Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction: Stem cell therapy has been applied as coadjutant or treatment for some diseases or disorders. A range of sources of pluripotent cells have been investigated as placental, umbilical cord, teeth pulp, fat. However pluripotent cell behavior submitted to a concomitant physiological disorder as diabetes has been no fully understood. Methods: We aimed to evaluate proliferative potential, and the characterization of stem cells markers for potential cell differentiation, mitochondrial activity, cell cycle and apoptosis in samples of stem cells from yolk sacs obtained from rats in 15 and 20 gd in normal and hyperglycemic conditions using flow cytometry to analyze cell cycle stages, mitochondrial membrane potential, expression of Stro-1, CD90, Nanog, Oct 3/4, CD117, CD115, CD 44, CD34, VEGF-R1, COX-2, MCP-1, INF-₢ R1, L 1 and phosphorylated Caspase-3. Results: In diabetic groups we observed high levels of mitochondrial inactivity, intensively decreasing in G2/M phase, over expression of caspase, decreased expression of adhesion formation markers such as CD 44, CD 34, and NANOG. Increased pluripotency CD 90 receptor, VEGF-R1, TNF-R1, IL-1, COX-2, Caspese. Discussion: In the last period of gestation diabetes might be associated to permeability deregulation, mitochondrial integrity, cytochrome c release, reduction in the cell cycle progression, apoptosis activation and proliferative capacity decreasing. Conclusion: Diabetes seems to play a negative influence on yolk sac cell behavior in the last period of gestation. / Introdução: A terapia com células-tronco tem sido aplicada como coadjuvante no tratamento para algumas doenças ou distúrbios. Uma variedade de células pluripotentes têm sido investigadas essas células podem ser encontradas na placenta, cordão umbilical, polpa de dentes. No entanto o comportamento de células pluripotentes submetido a um distúrbio fisiológico concomitante como diabetes não foi totalmente compreendido. Métodos: O objetivo foi avaliar o potencial de proliferação, e a caracterização de marcadores de células-tronco para diferenciação potencial celular, atividade mitocondrial, ciclo celular e apoptose das células-tronco do saco vitelino obtidos de ratas em 15 e 20 gd em condições normais e hiperglicêmicos usando a citometria de fluxo para analisar as fases do ciclo celular, o potencial da membrana mitocondrial, a expressão de Stro-1, CD90, Nanog, Out 3/4, CD117, CD115, CD 44, CD34, de VEGF-R1, a COX-2, a MCP-1, IFN-₢ R1, L 1 e a caspase-3. Resultados: Nos grupos diabéticos observou-se elevados níveis de inatividade mitocondrial, diminuindo intensamente em fase G2 / M, sobre a expressão de caspase, diminuição da expressão dos marcadores formadores de adesão como CD 44, CD 34, e NANOG. Aumento da Pluripotencia dos receptores CD 90, VEGF-R1, TNF-R1, IL-1, COX-2, Caspese Discussão: No último período de diabetes gestacional pode estar associado à desregulamentação permeabilidade, integridade mitocondrial, liberação de citocromo c, redução da progressão do ciclo celular, ativação da apoptose e diminuição da capacidade proliferativa. Conclusão: Diabetes parece ter uma influência negativa sobre o comportamento das células do saco vitelino nos último período de gestação.

