Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this study was to investigate the role of GnRH on the preimplantation development of mouse embryos in vitro. GnRH-I, GnRH-II, and GnRH agonists: Des-Gly, Des-Trp and histrelin did not improve embryo development. However, treatment with the specific GnRH antagonist SB-75 blocked embryo development at morula stage. The inhibition of embryo development by SB-75 could be rescued by the addition of histrelin. To determine which intracellular signaling cascade is involved following binding of GnRH to the GnRHR, embryos were cultured in the presence of specific PKC (GFX) or PKA (SQ22536) inhibitors. The PKC inhibitor blocked embryo development at a similar stage as SB-75, whereas SQ22536 had an inhibitory effect, diminishing blastocyst formation and hatched rates. There are evidences that GnRH has an essential autocrine effect on mouse embryonic development via GnRHR, probably by activating PKC signaling cascade while the inhibition of the GnRH signaling does not activate apoptotic mechanisms involving caspase-3. In another experiment, development in vitro of embryos from Chinese Meishan (M) and occidental white crossbred (WC) females were investigated after improving the vitrification protocol for pig embryos. Efficient cryopreservation of zona pellucida-intact porcine embryos and studies of the difference among breeds could greatly impact the swine industry. The percentage of embryos surviving 24 h after cryopreservation without lysis or degeneration was higher for M (72%) than WC (44%). However, in vitro development of embryos that survived cryopreservation was not different between M and WC at the expanded (64%) or hatched (22%) blastocyst stages. Developmental rates were significantly higher for control embryos than frozen embryos from both breeds at expanded blastocyst stage, but not at hatched blastocyst stage. Rates of expanded blastocyst formation did not differ between M and WC control embryos (98 and 95%, respectively). With a new procedure to warm vitrified pig embryos, the survival rates may be improved. The optimal stages to vitrify pig embryos using the microdroplet method ranges from late compact morula to early expanded blastocyst. The results suggest that M embryos have a higher capacity to survive the vitrification process than WC embryos. / O objetivo do presente estudo foi investigar a importância do GnRH no desenvolvimento embrionário precoce em camundongos. GnRH-I, GnRH-II e os GnRH agonistas: Des-Gly, Des-Trp e histrelina não incrementaram o desenvolvimento embrionário. Entretanto, o tratamento com SB-75, um antagonista específico do GnRH, bloqueou o desenvolvimento embrionário no estádio de mórula. A inibição do desenvolvimento embrionário pelo SB-75 pôde ser revertida com a adição de histrelina. Para determinar a cascata do sinal intracelular desencadeada pela ligação do GnRH com o seu receptor, embriões foram cultivados na presença de inibidores específicos da PKC (GFX) e da PKA (SQ22536). O inibidor da PKC bloqueou o desenvolvimento embrionário em estádio similar ao bloqueio mediado pelo SB-75, enquanto o SQ22536 teve efeito inibitório diminuindo a formação de blastocisto e taxas de eclosão. Os resultados sugerem que o GnRH tem um efeito autócrino essencial no desenvolvimento embrionário através do GnRHR, provavelmente, ativando a cascata da PKC. Por outro lado, a inibição do sinal do GnRH não ativa mecanismos apoptóticos que involvam caspase-3. Em outro experimento, foi investigado o desenvolvimento in vitro de embriões da raça Meishan (M) e branco cruzado (WC) após vitrificação pelo método microgota. O desenvolvimento de protocolos eficientes para criopreservação de embriões suínos com a zona pelúcida intacta e a avaliação das diferenças entre raças pode ter um significativo impacto na suinocultura. A percentagem de embriões que sobreviveram à criopreservação depois de 24 h foi maior na M (72%) do que na WC (44%). No entanto, o desenvolvimento in vitro dos embriões que sobreviveram à criopreservação não foi diferente entre M e WC nos estádios de blastocisto expandido (64%) ou eclodido (22%). Os índices de desenvolvimento foram significativamente mais altos para os embriões controle do que para os embriões vitrificados nas duas raças no estádio de blastocisto expandido, porém não foram diferentes para o estádio de blastocisto eclodido. A formação de blastocisto expandido não diferiu entre os embriões controle M e WC (98 e 95%, respectivamente). Com o novo procedimento ( hot warm ) para descongelar embriões vitrificados pelo método de microgota, pode-se aumentar dos índices de sobrevivência. Os melhores estádios embrionários para a vitrificação de embriões suínos variam de mórula compacta tardia até blastocisto expandido inicial. Os resultados sugerem que embriões M têm mais capacidade de sobreviver ao processo de vitrificação do que embriões WC.

