O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.

No transtorno bipolar (TB) diversas evidências apontam que a doença apresenta um curso progressivo, com os pacientes apresentando maiores anormalidades comportamentais, sensibilidade ao estresse e propensão a recaídas com o passar do tempo. A progressão pode ser refletida como uma sensibilização a diversos fatores, entre eles os episódios agudos de humor. Pesquisas indicam que esses episódios são “tóxicos” a múltiplos elementos do organismo humano. O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de um estudo pré-clínico (modelo animal de mania induzido por danfetamina – AMPH) e um estudo clínico (estudo longitudinal aberto de 16 semanas), os mecanismos subjacentes ao episódio agudo de humor e à remissão clínica no TB, focando em vias de epigenética, morte celular, inflamação e toxicidade sistêmica. Nós observamos que a AMPH, um potente psicoestimulante, aumentou significativamente a atividade da enzima histona desacetilase (HDAC) no córtex pré-frontal (CPF) de ratos wistar, sem aumentar os níveis de expressão gênica e proteica da neurotrofina BDNF. Mais ainda, lítio, valproato e butirato de sódio atenuaram esse aumento, indicando que a inibição da HDAC é importante no manejamento das estereotipias comumente vistas em modelos animais de mania. Ainda, nós observamos que pacientes com TB não-medicados e durante o episódio agudo de humor apresentam maiores níveis séricos de moléculas associadas ao dano (DAMPs). Após o tratamento farmacológico, apenas pacientes assintomáticos apresentam a normalização dos níveis séricos de DAMPs, além de apresentarem diminuição dos níveis de TNF-α e aumento nos níveis de ácido úrico. Em conclusão, este estudo ressalta que no TB os pacientes podem apresentar diferenças individuais nas respostas ao tratamento em virtude de particularidades a níveis epigenéticos (inibição da HDAC) e bioquímicos (morte celular, DAMPs e inflamação), aumentando assim, a necessidade de farmacoterapias cada vez mais individualizadas. / In bipolar disorder (BD) several lines of evidence indicate that the illness has a progressive course, with patients showing greater behavioral abnormalities, sensitization to stress and propensity to relapse over time. This progression may be reflected as a sensitization to several factors, including acute mood episodes. In general, studies support the idea that these episodes are ' toxic ' to multiple parts of the human body. The present study aimed to evaluate, through a pre-clinical study (animal model of mania induced by d-amphetamine (AMPH)) and a clinical trial (longitudinal-open study of 16 weeks), the mechanisms underlying the acute mood episode and the clinical remission in BD, focusing in pathways of epigenetic, cell death, inflammation and systemic toxicity. We observed that the AMPH significantly increased the activity of the enzyme histone deacetylase (HDAC) in the prefrontal cortex (PFC) of Wistar rats, without increasing the levels of the neurotrophic factor BDNF (gene and protein expression). Further, lithium, valproate and sodium butyrate attenuated the effects induced by AMPH, indicating that HDAC inhibition is important in the management of the stereotypies commonly seen in animal models of mania. In addition, we demonstraded that drug-free patients with BD, during acute mood episodes, have higher serum levels of molecules associated with damage (DAMPs). After the initial pharmacological treatment, only asymptomatic patients presented the normalization of serum levels of DAMPs over time, in addition to present reducing in the levels of TNF-α and increasing in the levels of uric acid. In conclusion, our study supports that in BD, patients may exhibit different treatment responses due to particularities in epigenetic pathways (inhibition of HDAC) and biochemical mechanisms (cell death, inflammation and DAMPs), thus increasing the need for more individualized pharmacotherapies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2013-11-21T19:07:28Z No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-11-25T11:14:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-25T11:14:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ClarissaCalaisRomez.pdf: 1504430 bytes, checksum: 4766ff473691c29620666cd2b96ea51b (MD5) / Introdução: A literatura tem demonstrado que células diferenciadas, por exemplo, fibroblastos, podem, por meio de transfecção mediada por retrovírus, adquirir cópias extras de genes cuja expressão está associada à pluripotência e voltarem assim a um estado de indiferenciação, similar ao encontrado em células-tronco embrionárias. Entretanto, a transfecção de genes mediada por retrovírus tem potencial restrito para uso em terapias humanas, pois, além de ser de baixíssima eficiência, pode ocorrer a inserção de genes virais no genoma das células com pluripotência induzida por essa técnica. Nesse sentido, diversos estudos têm sido desenvolvidos de modo a reverter essas células diferenciadas a um estado similar ao embrionário sem utilizar a transfecção de genes. O restabelecimento da pluripotência de células diferenciadas poderia também ser induzido por alterações na expressão de genes envolvidos na pluripotência celular sem afetar a sequência do DNA, ou seja, por mecanismos epigenéticos, como a inibição por algumas substâncias da ação de enzimas que desacetilam histonas ou metilam o DNA. Dentre as substâncias capazes de inibir a ação de enzimas com atividade Histona