Orientadores: Vera Lucia Gil da Silva Lopes, Iscia Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaCristinaLopesBurronede_D.pdf: 4235837 bytes, checksum: 014a02ceef9fbd93a09deb49df5f0a37 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Síndrome Blefaroqueilodôntica (BCD) e os Defeitos de Linha Média Facial com Hipertelorismo (DLMFH) são defeitos craniofaciais raros. Por esse motivo, os estudos de grandes casuísticas têm sido limitados. Contribuição científica significativa neste assunto tem sido dada por nosso grupo, que delineou características clínicas e diretrizes para seguimento de longo prazo e evidenciou achados neuroradiológicos em ambas as anomalias. Embasado nesses achados preliminares e evidências recentes da literatura pertinente, foi possível estabelecer uma estratégia inicial para investigação etiológica da BCD e dos DLMFH, sendo os objetivos desse projeto: investigar a etiologia da BCD nos indivíduos afetados pela síndrome, por meio de estudo dos genes candidatos IRF6, P63, OSR2, TBX10, FOXE1, SHH, FGF8 e PAX3; pesquisar, nos indivíduos com DLMFH, a presença de mutações nos genes candidatos SHH, FGF8 e PAX3; identificar, em ambas as malformações, possíveis alterações cromossômicas; e, por último, associar os achados clínicos detectados nas investigações anteriores aos possíveis achados moleculares. Foram utilizadas técnicas de sequenciamento direto, array-CGH, genotipagem automática e hibridação in situ por fluorescência. Não foi possível relacionar nenhuma mutação pontual nos genes estudados associadas às malformações em questão, pois não foram encontradas alterações gênicas patogênicas. Entretanto foram detectadas em pacientes com DLFMH três aberrações cromossômicas em regiões distintas do genoma, tratando-se de um caso de duplicação no cromossomo 6 (paciente DLMFH7), um caso com deleção no cromossomo 9 e duplicação no cromossomo 20 (paciente DLMFH10) e um caso de deleção no cromossomo 2 (paciente DLMFH1). Nesse último, o gene PAX3 encontrava-se dentro da região deletada, confirmando a hipótese inicial de que alguns genes de desenvolvimento estão envolvidos na etiologia dos DLMFH. Conclui-se, portanto, que em indivíduos com DLMFH, a técnica de array-CGH pode ser útil para detecção de aberrações cromossômicas diversas e o aconselhamento genético deve ser individualizado / Abstract: The Blepharocheilodontic Syndrome (BCD) and Midline Facial Defects with Ocular Hypertelorism (MFDH) are rare craniofacial anomalies. Considering the rarity of these two groups of congenital defects, studies with large casuistry have been limited. Our group has significantly contributed to the scientific knowledge about both anomalies, delineating clinical characteristics, evidencing neurological findings and designing protocols for long term follow-up. Based in these preliminary findings and recent evidences of pertinent literature, it was possible to determine an initial etiologic investigation strategy for the BCD and the MFDH. The objectives of this project are to investigate the etiology of the BCD in affected individuals through IRF6, P63, OSR2, TBX10, FOXE1, SHH, FGF8 and PAX3 candidate genes study; to search MFDH patients for mutations in the SHH, FGF8 and PAX3 candidate genes; to identify, in both syndromes, possible chromosomal anomalies; and finally, to associate the detected clinical findings in previous investigations to the molecular results. The direct sequencing, array-CGH, automatic genotyping and FISH were the molecular techniques used in this study. It was not possible to relate any punctual mutation in the studied genes associated to the syndromes investigated since none pathogenetic alteration was found. Although, chromosomal anomalies in different locations of the genome were detected in three MFDH patients, a chromosome 6 duplication (in patient MFDH7), a chromosome 9 deletion and chromosome 20 duplication (in patient MFDH10), and a chromosome 2 deletion (in patient MFDH1). In the latter case, the PAX3 gene was inside the deleted region, supporting the initial hypothesis that some development genes are involved in the MFDH etiology. Therefore, it can be concluded that in MFDH patients, the array-CGH investigation can be useful to detect a wide range of chromosomal anomalies and the genetic counseling must be individualized / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-12-13T18:53:37Z