pressure, and inoculated in Lúria broth without pressure médium, for 240 generations. After 240 generations 81,5% of cells maintained the plasmid, showing that pLK39is highly stable in Escherichia coli to make the incompatibility test, cells of Escherichia coli XL10 were co-transformed with pLK39/pUC18; pBR322 and pLK39/pACYC184. After 240 generations, the plasmid pLK39 iof detected in all systems used, showing the compatibility of pLK39 with the plasmids tested. The copý number pLK39 was estimated by the intensity of plasmidial bands in agarose gel, electrophoresis using a photodocumentation and analysis system (KODAK EDAS). The copý number of pLK39 was estimated as 25 copies per cell. PLK39 was digested with Sau3AI restriction and subcloned into the BamHI site of plasmid pUC18. The recombinant clones were sequenced and 1637 pb reading fragment was obtained. This sequence showed high homology with pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 and pBERT, which were isolated from Gram-negative bacteria. This sequence possesses two possible genes. The ORF I showed high homology with mobB gene from plasmid pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) and pBERT (87%). The ORF II showed homology with mobD gene from plasmids pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) and PUCD5000 (89%). / O objetivo deste trabalho foi caracterizar o plasmídeo pLK39. Este plasmídeo foi extraído de uma bactéria endofítica Gram-negativa, isolada da folha de Solanum Lycocarpum (Lobeira). Este plasmídeo apresenta um tamanho de aproximadamente 4,5 kb. Visando obter uma marca de seleção para permitir sua caracterização em células de Escherichia coli, foi introduzido o gene de resistência à Kanamicina, extraído do plasmídeo pUC4K. A caracterização do pLK39 foi realizada através de estudos de estabilidade, incompatibilidade, estimativa do número de cópias e através de seqüenciamento de parte do plasmídeo. A estabilidade foi testada em células de Escherichia coli XL10. Células transformadas com pLK39 foram cultivadas em meio Lúria suplementado com Kanamicina (50 μg/mL) durante 24 horas uma amostra da cultura era plaqueada em meio seletivo e em meio sem pressão seletiva parte dessa amostra foi inoculada em meio Lúria sem pressão seletiva e incubado por 24 até atingir 240 gerações. Após 240 gerações 81.5% das células mantiveram o plasmídeo, mostrando que o pLK39 é bastante estável em células de Escherichia coli. Para realização do teste de incompatibilidade, células de Escherichia coli XL10 foram co-transformadas com os plasmídeos pLK39/pUC18, pLK39/pBR322 e pLK39/pACYC184. Após 240 gerações, foi detectada a presença do plasmídeo pLK39 em todos os sistemas testados, demonstrando a compatibilidade do pLK39 com os plasmídeos testados. O número de cópias do pLK39 foi estimado através da comparação da intensidade das bandas plasmidiais, obtidas através de eletroforese em gel de agarose, realizada a partir de uma extração de plasmídeos de células de Escherichia coli XL10 transformadas com pUC18, pBR322 e pLK39. A quantificação de cada banda foi realizada utilizando o sistema de fotodocumentação e analise (KODAK EDAS). O número de cópias do pLK39 foi estimado em 25 cópias por células. O plasmídeo pLK39 foi digerido com enzima de restrição Sau3AI e sub-clonado no sítio de BamHI do plasmídeo pUC18. Os clones recombinantes foram seqüenciados. Foi obtido um fragmento com 1.637 pb. Essa seqüência apresentou uma grande homologia com os plasmídeos pSW200, pSW100, pEC3, pUCD5000 e pBERT, os quais foram isolados de diferentes bactérias Gram-negativas. A seqüência apresentou dois possíveis genes. A ORF I apresentou grande homologia com o gene mobB dos plasmídeos pSW200 (96%), pSW100 (96%), pEC3 (94%), pUCD5000 (94%) e pBERT (87%). A ORF II apresentou homologia com o gene mobD dos plasmídeos pSW200 (92%), pSW100 (90%), pEC3 (90%) e PUCD5000 (89%).