Desacetilase, ou seja, favorecer a expressão gênica situa-se o butirato de sódio, um ácido graxo de cadeia curta. A inibição da metilação do DNA ocorre por meio da inibição da atividade de enzimas DNA metiltransferases (DNMTs). Uma das drogas que inibe a ação de DNMTs é a hidralazina, um potente vasodilatador arterial. Objetivo: O presente estudo se propôs a avaliar o efeito da hidralazina e do butirato de sódio na desdiferenciação de células de polpa dental hígida e inflamada. Métodos: Células de polpa dental hígida (PN) e inflamada (PI) foram analisadas quanto à sua viabilidade celular, ensaio MTT e coloração por azul de tripano, quanto à sua morfologia, microscopia de luz e citometria de fluxo, e quanto à sua expressão gênica, RT-qPCR, na presença ou não de butirato de sódio ou hidralazina. Resultados: Seis subculturas de polpa dental hígida e inflamada não tiveram sua viabilidade alterada quando tratadas com butirato de sódio (10 mM) e hidralazina (30 μM). O tratamento com butirato de sódio (10 mM) induziu alterações discretas na morfologia das células, como o aumento do tamanho e da granulosidade celular. Células tratadas com hidralazina não mostraram alterações quanto a sua morfologia com relação às células não tratadas. O tratamento com butirato de sódio (10 mM) não alterou a expressão relativa dos genes OCT-4 (PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo I (PN-1; PN-3; PI-2; PI-3). O tratamento com butirato de sódio diminuiu a expressão relativa dos genes OCT- 4 (PN-1; PN-2); colágeno tipo III (PN-1; PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo I (PI-1) e aumentou a expressão relativa do gene colágeno tipo I (PN-2). O tratamento com hidralazina (30 μM) não alterou a expressão relativa dos genes OCT-4 (PN-2; PN-3; PI-1; PI- 2; PI-3); colágeno tipo I (PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3); colágeno tipo III (PN-1; PN-2; PN-3; PI-1; PI-2; PI-3). O tratamento com hidralazina (30 μM) diminuiu a expressão relativa do gene OCTOCT-4-4 (PN-1); e aumentou a expressão relativa do gene colágeno tipo I (PN-1). Conclusão: O butirato de sódio e a hidralazina não induziram a desdiferenciação celular de células de polpa dental hígida e inflamada. _____________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: The literature has demonstrated that differentiated cells, such as fibroblasts, may, by retrovirus-mediated transfection, gain extra copies of genes whose expression is associated with pluripotency and thus return to an undifferentiated state, similar to the state found in embryonic stem cells. However, the transfection of genes mediated by retrovirus has limited potential for use in human therapy, because, besides being very low efficiency, may occur the insert of viral genes into the genome of the cells with induced pluripotent by this technique. In this regard, various studies have been conducted in order to reverse these differentiated cells to an embryonic-like state without using the gene transfection. The restoration of pluripotency could be achived by changes in the expression of genes involved in cell pluripotency without affecting the DNA sequence, in other words, by epigenetic mechanisms, using certain substances that inhibit the action of histone deacetylases enzymes or DNA methyltransferase enzymes. Among the substances capable of inhibiting the action of enzymes with histone deacetylase activity, or promote gene expression is situated sodium butyrate, a fatty acid short-chain. Inhibition of DNA methylation occurs through inhibition of the enzyme DNA methyltransferase (DNMTs). A drug that inhibits the action of DNMTs is hydralazine, a potent arterial vasodilator. Objective: This study aims to analyze the effect of hydralazine and sodium butyrate on cell dedifferentiation of healthy and inflamed dental pulp cells. Methods: Cells from healthy (NP) and inflamed dental pulp (IP) were analyzed for cell viability, MTT assay and trypan blue staining, for cell morphology, light microscopy and flow cytometry, and gene expression, RT-qPCR, in the presence or absence of sodium butyrate or hydralazine. Results: Six subcultures of healthy and inflamed dental pulp did not have their viability altered when treated with sodium butyrate (10 mM) and hydralazine (30 μM). Treatment with sodium butyrate (10 mM) led to subtle changes in cell morphology, such as increased cell size and granularity. hydralazine treated cells showed no change in their morphology as compared to untreated cells. Treatment with sodium butyrate (10 mM) did not alter the relative expression of the genes OCT-4 (NP-3, IP-1, IP-2, IP-3); collagen type I (NP- 1, PN-3; PI-2, PI-3). Treatment with sodium butyrate decreased the relative expression of genes: OCT-4 (NP-1, NP-2), collagen III (NP-1, NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3), collagen type I (IP-1) and increased the relative expression of collagen type I gene (NP-2). Treatment with hydralazine (30 mM) did not alter the relative expression of genes: Oct-4 (NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3); collagen type I (NP-2, NP-3, IP-1, IP-2, IP-3), type III collagen (NP-1, NP-2, NPix 3, IP-1, IP-2, IP-3). Treatment with hydralazine (30 mM) decreased the relative expression of OCT-4 gene (NP-1) and increased the relative expression of type I collagen gene (NP-1). Conclusion: Sodium butyrate and hydralazine did not induce cellular dedifferentiation of cells from inflamed and healthy dental pulp.