Os tumores malignos hepáticos são raros nas crianças, sendo o tumor embrionário hepatoblastoma a neoplasia hepática mais comum em crianças abaixo dos 5 anos e, ainda assim, responsável por apenas 1% dos tumores incidentes nessa faixa etária. Devido, entre outros fatores, à sua baixa incidência, o hepatoblastoma é um tumor ainda pouco caracterizado a nível molecular. O presente trabalho contemplou três frentes de análises moleculares em hepatoblastomas: análise de alterações em número de cópias (através da técnica array-CGH), investigação de mutações somáticas em regiões codificadoras (sequenciamento de exoma por next-generation) e delineamento de perfil global de metilação de DNA (beadarrays). Encontramos um baixo número de alterações em número de cópias, na maioria ganhos de grande extensão cromossômica, evidenciando uma baixa instabilidade cromossômica em comparação ao encontrado em outros tumores sólidos de adultos. Uma região em 2q24 previamente associada a um pior prognóstico em hepatoblastomas foi encontrada como ganho de alta amplitude (amplicon). A análise de expressão gênica na área destacou 5 dos 48 genes como super-expressos em nossas amostras de hepatoblastomas (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A e SCN3A). Foi observada também uma baixa ocorrência de mutações somáticas não-sinônimas, quando comparada à magnitude de variações encontradas em outros tumores sólidos de adultos. Descrevemos uma nova mutação não-sinônima danosa no exon 3 do gene CTNNB1 (beta-catenina), marcador molecular de destaque em hepatoblastomas, que provavelmente desenvolve um papel importante na tumorigênese deste tipo de neoplasia. Dentre a lista de alterações somáticas encontradas, cabe destacar o enriquecimento da via Wnt, via da beta-catenina, já bem estudada em hepatoblastomas e que apresenta correlação tanto com desenvolvimento embrionário como com o processo de carcinogênese. Destacamos uma lista de mutações somáticas não-sinônimas presentes com boa cobertura em nossos experimentos, e ausentes ou presentes em baixa frequência (< 1%) na população. O presente estudo é o pioneiro na análise de alterações globais no padrão de metilação de citosinas em hepatoblastomas, e revelou um padrão incomum de hipometilação global nos tumores, não associado à metilação de regiões repetitivas LINE-1; especificamente, hepatobastomas apresentam um nível intermediário entre o encontrado para os fígados maduros e aquele encontrado para os fígados fetais. Tal achado dá suporte ao modelo no qual a tumorigênese do hepatoblastoma recapitularia fases do desenvolvimento fetal do fígado. Foram destacados 11 genes que apresentaram padrão de metilação de DNA diferencial em seus promotores. Em suma, nossos achados revelam que o tumor embrionário hepatoblastoma apresenta relativa estabilidade genética, com uma frequência menor de alterações (alterações em número de cópias e mutações somáticas em regiões codificadoras) que tumores sólidos de adultos. Simultaneamente, foi detectado um padrão marcante de hipometilação global de DNA associado ao tumor, evidenciando a importância de aspectos epigenéticos em sua tumorigênese / Hepatic malignant tumors are rare in children, the embryonal tumor hepatoblastoma is the most common liver cancer in children under 5 years old but, in spite of that, accounts for only 1% of incident tumors in this age group. Due to its low incidence, among other factors, hepatoblastoma is a tumor poorly characterized at molecular level. This study included three approaches of molecular analyzes in hepatoblastomas: examination of copy number alterations (through array-CGH technique), investigation of somatic mutations in coding regions (next-generation exome sequencing) and determination of the global DNA methylation profile (bead arrays). We found a low frequency of copy number alterations, mostly consisting of large extent chromosomal gains, reflecting lower chromosomal instability than other solid adult tumors. A region at 2q24, previously associated with worse prognosis in hepatoblastomas, was found amplified in high amplitude (amplicon). Gene expression analysis of the 48 genes comprised in the amplicon segment highlighted five genes as overexpressed (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A and SCN3A). We also observed a low frequency of non-synonymous somatic mutations in our hepatoblastomas samples compared to the amount of variation found in other adult solid tumors. We described a predicted harmful non-synonymous mutation in exon 3 of CTNNB1 gene (beta-catenin), the best characterized molecular marker in hepatoblastomas. The list of somatic alterations points to a remarkable enrichment of genes from the Wnt pathway, which is well-studied in hepatoblastomas and is associated both with embryonic development and with the process of carcinogenesis. We highlighted a list of non-synonymous somatic mutations that presented high coverage in our experiments, and were absent or present at low frequency (<1%) in the general population. This study is the first to analyze global changes in cytosine methylation in hepatoblastomas, and revealed an unusual pattern of global hypomethylation in these tumors, not associated with LINE-1 repetitive regions; specifically, hepatobastomas exhibited an intermediate level of methylation, in between the patterns of mature and fetal livers. This finding supports the model in which the oncogenesis of hepatoblastoma recapitulates stages of fetal liver development. We highlighted 11 genes that showed differential pattern of DNA methylation in their promoters compared to differentiated liver. In summary, our findings show that the embryonal tumor hepatoblastoma are relatively genetically stable with lower frequency of alterations (changes in copy number and somatic mutations in coding regions) than most solid adult tumors. Simultaneously, a clear pattern of global hypomethylation of non-repetitive DNA was associated with the tumor, indicating the importance of epigenetic aspects in its tumorigenesis

