Orientador: Luiz Carlos Marques / Banca: Fabiano Antonio Cadioli / Banca: Lúcia Helena Rodrigues / Resumo: Sabendo-se que os valores laboratoriais de referência devem ser estabelecidos para cada espécie e em seus grupos, este estudo objetivou estabelecer valores hematológicos e bioquímicos séricos de referência para jumentos da raça Pêga; determinar diferenças entre as faixas etárias, sexos, fêmeas prenhes e não prenhes, além de acompanhar mudanças durante o primeiro ano de vida. Foram realizados hemogramas, análises bioquímicas séricas e fracionamento de proteínas por eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) de amostras de animais com zero a um, um a três e com mais de três anos de idade, machos e fêmeas. No primeiro ano de vida, apenas a porcentagem de monócitos (Mon), níveis de albumina (Alb), triglicérides (Trig), magnésio (Mg) e cloretos (Cl) não diferiram significativamente. Os animais até um ano tiveram as maiores médias para a contagem total de leucócitos (Leu), neutrófilos bastonetes (NB), fosfatase alcalina (FA), glicose (Glic), colesterol (Col), fósforo (P), imunoglobulina A (IgA) e ceruloplasmina (Cer) e as menores para a aspartato aminotransferase (AST), gama glutamiltransferase (GGT), creatinina (Crea), bilirrubina indireta (BI), cálcio (Ca), Cl, proteína de peso molecular (PPM) 138 kDa e albumina obtida por eletroforese (Albe). Além disso, possuem médias de volume globular (VG), concentração de hemoglobina (Hb) e 1-glicoproteína ácida (A1GA) superiores e porcentagem de eosinófilos (Eos), níveis de ureia (Ur) e Trig inferiores àquelas do grupo com mais de três anos. Os animais mais velhos tiveram a menor média para Mon e os maiores valores para bilirrubina total (BT) e transferrina (Trans). O grupo com um a três anos apresentou potássio (K) sérico mais elevado que os animais acima de três anos. O cálcio inorgânico (Cai) teve sua maior média nos animais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The reference laboratory values must be determined for each specie and specific group. Therefore, the aim of this experiment were to determine the hematological and serum biochemical reference values for Pêga breed; to determine differences among age, sex, pregnant and non-pregnant females; and describe the changes during the first year of age. The complete blood count, serum biochemical analysis and the protein fractionation by means of sodium dodecyl sulphate - poliacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of blood samples collected from animals until one year, from one to three years, and over three year of age, males and females, were analysed. During the first year, just monocytes percentage (Mon), levels of albumin (Alb), triglycerides (Trig), magnesium (Mg) and chloride (Cl) did not differ significantly. The animals until one year of age had the highest means for leukocytes (Leu), band cells (BC), alkaline phosphatase (AP), glucose (Gluc), cholesterol (Chol), phosphorus (P), IgA and ceruloplasmin (Cer) and the lowest for aspartate aminotransferase (AST), gamma glutamyl transferase (GGT), creatinine (Crea), unconjugated bilirubin (UB), calcium (Ca), Cl, 138 kDa molecular weight protein (MWP) and albumin of electrophoresis (Albe). Moreover, they had means of packed cell volume (PCV), hemoglobin concentration (Hb) and 1-acid glycoprotein (A1AG) higher and means of eosinophils percentage (Eos), levels of urea (Ur) and Trig lower than animals over three years old. The oldest animals had the smallest mean for Mon and the biggest values for total bilirubin (TB) and transferrin (Trans). The group between ages of one and three years old showed serum potassium (K) higher than animals over three years old. The inorganic calcium (Cai) was higher for animals until one year old, followed by the oldest animals... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Fábio Erminio Mingatto / Banca: Fernanda Mani / Resumo: Estudos anteriores demonstraram que o tratamento de ratos diabéticos com 90 mg de curcumina/kg de peso corporal (pc) incorporada ao iogurte, durante 31 dias, melhorou diversos parâmetros fisiológicos e bioquímicos alterados no diabetes, em relação aos animais diabéticos tratados somente com água ou iogurte. Contudo, a baixa biodisponibilidade da curcumina tem estimulado a investigação de alternativas para melhorar seu efeito farmacológico. Também tem sido demonstrado que a piperina promove aumento na biodisponibilidade de determinados fármacos, quando co-administrados por via oral, inclusive da própria curcumina. O objetivo deste estudo foi investigar as atividades antidiabética e antioxidante da curcumina (90 mg/kg pc) isoladamente ou em associações com piperina (20 ou 40 mg/kg pc) incorporada em iogurte, em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). Ratos machos (10 animais/grupo) em modelo de diabetes estreptozotocínico foram tratados por via oral durante 45 dias com: iogurte (DIOG); com insulina (4U/dia, DINS, via subcutânea); 90 mg de curcumina/kg pc incorporada em iogurte (DC90), 20 ou 40 mg de piperina/kg pc (DP20 e DP40, respectivamente) e associações de 90 mg de curcumina/kg pc e 20 ou 40 mg de piperina/kg pc (DC90P20 e DC90P40, respectivamente). Os parâmetros fisiológicos: peso corporal, consumo de ração. ingestão hídrica e volume urinário e parâmetros bioquímicos: glicemia, glicosúria, ureia urinária e proteinúria foram analisados semanalmente, enquanto os parâmetros relacionados ao perfil lipídico (triacilgliceróis, colesterol total e colesterol-HDL) e de função hepática (ALT, AST e ALP) foram analisados quinzenalmente. Após a eutanásia, também foram removidos e pesados os músculos esqueléticos soleus e extensor digitorum longus (EDL), e os tecidos adiposos epididimal e retroperitoneal e ainda o fígado foi retirado para determinação da atividade de enzimas antioxidantes e de ... / Abstract: Previous studies showed that the treatment of diabetic rats with 90 mg of curcumin/kg body weight (bw) incorporated into yoghurt, for 31 days, improved several physiological and biochemical parameters altered in diabetes, compared to diabetic animals treated only with water or yoghurt. However, the low bioavailability of curcumin has stimulated the research of alternatives to improve its pharmacological effect. It has also been shown that piperine promotes an increase in the bioavailability of certain drugs when co-administered orally, including curcumin. The aim of this study was to investigate the antidiabetic and antioxidant activities of curcumin (90 mg/kg bw) alone or in combination with piperine (20 or 40 mg/kg bw) incorporated into yoghurt in diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Male rats (10 animals/group) under estreptozotocin diabetes model were orally treated for 45 days with: yoghurt (DYOG); insulin (4U/day, DINS, subcutaneously); 90 mg/kg curcumin incorporated into yoghurt (DC90), 20 or 40 mg/kg piperine (DP20 and DP40, respectively) associations of 90 mg of curcumin/kg bw and 20 or 40 mg of piperine/kg bw (DC90P20 and DC90P40, respectively) and The physiological parameters: body weight, food and water intake and urinary volume, and the biochemical parameters: glycemia, glycosuria, proteinuria and urinary urea were analyzed weekly, while the parameters related to lipid profile (triglycerides, total cholesterol and HDL-cholesterol) and liver function (ALT, AST and ALP) were analyzed at every 15 days. After euthanasia, it were removed and weighed the skeletal muscles soleus and extensor digitorum longus (EDL) and the epididymal and retroperitoneal white adipose tissues; liver was also removed to determine the activity of antioxidant enzymes and the levels of oxidative stress biomarkers. The treatment of diabetic rats with curcumin incorporated into yoghurt improved all parameters related to this experimental model of ... / Mestre

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The fruit growers are adapting to changes in consumption patterns and increased demand from consumers about the quality of fresh fruits available. The market need to meet the demand from consumption centers, which are increasingly distant from the centers of production, makes it necessary to prolong the shelf life of fruits without these attributes lose their health protection as a result of natural aging process. Research aimed at developing new technologies for reducing post harvest losses are fundamental to the national economy, and minimize losses, increase competitiveness and seek to meet the qualities of an increasingly demanding mark et. Biodegradable films and edible coatings have received attention in recent years, mainly due to its potential application for preserving fruit. The objective of this work was to study the biodegradable films prepared from galactomannan of Caesalpinia pu lcherrima and glycerol aiming its use in the creation of packaging to increase shelf life of fruits. Initially we analyzed the effect of preparation conditions of films on the properties of barriers and found that both temperature and drying time cause a p ositive effect on the permeability to water vapor of these films, being chosen, so the temperature of 50  C and 12 hours as standard methodology for preparing the films. Then , we studied the influence of concentrations of galactomannan and glycerol on phy sical - chemical properties and found that the variables were statistically significant in all properties, highlighting that the glycerol had a positive influence on all tests, increasing concentration of glycerol provides increased studied property , probabl y due to its hygroscopic character. The increase in the concentration of galactomannan causes a decrease in absorption, moisture content and oxygen permeability and carbon dioxide. It was observed that temperature and relative humidity have a major influen ce on the barrier properties of the films, since the increase of these variables causes an increase in permeability to water vapor and oxygen. To understand how films behave in the face of mechanical stress, we studied the influence of the galactomannan an d glycerol on the mechanical properties and found that the thickness of the films increases with these variables and that the polysaccharide is responsible for increasing the tensile strength , puncture and tear strength of the films and the plasticizer has a positive influence on elongation and tear strength. After the knowledge of all the physico - chemical, mechanical and barrier properties and having the formulations which afforded us the desired properties optimized, we chose the formulation of GalGl y (0 . 