No transtorno bipolar (TB) diversas evidências apontam que a doença apresenta um curso progressivo, com os pacientes apresentando maiores anormalidades comportamentais, sensibilidade ao estresse e propensão a recaídas com o passar do tempo. A progressão pode ser refletida como uma sensibilização a diversos fatores, entre eles os episódios agudos de humor. Pesquisas indicam que esses episódios são “tóxicos” a múltiplos elementos do organismo humano. O presente estudo tem como objetivo avaliar, através de um estudo pré-clínico (modelo animal de mania induzido por danfetamina – AMPH) e um estudo clínico (estudo longitudinal aberto de 16 semanas), os mecanismos subjacentes ao episódio agudo de humor e à remissão clínica no TB, focando em vias de epigenética, morte celular, inflamação e toxicidade sistêmica. Nós observamos que a AMPH, um potente psicoestimulante, aumentou significativamente a atividade da enzima histona desacetilase (HDAC) no córtex pré-frontal (CPF) de ratos wistar, sem aumentar os níveis de expressão gênica e proteica da neurotrofina BDNF. Mais ainda, lítio, valproato e butirato de sódio atenuaram esse aumento, indicando que a inibição da HDAC é importante no manejamento das estereotipias comumente vistas em modelos animais de mania. Ainda, nós observamos que pacientes com TB não-medicados e durante o episódio agudo de humor apresentam maiores níveis séricos de moléculas associadas ao dano (DAMPs). Após o tratamento farmacológico, apenas pacientes assintomáticos apresentam a normalização dos níveis séricos de DAMPs, além de apresentarem diminuição dos níveis de TNF-α e aumento nos níveis de ácido úrico. Em conclusão, este estudo ressalta que no TB os pacientes podem apresentar diferenças individuais nas respostas ao tratamento em virtude de particularidades a níveis epigenéticos (inibição da HDAC) e bioquímicos (morte celular, DAMPs e inflamação), aumentando assim, a necessidade de farmacoterapias cada vez mais individualizadas. / In bipolar disorder (BD) several lines of evidence indicate that the illness has a progressive course, with patients showing greater behavioral abnormalities, sensitization to stress and propensity to relapse over time. This progression may be reflected as a sensitization to several factors, including acute mood episodes. In general, studies support the idea that these episodes are ' toxic ' to multiple parts of the human body. The present study aimed to evaluate, through a pre-clinical study (animal model of mania induced by d-amphetamine (AMPH)) and a clinical trial (longitudinal-open study of 16 weeks), the mechanisms underlying the acute mood episode and the clinical remission in BD, focusing in pathways of epigenetic, cell death, inflammation and systemic toxicity. We observed that the AMPH significantly increased the activity of the enzyme histone deacetylase (HDAC) in the prefrontal cortex (PFC) of Wistar rats, without increasing the levels of the neurotrophic factor BDNF (gene and protein expression). Further, lithium, valproate and sodium butyrate attenuated the effects induced by AMPH, indicating that HDAC inhibition is important in the management of the stereotypies commonly seen in animal models of mania. In addition, we demonstraded that drug-free patients with BD, during acute mood episodes, have higher serum levels of molecules associated with damage (DAMPs). After the initial pharmacological treatment, only asymptomatic patients presented the normalization of serum levels of DAMPs over time, in addition to present reducing in the levels of TNF-α and increasing in the levels of uric acid. In conclusion, our study supports that in BD, patients may exhibit different treatment responses due to particularities in epigenetic pathways (inhibition of HDAC) and biochemical mechanisms (cell death, inflammation and DAMPs), thus increasing the need for more individualized pharmacotherapies.