Pela utilização de métodos bioquímicos, biofísicos, de tipagem sorológica e de visualização das proteínas totais bacterianas, isolados de surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilápia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, foram caracterizados, identificados e sua virulência determinada. Dentre as linhagens de referência, o isolado de surubim caracterizou-se como sendo Plesiomonas shiguelloides e os demais isolados de tilápia e pacu foram identificados como Aeromonas hydrophila, todos pertencentes à família Vibrionaceae. Os isolados de tilápia e pacu caracterizaram-se como linhagens virulentas, resistentes aos antibióticos ampicilina, amoxicilina, lincomicina, novobiocina, oxacilina, penicilina, rifampicina e trimetoprim+sulfametoxazol, em ensaios de antibiograma realizados em meio YEA que evidenciaram que as linhagens isoladas de peixes são resistentes a oito das dezessete substâncias antimicrobianas testadas pelo método de difusão em disco. Essas características são compatíveis com as apresentadas pelo espécime tipo de A. hydrophila. Ambas as linhagens quando cultivadas em meio YEA compartilharam a mesma banda de aproximadamente 33,61kDa com o espécime tipo para A. hydrophila. Em meio enriquecido com glucose, a banda compartilhada entre elas teve peso molecular aproximado de 144,28kDa. Os testes de aglutinação sorológica evidenciaram nestas duas linhagens a presença de antígenos estáveis ao calor do tipo O. A técnica de dupla imunodifusão de Ouchterlony demonstrou que o antígeno preparado a partir do isolado de tilápia é a linhagem de A. hydrophila mais indicada para ser utilizada em estudos visando o desenvolvimento de uma vacina polivalente. / Bacteria isolated from surubim Pseudoplatystoma corruscans, tilapia Oreochromis niloticus e pacu Piaractus mesopotamicus, were characterized and identified by biochemical, biophysical, serology, and SDS-PAGE, and their virulence observed. The strain isolated from surubim was characterized as Plesiomonas shigelloides. The other strains isolated from tilapia and pacu were Aeromonas hydrophila. The isolated A. hydrophila strains presented virulence and resistance against the follow antibacterial substances: ampicillin, amoxicillin, lincomicin, novobiocin, oxacillin, penicillin, rifampin and trimetoprim+sulfametoxazole. Both strains when cultivated in YEA medium shared with the A. hydrophila type strain a similar protein band of 33,61kDa. In a medium supplemented with glucose, only one protein exhibiting relative molecular mass of 144.28 kDa, was shared by the type strains isolated from fish and the type strain. The serology tests revealed that all isolated strains presented heat-stable O-antigens. The Ouchterlony double-immunodiffusion showed that the antigen prepared from the tilapia strain possessed surface antigens similar to A. hydrophila type strain and the strains isolated from pacu. This suggested the possibility of development and usage of a common or polyvalent vaccine for A. hydrophila among tilapia and pacu or other freshwater fish species.