Experimentos anteriores realizados em nosso laboratório indicam que o sucesso gestacional é afetado pela poluição atmosférica. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos associados a uma curva dose resposta das partículas de exaustão do diesel (PED) sobre o desenvolvimento embrionário inicial e o potencial de implantação, utilizando-se como modelo a fertilização in vitro e o cultivo embrionário de camundongos. No Experimento 1, encontrou-se um efeito negativo dose-dependente sobre o desenvolvimento embrionário inicial, o processo de eclosão, a alocação das células e a morfologia da massa celular interna (MCI) dos blastocistos. A análise post-hoc revelou que o desenvolvimento precoce do embrião não foi afetado pelas concentrações de 0,2 µg/cm2 ou 2 µg/cm2, mas foi significativamente afetado pela concentração de 20 µg/cm2 de PED. O processo de eclosão foi prejudicado pelas concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. A alocação das células da MCI e a relação entre as células da MCI e do trofectoderma foram significativamente afetadas por todas as concentrações. Adicionalmente, observou-se um efeito negativo sobre a morfologia da MCI para as concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. O Experimento 2, apesar de não mostrar efeito significativo sobre o potencial de implantação, evidenciado pela capacidade de adesão dos blastocistos e crescimento trofoblástico, revelou que a morfologia da MCI no dia 8 de cultivo, as taxas de viabilidade e de apoptose celular e a expressão de Oct4 e Cdx2 foram significativamente afetadas. O teste HSD-Tukey demonstrou que a presença de PED (0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2) durante o desenvolvimento embrionário aumentou significativamente a taxa de células em apoptose dos embriões tanto no dia 5 quanto no dia 8 de cultivo e, embora a proporção de células viáveis no dia 8 tenha sido prejudicada por ambas as concentrações, apenas a exposição a 2 µg/cm2 de PED diminuiu a viabilidade celular no dia 5. Por outro lado, tanto a concentração de 0,2 µg/cm2 como a de 2 µg/cm2 tiveram um efeito negativo significativo sobre a qualidade da MCI no dia 8 e a taxa de expressão de Oct4 nos blastocistos e aumentaram a porcentagem de células desses blastocistos expressando Cdx2, adicionalmente, a razão Oct4/Cdx2 dos embriões expostos a 0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2 foi significativamente menor. Frente a esses resultados, presumi-se que as PED poderiam estar envolvidas nos mecanismos que levariam à diminuição do sucesso reprodutivo observado em camundongos expostos à poluição atmosférica ambiental / Previous experiments conducted in our laboratory demonstrate that successful pregnancy is affected by air pollution. The aim of this study was to evaluate the biological effects associated with a dose-response curve of the diesel exhaust particles (DEP) on early embryonic development and implantation potential, using mice in vitro fertilization and culture embryo as model. In Experiment 1, we found a negative dose-dependent effect on the embryonic development, hatching process, cell allocation and morphology of inner cell mass (ICM) of blastocysts. A post-hoc analysis revealed that the early development of the embryo was not affected by concentrations of 0.2 g/cm2 or 2g/cm2, but was significantly affected by the concentration of 20 g/cm2 of DEP. The hatching process was impaired by concentrations of 2 g/cm2 and 20 g/cm2. Cell allocation of ICM and the ratio between cells of ICM and trophectoderm were significantly affected by all concentrations. Addicionaly, we observed a negative effect on ICM morphology was observed for the 2 µg/cm2 and the 20 µg/cm2 concentrations. Experiment 2, despite showing no significant effect on implantation potential, as evidenced by the adhesion ability and trophoblast outgrowth, revealed that ICM morphology on day 8 of culture, rates of cell viability and apoptosis, and expression of Oct4 and Cdx2 were significantly affected. The Tukey HSD test showed that presence of DEP (0.2 g/cm2 and 2 g/cm2) during embryonic development increased significantly the rate of apoptotic cells in embryos as on day 5 as on day 8 of culture, although the proportion of viable cells on day 8 was impaired by both concentrations, only exposure to 2 g/cm2 PED decreased cell viability on day 5. On the other hand, both the concentration of 0.2 g/cm2 such as 2 g/cm2 had a significant negative effect on the quality of ICM on the day 8 and the rate of expression of Oct4 on blastocysts, and increased the percentage of cells from these embryos expressing Cdx2, also, Oct4/Cdx2 ratio were significantly lower in the blastocysts derived from embryos exposed to 0.2 g/cm2 and 2 g/cm2¬ concentrations. Given these results, the suggestion is that DEP could be involved in the mechanisms that lead to decreased reproductive success observed in mice exposed to environmental pollution

A tranferência nuclear de células somáticas (TNCS) está sendo utilizada para produzir cavalos de elite. No entanto, durante este procedimento pode ocorrer a perfuração da zona pelúcida, levando, ocasionalmente, à secção da massa celular interna, e conseqüente derivação de gêmeos monozigóticos. Além de serem relatadas alterações no processo de imprinting genômico, que conduzem ao desenvolvimento de doenças. Com a descoberta da possibilidade de reprogramar as células somáticas a um estado de pluripotência (iPSCs), estas células passaram a ser muito utilizadas em pesquisas de neurociência. Contudo, também ocorrem modificações epigenéticas durante esta reprogramação celular. Portanto, nossas hipóteses são que os gêmeos eqüinos gerados pela TNCS podem levar às irregularidades no desenvolvimento do sistema nervoso. O padrão de metilação do SNRPN nas estruturas dos fetos muares clonados, e as células iPSCs são diferentes dos padrões encontrados nos muares analisados. A expressão dos genes SNRPN, Necdin e UBE3A são maiores no cérebro, enquanto a expressão do H19 é maior nas membranas extra-embrionárias. Em nosso estudo, obtivemos duas gestações gemelares equinas derivadas da TNCS, que foram interrompidas com 40 e 60 dias de gestação, e comparados com gestações eqüinas únicas de idade similar. Diferenças no comprimento entre os embriões gêmeos foram observadas aos 40 (2.0 e 2.2 cm 10%) e aos 60 (6,5 e 8,5 cm 24%) dias de gestação. Somente o plexo coróide do quarto ventrículo apresentou-se mais desenvolvido nos fetos com maior comprimento. Ao analisarmos fetos muares clonados em diferentes idades gestacionais e compará-los com muares, nos períodos embrionário, fetal e adulto, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, na décima passagem das células iPSC o padrão de metilação alterou, em relação aos muares estudados e ao padrão observado nos fibroblastos. Ao analisarmos os fetos clonados nas diferentes idades gestacionais observou-se no cérebro menor expressão dos gene H19 e UBE3A, e maior expressão do gene SNRPN. Contudo, a expressão do gene Necdin variou entre as estruturas estudadas. Em conclusão, apesar dos gêmeos eqüinos provenientes de TNCS diferirem quanto ao tamanho, morfologicamente são iguais. Dentre as estruturas cerebrais o plexo coróide se apresentou mais desenvolvido nos fetos de maior comprimento. Os fetos muares clonados não apresentaram diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, as iPSCs apresentaram alteração no padrão de metilação deste gene na décima passagem. Embora os genes SNRPN, Necdin e UBE3A sejam expressos no cérebro, o SNRPN apresentou-se prevalente nessa estrutura / The nuclear transfer of somatic cells (SCNT) is being used to produce elite horses. However, during this procedure can occur drilling of the zona pellucida, leading occasionally to the section of the inner cell mass, and subsequent derivation of monozygotic twins. Besides being related changes in genomic imprinting process, leading to the development of diseases. With the discovery of the possibility to reprogram somatic cells to a pluripotent state (iPSCs), these cells have become widely used in neuroscience