Submitted by Israel Vieira Neto (israel.vieiraneto@ufpe.br) on 2015-03-05T18:13:15Z No. of bitstreams: 2 Eduardo Ramalho.pdf: 538304 bytes, checksum: e4a30cf566174291fcd76bbfacaf4eff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T18:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Eduardo Ramalho.pdf: 538304 bytes, checksum: e4a30cf566174291fcd76bbfacaf4eff (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES / Sabe-se que os genes p53, BRCA1 e BRCA2 apresentam a característica em comum de serem considerados supressores tumorais. Eventos genéticos e epigenéticos são frequentes ao longo de todo o genoma humano. Mutações somáticas são passíveis de ocorrer nas regiões codificantes de genes específicos, alterando sua sequência e gerando proteínas mutantes, as quais resultam numa alteração de sua capacidade funcional ou até mesmo a perda dela. Este trabalho objetivou avaliar alterações epigenéticas nas regiões promotoras dos genes BRCA1 e BRCA2 através da técnica de PCR para Metilação Específica (MSP) e correlacionar mutações pontuais nos exons 4 e 7 do gene p53 como fator de risco para o carcinoma ductal invasivo (CDI) de mama na população feminina do Recife atendida no Hospital das Clínicas (HCUFPE). Cinquenta biópsias de mama diagnosticadas com CDI fixadas em formalina e embebidas em parafina foram obtidas do Setor de Anatomia Patológica do HC-PE e cinco amostras de tecido mamário de mulheres submetidas à mastectomia estética foram usadas como controle normal. O DNA das amostras foram extraídos e, então, amplificados por MSP. Para avaliação do perfil mutacional utilizou-se a técnica de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) com as enzimas BstUI e HaeIII para verificação dos polimorfismos nos exons 4 e 7, respectivamente. A frequência no padrão de metilação para o gene BRCA2 foi de 46,9% enquanto a frequência de mutações pontuais nos códons 72 (exon 4) e 249 (exon 7) do gene p53 foram de 91,8% e 8,1%, respectivamente. Para o BRCA1 os resultados obtidos foram inconsistentes quanto ao seu padrão de metilação. Os resultados mostraram que o polimorfismo do códon 72 apresentou-se estatisticamente significante para metástase podendo ser utilizado como um potencial biomarcador auxiliar no diagnóstico de carcinoma ductal invasivo de mama humana.

La apomixis es una forma de reproducción clonal, donde no ocurre ni meiosis ni fecundación para la formación de la semilla. Existe una estrecha relación entre la apomixis y el nivel de ploidía, dado que en la mayoría de las especies que presentan el carácter los genotipos diploides son sexuales y los poliploides son apomícticos y con un grado variable de sexualidad (facultativos). Aunque se sabe que el carácter es regulado por una o más regiones del genoma, se han hallado numerosas evidencias de mecanismos epigenéticos que regulan su expresión. Conocer los factores que determinan la apomixis tendría un gran impacto en la agricultura. Eragrostis curvula (“pasto llorón”) es una gramínea forrajera originaria de Sudáfrica, que incluye genotipos con diferentes niveles de ploidía (2X hasta 8X, con X = 10), que pueden ser sexuales o apomícticos (facultativos u obligados). Nuestro grupo de trabajo realizó numerosos estudios, sobre todo en el carácter apomixis, tanto a nivel de genética estructural como funcional. El objetivo de esta tesis fue contribuir a la dilucidación de las bases genéticas y epigenéticas que regulan uno de los componentes de la apomixis (apomeiosis) en E. curvula. Se desarrolló una población de mapeo segregante para el carácter apomixis a partir del cruzamiento entre dos genotipos tetraploides, uno sexual (OTA-S) y otro apomíctico facultativo (Don Walter). La genotipificación se realizó con marcadores DArT-SNP y el fenotipado mediante citoembriología y un marcador molecular dominante. El mapa de ligamiento quedó conformado por 20 grupos de ligamiento (GL), con el posicionamiento del APO locus en el GL1, donde también se ubicaron tres marcadores SNP 100 % ligados al carácter apomeiosis. La secuencia de los SNP 100 % ligados tienen homología con proteínas anotadas en bases de datos, que podrían estar relacionadas al modo reproductivo. Se realizó un análisis de sintenia entre los GLs del mapa consenso y el genoma de referencia de la especie (cv. Victoria) que permitió asociar todos los GLs a alguno de los contigs y hallar los GLs que corresponderían potencialmente a cada uno de los genomas del alotetraploide (homeólogos). Para la validación de los marcadores se diseñaron y evaluaron cinco primers KASP que permitieron discriminar entre los alelos de los individuos sexuales y apomícticos. En el segundo capítulo se analizaron diferentes resultados obtenidos por el grupo de trabajo que evidencian la influencia de la epigenética sobre el carácter apomixis en plantas de E. curvula. Para analizar la participación de mecanismos de metilación del ADN en la regulación de la apomixis bajo condiciones de estrés hídrico, se realizó un ensayo en el cual muestras de ADN de inflorescencias