No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-14T10:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-14T10:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-12-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to evaluate the addition of antioxidants in different cryopreservation diluents on bovine semen quality after thawing and the in vitro production of embryos. First, the effects of adding different concentrations of glutathione (1.5 and 2.5 mM) and melatonin (0.5 and 1.0 mM) in egg yolk semen cryopreservation diluents (Bovimix®) and soy lecithin (Andromed®) were evaluated. The results showed that the addition of the antioxidant glutathione did not improve the maintenance of sperm characteristics of bovine semen. Melatonin had a negative effect on the spermatic parameters evaluated. The diluent Andromed® obtained better parameters of spermatic kinetics when compared with the diluent Bovimix®. However, in relation to the membrane integrity analyzes of the Bovimix® diluent showed better performance in the maintenance of these parameters. The effect of the cryopreservation diluents and the addition of glutathione in the vitro production of bovine embryos (PIVE) was then evaluated. The rate of cleavage, blastocyst rate and hatching were evaluated eight and nine days after IVF, as well as the correlation between sperm characteristics and PIVE. The diluent Andromed® provided a better cleavage rate, with no effect of the addition of glutathione in it. However, the addition of 2.5 mM glutathione in the Bovimix® diluent improved the cleavage rate. There was a significant correlation of high and low magnitude between some sperm characteristics with the rate of cleavage. It was concluded that glutathione did not improve sperm viability. Melatonin worsened the maintenance of sperm characteristics. Andromed® diluent was more efficient in the in vitro production of bovine embryos with no glutathione effect observed in this diluent. The addition of 2.5 mM glutathione in the egg yolk Bovimix® diluent gave a higher cleavage rate. In vitro evaluation of semen quality is not the best method to predict the fertilizer potential of the same in PIVE, because only significant low to moderate magnitude correlations were observed between some parameters of semen quality and fertilization rate. / Objetivou-se avaliar a adição de antioxidantes em diferentes diluentes de criopreservação sobre a qualidade do sêmen bovino pós-descongelação e a produção in vitro de embriões. Primeiramente, avaliou-se os efeitos da adição de diferentes concentrações de glutationa (1,5 e 2,5 mM) e melatonina (0,5 e 1,0 mM) em diluentes de criopreservação de sêmen à base de gema de ovo (Bovimix®) e lecitina de soja (Andromed®). Os resultados demonstraram que a adição do antioxidante glutationa não melhorou a manutenção das características espermáticas do sêmen bovino. A melatonina reduziu a qualidade das características espermáticas avaliadas. O diluente Andromed® obteve melhores variáveis de cinética espermática quando comparado com o diluente Bovimix®. No entanto, com relação às análises de integridade de membrana o diluente Bovimix® demonstrou melhor desempenho na manutenção dessas variáveis. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos diluentes de criopreservação e a adição de glutationa sobre a produção in vitro de embriões bovinos (PIVE). Avaliou-se a taxa de clivagem, taxa de blastocisto e eclosão oito e nove dias após a fertilização (FIV), assim como a correlação entre as características espermáticas e as taxas de desenvolvimento embrionário. O diluente Andromed® proporcionou melhor taxa de clivagem, sem a necessidade da adição de glutationa no mesmo. Entretanto, a adição de 2,5 mM de glutationa no diluente Bovimix® melhorou a taxa de clivagem. Houve correlação significativa de alta e baixa magnitude entre algumas características espermáticas com a taxa de clivagem. Conclui-se que a glutationa não melhorou a viabilidade espermática. A melatonina reduziu a manutenção das características espermáticas. O diluente Andromed® foi mais eficiente na produção in vitro de embriões bovinos não sendo observado efeito da glutationa neste diluente. A adição de glutationa na concentração de 2,5 mM no diluente Bovimix®, à base de gema de ovo, proporcionou maior taxa de clivagem. A avaliação in vitro da qualidade do sêmen não é o melhor método para predizer o potencial fertilizante do mesmo na PIVE, pois só foram observadas correlações significativas de baixa a moderada magnitude entre algumas características de qualidade do sêmen e a taxa de fertilização.

