FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Lectinas sÃo proteÃnas que atravÃs de ligaÃÃes a resÃduos de carboidratos podem interagir com sistemas biolÃgicos elicitando uma diversidade de efeitos. As lectinas vegetais tÃm sido utilizadas como ferramentas no estudo da inflamaÃÃo devido a sua capacidade de reconhecer resÃduos de carboidratos presentes nas membranas das cÃlulas inflamatÃrias atravÃs de seus domÃnios lectÃnicos. Assim, investigou- se neste trabalho o possÃvel efeito prÃ-inflamatÃrio da lectina de sementes de Dioclea rostrata; ligadora de α-metil-D-manosÃdeo sobre a migraÃÃo de neutrÃfilos (MN) [(in vivo e in vitro)]. Os modelos utilizados foram: peritonite, edema de pata e bolsa de ar subcutÃnea (in vivo), quimiotaxia de neutrÃfilos e cultura de macrÃfagos (in vitro). Foi verificado que a lectina apresentava atividade prÃ-inflamatÃria em todos os estudos realizados. O aumento do nÃmero de macrÃfagos atravÃs do prÃ-tratamento dos animais com tioglicolato potencializou a MN induzida por Dros; a depleÃÃo de mastÃcitos atravÃs do tratamento com o composto 48/80 nÃo interferiu na MN da lectina. Sendo assim sugeriu-se o envolvimento de macrÃfagos e desconsiderou-se o de mastÃcitos. Na modulaÃÃo farmacolÃgica no modelo de peritonite feita atravÃs do prÃ-tratamento dos animais com drogas anti-inflamatÃrias, observou-se que indometacina, dexametasona e talidomida inibiram a MN. A lectina induziu quimiotaxia in vitro, estimulou a sÃntese/liberaÃÃo de citocinas como TNF-α e IL-1, IL-10, desta maneira sugere-se que estudos mais detalhados sejam realizados em continuidades a este trabalho para verificar se esta lectina pode ser utilizada em modelos de imunosupressÃo. O α-metil-D-manosÃdeo reverteu a MN induzida por Dros, desta forma parece que a Dros desencadeia resposta inflamatÃria atravÃs da interaÃÃo de seus domÃnios lectÃnicos com aÃucares presentes na membrana de macrÃfagos / Lectins are proteins possessing a carbohidate moiety that are able to interact with biological systems eliciting a variety of effects. Vegetal lectins have been used as tools in the study of inflammation due to its ability to recognize carbohydrate residues in inflammatory cell membranes by means of its lectin domain. The present work studied the pro-inflammatory effects of the lectin from Dioclea rostrata seeds (Dros), a binder of α-methyl-D-manoside, on neutrophil migration ( NM ) [(in vivo and in vitro)]. The models of peritonitis, paw edema, and subcutaneous air pouch (in vivo), neutrophil chemotaxy and macrophage culture (in vitro) were utilized. It was found that Dros showed a pro-inflammatory activity in all of the above models. The increase in the number of macrophages by the pre-treatment of the animals with thioglycolate potentialized the Dros-induced NM. Also, the depletion of mast cells by the use of the substance 48/80 did not interfere in the lectin-induced NM. The above data suggest the involvement of macrophages but not mast cells in the mechanisms studied. The pre-treatment of the peritoneum with anti-inflammatory drugs like indomethacine, dexamethasone and thalidomide inhibited the NM. Dros induced chemotaxy in vitro and stimulated the synthesis / release of cytokines as TNF-α and IL-1 in addition to IL-10 and this way he/she suggests himself that more detailed studies are accomplished in continuities to this work to verify this lectin can be used in imunosupression models. In the paw edema model the lectin promoted an intense edema and a significant increase in the mieloperoxidase activity (when compared to the control group). The α-methyl-D-manoside reversted the Dros-induced NM and so it seems that Dros triggers the inflammatory response by means of the interaction of its lectin domain with sugars in the macrophage membrane. The present data suggest that Dros could be used as tools in biochemical and pharmacological studies.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. A anotaÃÃo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos estÃo vÃrias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarÃdeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustÃceos. As quitinases sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterizaÃÃo bioquÃmica, estrutural e biolÃgica de uma quitinase recombinante (CV1897), da famÃlia 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequÃncia completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptÃdeo sinal nativo) foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequÃncia parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptÃdeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusÃo, de forma insolÃvel e inativa. Em P. pastoris, as proteÃnas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solÃvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em nÃquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presenÃa de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade Ãtima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 40 ÂC por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinÃsica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroÃsmo circular revelaram que a estrutura da proteÃna possui predominantemente estrutura secundÃria do tipo α-hÃlice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna foi produzida na sua conformaÃÃo enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinaÃÃo de conÃdios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associaÃÃo com o fluconazol atuaram de forma sinÃrgica contra diferentes cepas da levedura patogÃnica Candida tropicalis. Os estudos bioquÃmicos, estruturais e biolÃgicos da rCV1897 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima. / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 ÂC for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas sÃo proteÃnas de origem nÃo imune que possuem pelo menos um domÃnio de ligaÃÃo especÃfica e reversÃvel a carboidratos, sem aÃÃo enzimÃtica. Estas proteÃnas sÃo amplamente distribuÃdas na natureza. As lectinas isoladas de sementes de leguminosas estÃo entre as mais estudadas e possuem homologia, sendo importantes marcadores moleculares da evoluÃÃo dentro desta famÃlia vegetal. Existem poucas informaÃÃes sobre as lectinas das tribos da base da subfamÃlia Papilionoideae e novas informaÃÃes sÃo importantes para solidificar os conhecimentos sobre as lectinas dessas tribos. Este trabalho teve como objetivo purificar uma nova lectina de sementes de Swartzia laevicarpa, caracteriza-la fÃsicoquimicamente e por espectrometria de massas e testa-la quanto a sua capacidade de causar inflamaÃÃo e dor e quanto a sua toxidade contra nÃuplios de Artemia sp. A lectina foi purificada por fracionamento por sulfato de amÃnio seguido de cromatografia de troca iÃnica e exclusÃo molecular. Denominada de SLA, a lectina apresenta o perfil eletroforÃtico de uma cadeia de 30 kDa e, diferente de SLL, apresenta subunidades por volta de 13 e 17 kDa. Possui afinidade por GalNAc e derivados de galactose, e apresenta caracterÃsticas termodinÃmicas de ligaÃÃo diferente para Gal e GalNAc. A lectina em estudo causou inflamaÃÃo em modelo de edema de pata de camundongos e hipernocicepÃÃo ligada a inflamaÃÃo. SLA tambÃm apresentou toxicidade contra nÃuplios de fase II de Artemia sp. A lectina isolada e caracterizada nesse trabalho demonstra ser uma ferramenta taxonÃmica interessante para corroborar o posicionamento de Swartzeae alÃm de demonstrar tambÃm um potencial biotecnolÃgico no estudo de modelos de inflamaÃÃo e dor. AtravÃs da espectrometria de massas foi possÃvel verificar que SLA apresenta pelo menos duas isoformas e apresenta glicoformas. Possui aproximadamente 250 resÃduos de aminoÃcidos e nesse trabalho foram determinados 179 deles. SLA apresentou similaridade com lectinas de outras tribos basais como VML e SJA, corroborando com a classificaÃÃo de Swartzieae como tribo de Papilionoideae e demonstrando a utilizaÃÃo de lectinas como ferramenta taxonÃmica. / Lectins are proteins of non-immune origin that have at least one specific and reversible carbohydrate binding domain without enzymatic action. These proteins are widely distributed in nature. Lectins isolated from legume seeds are among the most studied, have homology and are important markers of evolution within this plant family. There is little information about the lectins of the basal tribes of the subfamily Papilionoideae and new information is important to solidify your knowledge of the lectins of these tribes. This study aimed to purify a new lectin from Swartzia laevicarpa, to characterize its physical-chemical and mass spectrometry proprieties and test as its ability to cause inflammation and pain and their toxicity against Artemia sp. The lectin was purified by ammonium sulfate fractionation followed by ion exchange chromatography and molecular exclusion. Named SLA, the lectin shows the electrophoretic profile of a chain of 30 kDa and, unlike SLL presents subunits around 13 and 17 kDa. Has affinity for GalNAc and Gal derivatives, and presents thermodynamic binds characteristics of different for Gal and GalNAc. SLA caused inflammation in a model of paw edema of mice and hypernociception linked to inflammation. SLA also showed toxicity against stage II nauplii of Artemia sp. The lectin isolated and characterized in this work proves to be an interesting tool and corroborate the taxonomic placement of Swartzeae. SLA also demonstrate the biotechnological potential in the study of models from inflammation and pain. By mass spectrometry we found that SLA has at least two isoforms and provides glycoforms. It has approximately 250 amino acid residues and in this work were determined 179 of them. SLA showed similarity with lectins from other basal tribes as VML and SJA, corroborating the classification as Swartzieae Papilionoideae tribe and demonstrating the use of lectins as a taxonomic tool.