fueron evaluadas mediante la “Estimación del contenido de metilación por doble corte con enzimas de restricción sensibles” (MCSeEd). En las regiones diferencialmente metiladas se lograron encontrar genes vinculados al modo reproductivo, como BABYBOOM, ubiquitinas, FBox y subtilisinas. Podría afirmarse que tanto el estrés interno como externo ejerce una gran influencia sobre el modo reproductivo de E. curvula, modificando la expresión del carácter apomixis en plantas apomícticas facultativas. / Apomixis is a type of clonal reproduction, where neither meiosis nor fertilization occurs in seed formation. There is a close relationship between apomixis and ploidy level, since in most of the apomictic species diploid genotypes are sexuals and polyploids are apomictics. Usually, apomictic plants are facultative, being some of the seeds sexuals in origin. Although it is known that this trait is regulated by one or more genomic regions, numerous evidences of epigenetic mechanisms that regulate its expression have been found. Knowing the factors that determine apomixis could have a great impact on agriculture. Eragrostis curvula, commonly known as weeping lovegrass, is a forage grass native to southern Africa, which includes genotypes with different ploidy levels (from 2X to 8X, with X = 10) and that can be sexuals or apomictics (facultative or obligate). Our work group carried out several studies on this model species, especially related with the apomixis character, both at the structural and functional genetic level. The objective of this thesis was to contribute to the elucidation of the genetic and epigenetic bases that regulate one of the components of apomixis (apomeiosis) in E. curvula. A segregating mapping population was generated for the apomixis trait from the cross between two tetraploid genotypes, one sexual (OTA-S) and the other one facultative apomictic (Don Walter). Genotyping was performed with DArT-SNP markers and phenotyping using cytoembryological techniques and a dominant molecular marker. The linkage map was made up of 20 linkage groups (LGs), with the apomeisis locus (APO locus) located on GL1, where three SNP markers 100 % linked to the APO locus were also located. All of this 100 % linked SNPs have homology with proteins, two of these annotated in databases. A synteny analysis was performed between the GLs of the consensus map and the E. curvula reference genome (cv. Victoria), which allowed all the GLs to be associated to any of the contigs and to find the GLs that would potentially correspond to each allotetraploid genome (homeologs). For the validation of the markers, five KASP primers were design and performed, allowing to discriminate between the sexual or apomictic alleles of the ndividuals of the mapping population. Furthermore, in a second chapter, several results obtained by the work group were evaluated, demonstrating an influence of epigenetic regulation on the apomixis trait in E. curvula. To analyze the involvement of DNA methylation mechanisms in the regulation of apomixis under water stress conditions, DNA samples of inflorescences under different stress conditions were evaluated, using the “Methylation content sensitive enzime double-digest restriction-site-associated DNA” (MCSeEd) method. Some of the genes identified in the differentially methylated regions were found to be related to the reproductive mode, such as BABYBOOM, ubiquitin, F-box and subtilisin genes. It could be proposed that stress, both internal and external, has a significant influence in the reproductive mode of E. curvula, modifying the expression of the trait in facultative apomicts.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6302.pdf: 1873865 bytes, checksum: 9751d8d17780f8f77d9e24a60cc67c6f (MD5) Previous issue date: 2013-09-20 / Financiadora de Estudos e Projetos / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / Epigenetics can be defined as the study of heritable changes in phenotype without the occurrence of changes in nucleotide sequence. Epigenetic modifications occur by the chemical changes in DNA and their associated proteins, such as DNA methylation and histone acetylation, respectively. Meat tenderness is a trait of great interest worldwide, resulting in the development of the beef livestock sector to produce meat of quality. It is worth to highlight the role of the calpain/calpastatin system on tenderness. Calpain encoded by the CAPN1 gene plays a role in proteolysis posmortem by cleaving proteins from muscle fiber. The calpastatin encoded by the CAST gene, on the other hand, acts controlling this cleavage by blocking the action of calpain. In addition, this system is also involved in myoblast differentiation into myotubes during embryogenesis. This system controls the proteolysis of proteins that constitute the cytoskeleton and the plasma membrane. To mimic the myotube formation during embryogenesis and to study the epigenetic control of CAPN1 and CAST gene expression, satellite cell cultures established from bovine