4:1 . 0) (%, m: m) to test the performance of films for packaging to maintain the shelf life of sliced apples. It was observed that the apples they received the protection of the films showed the lowest respiration rate, weight loss 10% lower and lower level s of browning, brightness and color variation when compared with those who were not covered under the tested conditions. Thus, the films studied in this work have great potential for application in the packaging sector and contribute to increase the shelf life of fruits / Os produtores de frutas estÃo se adaptando Ãs mudanÃas nos padrÃes de consumo e exigÃncia cada vez maior dos consumidores quanto à qualidade das frutas frescas disponÃveis no mercado. A necessidade do mercado de atender à demanda dos centros de consumo, que estÃo cada vez mais distantes dos centros de produÃÃo, faz com que seja necessÃrio, prolongar a vida Ãtil das frutas sem que estas percam seus atributos de proteÃÃo à saÃde, em consequÃncia do processo de senescÃncia natural. Pesquisas voltadas ao desenvolvimento de novas tecnologias para a reduÃÃo das perdas pÃs-colheita sÃo fundamentais para a economia nacional: alÃm de minimizar as perdas, elevam a competitividade e procuram atender Ãs qualidades de um mercado cada vez mais exigente. Filmes biodegradÃveis e revestimentos comestÃveis tÃm recebido atenÃÃo nos Ãltimos anos, principalmente em funÃÃo de seu potencial de aplicaÃÃo para conservaÃÃo de frutas. O objetivo deste trabalho foi estudar os filmes biodegradÃveis preparados a partir de galactomanana de Caesalpinia pulcherrima e glicerol visando o seu emprego na constituiÃÃo de embalagens para aumentar o tempo de prateleira de frutos. Inicialmente foi analisado o efeito das condiÃÃes de preparaÃÃo dos filmes nas propriedades de barreiras e foi observado que tanto temperatura quanto tempo de secagem causam um efeito positivo na permeabilidade ao vapor de Ãgua desses filmes, sendo escolhido, assim, a temperatura de 50 ÂC e 12 horas como metodologia padrÃo de preparaÃÃo dos filmes. Em seguida, foi avaliado a influÃncia das concentraÃÃes de galactomanana e glicerol nas propriedades fÃsico-quÃmicas, foi verificado que as variÃveis foram estatisticamente significativas, com destaque para o glicerol que apresentou influÃncia positiva em todos os testes, ou seja, o aumento da concentraÃÃo do glicerol proporciona um aumento na absorÃÃo de umidade, conteÃdo de umidade, permeabilidade ao vapor de Ãgua e na permeabilidade ao oxigÃnio e ao diÃxido de carbono, provavelmente devido ao seu carÃter higroscÃpico. O aumento na concentraÃÃo de galactomanana provoca uma diminuiÃÃo na absorÃÃo de umidade, conteÃdo de umidade e na permeabilidade ao oxigÃnio e diÃxido de carbono. Foi observado que a temperatura e a umidade relativa apresentam uma grande influÃncia nas propriedades de barreiras dos filmes, visto que o aumento dessas variÃveis provoca um aumento na permeabilidade ao vapor de Ãgua e ao oxigÃnio. Para entender como os filmes se comportariam frente a esforÃos mecÃnicos, foi avaliado a influÃncia das concentraÃÃes de galactomanana e de glicerol nas propriedades mecÃnicas e foi verificado que a espessura dos filmes aumenta com o aumento dessas variÃveis e que o polissacarÃdeo à responsÃvel por aumentar a elasticidade, a forÃa de perfuraÃÃo e ruptura dos filmes e que o plastificante tem influÃncia positiva no alongamento e na forÃa necessÃria para rasgar o filme. ApÃs o conhecimento de todas as propriedades fÃsico-quÃmicas, de barreira e mecÃnicas e tendo as formulaÃÃes necessÃrias para a finalidade proposta, a formulaÃÃo GalGli de (0,4:1,0) (%, m:m), foi escolhida para testar o desempenho dos filmes como embalagem na manutenÃÃo do tempo de prateleira de maÃÃs fatiadas. Foi observado que as maÃÃs que receberam a proteÃÃo dos filmes apresentaram a menor taxa de respiraÃÃo, perda de massa 10% menor e baixos Ãndices de escurecimento e variaÃÃo de cor quando comparadas com aquelas que nÃo foram recobertas nas condiÃÃes testadas. Dessa forma, os filmes estudados neste trabalho possuem grande potencial para aplicaÃÃo no setor de embalagens e contribuir para aumentar o perÃodo de conservaÃÃo de frutos.

