Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biolólogicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-26T00:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314078.pdf: 10245292 bytes, checksum: 7c929eea613abee45aaedc328628ac4e (MD5) / A S-nitrosilação de PtpA de Mycobacterium tuberculosis diminui sua atividade fosfatase. O objetivo deste trabalho é investigar o efeito da S-nitrosilação nos parâmetros cinéticos e na estabilidade térmica de PtpA. Por meio de ensaios de biotin switch observou-se que a substituição do resíduo Cys53 por um resíduo de alanina em mutantes resultou em proteínas incapazes de se ligar a biotina após tratamento com doador de NO. Observou-se também que a KM da PtpA nitrosilada foi semelhante à sua forma não modificada, mas a Vmax foi reduzida pela metade. Em contraste, a mutante C53A tratada com GSNO mostrou KM e Vmax semelhantes à forma não tratada. Na desnaturação térmica de PtpA S-nitrosilada, a TM diminuiu consideravelmente na proteína selvagem, C11A e C16A, porém as mutantes C53A, C11A/C53A e C16A/C53A não tiveram mudanças significativas. Esses resultados sugerem que a S-nitrosilação ocorre especificamente na C53 não catalítica, essa alteração não afeta a afinidade pelo substrato e a S-nitrosilação da Cys53 afeta a estabilidade térmica da proteína. Por outro lado, outras duas proteínas de M tuberculosis foram estudadas, PtkA e SapM. A tirosina cinase PtkA fosforila a PtpA em dois resíduos de tirosina situados no PDYY-loop e se autofosforila na Tyr262. Neste trabalho, a PtkA recombinante foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por IMAC. Ensaios de CD revelaram que a proteína apresenta 42% de ?-hélice e 7% de folha-?, o que sugere que a proteína recombinante está corretamente enovelada. Por pertencer a família de proteínas HAD, a PtkA requer Mg2+ para a hidrólise do ATP. Foi observado que a TM da proteína aumenta consideravelmente na presença do metal, de 31 °C para 43 °C. Assim pode-se dizer que a ligação do metal ao sítio ativo estabiliza a estrutura terciária da proteína. A PtkA também é S-nitrosilada, porém o efeito dessa modificação pós-traducional sobre a atividade e estrutura da proteína ainda é desconhecido. A sequência de DNA que codifica SapM também foi inserida no vetor de expressão pET-14b. Diversas condições de expressão foram testadas sendo que se obteve maior rendimento em bactérias E. coli BL21 (DE3) pLysS na temperatura e tempo de indução de 15 °C por 20 horas. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel do lisado bacteriano, essa teve que ser solubilizada pela adição de ureia 8M e posteriormente purificada por IMAC. As condições para o correto re-enovelamento ainda devem ser otimizadas para dar sequência à caracterização de SapM.<br> / Abstract : The S-nitrosylation of Mycobacterium tuberculosis PtpA decreases its phosphatase activity. The aim of this work is to investigate the effect of S-nitrosylation in PtpA kinetic parameters and thermal stability. By biotin switch assays it was observed that the substitution of Cys53 residue by an alanine residue in mutants C53A, C53A/C11A, C53A/C16A and C53A/C11A/C16A resulted in proteins unable to bind biotin upon NO donor treatment. It was also observed that the KM of nitrosylated PtpA was similar to its unmodified form, but the Vmax was reduced to half. In contrast, C53A treated with GSNO showed KM and Vmax similar to the untreated form. Thermal denaturation of Snitrosylated PtpA was evaluated by CD spectroscopy. When GSNO was added to PtpA, the TM decreased in wild type, C11A and C16A, while significant differences in C53A, C11A/C53A and C16A/C53A mutants were not observed. These results suggest that S-nitrosylation occurs specifically in the non-catalytic Cys53, this modification does not affect substrate affinity, and S-nitrosylated Cys53 affects protein thermal stability. Moreover, two other M. tuberculosis proteins are studied, PtkA and SapM. Tyrosine kinase PtkA phosphorylates PtpA in two tyrosine residues located in PDYY-loop and autophosphorylates at Tyr262. In this work, recombinant PtkA was expressed in E. coli BL21 (DE3), and purified by IMAC. CD experiments reveal that the protein has 42% á- helix and 7% â-sheet, which suggest that the recombinant protein is properly coiled. Like other proteins belonging to HAD family, PtkA requires Mg2+ for ATP hydrolysis. It was observed that the TM of this protein greatly increases in the presence of metal, from 31 °C to 43 °C. Thus, it can be said that the metal binding to the active site of this enzyme stabilizes the tertiary structure of the protein. It was observed that PtkA is also S-nitrosylated, but the effect of this post-translational modification on the structure and activity of the protein is still unknown. The DNA sequence encoding SapM was also inserted into the expression vector pET-14b. Various expression conditions were tested. The higher yield was obtained in E. coli BL21 (DE3) pLysS during 20 hours of induction at 15 °C. As the protein remained in the insoluble fraction of the bacterial lysate, it had to be solubilized by addition of 8M urea, and further purified by IMAC. The conditions for proper refolding still have to be optimized in order to be able to continue SapM characterization