Apesar da grande melhora nos resultados de desenvolvimento embrionário in vitro, cerca de 40% dos oócitos bovinos fecundados não completam o desenvolvimento na fase de pré-implantação. Diversos fatores estão relacionados a este fenômeno, conhecido como bloqueio do desenvolvimento embrionário. Partindo da premissa que o bloqueio no desenvolvimento ocorre normalmente, durante a ativação do genoma embrionário, aproximadamente, no 4º ciclo celular em bovinos, formulou-se a hipótese de que os genes transcritos no momento da ativação do genoma embrionário estão relacionados ao bloqueio. Nesta tese, um sistema fluorescente de Differential Display PCR (DDPCR) foi desenvolvido para isolar e identificar fragmentos de mRNAs expressos diferencialmente entre embriões que se desenvolvem mais rápido e com melhor taxa de desenvolvimento e aqueles que apresentam desenvolvimento mais lento e com maior taxa de bloqueio. Dentre 176 fragmentos recuperados, 27 foram clonados, seqüenciados e 30 genes identificados. Dois genes, PI3K e ITM2B foram quantificados pela PCR em tempo real. Os resultados sugerem que duas diferentes ativações do genoma podem estar ocorrendo: o grupo de desenvolvimento rápido ativa genes ligados ao desenvolvimento embrionário e, o grupo lento ativa os genes ligados à sobrevivência ou morte celular. / The embryonic developmental block occurs at the 8-cell stage in bovine and is characterized for a lengthening of the cell cycle. At the same stage, also takes place the maternal-embryonic transition (i.e. the activation of the embryonic genome). These events are highly correlated and many genes are activated at the 4th cell cycle however, their functions are mostly unknown. The study of gene expression during this stage will help understand the mechanisms involved in the maternal-embryonic transition and ultimately lead to improvements of in vitro embryo production rates. The aim of this study was to identify genes differentially expressed between bovine embryos with or without developmental competence to reach the blastocyst stage, using Differential Display PCR methodology. Embryos with fast cleavage divisions showing 8 cells at 48 hpi and high potential of development (R8), and embryos with slow cleavage divisions showing 4 cells at 48hpi (L4) and 8 cells at 80 hpi (L8), both with reduced rates of development to blastocyst, were analyzed. We developed an alternative protocol for amplification and recovery of differentially expressed genes from extremely small initial amounts of RNA (10 to 25 pg of mRNA) from preimplantation bovine embryos without need of radio-isotopes. A total of 176 differentially expressed bands were recovered, 27 isolated-fragments were cloned and sequenced confirming the expected primer sequences and allowing the recognition identification of 30 gene transcripts related to bovine embryonic physiology. Two genes, PI3K and ITM2B were chosen for relative quantification of mRNA using Real-Time PCR. Results suggest two different embryonic genome activation mechanisms: fast-developing embryos activate genes related to embryonic development, and slow-developing embryos activate genes related to cellular survival and/or death.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Introdução: Alterações no ambiente fetal conferem um risco aumentado para doenças crônicas como obesidade, doença cardiovascular, hipertensão arterial e diabetes tipo 2. As evidências sugerem que a restrição de crescimento intrauterino (RCIU) pode programar de forma persistente as preferências alimentares, e acredita-se que esse tipo de alteração comportamental, pode explicar, pelo menos em parte, o aumento do risco para essas doenças em indivíduos que sofreram RCIU. Portanto, torna-se importante entender os fatores associados e mecanismos envolvidos nesse comportamento. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da RCIU no comportamento alimentar em animais e humanos, assim como os possíveis mecanismos envolvidos na sua programação. Métodos: Ratas Sprague Dawley prenhes foram randomizadas para o grupo controle (Adlib), que recebeu dieta padrão ad libitum ou grupo restrição 50% (FR), que recebeu 50% do consumo habitual de genitoras alimentadas ad libitum. As dietas foram oferecidas a partir do dia 10 de gestação até o dia 21 de lactação. Em até 24h após o nascimento, foi realizada a adoção cruzada formando os grupos: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. O consumo de ração padrão foi comparado entre todos os grupos. A preferência alimentar, a preferência condicionada por lugar induzida por alimento palatável, assim como a fosforilação da enzima tirosina hidroxilase e os níveis de receptores D2 no núcleo acumbens foram comparados entre os grupos de interesse (Adlib_Adlib e FR_Adlib). Nos humanos, 75 jovens, classificados quanto à RCIU, participaram de avaliação antropométrica, bioquímica e de comportamento alimentar (teste de escolha alimentar, no qual todos recebiam um valor monetário para compra de um lanche, e Dutch Eating Behaviour Questionnaire, DEBQ). Dados de neuroimagem funcional em repouso entre regiões relacionadas à recompensa de 28 indivíduos foram processados e analisados, de um total de 43 exames realizados. Resultados: No estudo experimental, viu-se que o consumo de ração padrão não foi diferente entre os grupos. Ratos restritos apresentaram preferência pela dieta palatável, mas menor condicionamento de preferência ao lugar associado ao alimento palatável. A fosforilação da tirosina hidroxilase no núcleo acumbens foi maior nestes animais no estado basal, mas após exposição ao doce essa diferença entre os grupos permaneceu apenas nos machos. A RCIU também se associou a menores níveis de receptores D2 no núcleo acumbens. No estudo clínico, encontrou-se que a menor razão de crescimento fetal (indicativo de maior RCIU) e alto índice de massa corporal predizem um estilo alimentar restritivo visto pelo DEBQ. Pessoas nascidas com RCIU também usaram menor quantidade do um recurso financeiro oferecido no teste de escolha alimentar após um período de jejum. Os dados de neuroimagem funcional sugerem que os indivíduos restritos apresentam um padrão de conectividade em repouso alterado entre o córtex orbito-frontal, o estriado ventral/dorsal e a amígdala. Conclusão: A RCIU esteve associada com preferência por alimentos palatáveis e alterações no sistema dopaminérgico no estudo experimental e alterações da conectividade em repouso entre áreas do sistema mesocorticolímbico no estudo clínico. As alterações observadas no sistema dopaminérgico dos animais restritos indicam que esse sistema estaria envolvido na programação da preferência alimentar nesses indivíduos. Além disso, o padrão de conectividade em repouso observado nos indivíduos restritos sugere que alterações em determinadas regiões do sistema de recompensa poderiam estar associadas com mudanças no comportamento alimentar. As alterações neurocomportamentais observadas confirmam a existência de programação fetal do comportamento alimentar pela RCIU, apontando modificações persistentes no sistema de recompensa do cérebro, o que pode ser visto como um fator de risco para o desenvolvimento de obesidade e suas comorbidades. / Introduction: Fetal environment changes can lead to adaptations that are associated with increased risk for obesity, cardiovascular disease, hypertension and diabetes in adult life. Evidence suggests that intrauterine growth restriction (IUGR) can persistently program the subject’s preference for palatable foods. It is believed that feeding behavior alterations can explain, at least in part, the increased risk for chronic diseases in IUGR individuals. Therefore, it becomes important to understand the factors and mechanisms involved in this behavior. The aim of this study was to explore how IUGR affects feeding behavior of animals and humans, as well as to verify the potential mechanisms related to this behavioral programming. Methods: Time-mated pregnant Sprague-Dawley rats were randomly allocated to Control (receiving standard chow ad libitum) or 50% food restricted (FR), receiving 50% of the ad libitum-fed dam’s habitual intake. These diets were provided from day 10 of pregnancy throughout day 21 of lactation. Within 24 hours after birth, pups were crossfostered, forming four groups: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. Standard chow consumption was compared between all groups. Food preference, conditioned place preference to a palatable diet, and the nucleus accumbens tyrosine hydroxylase phosphorylation and D2 receptor levels were analyzed focusing on two groups