nÃo hà / A acerola Malpiguia emarginata DC à uma fruta dotada de qualidades nutricionais invejÃveis, sendo consumida tanto in natura quanto processada. A principal caracterÃstica que destaca a acerola à sua enorme capacidade em sintetizar o Ãcido ascÃrbico. A Embrapa desenvolveu quatro clones comerciais com caracterÃsticas fenotÃpicas e genÃticas bem definidas denominado BRS 235 (Apodi), BRS 236 (Cereja), BRS 237 (Roxinha) e BRS 238 (Frutacor). Os clones BRS 236 (Cereja) e BRS 237 (Roxinha) foram escolhidos devido a enorme diferenÃa de Ãcido ascÃrbico sintetizada entre eles, aproximadamente 50% a mais no clone Cereja. Para esse estudo foi analisada a expressÃo gÃnica das enzimas pertencentes a via Wheeler/Smirnoff, reconhecida como a principal via biossintÃtica do Ãcido ascÃrbico em plantas bem como a Oxidase alternativa (AOX) uma enzima desacopladora, nÃo fosforilante e insensÃvel ao cianeto, presente entre os complexos II e III da membrana mitocondrial interna, responsÃvel pela via alternativa de elÃtrons. O objetivo desse trabalho foi identificar quais enzimas sÃo determinantes na diferenÃa do conteÃdo de vitamina C entre os clones, bem como avaliar a expressÃo da AOX nos diferentes tecidos. De aceroleiras com cinco anos de idade foram colhidos quatro tecidos (Flores, Frutos verdes, Frutos semimaduros e Frutos maduros. Inicialmente os teores de Ãcido ascÃrbico foram dosados nos frutos verdes, semimaduros e maduros dos dois clones por titulometria de Tillman. Em seguida foi realizada a caracterizaÃÃo gÃnica da AOX para definiÃÃo de suas isoformas. ApÃs o isolamento do DNA e executadas as reaÃÃes de PCR com um par de primers degenerados os amplicons foram purificados e submetidos a clonagem, transformaÃÃo e seqÃenciamento. As dosagens de Ãcido ascÃrbico mostraram que ambos os clones decrescem seus nÃveis de Ãcido ascÃrbico a medida que os frutos se desenvolvem, alÃm do que em todos os trÃs estÃdios de desenvolvimento o clone Cereja apresenta quantidades de Ãcido ascÃrbico superiores ao clone Roxinha. Os nÃveis de Ãcido ascÃrbico entre os frutos verdes e maduros de ambos os clones revelaram que o clone Roxinha possui uma menor diferenÃa entre esses dois estÃdios de desenvolvimento. As anÃlises de expressÃo gÃnica revelaram que trÃs enzimas possuem sua expressÃo destacada das demais, sendo que essas mostraram um sinergismo de expressÃo com o padrÃo decrescente dos nÃveis de vitamina C contida no tecido, apresentando ainda diferenÃas de expressÃo favorÃveis ao clone Cereja. SÃo elas: Manose pirofosforilase, GDP-Manose 3â5â epimerase e GDP Galactose fosforilase. Com maior destaque para a GDP-Manose 3â5â epimerase e GDP Galactose fosforilase. NÃo existiam diferenÃas nas expressÃes gÃnicas das demais enzimas da via Wheeler/Smirnoff que justificassem as diferenÃas nos teores de Ãcido ascÃrbico presentes nos tecidos e tambÃm entre os clones. Quanto a AOX os resultados revelaram duas seqÃÃncias, uma relativa a uma AOX1 e outra a uma AOX2. A anÃlise da expressÃo gÃnica das isoformas da AOX demonstrou que a AOX1 eleva sua expressÃo gÃnica em ambos os clones a medida que os frutos amadurecem entretanto, o clone Roxinha possui uma expressÃo gÃnica mais elevada que o clone Cereja, em todos os trÃs estÃdios de desenvolvimento. A AOX2 possui diferenÃas de expressÃo gÃnica onde no clone Cereja ela se mostrou decrescente, jà no clone Roxinha ocorreu a elevaÃÃo da expressÃo nos trÃs estÃdios de desenvolvimento. TrÃs enzimas sÃo essenciais a biossÃntese do Ãcido ascÃrbico em Malpiguia emarginata DC, a Manose pirofosforilase, GDP-Manose 3â5â epimerase e GDP Galactose fosforilase, sendo a via Wheeler/Smirnoff determinante na quantidade de Ãcido ascÃrbico produzido. As expressÃes gÃnicas da AOX1 e AOX2 favorecem o clone Roxinha, aparentemente como um mecanismo compensatÃrio por esse clone sintetizar menos Ãcido ascÃrbico que o clone Cereja.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarÃdeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que à extremamente abundante na natureza. ApÃs o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteÃnas com potencial biotecnolÃgico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteÃna CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em cÃlulas de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importÃncia mÃdica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteÃna truncada, sem um possÃvel peptÃdeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressÃo pPICZαA, para expressÃo em P. pastoris KM71H. A proteÃna completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fraÃÃo proteica, contendo as proteÃnas secretadas para o meio de cultura, por cÃlulas de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressÃo recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogÃnea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo trÃs bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoÃcidos. ApÃs coloraÃÃo com reagente de Schiff para revelaÃÃo de