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2013-07-16T00:43:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-07-16T04:13:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289067.pdf: 3152612 bytes, checksum: db711251d6efc2ab5f4281d41e818f0d (MD5) / O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica de etiologia múltipla caracterizada pela hiperglicemia persistente decorrente da falta de insulina e/ou da resistência dos tecidos a ação do hormônio. A alta morbidade e mortalidade característica desta condição estão fortemente associadas ao desenvolvimento de alterações patológicas na vasculatura. No entanto, os mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no desenvolvimento das alterações vasculares, ainda não foram completamente elucidados. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo investigar o efeito do estrito controle das concentrações séricas de glicose através da administração de insulina em animais que desenvolveram hiperglicemia através da administração de estreptozotocina (STZ)sobre parâmetros do metabolismo energético, estresse oxidativo, apoptose, inflamação, neurodegeneração e vascularização em cérebro, tecidos periféricos, sangue e/ou líquido cefalorraquidiano. Ainda, foi investigado o efeito in vitro de derivados tóxicos da glicose, incluindo metilglioxal e proteínas glicadas não enzimaticamente (AGEs), sobre medidas de função mitocondrial, estresse oxidativo e neovascularização em suspensões mitocondriais obtidas a partir de músculo esquelético e fígado, bem como, em fibroblastos primários preparados a partir de pele de rato, e em células de retina (linhagem humana). A persistente hiperglicemia ocasionou estresse oxidativo o qual não conseguiu ser prevenido com a administração exógena de insulina. Esta situação pareceu ser a responsável pela severa deficiência no metabolismo energético observada nos animais tratados com STZ. Além disso, nos animais hiperglicêmicos, foi detectada uma marcada atividade da creatinaquinase mitocondrial e/ou total, provavelmente como um mecanismo compensatório para manter o estado energético da célula em situações de severo estresse oxidativo. Ainda, a hiperglicemia provocou o desenvolvimento de neurodegeneração e induziu a apoptose. Em concordância, a exposição de MG e MG-BSA em sistemas in vitro, também demonstrou inibições no metabolismo energético, estresse celular e angiogênese. Estes resultados demonstram que a hiperglicemia provoca deficiência no metabolismo energético celular e induz ao estresse oxidativo, e a normalização dos níveis glicêmicos foi bastante eficiente na prevenção destes processos, provavelmente devido às mudanças epigenéticas que estão relacionadas com o aumento na produção de EROs

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2010. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320911.pdf: 2768339 bytes, checksum: 45ddacef31b14dfae19f52b38c1bf956 (MD5) Previous issue date: 2010 / Desde a descoberta da atuação de íons metálicos para o correto funcionamento de inúmeras enzimas, os químicos de coordenação têm sintetizado e caracterizado compostos que possam mimetizar tanto a estrutura quanto a função dessas enzimas. Neste trabalho foram sintetizados dois novos complexos binucleares com o ligante 2-[N-bis-(2-piridilmetil) aminometil]-4-metil-6-[N-(2-hidroxi-3-formil-5-metilbenzil)(2-piridilmetil)aminometil]fenol (H2py3mff), [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII(py3mff)](ClO4)2 (1) e [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII(py3mff)](ClO4)2 (2). O novo ligante foi caracterizado por espectroscopias na região do infravermelho e de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Os complexos 1 e 2 foram caracterizados por várias técnicas incluindo, espectroscopia no infravermelho, espectroscopia eletrônica, eletroquímica, titulação potenciométrica e difração de raios X em monocristal. Os dados estruturais levaram a considerar os complexos 1 como modelo estrutural para o sítio ativo da fosfatase ácida púrpura de feijão vermelho, com a unidade [(H2O)FeIII(u-OH)ZnII]. Os complexos também foram testados na atividade de fosfatase, frente à hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato (2,4-bdnpp). Estes estudos revelaram que os complexos podem ser considerados como modelos funcionais das fosfatases com fatores catalíticos de cerca de 5 mil e 10 mil vezes a reação não catalisada, respectivamente. Destaca-se ainda que o ligante H2py3mff possui um grupo aldeído como substituinte, o que permite o ancoramento em suportes sólidos ou ainda em peptídeos.Uma propriedade importante que algumas enzimas apresentam é a promiscuidade catalítica, que é a capacidade de catalisar mais de um tipo de reação química. A promiscuidade catalítica apresenta um papel fundamental na evolução e acredita-se que esteja envolvida na biosíntese de metabólitos secundários.Devido a dificuldade em se obter grandes quantidades e cristais adequados dessas metaloenzimas e metaloproteínas, o uso de compostos modelos de baixa massa molar que sejam miméticos estruturais e/ou funcionais para estas biomoléculas tem contribuído na elucidação das suas propriedades físico-químicas e mecanismos de reação.Tendo em vista que o conteúdo metálico dos complexos é muito mais exposto que o das enzimas acredita-se que os mesmos possam apresentar promiscuidade catalítica, podendo então ter seu uso de particularmente aumentado.Assim, foi testada a promiscuidade catalítica de compostos já sintetizados e caracterizados [FeIII(?-OAc)2FeII(bpbpmp)](ClO4)2 (3), [FeIII(u-OAc)2FeIII(bpbpmp)](ClO4)3 (4), que mostraram ser promíscuos na catálise de hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato e na oxidação do substrato 3,5-di-tercbutilcatecol. Foi testada ainda a promiscuidade dos complexos [(H2O)FeIII(u-OH)CuII(bpbpmp)](ClO4)2 (5) e [(H2O)FeIII(u-OH)CuII(bpbpmp-CH3)](ClO4)2 (6). Estes dois últimos complexos já haviam sido testados na hidrólise do substrato bis(2,4-dinitrofenil)fosfato e no presente trabalho foi testada a atividade de oxidação do substrato 3,5-di-tercbutilcatecol. O complexo 6 foi mais reativo que o complexo 5, mostrando que quanto menor a diferença entre os potenciais redox dos dois centros metálicos maior a atividade catalítica do mesmo.São abertas, através do presente trabalho, novas perspectivas de pesquisa, que a partir da derivatização de ligantes pode possibilitar outras aplicações, seja pelo ancoramento de compostos em sílica, nanopartículas magnéticas e nanopartículas de ouro, seja pela utilização de compostos previamente desenhados para certo tipo de atividade catalítica em outras reações, frente a outros substratos