research. However, also occur epigenetic changes during this cellular reprogramming. Therefore, our hypothesis is that equine twins caused by equine ART could lead to developmental irregularities of the nervous system. The patterns of SNRPN methylation in the structures of cloned mule fetuses and in iPSCs are different from the patterns found in the analyzed mules. And the expression of SNRPN, Necdin and UBE3A genes are higher in the brain, while the higher expression of H19 gene occurs in the extraembryonic membranes. In our study we derived two equine twin SCNT pregnancies that were interrupted at 40 and 60 days of gestation and compared to singleton fetuses of similar age. Differences in lengths between twin embryos were observed at both 40 (2.0 and 2.2 cm 10%) and 60 (6.5 and 8.5 cm 24%) days of gestation. Only the choroid plexus in the fourth ventricle more developed in the twins with the greatest length. Analyzing mules cloned fetuses at different gestational ages, and compare them with mules at embryonic, fetal and adult period; there was no difference in the pattern of methylation in SNRPN gene. However, in the tenth passage of the iPSCs the methylation pattern was altered in relation to the studied mules and the pattern observed in fibroblasts. When the cloned fetuses at different gestational ages were analyzed, the brain presented lower expression of H19 and UBE3A genes, and higher expression of SNRPN gene. However, the expression of Necdin gene varied among the structures studied. In conclusion, despite the twin horses from SCNT differ in size, they are morphologically identical. Among the brain structures the choroid plexus performed more developed in the fetuses of greater length. Cloned mules fetuses showed no difference in the pattern of methylation SNRPN gene. However, iPSCs have changes in the pattern of methylation of this gene in the tenth passage. Although SNRPN, Necdin and Ube3A genes are expressed in the brain, SNRPN is prevalent in this structure

A poluição atmosférica de São Paulo (SP) pode provocar alterações cardiovasculares em seres humanos e animais experimentais, com maior vulnerabilidade em crianças e fetos. O mecanismo fisiopatológico que explicaria a relação entre a exposição aos poluentes e doenças cardiovasculares não está totalmente estabelecido, sendo que o estresse oxidativo pode estar ligado ao dano e morte celular. Há evidências de que o dano oxidativo pelo mecanismo da peroxidação lipídica pode estar relacionado às causas de diversas cardiovasculopatias. Estudamos o efeito da exposição ao ar ambiental nos níveis de peroxidação lipídica no coração de camundongos nos períodos pré e pós-natal. Os animais foram mantidos em duas câmaras de exposição, uma recebendo ar ambiente e outra ar filtrado, em quatro diferentes grupos: 1) LL: gestados e crescidos em câmara com ar filtrado, 2) PP: gestados e crescidos em câmara com ar poluído de SP, 3) PL: gestados na câmara poluída e crescidos na limpa, e 4) LP: gestados na câmara limpa e crescidos na poluída. A peroxidação lipídica do miocárdio foi avaliada tanto pelo método TBA como por imunohistoquímica para 15-F2t-isoprostano. As concentrações de malondialdeído (MDA, indicador de peroxidação lipídica) foi maior nos animais PP quando comparados aos LL (p = 0,004) e PL (p = 0,026), e não mostrou diferença significativa em relação ao grupo LP (p = 0,894). Os valores de MDA para animais PL e LP mostraram-se equivalentes (p = 0,168). Chama a atenção que o grupo PL apresentou um valor de MDA maior que o LL (p = 0,026). A fração de volume de miocárdio marcada imunohistoquimicamente para 15- F2t-isoprostano apresentou valores maior em PL (p = 2,884x10-5), LP (p = 6,632x10-6) e PP (p = 5,45x10-8) que em LL. O valor de PP foi maior que os de PL e LP (p = 3,661x10-4 e 1,058x10-3, respectivamente), sendo esses últimos equivalentes entre si (p = 0,624). A análise ultra-estrutural mostrou de maneira consistente a presença de lisossomos secundários contendo estruturas lipídicas membranosas nos grupos LP e PP. A porcentagem média de arteríolas com área entre 200 e 1000 ?m² em relação ao número total de vasos de cada grupo foi maior no grupo PP do que nos grupos LL e PL (p=0,0387 e p=0,0362, respectivamente). Estes resultados sugerem que existem altos níveis de peroxidação lipídica no tecido cardíaco dos animais expostos ao ar ambiental de SP. Chama a atenção o fato de que a exposição intra-uterina ter implicado em níveis maiores de estresse oxidativo na fase adulta, mesmo com a melhoria das condições ambientais. Comparam-se estes achados no miocárdio a outros resultados da literatura. / I t is well known that air pollution exposure in São Paulo can elicit cardiovascular injuries in humans and experimental animals and that children and fetuses appear to be particularly vulnerable. However, the mechanisms involved in this cardiovascular damage are not well understood. It has been suggested that the oxidative stress generated by air pollution exposure can trigger tissue injury. There is evidence supporting the idea that injury caused by lipid peroxidation may be related to the causes of several cardiovascular diseases. The aim of this study was to investigate the effects of prenatal and postnatal exposure to urban air pollution on the myocardium lipid peroxidation levels of adult mice. Myocardium lipid peroxidation was determined by the TBA method and by the detection of 15-F2t-isoprostan by immunohistochemical technique. The animals were placed in two chambers: one received air that passed through an air filter (clean) and the second received ambient air (polluted), according to four different exposure procedures: 1) Clean (CC): prenatal and postnatal in the clean chamber (control group), 2) Polluted (PP): prenatal and posnatal in the polluted chamber, 3) Polluted-clean (PC): prenatal in the polluted and posnatal in the clean chamber and 4) Clean-polluted (CP): prenatal in the clean and posnatal in the polluted chamber. The concentration of of malondialdehyde (MDA, a indicator of lipid peroxidation) was higher in group PP compared to CC (p = 0.004) and to PC (p = 0.026), and was not different of group CP (p = 0.894). The values of MDA for groups PC and CP turned to be equal (p = 0.168). Interestingly, group PC had a higher value of MDA than group CC (p = 0.026). The volume fraction of myocardium with detection of 15-F2tisoprostane is higher in PC (p = 2.884x10-5), CP (p = 6.632x10-6) and PP (p = 5.45x10-8) than in CC. The value of PP in higher than those of PC and CP (p = 3.661x10-4 and 1.058x10-3, respectively), while the latter two were equal to each other (p = 0.624). ). The mean ratio of arterioles wiht lumen area between 200 and 1000?m² to the total number of vessels in each group was higher in PP than in CC and PC (p=0.0387 and p=0.0362, respectively). These results, which suggest that exposure to air pollution is associated to higher levels of lipid peroxidation in the myocardium, are compared to other results previously published about respiratory and reproductive alterations related to pollution. Interestingly, the increased levels of lipid peroxidation in the PC group gives evidence that the prenatal exposure to urban air pollution can be linked to cardiovascular effects in adult life.