glicoproteÃnas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. AlÃm disso, rCV2736PS+ teve seus peptÃdeos identificados por espectrometria de massas, na fraÃÃo F0/95 do meio de cultura livre de cÃlulas. A proteÃna recombinante produzida sem os 22 aminoÃcidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinÃsica maior que a encontrada para a fraÃÃo contendo rCV2736PS+, apesar de nÃo ter sido detectada por SDS-PAGE. A fraÃÃo F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestÃvel atà 50ÂC e com pico de atividade quitinolÃtica em pH 3,0. A mesma fraÃÃo apresentou maior atividade endoquitinÃsica e ativa contra os substratos sintÃticos 4-nitrofenil N,Nââdiacetil-β-D-quitobiosÃdeo e 4-nitrofenil N,Nâ,Nâââtriacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), tÃpico das proteÃnas da famÃlia GH18. Do mesmo modo, a fraÃÃo F0/95 foi testada contra seis espÃcies de bactÃrias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fraÃÃo foi testada contra a levedura Candida albicans, mas nÃo foi detectada inibiÃÃo do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteÃna recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molÃcula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; ExpressÃo heterÃloga. / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiffâs reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 ÂC and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A salinidade à um fator conhecido por limitar o crescimento e a produtividade das plantas. Dentre os processos afetados està a absorÃÃo e assimilaÃÃo de Nitrato (NO3-). AlÃm disso, a salinidade induz a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio que levam a danos oxidativos e aumento da pressÃo de elÃtrons na cadeia transportadora de elÃtrons fotossintÃticos. Assim, neste presente estudo foram utilizadas diferentes abordagens para testar a hipÃtese de que o processo de assimilaÃÃo do nitrato pode aliviar a pressÃo de elÃtrons atuando como um dissipador e assim mitigar os efeitos negativos da salinidade e toxicidade do amÃnio em plantas de Jatropha curcas. Plantas submetidas à salinidade (NaCl 100 mM) e supridas com NO3- 10 mM mostraram maior absorÃÃo, atividade de NR e conteÃdo de proteÃnas solÃveis quando comparada com plantas supridas com NO3- 1mM. A alta assimilaÃÃo de nitrato de alta foi associada com um maior crescimento foliar, assimilaÃÃo de CO2 e menor dano de membrana em plantas tratadas com NaCl. AlÃm disso, uma melhor performance das plantas sob salinidade e supridas com NO3- 10 mM foi indicada por maior rendimento quÃntico efetivo do PSII e taxa de transporte de elÃtrons e menor excesso de energia ao nÃvel de PSII e quenching nÃo-fotoquÃmico. Em outra abordagem, os dados mostraram que o NO3- exÃgeno e sua assimilaÃÃo podem mitigar a toxicidade do NH4+, especialmente quando combinado com a salinidade, conforme mostrado pelos distÃrbios no metabolismo oxidativo, atividade fotoquÃmica e assimilaÃÃo de CO2. Estes efeitos foram demonstrados quando diferentes razÃes de NO3-/NH4+ foram aplicadas em plantas intactas e discos foliares incubados com tungstato (um inibidor da NR) e dose Ãnica de NH4+ na presenÃa ou ausÃncia de MSO (um inibidor de GS). A atividade da GS em Jatropha curcas foi fortemente aumentada pelo NH4+ permitindo manter nÃveis nÃo-tÃxicos de amÃnia em tecidos sob moderadas/altas concentraÃÃes de amÃnio externos. Paralelamente, quando a relaÃÃo exÃgena de NO3-/NH4+ diminuiu, as plantas sofreram reduÃÃo no acÃmulo de matÃria seca associada com acumulaÃÃo de espÃcies de oxigÃnio, diminuiÃÃo da eficiÃncia fotoquÃmica, surgimento de uma aparente fotoinibiÃÃo e reduÃÃo na assimilaÃÃo de CO2. Tomados em conjunto, os dados obtidos indicam que a assimilaÃÃo de NO3- à capaz de mitigar os efeitos negativos da salinidade e de NH4+ , visto pelo seu efeito de proteÃÃo contra danos oxidativos e por atuar como um dissipador de elÃtrons das membranas tilacÃides minimizando fotodanos e estimulando a assimilaÃÃo de CO2 em plantas de Jatropha Curcas.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Sementes de Centrolobium tomentosum Guill. ex Benth., pertencente à famÃlia Fabaceae, SubfamÃlia Papilionoideae, Tribo Dalbergieae, possuem uma lectina ligante à manose/glicose que aglutina eritrÃcitos de coelho nativos ou tratados com enzimas proteolÃticas. A lectina foi purificada por cromatografia de afinidade em Sepharose-manose, sendo posteriormente nomeada CTL. SDS-PAGE demonstrou que CTL possui um perfil eletroforÃtico composto por uma banda majoritÃria de massa molecular aparente de aproximadamente 28 kDa e duas bandas menores de massas de aproximadamente 14 e 12 kDa, tanto na presenÃa como na ausÃncia do agente redutor. A anÃlise por espectrometria de massa indicou que CTL possui massa molecular de 27.257  2 Da. A lectina de Centrolobium tomentosum apresenta elevada estabilidade tÃrmica, nÃo depende de cÃtions divalentes e mantÃm sua atividade hemaglutinante em uma ampla faixa de pH. CTL estimulou o crescimento microbiano e a formaÃÃo de biofilme experimental de duas espÃcies bacterianas do gÃnero Streptococcus, S.mitis e S. sobrinus. AlÃm disso, tambÃm demonstrou ser tÃxica para o microscrustÃceo Artemia sp. Esses resultados reforÃam a ideia da utilizaÃÃo de lectinas vegetais como ferramentas biotecnolÃgicas em estudos sobre os mecanismos de interaÃÃo proteÃna-carboidrato.