de interesse. <br> / Abstract : Enzymes are protein molecules with a three-dimensional globular shape. Their main functions are to accelerate chemical reactions in cells, and for that reason are often called biological catalysts. About a third of the enzymes and proteins with known structure have at least one metal ion in its constitution. An important property is that some enzymes show catalytic promiscuity, which is the ability to catalyze more than one type of chemical reaction. Promiscuity has a catalytic role in the evolution and is believed to be involved in the biosynthesis of secondary metabolites. Due to difficulty in obtaining suitable crystals and large amounts of these metalloenzymes and metalloproteins, the use of model complexes of low molecular weight that are structural and / or functional mimetics for these biomolecules has contributed to the elucidation of their physical-chemical properties and reaction mechanisms . Moreover, these compounds can be used as bioinspired catalysts of great interest in Medicine and Biotechnology. This work describes the synthesis, characterization and study of catalytic promiscuity bioinspired complex in hydrolytic enzymes. Thus, we synthesized two new complexes with the ligand H2py3mff (2-[N-bis-(2-piridilmetil)aminomethyl]-4-methyl-6-[N-(2- hydroxy-3-formyl-5-methylbenzyl) (2-piridilmetil) aminomethyl] phenol) FeIII(µ-OH)ZnII(py3mff) (H2O)] (ClO4)2 - complex 1 and FeIII(µ-OH)CuII(py3mff)(H2O)](ClO4)2 - complex 2. Both complexes had their X-ray structure determined showing that they are isostructural. The new complexes were characterized by electrochemical and spectroscopic techniques. pKa values for the coordinated water molecules were obtained by potentiometric titration. Trying to evaluate the catalytic promiscuity of binuclear complexes, the phosphatase and catecholase activities of complexes 1 and 2, and other complexes described in the literature FeIIIFeIIbpbpmp (complex 3), FeIIIFeIIIbpbpmp (complex 4), FeIII(µ-OH)CuII bpbpmp (complex 5), FeIII(µ-OH)CuII bpbpmp-CH3 (complex 6) were studied using the substrates 2,4-bdnpp and 3,5-dtbc.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317579.pdf: 2266949 bytes, checksum: c109cde9b9c0ab36f488fbf71f7b4fbb (MD5) Previous issue date: 2013 / Introdução. Bidens pilosa L. é uma planta considerada medicinal que contém poliacetilenos presumivelmente responsáveis por ações antitumorais. As quinonas, como a juglona, também compreendem uma classe de substâncias de interesse por seu potencial antitumoral. Além disto, evidências indicam que a associação de ascorbato com algumas quinonas pode potencializar a atividade antitumoral. Objetivos. Avaliar o efeito antitumoral do extrato de B.pilosa obtido pela tecnologia supercrítica, a fim de obter um extrato rico em poliacetilenos (SFE) com atividade superior em comparação ao extrato obtido por maceração hidroetanólica (HCE). Testar a administração de juglona isoladamente ou em associação ao ascorbato em células T24 pela citotoxicidade; caracterizado o mecanismo de morte celular induzido, indução de estresse oxidativo, efeito antiproliferativo e preliminarmente, anti-invasivo in vitro. Por fim, avaliar a administração de juglona e ascorbato em associação a quimioterápicos convencionais, doxorrubicina e cisplatina. Metodologia. A composição fitoquimica dos extratos foi avaliada por cromatografia em camada delgada e espectrofotometria UV-Vis. A citotoxicidade para células MCF-7 e T24 foi avaliada pelo ensaio do MTT. O potencial lesivo sobre o DNA foi avaliado in vitro pela motilidade eletroforética de DNA plasmidial e imunoeletroforese para fosforilação da histona gama-H2Ax em células T24. Foram avaliados marcadores de danos oxidativos, geração celular de EROs e conteúdo de GSH, também a fosforilação do fator de iniciação eucariótico 2 eIF2a. Foi avaliada a morfologia das células em processo de morte, sendo também verificada a ativação de caspases por espectrofluorimetria e clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) por imunoeletroforese. A atividade antiproliferativa foi medida pelo ensaio de formação de colônias. A inibição da motilidade celular foi investigada pelo ensaio de migração. A atividade antitumoral in vivo foi medida em camundongos Balb-c portadores de tumor ascítico de Ehrlich. Resultados. Os espectros sobre os constituintes majoritários de SFE apresentaram bandas típicas de poliacetilenos com picos de absorção na faixa do UV registrados em 208, 269 e 334 nm. A citotoxicidade in vitro foi dependente da concentração dos extratos. Às 24h, a CI50 foi 811 e 437 µg/mL, respectivamente para HCE e SFE, reduzindo para 291 µg/mL às 48h, no caso de SFE. Às 24h, a CI50 foi 28,5 µM para juglona, reduzindo para 6,3 µM, quando associada ao ascorbato 1 mM. A citotoxicidade da cisplatina chegou a dobrar devida sua associação com juglona e ascorbato. HCE causou danos no DNA em 160 µg/mL, ao passo que 40 µg/mL de SFE causaram danos equivalentes. Juglona iniciou danos sobre o DNA em 20 µM, ao passo que 5 µM associados ao ascorbato 1 mM causaram danos equivalentes. A juglona induziu à geração celular de EROs e consumo de GSH; iniciando fosforilação do eIF2a que indica estresse de retículo endoplasmático. Estes efeitos foram potencializados em até 4 vezes pela associação ao ascorbato. A juglona sozinha ou associada ao ascorbato não causou ativação de caspases; corroborando a morfologia das células T24 em processo de morte, o processo induzido provavelmente está mais relacionado à necrose. Em tratamentos subletais, a juglona diminuiu a proliferação e a motilidade de células T24, ambos os processos potencializados pela associação ao ascorbato, que induziu à morte clonogênica. Finalmente, os ensaios in vivo indicaram que ambos os extratos de B. pilosa apresentaram atividade, mas SFE causou redução superior do volume de líquido ascítico e células compactadas (4 ± 1 e 1 ± 0,4 mL, respectivamente), ao mesmo tempo em que resultou em maior aumento no tempo de sobrevida (~31%) em comparação aos animais do controle negativo. A inibição do crescimento tumoral determinada para HCE foi de cerca de 40%, ao passo que esta determinação ultrapassou 60% no caso de SFE. Conclusão. A extração com fluido de CO2 supercrítico é uma alternativa para a obtenção de um extrato de B. pilosa rico em poliacetilenos citotóxicos com atividade antitumoral superior em comparação ao extrato obtido por maceração hidroetanólica. O ascorbato potencializa a citotoxicidade, o efeito antiproliferativo e inibidor da motilidade de células T24 in vitro da juglona. Os achados deste trabalho levam a sugerir que a dose do tratamento feito com juglona pode ser ajustada, em termos de redução da mesma, em até 4 vezes, se a juglona for administrada em associação ao ascorbato.