muscle were kept undifferentiated (negative control) or were induced to differentiate by incubation with culture medium containing 2% fetal bovine serum in the absence (positive control) or after treatment with epigenetic modifiers like 5-Aza- 2'-deoxycytidine (Aza, DNA demethylating) for 48 h at 10 &#956;M, and Trichostatin A (TSA, histone acetylating) for 24 h at 50 nM. The results showed no differences (p>0.05) in myoblast rate fusion between Aza, TSA and positive control groups, but there were differences (p>0.05) when these groups were compared to the negative control, which showed lower fusion rates. There was no difference (p>0.05) in cell viability among the four groups, showing that Aza and TSA were not cytotoxic at the used concentrations. Concerning the gene expression, the gene CAST was more expressed (p<0,05) in the positive control group than the negative one; but no differences were seen in the expression (p>0,05) between positive control, 5-Aza-2 - deoxycytidine and Trichostatin A groups. For the CAPN1 gene, no difference was seen in the expression (p>0,05) between negative and positive control groups, but the CAPN1 gene was more expressed (p<0,05) in the 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments relative to the positive control group. When the expression ratio of CAPN1/CAST were compared between treatments, was seen more expression (p<0,05) in the positive control group both comparing with negative control group and with 5-Aza-2 -deoxycytidine and Trichostatin A treatments. We may conclude that the treatments with the epigenetic modifier agents didn't affect both the bovine myoblast differentiation into myotubes and the CAST gene expression, but did in the CAPN1 gene expression and so did in the expression ratio of CAPN1/CAST. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1. / A epigenética pode ser definida como o estudo de mudanças herdáveis no fenótipo sem a ocorrência de mudanças na sequência de nucleotídeos. As modificações epigenéticas caracterizam-se por alterações químicas no DNA e em suas proteínas associadas, como a metilação no DNA e a acetilação nas proteínas histonas, respectivamente. A maciez da carne bovina tem ganhado interesse por todo mundo, e o setor pecuário tem se desenvolvido para produzir carne de qualidade que satisfaça a essa demanda. Vale destacar os papéis do sistema calpaína/calpastatina. A calpaína, codificada pelo gene CAPN1, desempenha um papel fundamental na proteólise posmortem pela clivagem de proteínas que constituem a fibra muscular. A calpastatina, codificado pelo gene CAST, por outro lado, age controlando essa clivagem pelo bloqueio da ação da calpaína. Além disso, esse sistema também está envolvido na diferenciação dos mioblastos em miotubos na embriogênese. A ação desse sistema ocorre pela proteólise controlada de proteínas que constituem a membrana plasmática e o citoesqueleto. Para reproduzir a formação de miotubos durante a embriogênese e estudar o controle epigenético na expressão dos genes CAPN1 e CAST, foram estabelecidas culturas de células satélites de músculo bovino, que foram mantidas sem diferenciação (controle negativo) ou foram induzidas à diferenciação, por meio da incubação com meio de cultivo com 2% de soro fetal bovino, na ausência (controle positivo) e após o tratamento com os agentes modificadores epigenéticos como o 5-Aza-2 - desoxicitidina (Aza; desmetilante de DNA), por um período de 48 h á concentração de 10 &#956;M, e Tricostatina A (TSA; acetilante de histona), por um período de 24 h á concentração de 50 nM. Os resultados mostraram que não houve diferenças (p>0,05) no índice de fusão dos mioblastos entre os grupos Aza, TSA e controle positivo, mas que houve diferença (p<0,05) desses grupos em comparação ao controle negativo, que apresentou menor índice de fusão. Também não houve diferença (p>0,05) nas taxas de viabilidade das células entre os grupos, mostrando que o Aza e TSA não foram citotóxicos nas concentrações usadas Em relação à expressão gênica, o gene CAST foi mais expresso (p<0,05) no grupo controle positivo em comparação ao controle negativo; mas não foram observadas diferenças de expressão (p>0,05) entre os grupos controle positivo, 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Para o gene CAPN1, não foi observada diferença (p>0,05) de expressão entre os grupos controle negativo e positivo, mas o gene CAPN1 foi mais expresso (p<0,05) nos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A em comparação ao grupo controle positivo. Quando a razão de expressão CAST/CAPN1 foi comparada entre os tratamentos, foi observada maior expressão (p<0,05) no grupo controle positivo, tanto em comparação ao grupo controle negativo, quanto aos tratamentos 5-Aza-2 -desoxicitidina e Tricostatina A. Podemos concluir que os tratamentos com agentes modificadores epigenéticos não afetaram a diferenciação de mioblastos bovinos em miotubos e nem a expressão do gene CAST, mas afetaram a expressão do gene CAPN1 e a razão de expressão CAST/CAPN1.