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição crônica à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana e o desenvolvimento embrionário inicial. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar diferentes metodologias utilizadas para a coloração diferencial das linhagens celulares do blastocisto, um método mais adequado para a avaliação de sua qualidade e normalidade. As células de blastocistos intactos de camundongo obtidos através de fertilização in vitro (FIV) foram permeabilizadas e coradas utilizando-se diferentes concentrações de um detergente (TX-100; 0,5% ou 1%) e de iodeto de propídeo (IP; 50 g/mL ou 100 g/mL) e depois disso, incubadas durante a noite em uma solução contendo diferentes fixadores (etanol, metanol, paraformaldeído PFA1% ou 4%) e bisbenzimida. Para a avaliação da qualidade de coloração e contagem diferencial dos núcleos, os blastocistos foram montados em lâminas de vidro e analisados em um microscópio de epifluorescência. O escore de qualidade de coloração foi significativamente diferente (p<0,05) entre todas as soluções fixadoras, sendo maior para o etanol, seguido pelo metanol, PFA1% e PFA4%. Mudanças da concentração do IP e o uso de diferentes soluções de fixação revelaram efeitos significativos na contagem de células da massa celular interna (MCI) e na razão MCI/trofectoderma (TE). Concentrações diferentes do detergente utilizado para a permeabilização celular apresentaram efeitos significativos sobre a contagem de células TE e razão MCI/TE. Concluímos que o protocolo que utiliza TX-100 1% para a permeabilização celular, 50 g/mL de IP para coloração das células TE e etanol como solução de fixação representa o método mais eficiente para a coloração diferencial e contagem das células das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. No segundo projeto que compõe esta, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pós-natal ao ar ambiente sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de seis semanas tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré- e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante nove semanas. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos, razão sexual, resposta ovariana à estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e TE. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre a FIV, o desenvolvimento embrionário e a coloração diferencial dos blastocistos foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. Nenhuma diferença na contagem celular total foi observada. Baseando-se nessas observações, nosso estudo sugere que a exposição ao material particulado fino presente no ar ambiente de um grande centro urbano pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. Finalmente, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi de avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pósnatal ao ar ambiente no final da vida reprodutiva sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de cinco meses tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante seis meses. Os pontos de avaliação reprodutivos foram os mesmos que aqueles utilizados no segundo projeto. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre coloração diferencial dos blastocistos, mas não sobre a FIV e o desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular do TE dos blastocistos produzidos no protocolo FA-FA foi significativamente menor do que aquela em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular total foi similar entre os grupos. Nosso estudo sugere que a exposição à poluição ambiental particulada de um grande centro urbano não altera a função ovariana, mas pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina no período final do menacme, através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of chronic exposure to particulate air pollution on ovarian function and early embryo development. The objective of the first project was to assess different methodologies used in cell lineage differential staining of the blastocyst, a method for more accurate evaluation of its quality and normality. Cells of zona-intact mouse blastocysts obtained from in vitro fertilization (IVF) were permeabilized and stained using different concentrations of a detergent (TX-100; 0.5% or 1%) and propidium iodide (PI; 50 g/mL or 100 g/mL) followed by overnight incubation in a solution containing different fixatives (ethanol, methanol, paraformaldehyde - PFA 1% or 4%) and bisbenzimide. To evaluate the staining quality and count the nuclei differentially, blastocysts were mounted and viewed using epifluorescence microscopy. Staining quality scores were significantly different (P < 0.05) among all fixative solutions with the highest for ethanol followed by methanol, PFA1%, and PFA4%. Changes in PI concentration and use of different fixative solutions revealed significant effects on inner cell mass (ICM) cell count and ICM/trophectoderm (TE) ratio. Different concentrations of the detergent used for cell permeabilization showed significant effects on TE cell counts and ICM/TE ratio. I concluded that the protocol using 1% TX-100 for cell permeabilization, 50 g/mL of PI for TE cell staining, and ethanol as a fixative solution is the most efficient method for cell lineage differential staining and counting at the blastocyst stage. In the second project the objective was to evaluate the effects of preand/ or postnatal exposure to ambient air on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the IVF mouse model. Six-week old superovulated mice were preand/ or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FAAA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 for nine weeks. Reproductive endpoints evaluated included gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, sex ratio, ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and TE. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient fine particulate matter on IVF, embryo development, and blastocyst differential staining was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. No difference in the total cell count was observed. Based on these observations the study suggests that exposure to ambient fine particulate matter in a large urban center may negatively affect female reproductive health by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, the purpose of the third project was to evaluate the effects of pre- and/or postnatal exposure to particulate air pollution on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts during the late-life reproductive period using the IVF mouse model. Five-month-old superovulated mice were pre- and/or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FA-AA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 during six months. Reproductive endpoints were the same as the ones selected for the second project. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient air on blastocyst differential staining but not on IVF and embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. Cell counts in TE cells in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly lower than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. The total cell count was similar among groups. This study suggests that exposure to particulate air pollution in a large urban center has no effect on ovarian function but may negatively affect female reproductive health in the late-life period by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as oscilações da concentração de cálcio intracelular livre resultam na proliferação celular, migração e diferenciação neuronal. Nesta tese foram investigadas a participação dos receptores ionotrópicos purinérgicos dos tipos P2X2 e P2X4 seletivos ao influxo de cálcio durante a diferenciação neuronal in vitro das células de carcinoma embrionário murino P19. Identificamos o padrão diferencial de expressão de receptores purinérgicos nas células indiferenciadas e neurônios P19. O receptor P2X4 é expresso durante toda a diferenciação neuronal e o receptor P2X2 é detectado na fase tardia da diferenciação em neurônios. Através de ensaios farmacológicos, foi possível identificar a participação dos receptores metabotropicos P2Y e do receptor P2X4 na formação dos corpos embriônicos, na proliferação celular e ou na determinação do fenótipo de progenitor neural. Durante a maturação neuronal os receptores P2X2 e P2Y1 participam da determinação do fenótipo neuronal glutamatérgico NMDA e os receptores P2X2 e P2Y2 no fenótipo neuronal colinérgico. A ausência de inibidores específicos e seletivos aos receptores purinérgicos levou-nos a empregar a técnica SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) a fim de identificar inibidores seletivos aos receptores P2X2 e P2X4. A técnica envolve a utilização da biblioteca combinatória randômica de RNA 2\'- F pirimidina modificadas resistentes a nucleases. Após 9 ciclos de seleção in vitro de SELEX (ciclo 9-P2X4), as sequências selecionadas mostraram-se seletivas a ligação somente ao receptor P2X4 e não aos receptores P2X2 ou P2X7 através de ensaios de ligação radioligante-receptor. Por patch clamping na configuração whole cell recording identificou-se que além de seletividade ao receptor, que a aplicação do RNA ciclo 9- P2X4 promoveu inibição da corrente ativada pelo ATP somente nos receptores P2X4 e não em P2X2 em celulas 1321N1 astrocitoma transfectadas. A incubação do RNA ciclo 9-P2X4 na concentração de 200 nM com as células no estágio indiferenciado inibiu a formação dos corpos embriônicos. Já utilização de 25 nM, resultou em mudanças morfológicas nas células diferenciadas. Estes dados corroboram com os dados farmacológicos que identificaram a participação do receptor P2X4 na diferenciação precoce. Após 11 ciclos P2X2 de seleção, identificou-se sequências com especificidade de ligação aos receptores P2X2. Aptâmeros, moleculas de RNA com sequência identificada e com alta afinidade ao alvo da seleção, foram isolados de ambas as bibliotecas, ciclo 9 P2X4 e ciclo 11 P2X2. A co-aplicação destes aptâmeros e ATP em ensaios de whole-cell recording resultou na inibição de 30 a 80% da corrente ativada pelo ATP nos receptores P2X2 ou P2X4. Estes testes em células PC12 de rato, que expressa os receptores endógenos, resultou em inibição da corrente ativada pelo ATP de modo semelhante. Além de termos desenvolvido aptâmeros como ferramentas para elucidar as funções dos receptores P2X2 e P2X4 durante o desenvolvimento, diferenciação, em processos fisiológicos e patológicos, estas moléculas resistentes a nucleases são as primeiras identificadas capazes de reconhecer, discernir e inibir dois subtipos de receptores purinérgicos sendo promissores para utilização terapêutica. / During the development of the nervous system, oscillations of intracellular calcium concentrations activate programs of gene expression resulting in proliferation, migration and neuronal differentiation of embryonic cells. In this thesis, the participation of ionotropic P2X2 and P2X4 receptor subtypes, whose receptor channels are highly permeable for calcium influx in the cells, was studied during the process of neuronal differentiation. We have identified differential gene expression of purinergic receptors in undifferentiated and neuronal-differentiated P19 cells. P2X4 receptor expression was present along neuronal differentiation of P19 cells, whereas P2X2 receptor expression was only detected when P19 cells became neurons. Based on purinergic receptor pharmacology we have determined the participation of P2X4 receptors in addition to metabotropic P2Y2 receptors in the formation of embryonic bodies as prerequisites for phenotype determination of P19 neural progenitor cells. Final neuronal maturation of P19 cells in the presence or absence of agonists or antagonists of purinergic receptors implicated the involvement of P2X2, P2Y1, and P2Y2 in the determination of the final neuronal phenotype, such as expression of NMDA-glutamate and cholinergic receptors. In order to further evaluate the functions of these P2X receptors and due to the absence of specific inhibitors for these receptor subtypes, we have used the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) to select for specific inhibitors for P2X2 and P2X4 receptors. The 2\' -F-pyrimidine modified, nuclease- resistant combinatorial SELEX RNA pool enriched with inhibitors of P2X4 receptors following nine cycles of in vitro selection (cycle 9-P2X4) specifically interacted with P2X4 receptors and not with P2X2 or P2X7 receptors as verified in radioligand-receptor binding studies. Moreover, whole-cell recording measurements using astrocytoma cells expressing recombinant rat P2X2 or P2X4 receptors showed inhibition of P2X4 but not of P2X2 receptors by the selected RNA molecules. RNA molecules selected in vitro in 11 reiterative SELEX cycles using the P2X2 receptor as target specifically bound to membrane extracts containing recombinant P2X2 receptors. From both selected RNA libraries (against P2X4 and P2X2 receptors) aptamers, as RNA molecules with identified sequences and high-affinity binding, were identified by cloning and DNA sequencing. The presence of these aptamers in whole-cell recording experiments resulted in 30-80% inhibition of ATP-induced receptor activity and did not provoke any inhibitory effects on P2X receptors which had not been used as selection target. The activity of the aptamers selected using recombinant receptors as targets in inhibiting wild-type P2X4 or P2X2 receptors was verified in whole-cell recording experiments with PC12 cells which endogenously express both receptor subtypes. In addition of having developed aptamers as tools to elucidate P2X2 and P2X4 receptor functions during neuronal differentiation, these nuclease-resistant aptamers are suitable for in vivo use and may turn into therapeutics in the inhibition of purinergic receptor participation in pathophysiological conditions.