<br> / Abstract: Introduction. Bidens pilosa L. is a plant considered medicinal containing polyacetylenes expected to be responsible for antitumor actions. Quinones, such as juglone, comprise a class of substances of interest also due to their antitumor potential. Furthermore, evidences indicate that the combination of ascorbate with some quinones can result in potentiated antitumor activity. Objectives. The supercritical technology was assessed to obtain an extract from B.pilosa rich in polyacetylenes (SFE) with superior antitumor activity compared to that of the extract obtained by hydroethanol maceration (HCE). Juglone was tested administered alone and/or combined with ascorbate on T24 cells for cytotoxicity, the mechanism of cell demise was characterized, oxidative stress induction; antiproliferative and, preliminarily, anti-invasive effects. Juglone and ascorbate were evaluated for the cytotoxicity in combination with the conventional chemotherapics doxorubicin and cisplatin. Methodology. The phytochemical composition of extracts was evaluated by thin layer chromatography with UV-Vis spectroscopy. Cytotoxicity on MCF-7 and T24 cells was checked by the MTT assay. The damaging potential on DNA was assessed in vitro by the electrophoretic motility of plasmid DNA and immunoelectrophoresis for phosphorylation of histone gamma-H2Ax in T24 cells. Markers of oxidative stress, ROS generation and GSH consumption, and the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor eIF2á were analyzed as well. The induced cell death process was monitored by caspase activation through spectrofluorimetry and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage by immunoelectrophoresis. The antiproliferativo action was measured by the colony forming assay. Cell motility inhibition was investigated by a migration assay. In vivo antitumor activity was measured in Ehrlich carcinoma-bearing Balb-c mice. Results. Spectra about the major constituents in SFE presented typical bands of polyacetylenes recorded in UV at 208, 269 and 334 nm. Cytotoxicity in vitro was concentration-dependent. At 24 h, IC50 was 811 and 437 ìg/mL, respectively for HCE and SFE on MCF-7 cells, falling to 291 ìg/mL at 48 h, in the case of SFE. At 24h, IC50 was 28.5 ìM for juglone on T24 cells, falling to 6.3 ìM when it was combined with ascorbate 1 mM. At 24 h, the cisplatin#s cytoxicity on T24 cells increased up to 2-fold due to its combination with juglone and ascorbate. HCE caused DNA damage at 160 ìg/mL, whereas SFE at 40 ìg/mL caused equivalent damage. Juglone triggered DNA damage at 20 ìM, whereas 5 ìM in combination with ascorbate 1 mM caused equivalent damage. Juglone caused reduction in terms of ROS generation and increased GSH consumption, triggering eiF2á phosphorylation that indicates endoplasmic reticulum stress. These actions were potentiated up to 4-fold due to the combination of juglone with ascorbate. Juglone alone or combined with ascorbate did not cause caspase activation, corroborating T24 cell morphology under demise, the induced cell death process seems to be close related to necrosis. Under sublethal treatments, juglone reduced the proliferation and the motility of T24 cells, both actions were potentiated due to the combination with ascorbate, something that finally induced to clonogenic cell death. In vivo assays indicated that both extracts from B. pilosa had activity, but SFE caused superior reduction in terms of ascitic fluid volume and packed cells (4 ± 1 e 1 ± 0.4 mL, respectively). Furthermore, SFE increased more the animals life span (~31%) compared to animals from the negative control. The tumor growth inhibition by HCE was about 40%, whereas more than 60% was reached by SFE. Conclusion. Supercritical extraction with fluid CO2 is a choice to obtain an extract from B. pilosa rich in cytotoxic polyacetylenes with superior antitumor activity in comparison to that of the extract obtained by hydroethanol maceration. Ascorbate potentiated the cytotoxicity, the antiproliferative action and the inhibition of T24 cells motility in vitro by juglone. These findings lead to suggest that the dose of the treatment done with juglone can be adjusted, in terms of reduction, up to 4-fold, if juglone is administered in combination with ascorbate.