of interest (Adlib_Adlib and FR_Adlib). In humans, 75 youths were classified regarding IUGR and had anthropometric data, biochemical data, and feeding behavior (food choice task, in which everyone received a monetary value to purchase a snack, and Dutch Eating Behaviour Questionnaire) assessed. Forty three neuroimaging exams were performed and resting state functional connectivity between brain regions related to reward of 28 individuals were processed and analyzed. Results: In the experimental study, standard chow consumption was not different between groups. IUGR adult rats had increased preference for palatable food, but showed less conditioned place preference to a palatable diet compared to controls. At baseline, the accumbal tyrosine hydroxylase phosphorylation was increased in IUGR rats compared to controls. After sweet food exposure, the difference between groups remained only in males. Accumbal D2 receptors levels were decreased in IUGR rats. In the clinical study, it was found that low birth weight ratio (indicative of higher IUGR) and high body mass index predict a restrained eating style as seen by the DEBQ. IUGR individuals used a smaller quantity of a financial resource offered in the food choice task after a fasting period. Resting state functional connectivity data suggest that IUGR individuals had an altered pattern of connectivity between the orbitofrontal cortex, the ventral/dorsal striatum and the amygdala. Conclusion: IUGR was associated with a preference for palatable foods and alterations in the dopaminergic system in the experimental study, as well as changes in the resting state functional connectivity between regions of the mesocorticolimbic pathway in the clinical study. Alterations in the mesolimbic dopaminergic system observed in IUGR rats indicate an important role in the programming of food preferences. Moreover, the IUGR pattern of brain connectivity observed suggests that alterations in certain regions involved in reward processing and evaluation could be associated with changes in eating behavior. Neurobehavioral changes observed confirmed the existence of a fetal programming of feeding behavior associated with IUGR, pointing out to persistent modifications in the brain reward system, which can be seen as a risk factor for the development of obesity and its comorbidities.

Os tumores malignos hepáticos são raros nas crianças, sendo o tumor embrionário hepatoblastoma a neoplasia hepática mais comum em crianças abaixo dos 5 anos e, ainda assim, responsável por apenas 1% dos tumores incidentes nessa faixa etária. Devido, entre outros fatores, à sua baixa incidência, o hepatoblastoma é um tumor ainda pouco caracterizado a nível molecular. O presente trabalho contemplou três frentes de análises moleculares em hepatoblastomas: análise de alterações em número de cópias (através da técnica array-CGH), investigação de mutações somáticas em regiões codificadoras (sequenciamento de exoma por next-generation) e delineamento de perfil global de metilação de DNA (beadarrays). Encontramos um baixo número de alterações em número de cópias, na maioria ganhos de grande extensão cromossômica, evidenciando uma baixa instabilidade cromossômica em comparação ao encontrado em outros tumores sólidos de adultos. Uma região em 2q24 previamente associada a um pior prognóstico em hepatoblastomas foi encontrada como ganho de alta amplitude (amplicon). A análise de expressão gênica na área destacou 5 dos 48 genes como super-expressos em nossas amostras de hepatoblastomas (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A e SCN3A). Foi observada também uma baixa ocorrência de mutações somáticas não-sinônimas, quando comparada à magnitude de variações encontradas em outros tumores sólidos de adultos. Descrevemos uma nova mutação não-sinônima danosa no exon 3 do gene CTNNB1 (beta-catenina), marcador molecular de destaque em hepatoblastomas, que provavelmente desenvolve um papel importante na tumorigênese deste tipo de neoplasia. Dentre a lista de alterações somáticas encontradas, cabe destacar o enriquecimento da via Wnt, via da beta-catenina, já bem estudada em hepatoblastomas e que apresenta correlação tanto com desenvolvimento embrionário como com o processo de carcinogênese. Destacamos uma lista de mutações somáticas