O momento das primeiras divisões celulares pode predizer o potencial de desenvolvimento de um embrião, incluindo sua capacidade de estabelecer prenhez. Além de diferenças relacionadas ao metabolismo, estresse e sobrevivência, embriões com diferentes velocidades de desenvolvimento apresentam padrões transcricionais distintos, principalmente relacionados ao metabolismo energético e lipídico. Como o padrão transcricional é regulado por fatores epigenéticos este estudo visou caracterizar os mecanismos epigenéticos envolvidos neste fenótipo. Para isto, embriões bovinos foram produzidos in vitro utilizando sêmen sexado (fêmeas) e as 40 horas pós inseminação (hpi) foram classificados como Rápidos (4 ou mais células) ou Lentos (2 ou 3 células), permanecendo em cultivo até o estágio de blastocisto (168 hpi) (Capítulo 1) ou sendo avaliados com 40 hpi, 96 hpi ou 168 hpi (Capítulo 2). No capítulo 1, a análise da metilação global do genoma pelo sistema EmbryoGENE Methylation DNA Array (EDMA) identificou 11.584 regiões diferencialmente metiladas (DMRs) (7.976 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados do grupo de clivagem rápida FBL - e 3.608 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados de embriões de clivagem lenta - SBL). Os FBL apresentaram mais regiões classificadas como hipermetiladas, distribuídas ao longo do genoma, como nos íntrons, exons, promotores e elementos de repetição, enquanto em SBL, as regiões hipermetiladas estavam mais presentes nas ilhas CpG. As DMRs foram agrupadas em relação aos processos biológicos a que estavam envolvidas, e algumas das vias mais afetadas foram relacionadas à sobrevivência/diferenciação celular e metabolismo energético/lipídico. Os perfis dos transcritos dos genes diferencialmente metilados (DMs) relacionados com estas vias também foram avaliados, e a maior parte revelou mudanças na quantificação relativa. No capítulo 2, foi avaliada ao longo do desenvolvimento a presença de metilações e hidroximetilações do DNA e modificações pós-traducionais de histonas (acetilação e trimetilação da lisina 9 da histona 3 e trimetilação da lisina 27 da histona 3 H3K9ac, H3K9me3 e H3K27me3, respectivamente). A cinética das primeiras clivagens influenciou a maioria das modificações epigenéticas estudadas desde os estágios iniciais até o blastocisto (exceto pela hidroximetilação do DNA e H3K27me3). A análise dos transcritos relacionados a inclusão ou remoção dessas modificações corroborou o padrão de modificações encontrado. É possível concluir que a cinética das primeiras clivagens apresenta relação com modificações epigenéticas nos embriões e que se manterão até o final do desenvolvimento pré-implantacional, resultando em blastocistos de padrão transcricional e metabólico distintos, podendo influenciar na viabilidade embrionária. / The timing of the first cell divisions may predict the developmental potential of an embryo, including its ability to establish pregnancy. Besides differences related to metabolism, stress, and survival, embryos with different speeds of development present distinct patterns of gene expression, mainly related to energy and lipid metabolism. As gene expression is regulated by epigenetic factors, and that includes DNA methylation patterns, in this study we compared the global DNA methylation profile of embryos with different kinetics of development in order to identify general pathways and regions that are most influenced by this phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro using sexed semen (females) and the 40 hours post insemination (hpi) were classified as Fast (4 or more cells) or Slow (2 or 3 cells), remaining in culture until the blastocyst stage (168 hpi) (Chapter 1) or evaluated at 40 hpi, 96 hpi or 168 hpi (Chapter 2). In Chapter 1, the analysis of global DNA methylation by EmbryoGENE DNA Methylation Array (EDMA) identified 11,584 differentially methylated regions (DMRs) (7,976 regions hypermethylated in blastocysts derived from the fast cleavage group -FBL- and 3,608 hypermethylated regions in blastocyst derived from the slow cleavage group -SBL). FBL presented more regions classified as hypermethylated, distributed throughout the genome, as in introns, exons, promoters and repeating elements, whereas in SBL, hypermethylated regions were more present in the CpG islands. DMRs were grouped in relation to the biological processes to which they were involved, and some of the most affected pathways were related to cell survival/differentiation and energy/lipid metabolism. Profiles of transcripts of differentially methylated (DMs) genes related to these pathways were also evaluated, and most presented changes in relative quantification. In Chapter 2, the presence of DNA methylations and hydroxymethylations and post-translational histone modifications (histone 3 lysine 9 acetylation and trimethylation and histone 3 lysine 27 trimethylation - H3K9ac, H3K9me3 and H3K27me3, respectively). The kinetics of the first cleavages influenced most of the epigenetic modifications studied from the initial stages to the blastocyst (except DNA hydroxymethylations and H3K27me3). The analysis of the transcripts related to insertion or removal of these modifications corroborated the pattern of modifications. It is possible to conclude that the kinetics of the first cleavages is related with epigenetic modifications in embryos that will be maintained through the pre-implantation development, resulting in blastocysts with different transcriptional and metabolic patterns, which might influence the embryonic viability.