Um dos principais riscos associados às culturas inseticidas que expressam toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) é a evolução de resistência em pragas alvo, processo governado por fatores genéticos e bioecológicos que se inter-relacionam. Um dos parâmetros chave que influenciam a evolução de resistência é a freqüência inicial do alelo de resistência na população da praga alvo (FreqInicial). Devido à complexidade desse processo, experimentos para estudar sua evolução em larga escala são praticamente impossíveis. Modelos matemáticos de simulação têm sido utilizados para estimar a freqüência do alelo de resistência (FreqR) à toxina Bt ao longo das gerações da praga. O risco de resistência foi estimado utilizado o modelo de Caprio, incorporando incerteza ao parâmetro FreqInicial. Essa abordagem, denominada análise de incertezas, possibilita estimar o risco ao longo das gerações da praga, quantificado pela probabilidade de FreqR exceder um valor crítico. Os principais objetivos deste trabalho foram: (i) discutir o uso de análise de incertezas no contexto da estimação do risco de resistência e (ii) avaliar o efeito de diferentes distribuições da freqüência inicial do alelo de resistência (FreqInicial) sobre as estimativas de risco. Foi desenvolvido um software (RRiskBt), em linguagem Visual BASIC que permite quantificar o risco de resistência utilizando análise de incertezas. Os resultados da análise de incertezas indicaram que as estimativas de risco são afetadas pela distribuição de FreqInicial de modo diferenciado ao longo das gerações. As estimativas do risco de resistência, considerando a distribuição Normal para FreqInicial, são similares àquelas considerando a distribuição Triangular quando as referidas distribuições têm a mesma variância. O uso da distribuição Uniforme, ao invés da Normal ou Triangular em função da falta de informação sobre FreqInicial, leva à superestimação das estimativas de risco de resistência nas gerações iniciais e subestimação nas gerações subseqüentes à geração na qual a freqüência crítica é atingida. A análise de sensibilidade de FreqR a variações nos parâmetros FreqInicial ou DFRes possibilita estimar a geração a partir da qual a estimativa de FreqR independe da variação do parâmetro em questão dentro de um intervalo de valores possíveis preestabelecido. A utilização da análise de incertezas possibilita estimar a geração da praga alvo a partir da qual o risco de resistência é superior a 0,99, independentemente da distribuição utilizada para caracterizar a incerteza associada a FreqInicial. / One of the main risks associated to transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis (Bt) toxins is the pest resistance evolution, process driven by genetic and ecological inter related factors. A key parameter that influences the rate of resistance evolution is the initial frequency of the resistance allele in the pest population (FreqInicial). Due to complexity of that process, large scale field experiments to investigate resistance evolution are practically impossible. Mathematical simulation models have been utilized to estimate the R allele frequency (FreqR) along pest generations. The resistance risk was estimated using the deterministic Caprio’s model, incorporating uncertainty to FreqInicial. That approach, called uncertainty analysis, allows to estimate resistance risk along generations. The risk is quantified by the probability of FreqR exceeding a critical value. The main objectives of this work were: (i) to discuss the use of uncertainty analysis in the context of risk resistance estimation and (ii) to evaluate the effect of different FreqInicial input probability distributions on the risk estimates. A software (RRiskBt) was developed in Visual BASIC language to quantify risk of pest resistance evolution to Bt toxins using uncertainty analysis. The results of uncertainty analysis showed that the influence of FreqInicial input distributions on the risk estimates changes along pest generations. The risk estimates considering input Normal distribution for FreqInicial are similar to those ones obtained considering Triangular distribution if their variances are equal. The use of Uniform distribution instead the Normal or Triangular due to lack of information about FreqInicial, leads to super estimation of risk estimates for the initial generations and sub estimation for the generations after the generation for which the critical frequency is achieved. The sensitivity analysis of FreqR to FreqInicial or DFRes allows to estimate the generation after which the FreqR estimates become independent of changes in the particular parameter. The uncertainty analysis allows to estimate the pest generation after which the resistance risk is higher than 0.99, independently of the FreqInicial input distribution.