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-08-08T12:54:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Fernanda F de Souza.pdf: 4260965 bytes, checksum: df7ebff9a3d7acd903d8c3d204f37cbe (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-08T12:54:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Fernanda F de Souza.pdf: 4260965 bytes, checksum: df7ebff9a3d7acd903d8c3d204f37cbe (MD5) Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Apoio à Pesquisa - FUNAPE / Curcumin has emerged as a great promise for cancer treatment and chemoprophylaxis with curcumin, but its low solubility in water is minimal systemic bioavailability. Attempts were made to improve its solubility in aqueous solutions by incorporating curcumin in liposomes or micelles, but these systems have low stability. In addition, magnetic nanoparticles have been used as promising drug delivery systems because they can be functionalized to become water soluble and biocompatible. Studies with curcumin incorporated into the magnetic nanoparticles are still scarce. This study aims to evaluate the antiproliferative effect of curcumin combined with magnetic nanoparticles functionalized bilayer of lauric acid in human melanoma cell line SKMEL 37. Human melanoma cells were treated at different concentrations and cytotoxicity was evaluated by MTT assay. The cell morphology was evaluated by light microscopy and fluorescence. Our studies have shown that curcumin has incorporated into nanoparticles cytotoxic effect at concentrations above 40,8 μg/ml or 111 μM. Since free curcumin caused significant death at concentrations above 11.5 μM. We also observed morphological changes typical of apoptosis such as chromatin condensation, nuclear fragmentation and bleb formation. These findings show us that both their cytotoxic activity, as both the magnetic properties and its solubility in water make this new formulation with a curcumin compound interest for therapeutic use. / A curcumina surgiu como uma grande promessa para tratamento do câncer e de quimioprofilaxia com a curcumina, porém sua baixa solubilidade em água e sua biodisponibilidade sistêmica é mínima. Tentativas foram feitas para melhorar a sua solubilidade em soluções aquosas através da incorporação de curcumina em lipossomas ou micelas, mas esses sistemas têm estabilidade baixa. Além disso, as nanopartículas magnéticas têm sido usados como promissores sistemas de entrega de drogas, pois podem ser funcionalizadas para se tornarem solúveis em água e biocompatíveis. Estudos com curcumina incorporada á nanopartículas magnéticas ainda são escassos. Esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito anti-proliferativo de curcumina associada a nanopartículas magnéticas funcionalizadas com bicamada de ácido láurico em células de melanoma humano da linhagem SKMEL 37. Células de melanoma humano foram tratadas em diferentes concentrações e a citotoxicidade foi avaliada por ensaio de MTT. A morfologia das células foi avaliada através de microscopia óptica e de fluorescência. Nossos estudos mostraram que a curcumina incorporada em nanopartículas possui efeito citotóxico em concentrações acima de 40,8 μg/ml ou 111 μM. Já a curcumina livre provocou morte significativa em concentrações acima de 11,5 μM. Observamos também alterações morfológicas típicas do processo de apoptose, como condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de Blebs. Estes achados nos mostram que, tanto sua atividade citotóxica, como ambas as propriedades magnéticas e sua solubilidade em água fazem desta nova formulação com curcumina um composto interessante para uso terapêutico.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2014-09-03T10:17:49Z No. of bitstreams: 2 Tese Hugo Campos Oliveira Santos.pdf: 2080957 bytes, checksum: 336f5cb1ae89058f6495b2a2af051029 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-03T10:17:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Hugo Campos Oliveira Santos.pdf: 2080957 bytes, checksum: 336f5cb1ae89058f6495b2a2af051029 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-12-18 / Caesarean section is a surgical technique utilized to deliver the fetus from the uterus and an increase in this surgical procedure can be noted around the world. In Brazil, approximately 40% of total deliveries occur in this way, it is estimated that caesarean section corresponds to 80% of deliveries in private assistance between 2008 and 2012. Diabetes complicates gestation and pregnancy complicates diabetes, this combination increases the possibility of flawed scarring process, which may cause esthetic, psychological and clinical problems. The Low-Level Laser Therapy (LLLT) is an ally for the treatment of a number of wounds – accelerating cell metabolism and reducing inflammatory and infectious processes. The objective of this study was to evaluate the effects of AlGaInP LASER (660nm) treatment regarding wound healing quality and hypertrophic scar prevention in patients with gestational diabetes undergone caesarean section. The clinical study was performed at Hospital das Clínicas of the Federal University of Goiás, after Ethics Committee approval (CEP/HC.053/11). In the period between November (2011) and May (2013) 90 patients divided into 3 groups were assessed: Group A: LASER (3 Joules/cm2), Group B: LASER (6 Joules/cm2) and Group C (Control – no treatment). Caesarean incision was photographed in the periods: T1 (1day), T2 (2days), T3 (3days), T4 (15days) and T5 (30days). Photos were used in order to calculate mean area and standard deviation. The area of the photographs was analyzed and calculated in pixels with specific software (Software Image J – NIH/USA), measuring, thus, the wound contraction in percentage (%). The calculation was performed by the caesarean scar area reduction and the increase of incision contraction percentage (recovery) throughout the periods for each group. Contraction