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-05T22:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317900.pdf: 1698038 bytes, checksum: d51415443ed184773e517c0a2b8ceaf0 (MD5) Previous issue date: 2013 / As paredes celulares das plantas contém uma complexa mistura de polissacarídeos e proteínas, demandando uma série de enzimas para degradá-las. Organismos capazes de secretar enzimas de degradação podem aproveitar as paredes celulares como fonte de nutrientes, agindo como verdadeiros patógenos vegetais, gerando perdas nas produções agrícolas e consequentemente à economia. A busca por novas técnicas de controle de pragas tem impulsionado estudos baseados na sua biologia, visando diminuir o uso de substâncias químicas, sabidamente prejudiciais ao meio ambiente e aos consumidores. Trabalhos anteriores detectaram sequências gênicas supostamente codificadoras de poligalacturonases em larvas de C. maculatus, besouro praga do feijão caupi. Estas enzimas degradam o ácido poligalacturônico (PGA) presente na matriz de pectina na parede celular vegetal. A partir destes dados, investigamos se os genes estavam sendo expressos e se as enzimas tinham atividade funcional no animal. Amostras de homogeneizados intestinais do inseto foram ensaiadas contra PGA em teste de difusão radial, onde a atividade detectada foi proporcional à quantidade de amostra aplicada, demonstrando que a enzima além de ser expressa, é também funcional. A distribuição espacial da enzima foi ensaiada através da dosagem dos açúcares redutores, cujo tampão mais adequado foi o citrato-fosfato, com atividade ótima no pH 6,5. Os resultados mostraram maior atividade nas amostras do conteúdo luminal, confirmando que a enzima é secretada no intestino do inseto, embora os valores das atividades absoluta e específica tenham se mostrado baixos. SDS-PAGE foi preparado para confirmação do número de isoformas encontradas em estudos anteriores. Apenas duas isoformas foram detectadas, com formação de bandas em diferentes faixas de pHs. Atividade da enzima pectinase também foi ensaiada através do teste de difusão radial contra pectina, apresentando atividade e proporcionalidade em relação à quantidade de amostra aplicada, constituindo um novo ponto a ser abordado na espécie quanto às enzimas celulolíticas.<br> / Abstract : Plant cell walls contain a complex mixture of proteins and polysaccharides, requiring a number of enzymes to degrade them. Organisms capable of secreting enzymes active on the cell wall constituents can use it as a source of nutrients, acting as true plant pathogens, generating losses in agricultural production and consequently in the economy. The search for new methods of pest control has driven studies based on their biology, aiming to reduce the use of chemicals, known to harm the environment and consumers. In larvae of Callosobruchus maculatus, known as cowpea beetle, gene sequences encoding putative polygalacturonases were detected. These enzymes degrade polygalacturonic acid (PGA) present in the matrix of pectin in the plant cell wall. To assess if the enzymes were functional in C. maculatus, samples containing intestinal homogenates were tested against PGA in radial diffusion assays, where the activity detected was proportional to the amount of sample applied. The confirmation of the origin of the activity was performed using the same test, by using a cowpea flour extract, as enzyme source, which was inactive. The spatial distribution of the enzyme among the different compartments of the gut of the insect was assayed by the DNS method, whose the most suitable buffer among the tested, was citrate-phosphate, with maximum activity at pH 6.5. Results showed greater activity in the samples of luminal contents, confirming that the enzymes are secreted in the gut of the insect, although the values of absolute and specific activities have been shown very low. SDS-PAGE was prepared to confirm the number of isoforms found in the transcriptome and in the proteome of C. maculatus, however, only two isoforms were detected with bands at different pH values. Due to the commonly presence of genes encoding plants cell wall degrading enzymes in other members of the Chrysomelidae family, pectinase activity was also assayed in intestinal homogenates of larval C. maculatus. Radial diffusion assays against pectin confirmed activity and proportionality in relation to the amount of sample applied, constituting a new point to be addressed about the cellulolytic enzymes in the species

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:28:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318578.pdf: 1826383 bytes, checksum: 228509ff45eb74a8a5145c45a01f1d93 (MD5) Previous issue date: 2013 / Por prover informações sobre o do funcionamento do metabolismo de seres vivos, antigas formações geológicas, hábitos alimentares de antigos povos e também permitir estudos de toxicidade, a determinação de elementos traço em amostras animais e botânicas tem despertado interesse. Neste contexto a espectrometria de absorção atômica de alta resolução com fonte contínua utilizando a análise direta de sólidos é uma técnica ideal por ser rápida sensível e econômica, permitindo seu uso em complexos estudos como também para análise de rotina. Foi desenvolvido um método para a determinação de Mn, Ni, Rb e Sr em amostras de botânicas e biológicas.Otimizaram-se os parâmetros térmicos obtendo-se uma temperatura de pirólise e atomização ideal de 1000 e 2500 oC para Mn, de 1000 e 2600 oC para o Ni, de 800 e 2500 oC para o Rb e de 900 e 2600 oC para o Sr. Avaliou-se o fator de homogeneidade das amostras verificando-se que as amostras podem ser utilizadas para micro e submicroanálises. Avaliaram-se as curvas de calibração verificando-se a possibilidade do emprego de curvas feitas utilizando-se soluções aquosas. Para todos os analitos, nas amostras botânicas, com exceção do Ni, isto foi possível. Para as amostras de tecido animal o mesmo não foi observado devido à complexidade de sua matriz. Determinou-se Mn, Ni, Rb e Sr em amostras botânicas e biológicas obtendo-se limites de detecção de 5, 2, 103 e 10 ngg-1 , respectivamente. O método proposto demonstrou elevada sensibilidade, praticidade, rapidez e confiabilidade sendo viável para a análise de rotina em amostras botânicas para esses elementos, já as amostras biológicas devido à complexidade de suas matrizes apresentou ser inviável o uso da calibração aquosa, tornando a análise de rotina mais cara e nem sempre indicada <br> / Abstract: Hypercholesterolemia, the main risk factor for developing of cardiovascular disease, is a condition that one in every twenty individuals are affected and is common to many severe diseases such as non-alcoholic fatty liver disease and dementia. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction are associated with high plasma cholesterol levels and are common conditions in the pathophysiology of diseases related to hypercholesterolemia. Low-density lipoprotein receptor deficient mice (LDLr-/-) are a very good model to study hypercholesterolemia, their consequences and sequelae. In this context, our first objective was to evaluate the effect of hypercholesterolemia and aging, a risk factor unchanged, in oxidative stress parameters of the cardiovascular system and liver tissue of C57BL/6 and LDLr-/-. Furthermore, we evaluated the possible mechanisms of the antiatherogenic effect of diphenyl diselenide (PhSe)2 in the cardiovascular system of LDLr-/- mice. In addition, we evaluated the effect of high cholesterol diet on parameters of mitochondrial function and oxidative stress in C57BL/6 and LDLr-/-. In the cardiovascular system, the LDLr-/- mice had lower glutathione (GSH) levels in the aorta, and this was correlated with high plasma cholesterol levels. The treatment with (PhSe)2 improved the redox environment of the cardiovascular system by increase of GSH levels in middle-aged animals, increased activity of glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), besides, to reduce lipid peroxidation in the heart of young LDLr-/- mice. In the aorta, (PhSe)2 increased the GPx activity in young and middle-aged mice and increase GR activity only in middle-aged LDLr-/-. In liver tissue, we observed an effect of hypercholesterolemia on the parameters of oxidative stress and mitochondrial function, GSH levels and GR activity were decreased in LDLr-/-group, besides, and lipid peroxidation and accumulation of lipids in the liver was higher LDLr-/- group. This oxidative stress was even more pronounce when these LDLr-/- mice fed a high cholesterol diet. These data are strongly correlated with plasma levels of cholesterol. Aging reduced GSH levels and increased lipid peroxidation in liver of LDLr-/- mice. In the mitochondrial fraction, aging caused a decrease in GR activity and increased lipid peroxidation. In the mitochondrial function, the high-cholesterol diet caused a decrease in complex I and the aging induced a reduction of complex II of the respiratory chain in liver tissue of LDLr-/- mice. Taken together, these results show the hypercholesterolemia as strong inducer to oxidative stress and mitochondrial dysfunction in the cardiovascular system and the liver tissue of LDLr-/- mice, and this effect could be even more pronounced if these were fed a high cholesterol diet. Furthermore, treatment with (PhSe)2 seems to modulate the antioxidant system related to GSH and thioredoxin, favoring the cellular redox environment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-12-05T23:33:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013Bitstream added on 2014-09-24T20:21:05Z : No. of bitstreams: 1 317556.pdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Na atualidade as doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortes no mundo, sendo esta situação reflexo do estilo de vida populacional. A aterosclerose, uma das principais causa das doenças cardiovasculares, inter-relaciona diversos fatores de risco que convergem em um ponto: a produção anormal de espécies reativas de oxigênio (EROs). O aumento de EROs, e a subsequente queda na biodisponibilidade de óxido nítrico (oNO) têm sido proposto como o mecanismo patogênico da disfunção endotelial. Superóxido (O2o-) produzido principalmente pela mitocôndria endotelial reage rapidamente com oNO produzindo peroxinitrito, uma espécie reativa de nitrogênio (ERNs) que causa alterações profundas na mitocôndria, superprodução de EROs, conduzindo a disfunção endotelial e morte celular. Estes fenômenos têm sido implicados no início e na progressão do processo aterosclerótico. Este estudo teve por objetivo principal a determinação do efeito de um fluxo de peroxinitrito promovido por 1,3-morfolinosidnonimina (SIN-1), sobre a função mitocondrial e endotelial de células endoteliais de aorta bovina (BAEC). Além disso, investigamos se o disseleneto de difenila (PhSe)2, um simples composto orgânico de selênio, poderia ser utilizado como uma estratégia farmacológica para proteção contra os danos causados pelo peroxinitrito, tendo em vista as importantes propriedades antioxidantes descritas para este composto. Nossos resultados experimentais mostraram que a exposição à SIN-1 (250 ?M) causou um profundo comprometimento no consumo de oxigênio, na geração de energia e na capacidade de reserva mitocondrial nas BAEC. A disfunção mitocondrial resultou em produção adicional de peroxinitrito, amplificando o fenômeno e levando a disfunção endotelial. Além disso, observamos um extensivo declínio no potencial de membrana mitocondrial ( m), induzido pelo peroxinitrito, e este evento foi associado à morte celular apoptótica. Por outro lado, o pré-tratamento das BAEC com (PhSe)2, foi capaz de prevenir os danos celulares mediados pelo peroxinitrito possivelmente por promover um aumento na expressão de duas diferentes isoformas da enzima peroxirredoxina (Prx). O aumento na expressão da Prx em conjunto com a melhora no sistema antioxidante vinculado à glutationa (GSH), já demonstrado anteriormente por nosso grupo, contribui para a melhoria do sistema antioxidante nas células endoteliais, tornando-as mais resistentes ao dano oxidativo.