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf – 810, Xf – 818 e Xf – 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf – 810 e Xf – 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf – 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf – 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N–terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf – 810, Xf – 818 and Xf – 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf – 810 and Xf – 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf – 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf – 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

O trabalho objetivou avaliar o efeito de probióticos e antibióticos utilizados como promotores do crescimento sobre o desempenho de frangos de corte e a capacidade dos agentes de alterar o ecossistema intestinal de aves criadas em baterias e sobre piso. Adicionalmente foi estudado o efeito dos probióticos sobre a presença de oocistos na cama das aves. Os antibióticos tiveram sua eficácia, como promotores de crescimento, comprovada para aves criadas sobre piso, mas não em bateria. Foram observadas alterações na estrutura da comunidade de Bacteria no trato intestinal de frangos criados em baterias e sobre piso e suplementados com antibióticos. Não houve evidência de efeito favorável dos probióticos sobre o desempenho e incidência de oocisto na cama das aves. Os probióticos não tiveram a capacidade de colonizar o epitélio intestinal de frangos de corte. Foram observadas discretas modificações na estrutura da comunidade de Bacteria de frangos criados em bateria e sobre piso e suplementados com dietas contendo probióticos. A estrutura da comunidade de Bacteria do intestino delgado de frangos foi modificada em função do ambiente no qual frangos, suplementados com probióticos e antibióticos, foram criados. Frangos isentos de qualquer tipo de promotor de crescimento apresentaram 15 unidades taxonômicas operacionais distintas na microbiota intestinal aderida ao epitélio, predominantemente Lactobacillus e Pseudomonas. / This study was conducted to evaluated the effects of growth promoter probiotic and antibiotics on the perfomance and organ morphometry of broiler chickens raised in floor pens and in batteries and the ability of the additive to promote changes in the intestinal ecosystem. Additionally, the effect of probiotics on the presence of coccidia oocysts in the litter was evaluated. The efficacy of antibiotics as growth promoters was observed when the chickens were raised in floor pens but not in batteries. Antibiotic supplementation caused changes in the structure of Bacteria community of the intestinal tract of chicken raised in floor pens or in batteries. The probiotic additives tested did not result in improvement in performance in both environmental or in oocyst incidence in the litter. Also, the probiotic did not have the ability to colonize the intestinal epithelium of the birds. Discrete changes in the structure of Bacteria community were observed when probiotics were supplemented to chickens raised in floor pens or in batteries. Bacteria community structure in the small intestine of chicken was modified as a function of the environmental in which the birds were raised. Chicken fed diets devoid of growth promoters had 15 distinct phylogenetic groups in the microbiota adhered to the intestinal epithelium.

A bactéria Xylella fastidiosa causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Em 2000, foi concluído o seqüenciamento do genoma deste organismo, o primeiro de uma bactéria fitopatogênica, um fato que estimulou o estudo dos possíveis mecanismos de patogenicidade empregados pela bactéria para causar a doença em citros. X. fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Especula-se que a bactéria produza enzimas que degradem a membrana da pontuação, permitindo a colonização de novos vasos do xilema. A identificação de genes com similaridade de seqüência a genes de celulases, xilanases, pectinases e proteases, fomentou o presente estudo visando caracterizar os genes Xf - 810, Xf - 818 e Xf - 2708, similares a endoglicanases. Estes genes foram clonados em vetores de expressão e as respectivas proteínas foram produzidas em Escherichia coli. Através de ensaios enzimáticos as proteínas