results (%) with regard to wound area were significant (p<0.05) for all groups studied, according to Kruskal Wallis’, Mann-Whitney’s and Wilcoxon’s tests. Groups treated with LASER (A and B) presented higher edge contraction, being 89% the scar reduction of Group A (p<0.001) and 81% of Group B (p<0.05), when compared to control group (73%). However, Group A demonstrated higher wounded area reduction when compared to group B, especially in the period between the 3rd and the 15th day from the postoperative (p<0.001). It was verified that the better performance of Low-power LASER (AlGaInP) occurred in the time reported in the literature as scarring process inflammatory stage (≤7days). Inflammatory process reduction may have contributed to reducing scarring time, increasing wound contraction percentage, benefitting, thus, the incision esthetic aspect throughout 30 days of treatment. During the study, occurrence of hypertrophic scars was not observed in any of the experimental groups in the period of 60days from the postoperative. / A cesárea é uma técnica cirúrgica utilizada para retirar o feto do útero, nota-se atualmente um aumento dessa cirurgia em todo o mundo. No Brasil, aproximadamente 40% do total de partos são realizados por essa via, estima-se que a cesariana corresponda a 80% dos partos na assistência privada entre 2008 a 2012 . O diabetes complica a gestação, e, a gravidez complica o diabetes, essa combinação aumenta as chances de falhas no processo de cicatrização, o que pode acarretar problemas estéticos, psicológicos e clínicos. O LASER de baixa potência (LBP) é um aliado para o tratamento de uma variedade de ferimentos – acelerando o metabolismo celular, reduzindo os processos inflamatório e infeccioso. Esse estudo tem por objetivo avaliar os efeitos da terapia a LASER AlGaInP (660nm) quanto à qualidade da cicatrização e da prevenção de cicatrizes hipertróficas em pacientes com diabetes gestacional submetidas à cirurgia cesárea. A pesquisa clínica foi realizada no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás - UFG, após aprovação do Comitê de Ética (CEP/HC.053/11). Entre novembro de 2011 e maio de 2013 foram avaliadas 90 pacientes divididas em 3 grupos: Grupo A: LASER (3 Joules/cm2), Grupo B: LASER (6 Joules/cm2) e Grupo C (Controle - sem tratamento). A incisão cesárea foi fotografada nos tempos: T1 (1dia), T2 (2dias), T3 (3dias), T4 (15dias) e T5 (30dias). As fotos foram utilizadas para calcular a área média e o desvio padrão. A área das fotografias foi analisada e calculada em pixels por meio de programa específico (Software Image J – NIH/USA). Mensurando, assim, a contração da ferida em percentagem (%). O cálculo foi realizado por meio da redução da área da cicatriz cesárea e a percentagem de contração da incisão em decorrer do tempo para cada grupo. Os resultados da contração (%) em relação à área da ferida foram significativos (p<0,05) para todos os grupos estudados, conforme testes de Kruskal Wallis, Mann-Whitney e Wilcoxon. Os grupos tratados com LASER (A e B) tiveram maior contração das bordas, sendo de 89% de redução da cicatriz para o grupo A (p<0,001) e de 81% para o grupo B (p<0,05), quando comparados ao grupo controle (73%). Porém, o grupo A demonstrou maior redução da área da ferida, quando comparado ao grupo B, principalmente no período entre o 3º e 15º dias do pós-operatório (p<0,001). Verificou-se que a melhor atuação do LASER de baixa potência (AlGaInP) ocorreu no tempo relacionado na literatura como fase inflamatória do processo de cicatrização (≤ 7dias). A redução do processo inflamatório pode contribuir para reduzir o tempo de cicatrização, aumentando a percentagem de contração da ferida, favorecendo assim, o aspecto estético da incisão no decorrer de 30 dias de tratamento. Durante o estudo, não foi observado ocorrência de cicatrizes hipertróficas em nenhum dos grupos experimentais no período de até 60dias do pós-operatório.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-09-24T20:12:44Z No. of bitstreams: 2 hoffmann_doctoralThesis_2013_final.v4_forPrint.pdf: 2888260 bytes, checksum: 4331871b2fa71a10777e85a507ba14c8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-24T21:00:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 hoffmann_doctoralThesis_2013_final.v4_forPrint.pdf: 2888260 bytes, checksum: 4331871b2fa71a10777e85a507ba14c8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-24T21:00:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 hoffmann_doctoralThesis_2013_final.v4_forPrint.pdf: 2888260 bytes, checksum: 4331871b2fa71a10777e85a507ba14c8 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-08-15 / A dieta influencia a saúde sendo uma fonte de nutrientes e toxinas, e por moldar a composição de populações microbianas residentes no corpo humano. Estudos prévios começaram a mapear as associações entre a dieta e bactérias e vírus do microbioma intestinal humano. Este trabalho investiga as associações entre a dieta e populações arqueanas e fúngicas, tomando vantagem de amostras oriundas de 98 indivíduos bem caracterizados, e integra esses dados novos com o conhecimento corrente relacionado a bactérias e o microbioma intestinal humano. A dieta foi quantificada utilizando questionários que acessam a dieta usual e recente, e