<br> / Abstract : Nowadays cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide, and this situation reflects the lifestyle of the population. Atherosclerosis, one of the main causes of cardiovascular disease, interrelates several risk factors that converge on one point: the abnormal production of reactive oxygen species (EROs). The increase in EROs and the subsequent decrease in the bioavailability of nitric oxide (oNO) have been proposed as the pathogenic mechanism of endothelial dysfunction. Superoxide (O2o-) mainly produced by endothelial mitochondria rapidly reacts with oNO producing peroxynitrite, a reactive nitrogen species (ERNs) which causes profound changes in the mitochondria, overproduction of EROs, leading to endothelial dysfunction and cell death. These phenomena have been implicated in the onset and progression of the atherosclerotic process. This study was designed to determine the effect of a flow of peroxynitrite promoted by 1,3-morpholinylsydnonimine (SIN-1), in mitochondrial and endothelial function of bovine aortic endothelial cells (BAEC). Furthermore, we investigated whether diphenyl diselenide (PhSe)2 , a simple organic selenium compound, could be used as a pharmacological strategy for protection against peroxynitrite-mediated damage, taking into account the significant antioxidant properties described for this compound. Experimental results showed that overnight exposure to SIN-1 (250 µM) caused a profound impairment on oxygen consumption, energy generation and reserve capacity in mitochondria of BAEC. Mitochondrial dysfunction resulted in an additional intracellular production of peroxynitrite, amplifying the phenomenon and leading to endothelial dysfunction. Moreover, we observed an extensive decline in mitochondrial membrane potential (??m), induced by peroxinytrite, and this event was associated with apoptotic-type cell death. In another hand, pretreatment of BAEC with (PhSe)2, was capable to prevent peroxynitrite-mediated cell damage possibly by promoting an increase in the expression of two different isoforms of peroxiredoxin (Prx) enzyme. The increase in the expression of Prx together with the amelioration of the glutathione (GSH) antioxidant system, previously demonstrated by our group, contributes to the improvement of the antioxidant system in endothelial cells, making them more resistant to oxidative damage.

The polyamines, spermine, spermidine and putrescine, are a group of aliphatic amines that interact with diverse cellular targets such as nucleic acids and proteins. The polyamines may act as physiological modulators of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The processes mediated by NMDA receptor include synaptic plasticity and formation of neural circuitry consequently in the learning and memory process. However, little is known about the role of systemic administration endogenous modulators of the NMDA receptor, such as polyamines, in Pavlovian fear conditioning learning. In this paradigm, an emotionally neutral conditioned stimulus (CS), such as a tone, elicits behavioral responses after association with a noxious aversive unconditioned stimulus (US), such as a brief electric footshock. Once the CS-US association is learned, innate physiological and behavioral responses appear, such as freezing. Therefore, the present study was conducted to investigate whether the immediate post-training intraperitoneal injection of spermidine (1-100 mg/kg), an agonist of the NMDA receptor polyamine binding site, arcaine (0-360 min post- training), an antagonist of the NMDA receptor polyamine binding site and/or MK-801, a noncompetitive antagonist of the NMDA receptor, affected classical fear conditioning in rats. Intraperitoneal administration of arcaine (10 mg/kg) decreased, within a limited time window (0-180 min post-training), while spermidine (10-100 mg/kg) increased contextual and auditory fear conditioning. Arcaine or MK-801 co-administration, at a dose that had no effect per se, reversed the facilitatory effect of spermidine. These results provide evidence that endogenous and exogenous systemic administration of polyamine binding site ligands modulate early consolidation of fear-conditioning task. The facilitatory effect induced by spermidine would be NMDAreceptor-mediated. / As poliaminas endógenas, putrescina, espermina e espermidina são aminas alifáticas que atuam como moduladores endógenos de diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil-D-aspartato (NMDA-R) os quais estão envolvidos com plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais, consequentemente em processos de aprendizagem e memória. No entanto, não se sabe o papel das poliaminas administrados sistemicamente sobre o aprendizado do medo condicionado Pavloviano. Neste teste comportamental, um estímulo condicionado neutro (CS), tal como um tom, provoca respostas comportamentais depois da associação com um estímulo incondicionado aversivo (US), como um choque. Quando a associação CS-US é aprendida, respostas fisiológicas e comportamentais inatas aparecem tal como o comportamento de congelamento. Assim nós investigamos o efeito da administração intraperitoneal de espermidina, um agonista do sítio das poliaminas no NMDA-R, da arcaína, um antagonista do sítio das poliaminas no receptor NMDA, em uma determinada janela de tempo (0-360 min após o treino) e do MK-801, um antagonista não competitivo do NMDA-R, sobre a consolidação da memória na tarefa do medo condicionado clássico em ratos. Para isso, os ratos foram treinados, recebendo três pareamentos de tom (10 seg-2.000 Hz, 90 dB) e choque (1 seg-0,6 mA) nas patas com intervalos de 40 segundos e imediatamente após o treino recebiam injeções intraperitoneal de espermidina (1-100 mg/kg), arcaína (0,1-10 mg/kg), MK-801 (0,001-0,1 mg/kg), associação de espermidina (100 mg/kg) e arcaína (0,1 mg/kg) ou associação de espermidina (100 mg/kg) e MK-801 (0,001 mg/kg). Após 24h foram testados na tarefa do medo condicionado contextual e 48 h após ao medo condicionado ao tom. A administração de arcaína (0-180 min após o treino) e do MK-801 diminuiu, enquanto que espermidina aumentou o condicionamento de medo ao contexto e ao tom. A arcaína e o MK-801, em doses que não apresentaram efeito per se sobre a memória, reverteram o efeito facilitatório sobre a memória, causado pela espermidina. Estes resultados indicam que as poliaminas endógenas e exógenas modulam o início da consolidação da tarefa do medo condicionado quando administradas por via sistêmica em ratos, provavelmente esses efeitos são mediados pela modulação do NMDA-R.