foram caracterizadas como endoglicanases (EC 3.2.1.4), que são celulases com mecanismo endoglicolítico de ataque às moléculas de celulose. Estas celulases hidrolisam carboximetil celulose, Avicel e xilana, enquanto as enzimas Xf - 810 e Xf - 818 hidrolisam a celulose amolecida com ácido. Estas celulases degradam mais eficientemente a carboximetil celulose em pH ácido (entre 5,2 e 5,6) e na temperatura de 65 °C. Coletivamente, estas celulases são capazes de degradar polímeros solúveis e insolúveis, enquanto a enzima Xf - 818, é capaz de degradar oligossacarídeos derivados da celulose, como celotetraose e celopentaose, apresentando ampla variação catalítica. Esta celulase possui capacidade de ligação à celulose microcristalina, denotando a funcionalidade de seu domínio ligador de celulose. Desenvolvemos um protocolo, empregando cromatografia de troca aniônica, afinidade por metal (níquel) e filtração em gel, eficiente na purificação da proteína Xf - 818 expressa heterologamente em E. coli com fusão hexahistidina à extremidade N-terminal. A caracterização enzimática destas proteínas, com a confirmação da atividade celulásica, fornece subsídios para uma eventual função das celulases durante a colonização do hospedeiro pela bactéria, pois são cataliticamente funcionais. Ademais, corrobora a similaridade destes genes, verificada durante o seqüenciamento do genoma de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". The recent sequencing of its genome, achieved in 2000, was the first of a plant pathogen, a fact that stimulated the search for putative pathogenicity factors employed by this bacterium while infecting citrus trees. X. fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, being transmitted by sharpshooter vectors. Several authors argue that the bacterium produces enzymes to degrade plant cell, as a way to colonize new xylem vessels through pit membrane degradation. The identification of putative cellulases, xylanases, pectinases and proteases on X. fastidiosa genome, led us to carry out the present work to characterize the putative products of the endoglucanase genes Xf - 810, Xf - 818 and Xf - 2708. These genes were cloned into expression vectors and the proteins were produced in Escherichia coli. Based upon enzymatic assays, those proteins were characterized as endoglucanases (EC 3.2.1.4), which are cellulases able to promote the endo-hydrolysis of cellulose chains. These cellulases degraded carboxymethylcellulose, Avicel and xylan, while only Xf - 810 and Xf - 818 degraded acid swollen cellulose. The hydrolysis of carboxymethylcellulose was higher at acidic pH between 5.2 and 5.6) and at a temperature of 65 °C. As a group, these enzymes were able to degrade soluble and insoluble cellulose derivatives, while only the cellulase Xf - 818 could hydrolyze the cello-oligosaccharides cellotetrose and cellopentose, thus showing a high catalytic diversity. This protein also has the capacity to bind microcristalline cellulose, confirming the presence of a functional cellulose-binding domain. We set a protocol, employing anion exchange, metal affinity and gel filtration chromatography, to purify the Xf - 818 enzyme expressed in E. coli as a N-hexahistine fusion tag. The endoglucanase activity studied gives support for an eventual role of such cellulases during host colonization by the bacterium. Besides that, it agrees with similarities searches observed on the sequencing of X. fastidiosa genome.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-07-04T12:28:13Z No. of bitstreams: 1 Danubia Ramos Moreira de Lima.pdf: 2018961 bytes, checksum: 28f049e2a7315cb47c8a752dac394717 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-04T12:28:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danubia Ramos Moreira de Lima.pdf: 2018961 bytes, checksum: 28f049e2a7315cb47c8a752dac394717 (MD5) Previous issue date: 2012-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The sugar cane (Saccharum spp.) Culture is a widely distributed and is currently scattered across all continents, with the main world producer Brazil. Given the continued growth and expansion of the agricultural culture of sugar cane in Brazil, productive development should occur in parallel with agricultural techniques aimed at the economic viability and to minimize the degradability of the environment, such as the use of microrganisms that promote plant growth. In this context, biological nitrogen fixation (BNF) has emerged as an option to use in production systems. Objectives of the study was to diazotrophs