arquêas e fungos foram caracterizados usando genes marcadores obtidos de amostras fecais através e sequenciamento de DNA em larga escala de última geração. Foram encontrados 66 gêneros de fungos, geralmente com uma presença mutuamente exclusiva dos filos Ascomycota e Basidiomycota. Quanto as arquêas, Methanobrevibacter foi o gênero mais prevalente, presente em 30% das amostras. Diversas outras arquêas foram detectadas com abundancia e frequência mais baixa. Uma miríade de associações foi observada entre fungos e arquêas e a dieta, entre fungos e arquêas, e entre estes e linhagens bacterianas. Metanobrevibacter e Candida foram positivamente associados com uma dieta rica em carboidratos, e negativamente com dietas ricas em amino acidos, proteínas e ácidos graxos. Dados publicados previamente enfatizam que a estrutura das populações bacterianas no intestino são primariamente com hábitos alimentares de longo prazo, porém, uma abundancia alta de Candida foi fortemente associada com a ingestao recente de carboidratos. A abundância de Methanobrevibacter foi associada tanto com a ingestão usual ou recente de carboidratos. Estes resultados confirmam estudos direcionados anteriores e provém varias novas associações a serem consideradas quando modelando os efeitos da dieta no microbioma intestinal e a na saúde humana. / Diet influences health as a source of nutrients and toxins, and by shaping the composition of resident microbial populations. Previous studies have begun to map out associations between diet and the bacteria and viruses of the human gut microbiome. This work investigates associations of diet with fungal and archaeal populations, taking advantage of samples from 98 well-characterized individuals, and integrates this novel data with the current knowledge regarding the bacteria of the human gut microbiome. Diet was quantified using inventories scoring both long-term and recent diet, and archaea and fungi were characterized by deep sequencing of marker genes in DNA purified from stool. For fungi, we found 66 genera, with generally mutually exclusive presence of either the phyla Ascomycota or Basiodiomycota. For archaea, Methanobrevibacterwas the most prevalent genus, present in 30% of samples. Several other archaeal genera were detected in lower abundance and frequency. Myriad associations were detected for fungi and archaea with diet, with each other, and with bacterial lineages. Methanobrevibacter andCandida were positively associated with diets high in carbohydrates, but negatively with diets high in amino acids, protein, and fatty acids. Previously published data emphasized that bacterial population structure was associated primarily with long-term diet, but high Candida abundance was most strongly associated with the recent consumption of carbohydrates. Methobrevibacter abundance was associated with both long term and recent consumption of carbohydrates. These results confirm earlier targeted studies and provide a host of new associations to consider in modeling the effects of diet on the gut microbiome and human health.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina &#945;-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 &#959;C and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Lectinas de algas marinhas tÃm-se mostrado importantes ferramentas biotecnolÃgicas. Objetivou-se estudar as atividades antinociceptivas e antiinflamatÃrias da lectina da alga marinha vermelha Pterocladiella capillacea (Pc). A Pc, apresentando atividade hemaglutinante contra eritrÃcitos tripsinizados de coelho, foi obtida a partir da aplicaÃÃo do extrato protÃico total em cromatografia de troca iÃnica em coluna de DEAE-celulose seguida da cromatografia de afinidade em coluna de goma de guar. A seguir, foi utilizada nos ensaios de nocicepÃÃo e inflamaÃÃo, utilizando camundongos machos Swiss e ratos machos Wistar, respectivamente. Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg; i.v) foi administrada 30 min antes de cada estÃmulo nocigÃnico, ou seja, antes da injeÃÃo i.p de Ãcido acÃtico a 0,8% (10 &#956;L/mL), da injeÃÃo intraplantar de formalina a 1% (20 &#956;L/pata) ou do teste da Placa quente (51Â1 ÂC), e comparada a animais nÃo tratados ou prÃ-tratados com Indometacina ou Morfina, ambas a 5 mg/kg; s.c. Observou-se que a Pc (0,9; 8,1 ou 72,9 mg/kg) reduziu significantemente o nÃmero de contorÃÃes abdominais induzidas pelo Ãcido acÃtico em 29,2%; 39,3%, e 51,9%, respectivamente. Pc (72,9 mg/kg) tambÃm reduziu (p<0,05) a fase 1 (neurogÃnica) e a fase 2 (inflamatÃria) observadas apÃs administraÃÃo da formalina, em 58% e 87%, respectivamente. Entretanto, a Pc (72,9 mg/kg) nÃo foi capaz de reduzir a nocicepÃÃo observada no teste da Placa Quente, quando comparada à morfina. Os efeitos antinociceptivos da Pc foram abolidos quando a Pc foi prÃ-incubada com a glicoproteÃna mucina (1,25 mg/mL), inibidora de sua atividade hemaglutinante. Sugere-se, portanto, que a atividade antinociceptiva da Pc possa ser predominante via inibiÃÃo de mecanismos perifÃricos. Assim, seguiram-se os ensaios de induÃÃo da migraÃÃo neutrofÃlica para cavidade peritoneal ou do edema de pata de ratos por Carragenana (Cg-tipo l; 500 g/cavidade ou pata), onde observou-se que a administraÃÃo da Pc (8,1 mg/kg; i.v) 30 min antes da Cg reduziu significativamente a contagem do nÃmero de neutrÃfilos em 84%. No entanto, a Pc nÃo foi capaz de prevenir o edema de pata induzido pela Cg. Desta forma, sugere-se que esta proteÃna foi capaz de reduzir o mecanismo de migraÃÃo de neutrÃfilos, possivelmente ligando-se à molÃculas especÃficas celulares, como por exemplo, selectinas. Para confirmar sua seguranÃa, a PC (8,1 mg/kg) foi administrada em camundongos diariamente e no 7 dia foram coletadas amostras sanguÃneas para dosagens de urÃia e transaminases (TGO e TGP), e pesados rins e fÃgado. Observou-se que a Pc nÃo causou alteraÃÃes significativas, sugerindo portanto, ser segura no perÃodo de administraÃÃo avaliado. Dessa forma, considerando os dados em conjunto, conclui-se que a Pc possui propriedades antinociceptiva e antiinflamatÃria com aÃÃo perifÃrica. / Marine algae lectins had been showing important biotechnical tools. Our objectives were to study the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the lectin from the marine red alga Pterocladiella capillacea (Pc). The Pc, presenting haemagglutinating activity against trypsin-treated erytrocytes from rabbit, was purified by application of crude extract (0.025 M Tris-HCl buffer, pH 7.5) on ion exchange chromatography on DEAE-cellulose followed by affinity chromatography on guar-gum column. To proceed, it was used in the nocicepÃÃo and inflammation assays, using male Swiss mice and male Wistar rats, respectively. Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg; i.v) it was administered 30 min before each challenge, that is, before the injection i.p of acetic acid 0.8% (10 &#956;l/mL), of the intraplantar injection of 1% formalin (20 &#956;L/paw) or of the Hot Plate test (52Â1 ÂC), and compared to non treated animals or to pre-treated by Indomethacin or Morphine, both at 5 mg/kg; s.c. It was observed that the Pc (0.9; 8.1 or 72.9 mg/kg) reduced significantly the number of writhes induced by acetic acid (29.2%; 39.3%, and 51.9%, respectively). Pc (72.9 mg/kg) also reduced (p<0.05) the 1st phase (neurogenic) and the 2nd phase (inflammatory) observed after administration of the formalin (58% and 87%, respectively). However, the Pc (72.9 mg/kg) was not capable to reduce the nociception evaluated by Hot Plate test, compared to morphine. These antinociceptive effects were abolished when the Pc was pre-incubated with mucin (1.25 mg/mL), inhibitory glycoprotein of its haemagglutinating activity. Therefore, it is suggested that the antinociceptive activity of the Pc can be predominant by inhibition of peripheric mechanisms. After this, was realized the assays of neutrophil migration for peritoneal cavity or of the paw edema of mice by Carragenan (Cg-type l; 500 g/cavity or paw), where was observed that the administration of the Pc (8,1 mg/kg) 30 min before Cg reduced the neutrophil counts significantly by 84%. However, Pc was not capable to prevent the paw edema induced by Cg. This way, it is suggested that this protein was capable to reduce neutrophil migration by previous mechanism to migration, possibly linking to cellular specific molecules as, for example, selectins. Then, to confirm its safety, the Pc (8.1 mg/kg) was administered daily in mice and observed their behaviors, and at the 7th day, sanguine samples were collected for urea and transaminases (TGO and TGP) dosages, and heavy kidneys and liver. It was observed that Pc did not cause significant alterations, suggesting be safety for the administration period. Considering the data together, it is ended that the Pc possesses antinociceptive and anti-inflammatory properties with peripheral action.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Cinco inibidores de tripsina da famÃlia Kunitz (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 e JB4) foram purificados de sementes de Pithecellobium dumosum, uma Ãrvore da subfamÃlia Mimosoideae, por precipitaÃÃo com Ãcido tricloroÃcetico (TCA), cromatografia de afinidade sobre tripsina imobilizada em Sepharose e coluna de fase reversa em sistema de CLAE. Os cinco inibidores possuem massa molecular entre 18 e 20 kDa formados por uma cadeia polipeptÃdica como determinado por SDS-PAGE na presenÃa ou ausÃncia de &#61538;-mercaptoetanol. JB1, JB3-1 e JB3-2 tÃm massas moleculares de 19,70, 19,69 e 19,69 kDa, respectivamente, por MALDI-TOF. JB2 e JB4 tÃm massa molecular de 18,08 e 20,85 kDa, respectivamente. A seqÃÃncia N-terminal de JB1, JB3-1 e JB3-2 mostrou identidade com outros inibidores da famÃlia Kunitz. Os cinco inibidores foram estÃveis Ãs variaÃÃes de temperatura e pH. A inibiÃÃo da tripsina por JB1, JB2 e JB4 foi do tipo competitivo. JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 tiveram Kis de 3,56 x 10-8 M, 1,65 x 10-8 M, 4,20 x10-8 M, 2,88 x 10-8 M, respectivamente para a tripsina bovina. Em comparaÃÃo com os outros inibidores JB4, com Ki de 5,70 x 10-10 M, apresentou maior afinidade para tripsina. Entre os inibidores purificados apenas JB4 inibiu moderadamente a atividade da quimotripsina. A atividade da elastase e bromelaÃna nÃo foi inibida efetivamente por esses inibidores. A inibiÃÃo de JB1, JB2, JB3-1 e JB3-2 sobre a papaÃna variaram entre 32,93 a 48,82% e foi indicativo de sua bifuncionalidade, com exceÃÃo de JB4 que inibiu fracamente essa atividade (9,93% de inibiÃÃo). A inibiÃÃo da papaÃna por JB1 e JB2 foi do tipo nÃo competitiva e os valores de Ki foram de 7,6 x 10-7 e 5,1 x 10-7 M, respectivamente. Ensaios in vitro sobre as proteinases digestÃrias de Lepidoptera, Diptera e Coleoptera foram feitos. Esses inibidores foram efetivos para enzimas digestÃrias semelhantes à tripsina desses insetos em diferentes graus. As enzimas digestivas de Zabrotes subfasciatus e Ceratitis capitata foram inibidas por JB1 em 68,87 e 65,53%, respectivamente, e as enzimas de Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae e Plodia interpunctella foram inibidas entre 29,18 e 44,35%. Enzimas digestÃrias de Z. subfasciatus, C. maculatus e C. capitata foram inibidas por JB2 entre 70,04 e 74,54% e as enzimas de larvas de A argillaceae e P. interpunctella foram suprimidas em 13,58 e 48,67%, respectivamente. A atividade semelhante à tripsina de larvas de Z. subfasciatus foi suprimida em 67,33 e 56,93% por JB3-1 e JB3-2, respectivamente, e a atividade de C. maculatus, A argillaceae, P. interpunctella e C. capitata foram suprimidas por esses inibidores entre 5,17 e 49,00%. JB4 inibiu entre 54,53 a 66,15 % as enzimas digestivas de C. maculatus, Z. subfasciatus e A argillaceae e inibiu as enzimas digestivas de larvas de P. intepunctella e C. capitata em 8,97 e 37,47%, respectivamente. A inibiÃÃo de proteinases semelhantes à tripsina e à papaÃna presentes no intestino de vÃrios insetos sugere que esses inibidores possam afetar o crescimento e sobrevivÃncia desses insetos pragas quando incorporados em sementes artificiais e esta bifuncionalidade à indicativo de que estes inibidores possam ser fortes candidatos para os programas de melhoramento de plantas via transgenia. / Five Kunitz-type trypsin inhibitors (JB1, JB2, JB3-1, JB3-2 and JB4) were purified from Pithecellobium dumosum seeds, a tree of the sub-family Mimosoideae, by TCA precipitation, affinity chromatography on immobilized trypsin-Sepharose and reverse phase HPLC using Vydac C-18 column. The five inhibitors had Mr between 18 and 20 kDa with a single polypeptide chain as determined by SDS-PAGE with and without reduction. JB1, JB3-1 and JB3-2 had Mr of 19.70, 19.69 and 19.69 kDa, respectively, by MALDI-TOF. JB2 and JB4 had Mr of 18.08 and 20.85, respectively, by SDS-PAGE. The N-terminal sequences of JB1, JB3-1 and JB3-2 showed identity with others Kunitz-type inhibitors. The five inhibitors were stable over a wide range of temperature and pH. The inhibition of trypsin by JB1, JB2 and JB4 was competitive. JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 showed Ki values of 3.56 x 10-8 M, 1.65 x 10-8 M, 4.20 x 10-8 M, 2.88 x 10-8 M, respectively, against bovine trypsin. In comparison with others inhibitors JB4, with Ki of 5.70 x 10-10 M, showed a high affinity toward trypsin. Among the inhibitors purified only JB4 inhibited chymotrypsin activity. The activities of elastase and bromelain were not inhibited for these inhibitors. The inhibition of JB1, JB2, JB3-1 and JB3-2 on papain varied between 32.93 to 48.82% of inhibition and was indicative of its bifunctionality with exception of JB4 that inhibited this activity in 9.9%. The papain inhibition by JB1 and JB2 were noncompetitive type and the Kivalues were 7.6 x 10-7 and 5.1 x 10-7 M, respectively. In vitro assays against digestive proteinases from Lepidoptera, Diptera and Coleoptera pests were carried out. These inhibitors were effective towards trypsin-like digestive enzymes of the insect in different degrees. The digestive enzymes from Zabrotes subfasciatus and Ceratitis capitata were inhibited by JB1 in 68.87 and 65.53% respectively, and Callosobruchus maculatus, Alabama argillaceae and Plodia intepunctella enzymes were inhibited in the range of 29.18 to 44.35%. Digestive enzymes from Z. subfasciatus, C. maculatus and C. capitata were inhibited by JB2 in the range of 70.04 to 74.54%, and the enzymes of A. argillaceae and P. intepunctella were suppressed in 13.58 and 48.67%, respectively. Trypsin-like activities of larval from Z. subfasciatus were suppressed in 67.33 and 56.93% by JB3-1 and JB3-2, respectively, and the activities of C. maculatus, A. argillaceae, P. intepunctella and C. capitata were inhibited by these inhibitors in the range of 5.17-49.00%. JB4 inhibited around 54.53 to 66.15% the digestive enzymes of C. maculatus, Z. subfasciatus and A. argillaceae and the digestive enzymes from P. intepunctella and C. capitata larvae in 8.97% and 37.47%, respectively. The inhibition of trypsin-like and papain-like proteinases of several insects suggested that these inhibitors may affect the growth and survival of these insect pests when incorporated into artificial diet and their bifunctionality are indicative that these inhibitors could be strong candidates to plant management programs cross transgenia.