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Seis fêmeas adultas da espécie C. apella foram selecionadas e, posteriormente, condicionadas para os procedimentos de colpocitologia ou contenção química. Para o monitoramento do ciclo reprodutivo das fêmeas e crescimento folicular, foram realizados exames colpocitológicos e ultrassonografia (US), respectivamente, para a escolha do melhor dia da monta natural ou inseminação artificial. Vinte dias após a cópula ou inseminação, era realizado o diagnóstico da gestação por meio da US. O dia de cada exame em relação ao parto foi contado em retrospecto (nascimento = dia 0). Os exames ultrassonográficos foram feitos nos dias -133, -113, -83, -53, -21 e -1 antes do parto. A US bidimensional em modo B foi utilizada para mensurar o saco gestacional do dia - 133 até -113; os diâmetros biparietal, fronto-occiptal, circunferência da cabeça e circunferência abdominal do dia -113 a -1; e comprimento do fêmur do dia -53 até -23, mostrando o aumento desses parâmetros com o avanço da gestação. O coração e o estômago começaram a ser visualizados no dia -113 e, os demais órgãos e a sexagem no dia -83. O Triplex Doppler foi empregado para avaliar o fluxo sanguíneo durante o período gestacional, mostrando uma diminuição nos IR e IP das AU e Aum, do dia -133 a -1, bem como observar o desaparecimento da IPD (dia -1) e aparecimento do componente diastólico (dia -53) na onda de fluxo sanguíneo das AU e Aum, respectivamente. Entre os dias -113 a -1, a média da freqüência cardíaca fetal, obtida pelo Triplex Doppler, foi de 189 ± 2,43 bpm. O presente trabalho permitiu determinar a idade gestacional, avaliar o crescimento anatômico do feto, descrever o momento em que os órgãos são visualizados e realizar a sexagem em C. apella. Constatou-se, também, que o fluxo sanguíneo das AU e Aum são importantes parâmetros para avaliar a vitalidade fetal em C. apella. / The objectives were to: 1) perform conceptus ecobiometry for fetal growth assessment and determine the gestational age in Cebus apella; 2) describe the moment that the fetal organs are observed; 3) perform fetal sex identification; 4) evaluate blood flow in the uterine (UA) and umbilical (Uma) arteries, by measuring the resistive index (RI) and pulsatility index (PI); 5) to note the presence or absence of the early diastolic notch (EDN) and diastolic flow in the UA and Uma flow waveforms, respectively, during gestational period in C. apella. Six adult females were selected and trained to allow vaginal swabs or sedation. Vaginal smears and ultrasography (US) were used to monitor the menstrual cycles and follicular growth, respectively, for choose the better day to natural mating or artificial insemination. Twenty days after mating or insemination, the diagnosis of gestation by US was done. The day of the examination relative to whelping was calculated in retrospect (whelping = Day 0). Ultrasonographic examinations were done on Days -133, -113, -83, -53, -21 and -1 before whelping. The B-mode US was used to measure the gestational sac on Days -133 to -113; the biparietal diameter, occipito-frontal diameter, head circumference and abdominal circumference on Days -113 to -1; and femur length on Days -53 to -23, showing that these parameters increased as gestational age advanced. The fetal heart and stomach were observed on Day -113 and, the other organs and fetal sex identification on Day -83. The Triplex Doppler was used to evaluate the blood flow during the gestational period, showing decrease on RI and PI of UA and Uma, on Days -133 to -1, as well as to note the absence of the EDN in the UA waveform on Day -1 and the presence of the Uma diastolic flow on Day -53. From Days -113 to -1, the mean of fetal heart rate, obtained by Triplex Doppler, was 189 ± 2,43 bpm. The current study enabled to determine the gestational age, to assess the fetal anatomical growth, to describe the moment that the organs were observed and to perform fetal sex identification in C. apella. We inferred that UA and Uma blood circulation were important end points to assess fetal vitality in C. apella.