isolate, estimate the density population, linagens Identify the bacterial genetic diversity assess bacterial culturable and unculturable by the techniques of BOX-PCR and DGGE of 16S rRNA and nifH genes, functionally characterize the bacterial isolates for the production of indole acetic acid, inorganic phosphate solubilization, production of quorum sensing, isolates selecting to promote plant growth and evaluate their interaction with plants of sugar cane in a greenhouse.To do this, first, samples were collected from two varieties (RB92579 and RB867515) of sugar cane at the Estação Experimental de cana-de-açúcar de Carpina, PE, Universidade Federal Rural de Pernambuco, these were isolated potentially fixing bacteria N2. After isolation and selection of N2-fixing bacterial strains was relization functional characterization for the production of indole acetic acid (IAA), phosphate solubilization index (SI), production the quorum sensing (QS) and evaluated genetic variability through technical of BOX-PCR and PCR-DGGE for 16S rRNA. Ten bacterial isolates were selected for reinoculation wheels in two varieties of sugar cane grown in the greenhouse. Results was evident in the high and variable functionality for the BNF, AIA, IS and QS production. Regardless of the technique used to study the genetic variability was observed for the high genetic diversity of bacteria from the rhizosphere and roots of ratoon cane varieties RB92579 and RB867515 cultivated in Pernambuco. Reinoculation of bacterial strains in sugar cane has been shown that some bacteria benefit the development of plants in relation to control plants. / A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma cultura amplamente distribuída e atualmente dispersa em todos os continentes, tendo como principal produtor mundial o Brasil. Diante da ampliação e contínuo crescimento agrícola da cultura da cana-de-açúcar no Brasil, o desenvolvimento produtivo deve ocorrer em paralelo com técnicas agrícolas que visem a viabilidade econômica e que minimizem a degradabilidade do meio ambiente, como por exemplo, o uso de micro-organismos que promovam o crescimento vegetal. Neste contexto, a fixação biológica de nitrogênio (FBN) desponta como uma opção de uso nos sistemas produtivos. Diante do exposto, os objetivos do trabalho foi isolar bactérias diazotróficas, estimar a densidade populacional, identicar as linagens bacterianas, avaliar a diversidade genética bacteriana cultivável e não cultivável por meio das técnicas de BOX-PCR e DGGE dos genes 16S rRNA e nifH, caracterizar funcionalmente os isolados bacterianos para a produção do ácido indol acético, solubilização de fosfato inorgânico, produção de quorum sensing, selecionar isolados promissores para a promoção do crescimento vegetal e avaliar sua interação com plantas de cana-de-açúcar em casa de vegetação. Para tal, primeiramente, foram coletadas amostras de duas variedades (RB 92579 e RB 867515) de cana-de-açúcar da Estação Experimental de Cana-de-Açúcar de Carpina, PE, da Universidade Federal Rural de Pernambuco, destas foram isoladas bactérias potencialmente fixadoras de N2. Após o isolamento e seleção das linhagens bacterianas fixadoras de N2 foi relizado a caracterização funcional para produção do ácido indol acético (AIA), índice de solubilização de fosfato (IS), produção da molécula quorum sensing (QS) e avaliada variabilidade genética através da técnica de BOX-PCR e PCR-DGGE para o gene 16S rRNA e nifH. As bactérias foram identificados por análise da seqüência parcial do 16S rDNA. Dez isolados bacterianos foram selecionados para a reinoculação em rebolos de duas variedades de cana-de-açúcar, cultivadas em casa de vegetação. Nos resultados obtidos foi evidente a elevada e variável funcionalidade para a FBN, AIA, IS e produção de QS. Independente da técnica utilizada para o estudo da variabilidade genética foi observado elevada diversidade genética para as bactérias oriundas da rizosfera e de raízes de cana soca das variedades RB92579 e RB867515 cultivadas em Pernambuco. Na reinoculação de linhagens bacterianas em cana-de-açúcar foi evidenciado que algumas bactérias beneficiam o desenvolvimento das plantas em relação às plantas controle.