não-sinônimas presentes com boa cobertura em nossos experimentos, e ausentes ou presentes em baixa frequência (< 1%) na população. O presente estudo é o pioneiro na análise de alterações globais no padrão de metilação de citosinas em hepatoblastomas, e revelou um padrão incomum de hipometilação global nos tumores, não associado à metilação de regiões repetitivas LINE-1; especificamente, hepatobastomas apresentam um nível intermediário entre o encontrado para os fígados maduros e aquele encontrado para os fígados fetais. Tal achado dá suporte ao modelo no qual a tumorigênese do hepatoblastoma recapitularia fases do desenvolvimento fetal do fígado. Foram destacados 11 genes que apresentaram padrão de metilação de DNA diferencial em seus promotores. Em suma, nossos achados revelam que o tumor embrionário hepatoblastoma apresenta relativa estabilidade genética, com uma frequência menor de alterações (alterações em número de cópias e mutações somáticas em regiões codificadoras) que tumores sólidos de adultos. Simultaneamente, foi detectado um padrão marcante de hipometilação global de DNA associado ao tumor, evidenciando a importância de aspectos epigenéticos em sua tumorigênese / Hepatic malignant tumors are rare in children, the embryonal tumor hepatoblastoma is the most common liver cancer in children under 5 years old but, in spite of that, accounts for only 1% of incident tumors in this age group. Due to its low incidence, among other factors, hepatoblastoma is a tumor poorly characterized at molecular level. This study included three approaches of molecular analyzes in hepatoblastomas: examination of copy number alterations (through array-CGH technique), investigation of somatic mutations in coding regions (next-generation exome sequencing) and determination of the global DNA methylation profile (bead arrays). We found a low frequency of copy number alterations, mostly consisting of large extent chromosomal gains, reflecting lower chromosomal instability than other solid adult tumors. A region at 2q24, previously associated with worse prognosis in hepatoblastomas, was found amplified in high amplitude (amplicon). Gene expression analysis of the 48 genes comprised in the amplicon segment highlighted five genes as overexpressed (DAPL1, ERMN, GALNT5, SCN1A and SCN3A). We also observed a low frequency of non-synonymous somatic mutations in our hepatoblastomas samples compared to the amount of variation found in other adult solid tumors. We described a predicted harmful non-synonymous mutation in exon 3 of CTNNB1 gene (beta-catenin), the best characterized molecular marker in hepatoblastomas. The list of somatic alterations points to a remarkable enrichment of genes from the Wnt pathway, which is well-studied in hepatoblastomas and is associated both with embryonic development and with the process of carcinogenesis. We highlighted a list of non-synonymous somatic mutations that presented high coverage in our experiments, and were absent or present at low frequency (<1%) in the general population. This study is the first to analyze global changes in cytosine methylation in hepatoblastomas, and revealed an unusual pattern of global hypomethylation in these tumors, not associated with LINE-1 repetitive regions; specifically, hepatobastomas exhibited an intermediate level of methylation, in between the patterns of mature and fetal livers. This finding supports the model in which the oncogenesis of hepatoblastoma recapitulates stages of fetal liver development. We highlighted 11 genes that showed differential pattern of DNA methylation in their promoters compared to differentiated liver. In summary, our findings show that the embryonal tumor hepatoblastoma are relatively genetically stable with lower frequency of alterations (changes in copy number and somatic mutations in coding regions) than most solid adult tumors. Simultaneously, a clear pattern of global hypomethylation of non-repetitive DNA was associated with the tumor, indicating the importance of epigenetic aspects in its tumorigenesis