A perda anual de ovelhas em criações de sistema extensivo apresenta altos níveis na região Sul do Brasil. Na Serra Gaúcha essa porcentagem chega a 30% e torna-se um fator alarmante para propriedades com sistemas de produção de carne, leite e lã. As perdas reprodutivas em ovinos desta região estão relacionadas com a baixa taxa de concepção do rebanho e alta mortalidade perinatal de cordeiros (MPC) e frequentemente esses fatores são decorrentes de enfermidades, deficiências nutricionais durante o período gestacional e pós-parto ou por manejo inadequado de ovelhas e cordeiros. A MPC, definida como a morte de recém-nascidos imediatamente antes ou durante o parto e até os primeiros vinte e oito dias de vida é uma das principais causas de baixa taxa de desmame no Rio Grande do Sul (RS). Sua etiologia envolve ações complexas que circundam a ação individual e a interação de muitos fatores relacionados entre si. Estudos sobre as causas de MPC no RS têm apontado o complexo exposição/inanição e hipotermia, além da distocia como as duas principais patologias envolvidas nesses óbitos. Condições ambientais adversas, como o frio severo, também causam a morte em consequência da falta de adaptação do recém-nascido às novas condições de vida. A busca de informações que venham a elucidar as causas dessas perdas motivou a realização do presente estudo e o uso da esquila durante a gestação foi utilizado como uma possível ferramenta para minimizar a MPC. O efeito da esquila préparto (74 dias de gestação) sobre sobre o perfil metabólico e produtivo de ovelhas e no peso e desenvolvimento de seus cordeiros durante o primeiro mês de vida foram avaliados neste estudo. Um rebanho de 40 ovelhas gestantes da raça Corriedale foi dividido aleatoriamente em dois grupos: ovelhas com esquila completa (EC) e ovelhas mantidas com velo ou ovelhas controle (OC). As ovelhas e seus respectivos cordeiros foram avaliados em três momentos distintos durante o experimento: no parto, entre 15 e 21 dias de lactação e entre 22 e 45 dias de lactação. Os parâmetros de escore de condição corporal, dosagem de beta-hidroxibutirato, hematócrito, hemoglobina, lactato, glicose, peso corporal, peso da placenta e produção do leite foram mensurados e correlacionados. Os valores médios de hematócrito, hemoglobina e peso dos cordeiros apresentaram diferenças significativas (p< 0,05) entre os grupos EC e OC. O peso médio da placenta e a produção de leite apontaram diferença significativa enquanto que os achados para escore de condição corporal (ECC) e beta-hidroxibutirato não evidenciaram diferenças entre os grupos EC e OC, considerando todos os períodos em conjunto (p> 0,05). A produção leiteira de ovelhas do grupo EC (1.261,25 mL/dia) foi maior (p <0,05) do que no grupo OC (937,79 mL/dia). A esquila de ovelhas aos 74 dias de gestação mostrou-se como importante ferramenta para o melhor desenvolvimento de cordeiros na fase pós-nascimento de forma a contribuir para a diminuição da taxa de mortalidade perinatal. / The annual loss of sheep in extensive system has expressive levels in southern Brazil. It can reach 30% in some areas and becomes an alarming factor for properties with systems producing meat, milk and wool. Reproductive losses in sheep in this region are related to low conception rate of the herd and a high lamb perinatal mortality (LPM). Often these factors are due to diseases, nutritional deficiencies during pregnancy and postpartum period or inadequate management of ewes and lambs. Perinatal mortality is defined as lambs in the death of the neonate until the first twenty-eight days. The LPM is responsible for the low rate of weaning in Rio Grande do Sul (RS), southern Brazil. Its etiology involves complex actions and interaction of many factors related to each other. Studies about causes of the LPM in RS have showed the complex exposure, hypothermia and starvation, in addition to dystocia as the two main pathologies involved in these deaths. Adverse environmental conditions, such as severe cold, cause death due to the lack of adaptation of the newborn to the new living conditions also. The search for more information that might elucidate the causes of these losses motivated the present study and the use of shearing during pregnancy has been used as a possible tool to minimize LPM. The effect of pre-partum shearing (74 days gestation) on the metabolic and productive profile and weight of ewes and their lambs develop during the first month of life were studied. A flock of 40 pregnant Corriedale ewes were randomly divided into 2 groups: ewes completely sheared (EC) and ewes maintained with fleece or sheep control (OC). The ewes and their lambs were evaluated at three different times during the experiment: at birth, between 15 and 21 days of lactation and between 22 and 45 days of lactation. The parameters such as body condition score, betahydroxybutyrate, PVC, hemoglobin, lactate, glucose, body weight, placental weight and milk production were measured and correlated. The mean values of PVC, hemoglobin and lambs weight showed significant differences (p <0.05) between the EC and OC groups. The average weight of placenta and milk production showed a significant difference while the findings for body condition score (ECC) and beta-hydroxybutyrate showed no differences between groups EC and OC, considering all periods together (p> 0.05). Milk production of ewes of group EC (1261.25 mL / day) was higher (p < 0.05) than in the OC group (937.79 mL / day). Shearing of sheep at 74 days of pregnancy was a important tool for the better development of lambs in the post-birth in order to contribute to reducing the rate of perinatal mortality.