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andre Luis Willerding.pdf: 1072090 bytes, checksum: 40252d9eb53ef8726b984868bb04a34a (MD5) Previous issue date: 2007-09-28 / The biotechnology industries look for new products or in the improvement of the already existent processes with the use of the genetic available resources. The recent advancements in areas as metabolic roads and directed evolution of the protein, they indicate an exchange of the paradigm of the traditional biology to biotechnology. This work presents a selection of bacteria producer of lipase, with the objective to apply the enzyme in the Buriti oil hydrolysis. Of 440 activated bacteria, 181 isolated ones were effectively tested in medium inductors. Of this total, 75 isolated ones (41 %) showed lipase production. The enzymatic activity were tested in different temperatures (30º, 35º, 40º, 45ºC), with the enzymatic activity lessening with the increase of the temperature. To 30ºC had to peak of enzymatic activity. After 72 hours of cultivation in Petri dishes containing olive oil as substrate, the enzymatic index was valued through the relation beTween the diameter of the halo around the colony and the diameter of the colony. The isolated they were classified in different categories according to the enzymatic activity. Of isolated tested, twenty four were selected for the quantitative lipase tests and also for the affinity tests to Buriti oil in Petri dishes. After, it was possible to select six streams (INPA P-106; INPA P-108; INPA P-124; INPA P-798; INPA P-803 and INPA P-799). There were no significant differences beTween the six bacterias and they all were selected for the tests of enzymatic hydrolysis of the Buriti oil. The enzymatic hydrolysis was analysed by Response Surface Methodology. The selected bacterium (INPA P-798) presented the biggest affinity regarding the Buriti oil when were compared with others five bacterias. The profit of the hydrolysis with the precipitate enzyme (33,84 % fat acid free ) was superior to that of the purified lipase and crude extract results. The optimal activity were beTween 6,0 and 8,5 pH values above 3 hours. The extracellular lipase was purified by Sephadex G-25 gel and his kinetic analysis it presented the best activity 55ºC and pH 8,5. The lipolytic enzyme was promoted by CaCl2 and ZnSO4 that increase of the activity in 22 % and 18 %, respectively. The activity was inhibited by MgSO4 in 13%. The specific activity of the lipase purified was Vmax = 12500 μM p-NP.mL-1 e Km = 1,125 μM p-NP.min-1. The selected bacteria is a Burkholderia cepacia, a classic producer of lipase. / As indústrias biotecnológicas vêm buscando novos produtos ou realizando mehorias dos processos já existentes a partir dos recursos genéticos disponíveis. Os avanços recentes em áreas como biossíntese, rotas metabólicas e evolução dirigida de proteínas, indicam uma troca de paradigma da biologia tradicional para a biotecnológica. Esse trabalho apresenta uma seleção de bactérias produtoras de lipase visando a aplicação na hidrólise de óleo de buriti. De 440 isolados bacterianos testados, 181 foram selecionados para os testes qualitativos em placas de Petri. Desses, 75 isolados (41%) foram lipase positivos. A atividade enzimática foi analisada em diferentes temperaturas (30o, 35o, 40o e 45oC). Após 72 horas de cultivo em meio de cultura indutor contendo óleo de oliva como substrato, os índices enzimáticos foram avaliados através da relação entre o diâmetro do halo ao redor da colônia e o diâmetro da colônia. Aos 30oC houve a maior atividade enzimática, servindo assim como temperatura chave para a seleção. Os isolados foram classificados em diferentes categorias conforme a atividade enzimática e comparados com uma estirpe padrão. Assim, vinte e quatro foram selecionados para os testes quantitativos. Desses, foi possível selecionar seis isolados bacterianos (INPA P-106; INPA P-108; INPA P-124; INPA P-798; INPA P-803 e INPA P-799). Não houve diferenças significativas entre esses seis e todos foram selecionados para os testes de hidrólise enzimática do óleo de buriti. A bactéria selecionada (INPA P-798) apresentou a melhor afinidade ao óleo de buriti e o seu rendimento com a enzima precipitada (em % de ácidos graxos liberados) foi superior ao da sua lipase purificada e do seu extrato bruto. A enzima purificada apresentou atividade ótima a 55ºC e em pH 8,5. O CaCl2 e ZnSO4 promoveram o aumento da atividade em 22% e 18%, respectivamente, e o MgSO4 reduziu a atividade em 13%. Nos ensaios com diferentes concentrações de substrato, a enzima obteve um valor de Vmax = 12500 μM p-NP.mL-1 e Km = 1,125 μM p- NP.min-1. Das seis bactérias selecionadas, quatro pertecem ao gênero Burkholderia, uma ao gênero Klebsiella e uma não foi identificada ao nível de espécie. A bactéria selecionada (INPA P-798) pertence à espécie Burkholderia cepacia , uma clássica produtora de lipase.

Um dos principais riscos associados às culturas inseticidas que expressam toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) é a evolução de resistência em pragas alvo, processo governado por fatores genéticos e bioecológicos que se inter-relacionam. Um dos parâmetros chave que influenciam a evolução de resistência é a freqüência inicial do alelo de resistência na população da praga alvo (FreqInicial). Devido à complexidade desse processo, experimentos para estudar sua evolução em larga escala são praticamente impossíveis. Modelos matemáticos de simulação têm sido utilizados para estimar a freqüência do alelo de resistência (FreqR) à toxina Bt ao longo das gerações da praga. O risco de resistência foi estimado utilizado o modelo de Caprio, incorporando incerteza ao parâmetro FreqInicial. Essa abordagem, denominada análise de incertezas, possibilita estimar o risco ao longo das gerações da praga, quantificado pela probabilidade de FreqR exceder um valor crítico. Os principais objetivos deste trabalho foram: (i) discutir o uso de análise de incertezas no contexto da estimação do risco de resistência e (ii) avaliar o efeito de diferentes distribuições da freqüência inicial do alelo de resistência (FreqInicial) sobre as estimativas de risco. Foi desenvolvido um software (RRiskBt), em linguagem Visual BASIC que permite quantificar o risco de resistência utilizando análise de incertezas. Os resultados da análise de incertezas indicaram que as estimativas de risco são afetadas pela distribuição de FreqInicial de modo diferenciado ao longo das gerações. As estimativas do risco de resistência, considerando a distribuição Normal para FreqInicial, são similares àquelas considerando a distribuição Triangular quando as referidas distribuições têm a mesma variância. O uso da distribuição Uniforme, ao invés da Normal ou Triangular em função da falta de informação sobre FreqInicial, leva à superestimação das estimativas de risco de resistência nas gerações iniciais e subestimação nas gerações subseqüentes à geração na qual a freqüência crítica é atingida. A análise de sensibilidade de FreqR a variações nos parâmetros FreqInicial ou DFRes possibilita estimar a geração a partir da qual a estimativa de FreqR independe da variação do parâmetro em questão dentro de um intervalo de valores possíveis preestabelecido. A utilização da análise de incertezas possibilita estimar a geração da praga alvo a partir da qual o risco de resistência é superior a 0,99, independentemente da distribuição utilizada para caracterizar a incerteza associada a FreqInicial. / One of the main risks associated to transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis (Bt) toxins is the pest resistance evolution, process driven by genetic and ecological inter related factors. A key parameter that influences the rate of resistance evolution is the initial frequency of the resistance allele in the pest population (FreqInicial). Due to complexity of that process, large scale field experiments to investigate resistance evolution are practically impossible. Mathematical simulation models have been utilized to estimate the R allele frequency (FreqR) along pest generations. The resistance risk was estimated using the deterministic Caprio’s model, incorporating uncertainty to FreqInicial. That approach, called uncertainty analysis, allows to estimate resistance risk along generations. The risk is quantified by the probability of FreqR exceeding a critical value. The main objectives of this work were: (i) to discuss the use of uncertainty analysis in the context of risk resistance estimation and (ii) to evaluate the effect of different FreqInicial input probability distributions on the risk estimates. A software (RRiskBt) was developed in Visual BASIC language to quantify risk of pest resistance evolution to Bt toxins using uncertainty analysis. The results of uncertainty analysis showed that the influence of FreqInicial input distributions on the risk estimates changes along pest generations. The risk estimates considering input Normal distribution for FreqInicial are similar to those ones obtained considering Triangular distribution if their variances are equal. The use of Uniform distribution instead the Normal or Triangular due to lack of information about FreqInicial, leads to super estimation of risk estimates for the initial generations and sub estimation for the generations after the generation for which the critical frequency is achieved. The sensitivity analysis of FreqR to FreqInicial or DFRes allows to estimate the generation after which the FreqR estimates become independent of changes in the particular parameter. The uncertainty analysis allows to estimate the pest generation after which the resistance risk is higher than 0.99, independently of the FreqInicial input distribution.