Os microRNAs (miRs) desempenham um papel importante na biologia das células-tronco por meio da interação com seus mRNAs alvos, induzindo inibição da tradução e/ou degradação destes transcritos. Durante a diferenciação de células pluripotentes, os miRs podem ser induzidos ou reprimidos, no entanto, suas funções específicas são amplamente inexploradas. Nós investigamos os papéis funcionais de um conjunto selecionado de miRs na pluripotência e diferenciação celular, usando microscopia de fluorescência quantitativa (High Content Analysis). Para isso, foram empregadas a NTera-2 (células de carcinoma embrionário humano, CCE) e a H1 (células-tronco embrionárias humanas, CTEh) como modelos. Essas células foram transfectadas reversamente com trinta moléculas de miRs distintas (individualmente) ou moléculas controles. Após 3-4 dias de cultura, as células foram fixadas, permeabilizadas e coradas com Hoechst / CellMask Blue (núcleo/citoplasma), anti-OCT4, anti-Ciclina B1 e imageadas com um sistema ImageXpress Micro HCA. O CellProfiler foi utilizado para quantificar vários parâmetros morfométricos e medidas de intensidade de OCT4 e Ciclina B1 em compartimentos nucleares e citoplasmáticos. Esses dados foram usados para gerar perfis fenotípicos multiparamétricos específicos de cada miR (usando KNIME) e o agrupamento desses dados levou à identificação de vias e processos envolvidos na indução de características de pluripotência ou diferenciação celular causadas por miRs com efeitos fenotípicos similares. Como exemplo, as vias de PI3K-AKT, WNT, TGF? e DICER foram encontradas como moduladas por alguns clusters fenotípicos e os transcritos de alguns alvos foram avaliados por qPCR para validar os achados. Parte do trabalho foi focada na regulação da via Notch por miRNAs em células pluripotentes, o que levou à observação de que o miR- 363-3p inibe a sinalização de Notch e promove pluripotência nessas células. A transfecção de miR-363-3p não apenas elevou as características de pluripotência em NTera-2 e H1, mas também protegeu as CCE da diferenciação induzida por cocultivo com OP9 expressando DLL1 e causou a diminuição no nível de transcritos de PSEN1. Em conclusão, o ensaio desenvolvido aqui provou ser uma ferramenta robusta na detecção de mecanismos moleculares, baseando-se na combinação de análises fenotípicas funcionais e bioinformáticas. / microRNAs (miRs) play an important role in stem cell\'s biology by binding to target mRNAs transcripts, inducing translation blockage and/or transcripts degradation. Upon differentiation of pluripotent cells, miRNAs can be induced or repressed, however, their specific roles are largely unexplored. We investigated the functional roles of a selected set of miRs in pluripotency and differentiation, using quantitative automated fluorescence microscopy (High Content Analysis). For this, we used NTera-2 (human embryonal carcinoma cells, ECC) and H1 (embryonic stem cells; ESC) as models. These cells were reverse-transfected with thirty distinct miRs mimics (individually) or control molecules. Following 3-4 days of culture, cells were fixed, permeabilized and stained with Hoechst/CellMask Blue (nucleus/cytoplasm), antiOCT4, anti-Cyclin B1 and imaged using an ImageXpress Micro HCA System. CellProfiler was used to quantify several morphometric parameters and intensity measurements of OCT4 and CYCB1 in nuclear and cytoplasmic compartments. Quantified parameters were used to generate miR-specific multiparametric phenotypic profiles (using KNIME) and clustering these data led to identification of pathways and processes involved in the induction of pluripotency or cell diferention features caused by miRs with similar phenotypic effects. As an example, PI3K-AKT, WNT, TGF? and DICER pathways were found to be regulated by some phenotypic clusters and transcripts level of some of miR targets were evaluated by qPCR to validate de findings. Part of the work was focused in the regulation of Notch pathway by miRNAs in pluripotent cells, which led the observation that miR-363-3p inhibits Notch signaling and promotes pluripotency feature, as the transfection with miR-363-3p mimic not only enhanced pluripotent phenotype in NTera-2 and H1, but also protected de ECCs from differentiation induced by coculture with OP9 expressing DLL1 and decreased PSEN1 transcripts level.In conclusion, The assay developed here proved to be a robust tool in the detection of molecular mechanisms based on combined functional phenotypic and bioinformatic analyzes.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.