A dengue é uma infecção viral sistêmica, autolimitada, transmitida para os humanos através da picada de mosquitos fêmeas infectadas do gênero Aedes sp. Trata-se de uma doença com grandes impactos na economia e na saúde pública, e estima-se que entre 50 a 100 milhões novas infecções ocorram anualmente em mais de 100 países. A dengue é causada pelo Dengue virus (DENV), um vírus pertencente à família Flaviviridae, com genoma composto de uma única molécula de RNA, fita simples com polaridade positiva. A infecção pelo DENV pode ser assintomática ou apresentar diferentes manifestações clínicas, como febre do dengue (FD), febre hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do Choque do dengue (SCD). Dados da literatura indicam que algumas infecções virais podem causar alterações epigenéticas em seus hospedeiros, principalmente a metilação do DNA. Assim, o propósito deste trabalho foi investigar a influência da infecção pelo DENV no perfil global de metilação dos pacientes, através da técnica de MethELISA, e analisar o padrão de metilação no promotor dos genes fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interferon gama (IFN-γ). Os resultados obtidos indicam uma tendência na diminuição do percentual relativo de metilação após a infecção pelo DENV, sugerindo uma influência da infecção viral nos mecanismos epigenéticos do hospedeiro. Observou-se também uma maior taxa de desmetilação do promotor do TNF-α dos pacientes infectados em relação ao grupo controle. Em relação ao IFN-γ, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene entre os dois grupos analisados. A meta-análise de microarranjos de DNA obtidos de pacientes infectados pelo DENV indica um aumento na expressão dos genes da Timina DNA Glicosilase (TDG) e das DNA Metiltransferases 1 e 3 (DNMT1 e DNMT3) nos pacientes infectados. Estes dados sugerem que o DENV é capaz de interferir com os mecanismos epigenéticos do hospedeiro. / Dengue fever is a systemic viral infection, self-limited, transmitted to humans through the bite of infected female mosquito from Aedes genus. It is a disease with major impacts on the economy and public health, and it is estimated that between 50 to 100 million new dengue infections occur annually in more than 100 countries. Dengue fever is caused by Dengue virus (DENV), a single strand positive sense RNA virus belonging to the Flaviviridae family. The DENV infection may be asymptomatic or present different clinical manifestations, such as dengue fever (DF), hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS). Published data indicate that some viral infections can cause epigenetic changes in their hosts, especially in the DNA methylation. Thus, the aim of this study was to investigate the influence of DENV infection in global methylation profile of DENV infected patients by MethELISA technique, and analyze the pattern of methylation in the promoter of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interferon gamma (IFN-γ) genes. The results obtained show a decrease the relative methylation percentage after DENV infection, suggesting an influence of viral infection in the epigenetic mechanisms of the host. There was also detected a higher rate of demethylation of TNF-α promoter in infected patients if compared to the control group. No difference was found in the methylation frequency between the two analyzed groups regarding the IFN-γ promoter. Meta-analysis of DNA microarray indicates that patients infected with DENV shows an increase in the expression of Thymine DNA Glycosylase (TDG) and DNA methyltransferases 1 and 3 (DNMT1 and DNMT3) genes, all involved in epigenetic regulation. So, these data indicated that DENV is able to interfere with the host epigenetic mechanisms. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

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