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cacti are resistant plants during dry periods, among which is included the Cereus jamacaru, known as mandacaru. The mandacaru is a common columnar cactus in Brazil that produces an edible, red, fleshy fruit, with white flesh and small seeds. The fruits to providing essential nutrients and they also produces active ingredients with biological properties such as antioxidant activity. The main objective of the study was to evaluate the antioxidant potential, cytotoxicity and verify the chemical composition of parts of the fruit of Cereus jamacaru DC, aimed at encouraging the consumption and the industrial use of the fruit. Parts of the fruit were separated (peel, pulp and seeds) and made extraction with ethanol 70% and 95%, resulting in six samples: peel (CM70% and CM95%) pulp (PM70% and PM95%) and seeds (SM70% and SM95%). The antioxidant activity was evaluated through sequestration method free radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrilhidrazila). The six samples were tested in concentrations of 100 to 2000 μg mL-1. The positive controls were eugenol and β-carotene. We calculated the percentage of antioxidant activity (AA%) and the Efficient Concentration (EC50). The kinetic profile was determined by the reduction of DPPH with respect to time. The chemical characterization of the samples was performed by infrared spectroscopy (FTIR). The cytotoxicity was determined by MTT assay on macrophages. With the data obtained by infrared, it was found that the six samples show different antioxidant compounds. The peel samples showed AA% values higher than β-carotene in all tested concentrations. Already the SM70% and SM95%% exhibited the highest AA%, with antioxidant activity similar to eugenol in concentrations above of 400 Âg mL-1. The samples exhibited three kinetic profiles: fast for SM70%, SM95%, and CM70%; intermediate for the CM95% and slow for PM70% and PM95. The lower EC50 values were observed in seeds and peel samples: SM70% (0,233 mg mL-1) SM95% (0,217 mg mL-1); CM70% (0,56mg mL-1), and CM95% (0.94 mg mL-1). The highest EC50 values were observed in pulp samples: PM70% (10.95 mg mL-1) and PM95% (8,73mg mL-1). Samples of skin and seeds had lower EC50 values than various fruits and seeds known for their antioxidant activity. Only the CM70% showed levels of cytotoxicity in the three highest concentrations, the other samples showed no cytotoxicity at higher concentrations and increased cell viability. Thus we conclude that the mandacaru fruit has compounds with potent antioxidant capacity and could be used by the industry for fresh consumption in the form of juice, pulp, or extraction of antioxidant compounds that can later be used as additives in food. / As cactÃceas sÃo plantas bastante resistentes a perÃodos de seca, entre elas està incluÃdo o Cereus jamacaru, conhecido como mandacaru, que à um cacto colunar comum no Brasil, produz um fruto comestÃvel, vermelho, carnoso, com polpa branca e sementes pequenas. Os frutos alÃm de fornecerem nutrientes essenciais, tambÃm produzem princÃpios ativos com propriedades biolÃgicas, como a atividade antioxidante. Desta forma o principal objetivo do trabalho foi avaliar o potencial antioxidante, a citotoxicidade e verificar a composiÃÃo quÃmica das partes do fruto de Cereus jamacaru DC, visando incentivar o consumo e o aproveitamento industrial do fruto. Foram separadas as partes dos frutos (casca, polpa e semente), e feitas extraÃÃes com etanol 70% e 95% de cada parte, resultando em seis amostras: casca (CM70%, CM95%), polpa (PM70%, PM95%) e semente (SM70%, SM95%). A atividade antioxidante foi avaliada atravÃs do mÃtodo de seqÃestro de radicais livres DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila). foram testadas as seis amostras nas concentraÃÃes de 100 a 2000Âg.mL-1. Os controles positivos foram o eugenol e o β-caroteno. A partir dos resultados foi calculada a porcentagem da atividade antioxidante (AA%) e a ConcentraÃÃo Eficiente (EC50). O perfil cinÃtico foi determinado pela reduÃÃo do DPPH em funÃÃo do tempo. A caracterizaÃÃo quÃmica das amostras foi realizada por espectroscopia no infravermelho. A citotoxicidade foi determinada pelo mÃtodo MTT sobre macrÃfagos. Com os dados obtidos atravÃs do infravermelho, verificou-se que as seis amostras apresentam diferentes compostos potencialmente antioxidantes. As amostras da casca apresentaram AA% superiores ao β-caroteno em todas as concentraÃÃes testadas. A CM70% foi mais eficiente que a CM95%, com AA% aproximada ao eugenol nas concentraÃÃes de 1000 e 2000 Âg/ml. A amostra PM95% demonstrou maior porcentagem antioxidante que a PM70%, sendo comparÃvel ao β-caroteno nas concentraÃÃes de 100-300Âg/ml e mediana nas concentraÃÃes superiores. Jà a SM70% e a SM95% exibiram as mais altas AA% entre as amostras, sendo similares ou superiores ao eugenol a partir da concentraÃÃo de 400Âg/ml. As amostras exibiram trÃs perfis de cinÃtica: RÃpida para as amostras SM70%, SM95% e CM70%, IntermediÃria para a CM95% e lenta para a PM70% e PM95%. Os menores valores de EC50 foram observados nas amostras de semente e casca: SM70% (0,233mg/mL), SM95% (0,217mg/mL); CM70% (0,56mg/mL), CM95% (0,94 mg/mL). Sendo que os valores de EC50 mais elevados foram observados nas amostras de polpa: PM70% (10,95 mg/mL) e PM95% (8,73mg/mL). As amostras de casca e semente destacaram-se, apresentando valores de EC50 menores do que vÃrias frutas e sementes jà conhecidas por sua aÃÃo antioxidante. Apenas a amostra CM70% mostrou nÃveis de citotoxicidade nas trÃs maiores concentraÃÃes, as demais amostras nÃo apresentaram citotoxicidade, e nas concentraÃÃes mais elevadas aumentaram a viabilidade celular. Desta forma à possÃvel concluir que o fruto possui compostos com capacidade antioxidante potente, podendo vir a ser utilizado pela indÃstria, para o consumo in natura, na forma de suco, polpa, ou para extraÃÃo de compostos antioxidantes podendo ser posteriormente utilizados como aditivos em alimentos.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As lectinas consitem em uma classe diversificada de proteÃnas, capazes de reconhecer estruturas glicÃdicas de forma reversÃvel e com alta especificidade, no entanto sem alterar suas estruturas quÃmicas, participando de vÃrios processos celulares importantes. Dentre as diferentes famÃlias de lectinas, as isoladas a partir de leguminosas sÃo as mais extensivamente estudadas, havendo sido relatada a influÃncias dessas molÃculas sobre diversos processos patolÃgicos, incluindo a carcinogÃnese. NotÃveis propriedades antitumorais tÃm sido detectadas para algumas lectinas de leguminosas, resultantes da sua habilidade em induzir a morte celular ou a autofagia em cÃlulas cancerÃgenas, o que atraÃdo atenÃÃo para suas possiveis aplicaÃÃes biomÃdicas. AlÃm disso, algumas lectinas desse grupo especificas para galactose/N-acetil-D-galactosamina (Gal/GalNAc) tÃm se mostrado Ãteis como marcadores histoquÃmicos na pesquisa do cÃncer e a caracterizaÃÃo estrutural dessas lectinas em complexo com diferentes epÃtopos cancerÃgenos vem sendo realizada com sucesso. A lectina isolada a partir das sementes da leguminosa Vatairea macrocarpa (VML) à uma lectina bem caracterizada especÃfica para Gal/GalNAc capaz de reconhecer especificamente o antÃgeno Tn (GalNAc-α-O-Ser), naturalmente encontrado em O-mucinas presentes em diferentes tipos de cÃncer. As estruturas cristalogrÃficas para a VML em complexo com o antÃgeno Tn e GalNAc foram determinadas com resoluÃÃes de 1.4 e 1.7 Ã, respectivamente. A maioria das lectinas obtidas a partir de fontes naturais consiste em misturas de diferentes isoformas, uma caracterÃstica indesejada para aplicaÃÃes biomÃdicas. Com base nisso, uma construÃÃo recombinante para VML (rVML) foi expressa em Escherichia coli, sendo obtida de forma solÃvel em com alto rendimento. A estrutura cristalina para a rVML, bem como para seus complexos com o antÃgeno Tn, GalNAc e α-Lactose foram determinadas com resoluÃÃes de 1.7, 2.7, 2 e 1.8 Ã, respectivamente, apresentando a mesma estrutura geral e padrÃes de interaÃÃo que a lectina silvestre. Com o intuito de gerar um perfil comparativo entre a VML e outras lectinas de leguminosas capazes de reconhecer o antÃgeno Tn, foram realizadas anÃlises de docking molecular utilizando fragmentos de O-mucinas diferentemente decorados com o antÃgeno Tn. Esse perfil ressalta como alteraÃÃes sutis no elenco ou disposiÃÃo dos aminoÃcidos constituintes do sÃtio de ligaÃÃo a carboidrato, que talvez nÃo influenciem a capacidade de ligaÃÃo a monossacarÃdeo, podem impactar diretamente a habilidade dessas lectinas em reconhecer antÃgenos em condiÃÃes naturais. Adicionalmente aos jà caracterizados efeitos biolÃgicos relatados para VML, a similaridade entre sua estrutura e perfis de interaÃÃes quando comparadas a outras lectinas comumente utilizadas como marcadores histoquÃmicos (e.g., VVLB4 e SBA), sugerem fortemente a possÃvel utilizaÃÃo da VML como uma nova ferramenta na pesquisa do cÃncer. Esse trabalho consiste no primeiro relato de estruturas cristalogrÃficas para uma lectina de leguminosa especÃfica para Gal/GalNAc da tribo Dalbergieae. / Lectins are a very diverse class of proteins able to bind specific sugar structures reversibly and with high specificity, but without enzymatically modifying them, triggering several important cellular processes. Among the different lectin families, legume lectins are the most thoroughly studied and have been widely reported to exhibit a number of links to many pathological processes, including carcinogenesis. The remarkable anti-tumor properties of some legume lectins, resulting from their ability to induce programmed cell death and/or autophagocytosis in cancer cells have attracted much attention for biomedical applications. Moreover, a few galactose/N-acetylgalactosamine (Gal/GalNAc)-binding lectins from this group have proven to be useful markers for cancer histochemistry, and the structural characterization of these lectins bound to specific cancer epitopes has been carried out successfully. The seed lectin isolated from the legume tree Vatairea macrocarpa (VML) is a well characterized Gal/GalNAc-binding protein able to specifically recognize naturally occurring O-mucins presenting the carcinoma epitope Tn antigen (GalNAc-α-O-Ser). The crystal structures of VML in complex with Tn antigen and GalNAc have been determined at the resolution of 1.4 and 1.7 Ã, respectively. Unfortunately, most of lectins obtained from natural sources consist in a mixture of forms, which is an undesired feature for biomedical applications. Thus, the recombinant form of VML (rVML) was expressed in Escherichia coli, being obtained soluble and wih high yielding. The crystal structure for rVML, as well as for the complex with Tn antigen, GalNAc and α-Lactose have been determined at resolutions of 1.7, 2.7, 2 and 1.8 Ã, respectively, presenting the same overall structure and binding patterns as the wild lectin. Molecular docking analysis of this new structure and other Tn-binding legume lectins to O-mucin fragments differently decorated with this antigen provides a comparative binding profile among these proteins, stressing that subtle alterations that may not influence monosaccharide binding can, nonetheless, directly impact the ability of these lectins to recognize naturally occurring antigens. In addition to the specific biological effects of VML, the structural and binding similarities between it and other lectins commonly used as histological markers (e.g., VVLB4 and SBA) strongly suggest that VML can be used as a new tool for cancer research. This is the first report of crystal structures of a Gal/GalNAc-binding legume lectin from the Dalbergieae tribe.

As purinas extracelulares ATP e adenosina têm sido extensivamente estudadas em diferentes modelos e tipos celulares na modulação de várias respostas fisiológicas e patológicas. No entanto, a inosina extracelular, produto da degradação da adenosina pela Adenosina Deaminase (ADA), foi considerada por muito tempo um simples metabólito inativo. Recentemente, diversos trabalho têm demonstrado que este nucleosídeo possui importante papel na regulação de inúmeros processos. As células de Sertóli são as células somáticas dos túbulos seminíferos, e possuem fundamental importância na espermatogênese. Estas células, expressam diferentes purinoreceptores, estando estes envolvidos na regulação de diversas funções destas células relacionadas ao controle do desenvolvimento das células germinativas. No testículo, o TNF-α é produzido pelas espermátides redondas e pelos macrófagos ativados presentes no espaço intersticial. As células de Sertóli expressam os dois receptores descritos para TNF-α, TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75), e diversos trabalhos tem descrito a modulação de diferentes funções destas células por esta citocina, incluindo a modulação da produção de NO e da fosforilação das MAPKs. Recentemente, foi descrita a modulação purinérgica da sinalização por TNF-α, bem como, a atividade ATPásica do receptor TNF-R1. Assim, nesta dissertação, foi estudado o efeito do TNF-α nos níveis das purinas extracelulares, além da possível participação purinérgica na sinalização desta citocina, em células de Sertóli em cultura. O tratamento destas células com TNF-α leva a um rápido aumento (5minutos) da concentração extracelular da inosina, que se prolonga até seis horas de incubação, sem alterar a concentração dos demais nucleotídeos e seus metabólitos. A inosina modula a produção de NO e a fosforilação das MAPKs ERK½ e p38 em células de Sertóli em cultura, aparentemente, através de diferentes mecanismos, sendo o primeiro efeito independente do receptor para adenosina A1 e o segundo efeito dependente da ativação deste receptor. Além disso, a inosina extracelular está envolvida na modulação da produção de NO e da fosforilação da MAPK ERK½ em células de Sertóli em cultura pelo TNF-α. A inibição do acúmulo de inosina estimulado pelo TNF-α através da incubação com um inibidor da adenosina deaminase cancela o aumento da produção de NO estimulada por esta citocina. Além disso, o bloqueio do receptor para adenosina A1 por antagonistas específicos impede o aumento na fosforilação da ERK½ estimulada por esta citocina. Assim, nesta dissertação, é descrito um papel intermediário da inosina extracelular na sinalização do TNF-α em células de Sertóli em cultura.