The endogenous poliaminas, putrescine, spermidina and spermine are aliphatics amines that are present in high concentrations in the central nervous system (SNC). The action of the poliamines involves the modulation of several ionic channels, including the subtype of glutamatergic N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA). The processes mediated by NMDA receptor include synaptic plasticity and formation of neural circuitry. It is believed that these plasticities happening in some cerebral areas specifies, as the hippocampus, are critical for the learning and memory processes. It is described that spermidine (SPD), as well as the nitric oxide are directly involved with processes of formation of the memory. Therefore, we investigated the involvement of the nitric oxide in the facilitatory effect induced by SPD on the memory of males Wistar rats. For that, the rats were bilaterally cannulae in the hippocampus, after the surgical recovery, the animals were trained in the inhibitory avoidance task, injected bilaterally in the hippocampus and tested in the same task. Thirty minutes after the administration of the drugs the animals were decapitated and the nitrite and nitrate levels (NOX) they were determined in the hippocampus of the rats. The bilateral injection of 0.1 nmol of L-NAME, a non-selective inhibitor of the nitric oxide synthase, SPD (0.2 nmol) or the association of SPD and L-NAME, were achieve Immediately after the training in the inhibitory avoidance task. The administration of L-NAME didn't cause effect per se on memory and it reverted the facilitatory effect induced by SPD. Spermidine increased the levels of NOX in the hippocampus, and the coinjection of L-NAME prevented this increase induced by SPD. The systemic administration of 7-NI (30 mg/kg), a selective inhibitor of the nitric oxide synthase neuronal, 30 minutes before the training of it the inhibitory avoidance impaired the memory and didn't prevent the increase in the levels of NOX induced by SPD. None of the drugs studies altered the locomotor activity of the animals. These results suggest that the facilitatory effect of the memory induced by SPD it is mediated, at least partly, for the increase of the synthesis of the nitric oxide. / As poliaminas endógenas, putrescina, espermidina e espermina, são aminas alifáticas que estão presentes em altas concentrações no sistema nervoso central (SNC). A ação das poliaminas envolve a modulação de diversos canais iônicos, incluindo o subtipo de receptor glutamatérgico N-metil-Daspartato (NMDA). Os processos mediados pelo receptor NMDA incluem plasticidade sináptica e formação de circuitos neurais. Acredita-se que estas plasticidades ocorrendo em algumas regiões cerebrais especificas, como o hipocampo, são críticas para os processos de aprendizado e memória. Está descrito que espermidina (SPD), assim como o óxido nítrico (NO) estão diretamente envolvidos com processos de formação da memória. Assim nós investigamos o envolvimento do óxido nítrico sobre a melhora da memória induzida por SPD em ratos Wistar machos. Para isso, os ratos foram canulados bilateralmente no hipocampo, após a recuperação cirúrgica, os animais foram treinados no aparelho de esquiva inibitória, injetados bilateralmente no hipocampo e testados no mesmo aparelho. Trinta minutos após a administração das drogas os animais foram decapitados e os níveis de nitrito e nitrato (NOX) foram determinados no hipocampo dos ratos. A injeção bilateral de 0,1 nmol de L-NAME, um inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase, SPD (0,2 nmol) ou a associação de SPD e L-NAME, foram realizadas imediatamente após o treino na tarefa de esquiva inibitória. A administração de L-NAME não causou efeito per se sobre a memória e reverteu o efeito facilitatório causado pela SPD. Espermidina aumentou os níveis de NOX no hipocampo, e a co-injeção de L-NAME preveniu este aumento induzido por SPD. A administração sistêmica de 7-NI (30 mg/kg), um inibidor seletivo da óxido nítrico sintase neuronal, 30 minutos antes do treino da esquiva inibitória piorou a memória e não preveniu o aumento nos níveis de NOX induzidos por SPD. Nenhuma das drogas estudas alterou a atividade motora dos animais. Estes resultados sugerem que o efeito facilitatório da memória induzido por SPD é mediado, pelo menos em parte, pelo aumento da síntese do óxido nítrico.