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição crônica à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana e o desenvolvimento embrionário inicial. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar diferentes metodologias utilizadas para a coloração diferencial das linhagens celulares do blastocisto, um método mais adequado para a avaliação de sua qualidade e normalidade. As células de blastocistos intactos de camundongo obtidos através de fertilização in vitro (FIV) foram permeabilizadas e coradas utilizando-se diferentes concentrações de um detergente (TX-100; 0,5% ou 1%) e de iodeto de propídeo (IP; 50 g/mL ou 100 g/mL) e depois disso, incubadas durante a noite em uma solução contendo diferentes fixadores (etanol, metanol, paraformaldeído PFA1% ou 4%) e bisbenzimida. Para a avaliação da qualidade de coloração e contagem diferencial dos núcleos, os blastocistos foram montados em lâminas de vidro e analisados em um microscópio de epifluorescência. O escore de qualidade de coloração foi significativamente diferente (p<0,05) entre todas as soluções fixadoras, sendo maior para o etanol, seguido pelo metanol, PFA1% e PFA4%. Mudanças da concentração do IP e o uso de diferentes soluções de fixação revelaram efeitos significativos na contagem de células da massa celular interna (MCI) e na razão MCI/trofectoderma (TE). Concentrações diferentes do detergente utilizado para a permeabilização celular apresentaram efeitos significativos sobre a contagem de células TE e razão MCI/TE. Concluímos que o protocolo que utiliza TX-100 1% para a permeabilização celular, 50 g/mL de IP para coloração das células TE e etanol como solução de fixação representa o método mais eficiente para a coloração diferencial e contagem das células das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. No segundo projeto que compõe esta, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pós-natal ao ar ambiente sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de seis semanas tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré- e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante nove semanas. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos, razão sexual, resposta ovariana à estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e TE. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre a FIV, o desenvolvimento embrionário e a coloração diferencial dos blastocistos foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. Nenhuma diferença na contagem celular total foi observada. Baseando-se nessas observações, nosso estudo sugere que a exposição ao material particulado fino presente no ar ambiente de um grande centro urbano pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto. Finalmente, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi de avaliar os efeitos da exposição pré e/ou pósnatal ao ar ambiente no final da vida reprodutiva sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais, utilizando o modelo de FIV de camundongo. Fêmeas de camundongo com idade de cinco meses tiveram a ovulação estimulada e foram expostas no período pré e/ou pós-natal ao ar filtrado (AF-AF), ar filtrado ar ambiente (AF-AA) ou ar ambiente ar ambiente (AA-AA) em câmaras de exposição 24 horas por dia, sete dias na semana, durante seis meses. Os pontos de avaliação reprodutivos foram os mesmos que aqueles utilizados no segundo projeto. A duração da gestação, tamanho e peso da prole, índice de nascidos vivos e razão sexual foram similares nos diferentes grupos de exposição. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariável para a exposição pré e/ou pós-natal ao material particulado fino ambiente sobre coloração diferencial dos blastocistos, mas não sobre a FIV e o desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular na MCI e a razão MCI/TE dos blastocistos produzidos no protocolo AF-AF foram significativamente maiores do que aquelas em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular do TE dos blastocistos produzidos no protocolo FA-FA foi significativamente menor do que aquela em blastocistos produzidos nos protocolos FA-AA e AA-AA. A contagem celular total foi similar entre os grupos. Nosso estudo sugere que a exposição à poluição ambiental particulada de um grande centro urbano não altera a função ovariana, mas pode afetar negativamente a saúde reprodutiva feminina no período final do menacme, através da alteração da especificação das linhagens celulares do embrião no estágio de blastocisto / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of chronic exposure to particulate air pollution on ovarian function and early embryo development. The objective of the first project was to assess different methodologies used in cell lineage differential staining of the blastocyst, a method for more accurate evaluation of its quality and normality. Cells of zona-intact mouse blastocysts obtained from in vitro fertilization (IVF) were permeabilized and stained using different concentrations of a detergent (TX-100; 0.5% or 1%) and propidium iodide (PI; 50 g/mL or 100 g/mL) followed by overnight incubation in a solution containing different fixatives (ethanol, methanol, paraformaldehyde - PFA 1% or 4%) and bisbenzimide. To evaluate the staining quality and count the nuclei differentially, blastocysts were mounted and viewed using epifluorescence microscopy. Staining quality scores were significantly different (P < 0.05) among all fixative solutions with the highest for ethanol followed by methanol, PFA1%, and PFA4%. Changes in PI concentration and use of different fixative solutions revealed significant effects on inner cell mass (ICM) cell count and ICM/trophectoderm (TE) ratio. Different concentrations of the detergent used for cell permeabilization showed significant effects on TE cell counts and ICM/TE ratio. I concluded that the protocol using 1% TX-100 for cell permeabilization, 50 g/mL of PI for TE cell staining, and ethanol as a fixative solution is the most efficient method for cell lineage differential staining and counting at the blastocyst stage. In the second project the objective was to evaluate the effects of preand/ or postnatal exposure to ambient air on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the IVF mouse model. Six-week old superovulated mice were preand/ or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FAAA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 for nine weeks. Reproductive endpoints evaluated included gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, sex ratio, ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and TE. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient fine particulate matter on IVF, embryo development, and blastocyst differential staining was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. No difference in the total cell count was observed. Based on these observations the study suggests that exposure to ambient fine particulate matter in a large urban center may negatively affect female reproductive health by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, the purpose of the third project was to evaluate the effects of pre- and/or postnatal exposure to particulate air pollution on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts during the late-life reproductive period using the IVF mouse model. Five-month-old superovulated mice were pre- and/or postnatally exposed to filtered air (FA-FA), filtered-ambient air (FA-AA), or ambient air (AA-AA) in exposure chambers 24/7 during six months. Reproductive endpoints were the same as the ones selected for the second project. Gestation length, litter size, litter birth weight, live birth index, and sex ratio were similar among exposure groups. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for pre- and/or postnatal exposure to ambient air on blastocyst differential staining but not on IVF and embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly higher than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. Cell counts in TE cells in blastocysts produced in the FA-FA protocol were significantly lower than in blastocysts produced in FA-AA and AA-AA protocols. The total cell count was similar among groups. This study suggests that exposure to particulate air pollution in a large urban center has no effect on ovarian function but may negatively affect female reproductive health in the late-life period by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage.