Esta tese foi dividida em três capítulos. O capítulo I descreve o desenvolvimento do método Column switching UHPLC-MS/MS para a determinação simultaneamente de fármacos psicotrópicos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos. A politerapia é uma prática comum no tratamento da esquizofrenia. Portanto, a monitorização terapêutica destes fármacos tem sido realizada para o ajuste das doses e individualização da terapia farmacológica. O método Column switching UHPLC-MS/MS apresentou linearidade na faixa de concentração de 0,025 a 1,25 ng mL-1 com R2 acima de 0,9950 e a falta de teste de ajuste (p > 0,05); precisão com coeficientes de variação inferiores a 12% e exatidão com erro padrão relativo inferior a 14%. Este método foi aplicado com sucesso para determinação de fármacos em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. No capítulo II, o desempenho cromatográfico de colunas C18 superficialmente e totalmente porosas com diferentes tamanhos de partícula foi avaliado para a análise de fármacos psicotrópicos por LC-MS/MS e LC-DAD. Com o sistema LC-MS/MS foram avaliados os seguintes parâmetros cromatográficos: altura do prato reduzido vs velocidade linear reduzida, impedância vs velocidade linear reduzida, tempo da corrida cromatográfica vs vazão, pressão vs vazão, resolução, capacidade de pico, assimetria e fator de retenção. Já com o sistema LC-DAD foram avaliados a hidrofobicidade, atividade silanol e impurezas metálicas também foram avaliadas. As colunas com superfície carregada apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos em sua forma ionizada. Já as colunas com partículas menores que 2 µm (Cortecs 1,6 µm, Acquity 1,7 µm, e Kinetex 1,7 µm) apresentaram maior eficiência cromatográfica para os fármacos na forma parcialmente ionizada. Os modelos matemáticos gerados foram capazes de prever a pressão e o tempo da corrida cromatográfica em diferentes vazões para todas as colunas. Considerando a eficiência, impedância, resolução, capacidade de pico, fator de retenção e hidrofobicidade, as colunas Cortecs 1,6 µm e Acquity 1,7 µm apresentaram melhor desempenho durante a análise dos fármacos em amostra de plasma. O capítulo III descreve o desenvolvimento e validação dos métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS para a determinação dos endocanabinóides (AEA e 2-AG) em amostras biológicas. Para a otimização do processo SPME foram avaliadas as fases SPME (C18, C30 e HLB) e os solventes para dessorção (metanol, acetonitrila e isopropanol). Os aditivos modificadores de matriz, como cloridrato de guanidina, ácido trifluoroacético e acetonitrila foram avaliados por planejamento experimental. Os métodos SPME-UHPLC-MS/MS e Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS, com a fase HLB biocompatível, apresentaram para ambos endocanabinóides valores de LOQs de 1 ng mL-1 e 50 ng mL-1, respectivamente. O método Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS permitiu o direto acoplamento da fibra SPME ao espectrômetro de massas via dessorção/ionização nanoeletrospray que resultou em rápida determinação quantitativa dos endocanabinóides em amostras biológicas. / This thesis is divided into three chapters. Chapter I describes the development of a column switching UHPLCMS/MS method to determine psychotropic drugs in schizophrenic patients plasma samples simultaneously. Polytherapy is a common practice in schizophrenia treatment. Therefore, therapeutic drug monitoring has been applied to adjust doses and to customize pharmacological therapy. The column switching UHPLCMS/MS method developed here is linear at concentrations ranging from 0.025 to 1.25 ng mL-1 with R2 above 0.9950 and presents lack of fit test (p > 0.05), precision with coefficients of variation lower than 12%, and accuracy with relative standard error lower than 14%. This method was successfully applied to determine drugs in schizophrenic patients plasma samples for therapeutic drug monitoring. In chapter II, the chromatographic performance of C18 superficially porous columns and of C18 fully porous columns with different particle sizes were evaluated for analysis of psychotropic drugs by LC-MS/MS and LC-DAD. Within the LC-MS/MS system, the following chromatographic parameters were assessed: reduced plate height vs reduced linear velocity, impedance vs reduced linear velocity, chromatographic run time vs flow rate, backpressure vs flow rate, resolution, peak capacity, asymmetry, and retention factor. Within the LC-DAD system, hydrophobicity, silanol activity, and metal impurities were also examined. Columns with charged surface displayed improved chromatographic efficiency for drugs in the ionized form. Columns with particles smaller than 2 µm (Cortecs 1.6 µm, Acquity 1.7 µm, and Kinetex 1.7 µm) presented higher chromatographic efficiency for the drugs, which were in their partially ionized form. The generated mathematical models were able to predict the backpressure and the chromatographic run time at different flow rates for all the columns. Considering efficiency, impedance, resolution, peak capacity, retention factor, and hydrophobicity, columns Cortecs 1.6 µm and Acquity 1.7 µm provided the best performance during analysis of drugs in plasma samples. Chapter III describes the development and validation of the SPME-UHPLC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods for determination of endocannabinoids (AEA and 2-AG) in biological samples. To optimize the SPME process, SPME coatings (C18, C30, and HLB) and solvents for desorption (methanol, acetonitrile, and isopropanol) were evaluated. Matrix modifier additives, such as guanidine hydrochloride, trifluoroacetic acid, and acetonitrile, were assessed by experimental design. The SPME-UHPC-MS/MS and the Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS methods with HLB biocompatible coating provided LOQ values of 1 ng mL-1 and 50 ng mL-1, respectively, for both endocannabinoids. The Bio-SPME-Nano-ESI-MS/MS method allowed direct coupling of SPME fibers to the mass spectrometer by desorption/ionization nanoelectrospray, which resulted in rapid quantitative determinations of endocannabinoids in biological samples.

A esquizofrenia é um transtorno mental de alta complexidade e até o presente momento nenhuma teoria conseguiu explicar completamente sua etiologia. Uma dessas teorias acredita que a transferência de informações entre os hemisférios de pacientes com esquizofrenia, que ocorre através do corpo caloso, comissura anterior e posterior, pode estar comprometida. Os objetivos do nosso estudo foram avaliar se existem alterações de conectividade inter-hemisférica (IH) e se essas alterações sofrem influência do gênero, em pacientes portadores de esquizofrenia quando comparados com seus parentes em primeiro grau e controles saudáveis, utilizando-se da imagem de ressonância magnética por tensor de difusão (IRMTD). Participaram do estudo 30 pacientes portadores de esquizofrenia, diagnosticados pelos critérios do Manual diagnóstico e estatístico das doenças mentais em sua quarta edição, os quais foram selecionados entre os pacientes do grupo de medicações atípicas do ambulatório de esquizofrenia e da enfermaria psiquiátrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo; 30 parentes em primeiro grau desses pacientes; e 30 voluntários saudáveis. Todos os sujeitos do estudo foram submetidos a um exame de ressonância magnética, realizado no Centro de Ciências das Imagens e Física Médica de nossa instituição, onde foram adquiridas as sequências volumétricas e difusionais utilizadas em nosso estudo. Em posse das imagens de ressonância magnética dos 90 sujeitos do estudo, realizamos o pós-processamento dessas imagens, utilizando o software BrainVoyager QX® versão 2.4, com o intuito de obtermos, por meio dos dados provenientes da IRMTD, os mapas de anisotropia fracional (AF) e difusibilidade média (DM). Com esses mapas em mãos, procedemos à análise estatística do estudo, denominada de análise de covariância voxel a voxel (VANCOVA), no cérebro todo. Nessa análise, utilizamos a idade como covariável e verificamos a influência do gênero nos resultados encontrados. Nossos resultados 6 evidenciaram que os pacientes portadores de esquizofrenia apresentaram valores de AF e DM alterados em estruturas homólogas ao corpo caloso e áreas frontais adjacentes. Assim, podemos afirmar que descobrimos perda de conectividade IH nesses mesmos pacientes. Por meio de nosso estudo, descobrimos também a influência do gênero nos valores de AF e DM encontrados e então, consequentemente, podemos dizer que a conectividade IH de pacientes portadores de esquizofrenia sofreu influência do sexo. A idade também mostrou influenciar a conectividade IH de nossos pacientes. Com o atual conceito de que alterações de AF e DM podem ser encaradas como indicativos de comprometimento da mielina, e sabendo que a mielina participa diretamente das reações neuroquímicas do sistema glutamatérgico cerebral, também podemos dizer que o sistema glutamatérgico que participa da conectividade IH desses pacientes encontrava-se comprometido. / Schizophrenia is a highly complex mental disorder and no theory to date was able to fully explain the etiology of this disorder. One of the existing theories advocates that interhemispheric communication, which occurs through the corpus callosum and the anterior and posterior commissures, might be impaired in schizophrenia. Our study was designed to investigate whether there are interhemispheric connectivity (IC) alterations in schizophrenia and whether these alterations are influenced by gender through the comparison of schizophrenia patients with their first-degree relatives and healthy controls using diffusion tensor imaging (DTI). We enrolled 30 schizophrenia patients diagnosed according to the fourth edition of the Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders and selected from the Group of Atypical Medications of the Schizophrenia Outpatient Clinic and the psychiatric ward of the Ribeirão Preto Medical School University Hospital, 30 first-degree relatives of these patients and 30 healthy volunteers. All subjects underwent magnetic resonance imaging (MRI) scans for the acquisition of volumetric and diffusion sequences. The images were post-processed using BrainVoyager QX® version 2.4 to create fractional anisotropy (FA) and mean diffusivity (MD) maps from DTI data. The resulting data were analyzed using voxel-to- voxel analysis of covariance (VANCOVA) for the whole brain. In this analysis, we used age as a co-variable and assessed the influence of gender. Our results showed that schizophrenia patients had altered FA and MD values in structures homologous to the corpus callosum and adjacent frontal areas, suggestive of IC loss in the patients. We also found that gender influenced FA and MD values and, therefore, that IC in schizophrenia patients is influenced by gender. Age was also found to influence IC in our patients. Based on the current conception that FA and MD alterations may indicate myelin impairment and knowing that myelin participates directly in neurochemical reactions of the glutamatergic system in the brain, we can infer that the glutamatergic system, which is implicated in IC, is affected in schizophrenia and is influenced by gender.

[ES] La esquizofrenia (SC) es un trastorno del neurodesarrollo que afecta los procesos cognitivos y el comportamiento social. A diferencia de otras neuropatologías, los cerebros de los pacientes con SC no muestran características histológicas evidentes y los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad siguen siendo desconocidos, lo que dificulta mucho su prevención y tratamiento eficaz. Los endofenotipos más consistentes en la SC incluyen la reducción del neuropilo, la conectividad funcional deteriorada entre las áreas corticales y cambios específicos en las conexiones sinápticas. El cuerpo calloso (CC) es el haz más grande de fibras nerviosas cortico-corticales, conectando ambos hemisferios cerebrales, y su desarrollo es un proceso complejo crucial para la formación adecuada de los circuitos corticales. Numerosa evidencia convergente apoya la hipótesis de que el CC se encuentra hipoconectado en pacientes con SC. Está bien establecido que la SC tiene un fuerte componente genético. Un gen clave implicado en el riesgo de SC es neuregulina 1 (NRG1), controlando varios aspectos del desarrollo neuronal. Estudios previos se han centrado principalmente en la señalización de Nrg1 en las interneuronas inhibitorias, descuidando su papel en las neuronas excitatorias. Para comprender el papel de Nrg1 en los circuitos corticales, en este trabajo estudiamos el papel de Nrg1 en el desarrollo de los axones del cuerpo calloso y específicamente, su función celular autónoma en las neuronas excitatorias. Para este objetivo quisimos, 1) evaluar la participación de la Nrg1 en el desarrollo de las neuronas de proyección callosa; 2) investigar el efecto autónomo de Nrg1 en el desarrollo de las neuritas; 3) estudiar los mecanismos moleculares subyacentes al papel de Nrg1 en el desarrollo neuronal; 4) explorar el potencial de Nrg1 en la reprogramación de astrocitos a neuronas, como un nuevo posible enfoque terapéutico después de una lesión cerebral. Para ello, primero desarrollamos un modelo in vivo de pérdida de función para determinar el papel de Nrg1 en el desarrollo de las proyecciones callosas.Descubrimos que la eliminación de Nrg1 en el modelo de ratón condicional impedía el desarrollo de axones callosos in vivo. A nivel mecanístico, encontramos que la señalización intracelular de Nrg1 es tanto necesaria como suficiente para promover el desarrollo axonal en las neuronas corticales in vivo. En segundo lugar, para determinar específicamente el papel de Nrg1 en el desarrollo axonal de las neuronas excitatorias, empleamos un modelo in vitro con un enfoque más reduccionista. Realizamos cultivos primarios de neuronas corticales. En este modelo, llevamos a cabo experimentos de ganancia y pérdida de función para investigar específicamente el efecto autónomo celular de Nrg1 sobre el desarrollo de dendritas y axones. Nuestros experimentos con cultivos primarios de neuronas confirmaron que la señalización intracelular de Nrg1 es necesaria y suficiente para promover el crecimiento axonal in vitro. En tercer lugar, estudiamos los mecanismos moleculares subyacentes al papel de Nrg1 en el desarrollo neuronal. Descubrimos mediante Western blot e inmunofluorescencia que la expresión de la proteína GAP43 está altamente disminuida en neuronas knockout para Nrg1. Además, observamos que disminución del desarrollo axonal en neuronas knockout para Nrg1 es parcialmente rescatado al sobreexpresar la proteína GAP43. Estos resultados sugieren que la señalización a través de GAP43 podría ser uno de los mecanismos involucrados en el papel de Nrg1 en el crecimiento axonal. En conjunto, nuestro estudio indica un papel crucial para la señalización intracelular de Nrg1 en el desarrollo de las conexiones cortico-corticales que conectan ambos hemisferios cerebrales. Nuestros resultados sugieren que la disfunción de Nrg1 en las neuronas excitatorias puede contribuir a la hipoconectividad asociada a la SC y las alteraciones del desarrollo neurológico. / [CA] L'esquizofrènia (SC) és un trastorn del neurodesenvolupament que afecta els processos cognitius i el comportament social. A diferència d'altres neuropatologies, els cervells dels pacients amb SC no mostren característiques histològiques evidents i els mecanismes moleculars subjacents a la malaltia continuen sent desconeguts, la qual cosa dificulta molt la seua prevenció i tractament eficaç. Els endofenotipus més consistents en la SC inclouen la reducció del neuropil, la connectivitat funcional deteriorada entre les àrees corticals i els canvis específics en les connexions sinàptiques. El cos callós (CC) és el feix més gran de fibres nervioses cortico-corticals, connecta tots dos hemisferis cerebrals, i el seu desenvolupament és un procés complex crucial per a la formació adequada dels circuits corticals. Nombrosa evidència convergent dona suport a la hipòtesi que el CC es troba hipoconnectat en pacients amb SC. Està ben establit que la SC té un fort component genètic. Un gen clau implicat en el risc de SC és neuregulina 1 (NRG1) que controla diversos aspectes del desenvolupament neuronal. Estudis previs s'han centrat principalment en la senyalització de Nrg1 en les interneurones inhibitòries, descurant el seu paper en les neurones excitatòries. Per a comprendre el paper de Nrg1 en els circuits corticals, en este treball estudiem el paper de Nrg1 en el desenvolupament dels axons del cos callós i específicament, la seua funció cel·lular autònoma en les neurones excitatòries. Per a este objectiu, 1) avaluem la participació de Nrg1 en el desenvolupament de les neurones de projecció callosa; 2) investiguem l'efecte autònom de Nrg1 en el desenvolupament de les neurites; 3) estudiem els mecanismes moleculars subjacents al paper de Nrg1 en el desenvolupament neuronal; 4) explorem el potencial de Nrg1 en la reprogramació d'astròcits a neurones, com un nou possible enfocament terapèutic després d'una lesió cerebral. Per això, emprem ratolins knockout nounats per a Nrg1 i realitzem un rastreig neuronal de les projeccions calloses, així com també rastregem estes projeccions en ratolins wild-type mitjançant la tècnica d'electroporació in utero. Descobrim que l'eliminació de Nrg1 en el model de ratolí condicional impedia el desenvolupament d'axons callosos in vivo. A nivell mecanístic, trobem que la senyalització intracel·lular de Nrg1 era suficient per a promoure el desenvolupament axonal en les neurones corticals in vivo. En segon lloc, per a determinar específicament el paper de Nrg1 en el desenvolupament axonal de les neurones excitatòries, emprem cultius primaris de neurones corticals. En este model, duem a terme experiments de guany i pèrdua de funció per a investigar específicament l'efecte autònom cel·lular de Nrg1 sobre el desenvolupament de dendrites i axons. Els nostres experiments amb cultius primaris de neurones van mostrar que la senyalització intracel·lular de Nrg1 és necessària i suficient per a promoure el creixement axonal in vitro. En tercer lloc, estudiem els mecanismes moleculars subjacents al paper de Nrg1 en el desenvolupament neuronal. Descobrim que l'expressió de la proteïna GAP43 està altament disminuïda en neurones knockout per a Nrg1. A més, observem que la disminució del desenvolupament axonal en neurones knockout per a Nrg1 és parcialment rescatat al sobreexpresar la proteïna GAP43. Estos resultats suggerixen que la senyalització a través de GAP43 podria ser un dels mecanismes involucrats en el paper de Nrg1 en el creixement axonal. En conjunt, el nostre estudi indica un paper crucial per a la senyalització intracellular de Nrg1 en el desenvolupament de les connexions cortico-corticals que connecten tots dos hemisferis cerebrals. Els nostres resultats assenyalen que la disfunció de Nrg1 en les neurones excitatòries pot contribuir a la hipoconnectivitat associada a la SC i a les alteracions del desenvolupament neurològic. / [EN] Schizophrenia (SZ) is a neurodevelopmental disorder that affects cognitive processes and social behavior, impacts approximately 1% of the population but presents a major socio-economic impact. Unlike other neuropathologies, the brains of SZ patients do not display obvious histological hallmarks and their molecular mechanisms remain unknown, making it very difficult to prevent and treat effectively. The most consistent endophenotypes in SZ include reduced neuropil, impaired functional connectivity between cortical areas and specific changes in synaptic connections. Therefore, SZ is a pathology based on abnormal cortical neuronal connectivity. The corpus callosum (CC), connecting the brain's hemispheres, is the largest bundle of cortico-cortical nerve fibers and its development is a complex process crucial for proper cortical circuitry formation. Converging evidence supports the hypothesis that the CC is hypoconnected in SZ patients. While the developmental etiology of SZ remains largely unresolved, it is well established that SZ has a strong genetic component. A key gene implicated in SZ risk is neuregulin 1 (NRG1), which controls several aspects of neuronal development. Prior research has primarily focused on Nrg1 signaling in inhibitory interneurons, neglecting its role in excitatory neurons. To understand the function of Nrg1 signaling in the development of cortical circuits, we studied the Nrg1's role in the development of callosal axons and specifically, the cell autonomous function in the excitatory neurons. To this aim, we sought to 1) evaluate the Nrg1's involvement in the development of callosal projecting neurons; 2) investigate the Nrg1's cell autonomous effect on neurites outgrowth; 3) study the molecular mechanisms underlying Nrg1's role in neuron development; 4) explore the Nrg1's potential in reprogramming astrocytes to neurons, as a novel therapeutic approach following brain injury. First, we developed an in vivo loss-of-function model to determine the role of Nrg1 in the development of callosal projections. We employed newborn Nrg1 knockout mice and performed neuronal tracing of the callosal projections, as well as we traced those projections in wild type mice by in utero electroporation. We found that the deletion of Nrg1 in a conditional mouse model impaired the development of callosal axons in vivo. On a mechanistic level, we found that the intracellular signaling of Nrg1 was sufficient to promote axonal development in cortical neurons in vivo. Second, to specifically determine the role of Nrg1 in axonal development of excitatory neurons, we employed a suitable in vitro model with a more reductionist approach. We performed primary cultures of cortical neurons. Using transfection by electroporation, we achieved sparse labeling and obtained internal controls. In this model, we carried out gain- and loss-of-function approaches to investigate specifically the Nrg1's cell autonomous effect on dendrites and axonal development. Our single-cell experiments in primary cultures showed that Nrg1 is cell-autonomously required and sufficient to promote axonal outgrowth in vitro. Third, we studied the molecular mechanisms underlying Nrg1's role in neuron development. We found by Western blot and immunofluorescence that the GAP43 protein expression is impaired in Nrg1 knockout neurons. Additionally, we observed that decreased axonal development in Nrg1 knockout neurons was rescued by overexpressing GAP43 protein. These results suggest that signaling through GAP43 may be one of the mechanisms involved in the role of Nrg1 in axonal growth. In conclusion, our study indicates a crucial role for Nrg1 intracellular signaling in the development of long-range cortico-cortical connections between brain hemispheres. It indicates that Nrg1 dysfunction in excitatory neurons may contribute to SZ-associated hypoconnectivity and neurodevelopmental alterations, providing new insights into the role of Nrg1 in the etiology of SZ. / Rodríguez Prieto, Á. (2024). Nrg1 Signaling in the Development of Cortical Circuits: Molecular Basis of Schizophrenia [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/212464

Evidências de estudos genético-epidemiológicos têm demonstrado a existência de um fator de risco genético para o desenvolvimento da esquizofrenia. Na presente Tese, um total de 245 pacientes com esquizofrenia e 834 controles foi selecionado com o objetivo de investigar a diferença na distribuição de alelos e genótipos de seis polimorfismos de quatro diferentes genes do sistema dopaminérgico nesses dois grupos: 1. TaqI A1/A2 do DRD2 - rs1800497; 2. -141C (Ins/Del) do DRD2 - rs1799732; 3. Ser-9-Gly do DRD3 - rs6280; 4. VNTR da região 3´ não-codificadora do SLC6A3; 5. A1343G do SLC6A3 - rs6347; 6. A/G da região 3´ não-codificadora do COMT - rs165599. Os resultados mostraram associação dos polimorfismos -141C (Ins/Del) do DRD2 (rs1799732) e A1343G do SLC6A3 (rs6347) com esquizofrenia na amostra investigada. / Evidences from genetic epidemiological studies have demonstrated the existence of a genetic risk factor for schizophrenia. In the present work a total of 245 schizophrenic patients and 834 controls were selected to investigate differences in the allelic and genotypic distribution of six polymorphisms from four different genes of the dopaminergic system between the groups: 1. TaqI A1/A2 of the DRD2 - rs1800497; 2. -141C (Ins/Del) of the DRD2 - rs1799732; 3. Ser-9-Gly of the DRD3 - rs6280; 4. VNTR in the 3\'-untranslated region of the SLC6A3; 5. A1343G of the SLC6A3 - rs6347; 6. A/G in the 3\'-untranslated region of the COMT - rs165599. The results have found an association of the polymorphisms -141C (Ins/Del) of the DRD2 (rs1799732) and A1343G of the SLC6A3 (rs6347) with schizophrenia in the investigated sample.

INTRODUÇÃO: Os transtornos mentais psicóticos são condições frequentes na população em geral e estão associados à grande morbidade e elevadas taxas de comprometimento funcional, tornando-os um grave problema de saúde pública. O desenvolvimento de novos métodos de auxílio diagnóstico e prognóstico a pratica clínica psiquiátrica possibilitando que intervenções efetivas sejam feitas precocemente na história natural da doença são, dessa forma, desejáveis. A classificação de padrões neuroanatômicos é uma robusta técnica para processamento e análise de imagens médicas que permite tanto a realização de comparações voxel-a-voxel entre grupos com alta dimensionalidade de variáveis, como a classificação individualizada das imagens. OBJETIVOS: Avaliar o desempenho diagnóstico de um classificador de padrões morfológicos complexos baseado em support vector machine (SVM) na discriminação entre diferentes transtornos psicóticos no momento do primeiro episódio, utilizando-se uma abordagem epidemiológica para a seleção de casos e controles, bem como na determinação de prognóstico de 1 ano em pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia. MÉTODOS: Uma amostra de 62 pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme, 23 casos de primeiro episódio de mania psicótica (transtorno bipolar tipo I, TB-I), e 19 indivíduos com depressão maior (DM) psicótica foram estudados com ressonância magnética (RM) estrutural de 1.5T, assim como um total de 89 controles residentes na mesma região dos casos. As imagens T1 foram inicialmente registradas a uma imagem molde comum através de um método com preservação de massa, permitindo a obtenção de volumes cerebrais regionais. Um classificador neuroanatômico multivariado baseado em redução de dimensionalidade e SVM foi utilizado para identificar o melhor conjunto de características morfológicas que diferencia cada transtorno psicótico (esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme, TB-I e DM psicótica) de subgrupos de controles saudáveis pareados por idade, gênero e anos de escolaridade. Os resultados obtidos pelo classificador foram, então, analisados com o auxílio de uma curva ROC, e um mapa espacial de alta dimensionalidade daquelas regiões cerebrais que constituem um padrão de distribuição tecidual cerebral característico de cada transtorno psicótico em relação aos controles foi gerado. RESULTADOS: O classificador obteve uma discriminação apenas modesta entre pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme e controles saudáveis, com uma medida de área sob a curva (AUC) de 0,75 e acurácia de 73,4%. O mapa espacial discriminatório resultante mostrou um padrão complexo de alterações volumétricas comprometendo regiões fronto-límbicas tanto de substância cinzenta como de substância branca cerebral bilateralmente, fascículos cerebrais associativos, terceiro ventrículo e o ventrículo lateral esquerdo. Um desempenho diagnóstico pobre foi observado nas comparações entre pacientes com TB-I e MD psicótica e controles. Além disso, o classificador baseado em SVM não conseguiu predizer satisfatoriamente o prognóstico de 1 ano (evolução de remissão versus não remissão) dos pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia. CONCLUSÃO: Utilizando uma amostra de pacientes com psicoses afetivas e não afetivas com características clínicas semelhantes aos pacientes vistos na nossa prática psiquiátrica (comorbidade com transtornos de uso de substâncias e curso clínico variável) e selecionados através de uma abordagem epidemiológica populacional, o classificador de padrões neuroanatômicos não obteve bom desempenho diagnóstico na discriminação entre as formas esquizofreniformes e afetivas de primeiro episódio psicótico, e também não conseguiu predizer satisfatoriamente o prognóstico de 1 ano em primeiro episódio de esquizofrenia, utilizando apenas imagens estruturais de RM / INTRODUCTION: Psychotic disorders are prevalent medical conditions in the general population, and are usually associated with high morbidity and functional impairment rates, which make them a major concern for public health. The development of new methods aiming to aid diagnostic and prognostic value in clinical psychiatric practice thus allowing effective interventions at an early course of the illness are, therefore, desirable. Neuroanatomical pattern classification is a powerful technique for image processing and analysis which allows both high-dimensional voxelwise group comparisons and classification of images at an individual basis. OBJECTIVES: To evaluate the diagnostic performance of a support vector machine (SVM)-based complex morphological pattern classifier was used to discriminate different non-affective and affective psychotic disorders at the first episode using a population-based approach to recruit both cases and healthy controls, and also to predict 1-year prognosis (i.e., remitting versus non-remitting course) in a group of patients with first-episode schizophrenia. METHODS: A sample of 62 patients with first-episode schizophrenia/ schizophreniform disorder, 23 cases presenting with their first-episode of psychotic mania (bipolar I disorder, BD-I) and 19 individuals with psychotic major depressive disorder (MDD) was studied with 1.5T structural magnetic resonance imaging (MRI), as well as a pool of 89 epidemiologically recruited controls. T1-weighted images were first registered to a common template through a robust mass-preserving routine allowing regional volumetric analysis. A high-dimensional multivariate classification method based on dimensionality reduction and SVM was employed to identify the best and most parsimonious set of morphological features that discriminate each psychotic group (schizophrenia/ schizophreniform disorder, BD-I & psychotic MDD) from subgroups of age, gender and educationally-matched healthy controls. The abnormalities scores generated by the classifier were analyzed with a ROC curve analysis and a high-dimensional spatial map of the brain regions that constitute a pattern of brain tissue distribution characteristic of each of the non-affective and affective groups relative to controls was created. RESULTS: The SVM-classifier afforded modest discrimination between subjects with first-episode schizophrenia/ schizophreniform disorder and controls, with an area under the curve (AUC) value of 0.75 and overall accuracy of 73.4%. The resulting discriminative spatial map revealed a complex pattern of regional volumetric abnormalities affecting both gray and white matter fronto-limbic regions bilaterally, long associative fasciculi, besides the third and lateral ventricles. A poor diagnostic performance was observed in the pairwise comparisons between BD-I and psychotic MDD versus controls. Also, the SVM-classifier failed to predict 1-year prognosis (remitting versus non-remitting course) in the first-episode schizophrenia group. CONCLUSION: The present results suggest that at the population level and using a real world sample of affective and non-affective psychotic patients with comorbid substance use disorders and variable disease course, we failed to achieve good discrimination between schizophreniform and affective forms of first-episode psychosis, and also in predicting 1-year prognosis of first-episode schizophrenia patients, using structural images

A esquizofrenia é um transtorno neuropsiquiátrico crônico que afeta aproximadamente 1% da população mundial. As teorias neurobiológicas descrevem que a esquizofrenia é essencialmente causada por alterações bioquímicas e estruturais do cérebro, devido às disfunções nos sistemas glutamatérgico, dopaminérgico e serotoninérgico. Desta forma, a determinação das concentrações de aminoácidos e neurotransmissores em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos pode auxiliar na avaliação da eficácia da terapia. Além dos antipsicóticos, medicação de primeira linha no tratamento inicial da esquizofrenia, a maioria dos pacientes também faz uso concomitante de outras classes de fármacos, tais como antidepressivos, anticonvulsivantes e ansiolíticos para minimizar os sintomas associados a esta doença. Nesta tese, um método empregando a precipitação de proteínas (PPT) e a cromatografia líquida por interação hidrofílica acoplada à espectrometria de massas em tandem (HILIC-MS/MS) foi adequadamente desenvolvido e validado para a determinação de aminoácidos (aspartato, serina, glicina, alanina, metionina, leucina, tirosina e triptofano) e neurotransmissores (glutamato e ácido -aminobutírico) em amostras de plasma de 35 pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina (27 pacientes) e olanzapina (8 pacientes) para avaliar a eficácia do tratamento, tendo como controle 38 voluntários sadios. O método HILIC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (9,7 pmol mL-1 - 13,3 nmol mL-1) ao LSQ (19,4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1), tempo de análise de 3,0 min, exatidão com EPR de -18 a 19% e precisão com CV de 0,1 a 16% (LIQ). A análise de variância (ANOVA), seguida por teste post-hoc de Duncan, revelou que os níveis médios plasmáticos (nmol mL-1) de metionina (F2,70 = 3,14, p = 0,049) de pacientes esquizofrênicos em tratamento com olanzapina foram significativamente mais elevados, quando comparados aos valores obtidos com o grupo controle (voluntários saudáveis), já o nível de glutamato em pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina apresentaram tendência a valores mais altos (F2.70 = 2,50, p = 0,090). Já os métodos, PPT/LC-MS/MS e LC-MS/MS no modo column switching utilizando uma coluna monolítica de sílica híbrida com grupos cianopropil na primeira dimensão, foram desenvolvidos e validados para a determinação dos antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina), e ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. O método PPT/LC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (0,2 ng mL-1 - 5,0 ng mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -9,7 a 8,0%, e precisão com CV de 0,1 a 12%. Já o método LC-MS/MS no modo column switching apresentou linearidade do LIQ (63,0 pg mL-1 - 1250,0 pg mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -14 a 12% e precisão com CV de 0,6 a 6,5%. A pré-concentração seletiva dos fármacos na coluna monolítica com grupos cianopropil incorporados e a remoção dos componentes endógenos da amostra biológica, antes da separação cromatográfica, favoreceram a seletividade e detectabilidade do método LC-MS/MS no modo column switching. Este método quando comparado ao de referência PPT/LC-MS/MS, através da análise de 10 amostras de pacientes esquizofrênicos, não apresentou diferença significativa (teste t) entre as concentrações plasmáticas, podendo ser aplicado na monitorização terapêutica. Além deste fato, este método automatizado favoreceu a precisão, a exatidão e a freqüência analítica. / Schizophrenia is a chronic neuropsychiatric disorder that affects approximately 1% of the world population. According to neurobiological theories, schizophrenia stems from biochemical and structural alterations in the brain due to dysfunction in the glutamatergic, dopaminergic, and serotonergic systems. Determining the concentrations of amino acids and neurotransmitters in plasma samples from schizophrenic patients may assist evaluation of therapy effectiveness. In addition to antipsychotics (the first-line drug in the initial treatment of schizophrenia), most patients concomitantly use other classes of drugs such as antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics to minimize the symptoms associated with this disease. To evaluate treatment efficacy, in this thesis a method based on protein precipitation (PPT) and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) has been properly developed and validated to determine amino acids (aspartate, serine, glycine, alanine, methionine, leucine, tyrosine, and tryptophan) and neurotransmitters (glutamate and -aminobutyric acid) in plasma samples obtained from 35 schizophrenia patients treated with clozapine (27 patients) or olanzapine (8 patients); 38 healthy volunteers served as controls. The HILIC-MS/MS method was linear for concentrations ranging from the LLOQ (9.7 pmol mL-1 - 13.3 nmol mL-1) to the ULOQ (19.4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1). The analysis time was 3.0 min. In the case of accuracy, RSE ranged from -18 to 19%. As for precision, CV lay between 0.1 and 16% (LLOQ). Analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc Duncan showed that the average methionine serum levels (nmol mL-1) (F2.70 = 3.14, p = 0.049) in schizophrenic patients treated with olanzapine were significantly higher as compared with the control group (healthy volunteers). The glutamate level in schizophrenic patients treated with clozapine tended to higher values (F2.70 = 2.50, p = 0.090). Concerning the analytical methods, PPT/LC-MS/MS and LC-MS/MS operating in the column-switching mode were developed and validated to determine antipsychotic (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine), antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, and fluoxetine), anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples taken from schizophrenic patients for therapeutic drug monitoring. A monolithic hybrid column containing silica with cyanopropyl groups in the first dimension was employed. The PPT/LC-MS/MS method was linear from the LLOQ (0.2 ng mL-1 - 5.0 ng mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). In the case of accuracy, RSE ranged from -9.7 to 8.0%; as for precision, CV lay between 0.1 and 12%. LC-MS/MS in the column-switching mode was linear from the LLOQ (63.0 pg mL-1 - 1250.0 pg mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). RSE ranged from -14 to 12%; CV lay between 0.6 and 6.5%. The drugs were selectively pre-concentrated in the monolithic column containing silica incorporated with cyanopropyl groups. For the LC-MS/MS method operating in the column-switching mode, the endogenous components of the biological sample of the LC-MS/MS method were removed before analysis. Analysis of 10 plasma samples obtained from schizophrenic patients did not reveal any significant differences (t test) between the LC-MS/MS method and the reference PPT/LC-MS/MS method. Therefore, LC-MS/MS can be applied in therapeutic monitoring, with the advantage that this method offers improved precision, accuracy, and analytical frequency.

Evidências de estudos genético-epidemiológicos têm demonstrado a existência de um fator de risco genético para o desenvolvimento da esquizofrenia. Na presente Tese, um total de 245 pacientes com esquizofrenia e 834 controles foi selecionado com o objetivo de investigar a diferença na distribuição de alelos e genótipos de seis polimorfismos de quatro diferentes genes do sistema dopaminérgico nesses dois grupos: 1. TaqI A1/A2 do DRD2 - rs1800497; 2. -141C (Ins/Del) do DRD2 - rs1799732; 3. Ser-9-Gly do DRD3 - rs6280; 4. VNTR da região 3´ não-codificadora do SLC6A3; 5. A1343G do SLC6A3 - rs6347; 6. A/G da região 3´ não-codificadora do COMT - rs165599. Os resultados mostraram associação dos polimorfismos -141C (Ins/Del) do DRD2 (rs1799732) e A1343G do SLC6A3 (rs6347) com esquizofrenia na amostra investigada. / Evidences from genetic epidemiological studies have demonstrated the existence of a genetic risk factor for schizophrenia. In the present work a total of 245 schizophrenic patients and 834 controls were selected to investigate differences in the allelic and genotypic distribution of six polymorphisms from four different genes of the dopaminergic system between the groups: 1. TaqI A1/A2 of the DRD2 - rs1800497; 2. -141C (Ins/Del) of the DRD2 - rs1799732; 3. Ser-9-Gly of the DRD3 - rs6280; 4. VNTR in the 3\'-untranslated region of the SLC6A3; 5. A1343G of the SLC6A3 - rs6347; 6. A/G in the 3\'-untranslated region of the COMT - rs165599. The results have found an association of the polymorphisms -141C (Ins/Del) of the DRD2 (rs1799732) and A1343G of the SLC6A3 (rs6347) with schizophrenia in the investigated sample.

INTRODUÇÃO: Os transtornos mentais psicóticos são condições frequentes na população em geral e estão associados à grande morbidade e elevadas taxas de comprometimento funcional, tornando-os um grave problema de saúde pública. O desenvolvimento de novos métodos de auxílio diagnóstico e prognóstico a pratica clínica psiquiátrica possibilitando que intervenções efetivas sejam feitas precocemente na história natural da doença são, dessa forma, desejáveis. A classificação de padrões neuroanatômicos é uma robusta técnica para processamento e análise de imagens médicas que permite tanto a realização de comparações voxel-a-voxel entre grupos com alta dimensionalidade de variáveis, como a classificação individualizada das imagens. OBJETIVOS: Avaliar o desempenho diagnóstico de um classificador de padrões morfológicos complexos baseado em support vector machine (SVM) na discriminação entre diferentes transtornos psicóticos no momento do primeiro episódio, utilizando-se uma abordagem epidemiológica para a seleção de casos e controles, bem como na determinação de prognóstico de 1 ano em pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia. MÉTODOS: Uma amostra de 62 pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme, 23 casos de primeiro episódio de mania psicótica (transtorno bipolar tipo I, TB-I), e 19 indivíduos com depressão maior (DM) psicótica foram estudados com ressonância magnética (RM) estrutural de 1.5T, assim como um total de 89 controles residentes na mesma região dos casos. As imagens T1 foram inicialmente registradas a uma imagem molde comum através de um método com preservação de massa, permitindo a obtenção de volumes cerebrais regionais. Um classificador neuroanatômico multivariado baseado em redução de dimensionalidade e SVM foi utilizado para identificar o melhor conjunto de características morfológicas que diferencia cada transtorno psicótico (esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme, TB-I e DM psicótica) de subgrupos de controles saudáveis pareados por idade, gênero e anos de escolaridade. Os resultados obtidos pelo classificador foram, então, analisados com o auxílio de uma curva ROC, e um mapa espacial de alta dimensionalidade daquelas regiões cerebrais que constituem um padrão de distribuição tecidual cerebral característico de cada transtorno psicótico em relação aos controles foi gerado. RESULTADOS: O classificador obteve uma discriminação apenas modesta entre pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia/ transtorno esquizofreniforme e controles saudáveis, com uma medida de área sob a curva (AUC) de 0,75 e acurácia de 73,4%. O mapa espacial discriminatório resultante mostrou um padrão complexo de alterações volumétricas comprometendo regiões fronto-límbicas tanto de substância cinzenta como de substância branca cerebral bilateralmente, fascículos cerebrais associativos, terceiro ventrículo e o ventrículo lateral esquerdo. Um desempenho diagnóstico pobre foi observado nas comparações entre pacientes com TB-I e MD psicótica e controles. Além disso, o classificador baseado em SVM não conseguiu predizer satisfatoriamente o prognóstico de 1 ano (evolução de remissão versus não remissão) dos pacientes com primeiro episódio de esquizofrenia. CONCLUSÃO: Utilizando uma amostra de pacientes com psicoses afetivas e não afetivas com características clínicas semelhantes aos pacientes vistos na nossa prática psiquiátrica (comorbidade com transtornos de uso de substâncias e curso clínico variável) e selecionados através de uma abordagem epidemiológica populacional, o classificador de padrões neuroanatômicos não obteve bom desempenho diagnóstico na discriminação entre as formas esquizofreniformes e afetivas de primeiro episódio psicótico, e também não conseguiu predizer satisfatoriamente o prognóstico de 1 ano em primeiro episódio de esquizofrenia, utilizando apenas imagens estruturais de RM / INTRODUCTION: Psychotic disorders are prevalent medical conditions in the general population, and are usually associated with high morbidity and functional impairment rates, which make them a major concern for public health. The development of new methods aiming to aid diagnostic and prognostic value in clinical psychiatric practice thus allowing effective interventions at an early course of the illness are, therefore, desirable. Neuroanatomical pattern classification is a powerful technique for image processing and analysis which allows both high-dimensional voxelwise group comparisons and classification of images at an individual basis. OBJECTIVES: To evaluate the diagnostic performance of a support vector machine (SVM)-based complex morphological pattern classifier was used to discriminate different non-affective and affective psychotic disorders at the first episode using a population-based approach to recruit both cases and healthy controls, and also to predict 1-year prognosis (i.e., remitting versus non-remitting course) in a group of patients with first-episode schizophrenia. METHODS: A sample of 62 patients with first-episode schizophrenia/ schizophreniform disorder, 23 cases presenting with their first-episode of psychotic mania (bipolar I disorder, BD-I) and 19 individuals with psychotic major depressive disorder (MDD) was studied with 1.5T structural magnetic resonance imaging (MRI), as well as a pool of 89 epidemiologically recruited controls. T1-weighted images were first registered to a common template through a robust mass-preserving routine allowing regional volumetric analysis. A high-dimensional multivariate classification method based on dimensionality reduction and SVM was employed to identify the best and most parsimonious set of morphological features that discriminate each psychotic group (schizophrenia/ schizophreniform disorder, BD-I & psychotic MDD) from subgroups of age, gender and educationally-matched healthy controls. The abnormalities scores generated by the classifier were analyzed with a ROC curve analysis and a high-dimensional spatial map of the brain regions that constitute a pattern of brain tissue distribution characteristic of each of the non-affective and affective groups relative to controls was created. RESULTS: The SVM-classifier afforded modest discrimination between subjects with first-episode schizophrenia/ schizophreniform disorder and controls, with an area under the curve (AUC) value of 0.75 and overall accuracy of 73.4%. The resulting discriminative spatial map revealed a complex pattern of regional volumetric abnormalities affecting both gray and white matter fronto-limbic regions bilaterally, long associative fasciculi, besides the third and lateral ventricles. A poor diagnostic performance was observed in the pairwise comparisons between BD-I and psychotic MDD versus controls. Also, the SVM-classifier failed to predict 1-year prognosis (remitting versus non-remitting course) in the first-episode schizophrenia group. CONCLUSION: The present results suggest that at the population level and using a real world sample of affective and non-affective psychotic patients with comorbid substance use disorders and variable disease course, we failed to achieve good discrimination between schizophreniform and affective forms of first-episode psychosis, and also in predicting 1-year prognosis of first-episode schizophrenia patients, using structural images

A esquizofrenia é um transtorno neuropsiquiátrico crônico que afeta aproximadamente 1% da população mundial. As teorias neurobiológicas descrevem que a esquizofrenia é essencialmente causada por alterações bioquímicas e estruturais do cérebro, devido às disfunções nos sistemas glutamatérgico, dopaminérgico e serotoninérgico. Desta forma, a determinação das concentrações de aminoácidos e neurotransmissores em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos pode auxiliar na avaliação da eficácia da terapia. Além dos antipsicóticos, medicação de primeira linha no tratamento inicial da esquizofrenia, a maioria dos pacientes também faz uso concomitante de outras classes de fármacos, tais como antidepressivos, anticonvulsivantes e ansiolíticos para minimizar os sintomas associados a esta doença. Nesta tese, um método empregando a precipitação de proteínas (PPT) e a cromatografia líquida por interação hidrofílica acoplada à espectrometria de massas em tandem (HILIC-MS/MS) foi adequadamente desenvolvido e validado para a determinação de aminoácidos (aspartato, serina, glicina, alanina, metionina, leucina, tirosina e triptofano) e neurotransmissores (glutamato e ácido -aminobutírico) em amostras de plasma de 35 pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina (27 pacientes) e olanzapina (8 pacientes) para avaliar a eficácia do tratamento, tendo como controle 38 voluntários sadios. O método HILIC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (9,7 pmol mL-1 - 13,3 nmol mL-1) ao LSQ (19,4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1), tempo de análise de 3,0 min, exatidão com EPR de -18 a 19% e precisão com CV de 0,1 a 16% (LIQ). A análise de variância (ANOVA), seguida por teste post-hoc de Duncan, revelou que os níveis médios plasmáticos (nmol mL-1) de metionina (F2,70 = 3,14, p = 0,049) de pacientes esquizofrênicos em tratamento com olanzapina foram significativamente mais elevados, quando comparados aos valores obtidos com o grupo controle (voluntários saudáveis), já o nível de glutamato em pacientes esquizofrênicos em tratamento com clozapina apresentaram tendência a valores mais altos (F2.70 = 2,50, p = 0,090). Já os métodos, PPT/LC-MS/MS e LC-MS/MS no modo column switching utilizando uma coluna monolítica de sílica híbrida com grupos cianopropil na primeira dimensão, foram desenvolvidos e validados para a determinação dos antipsicóticos (olanzapina, quetiapina, clozapina, haloperidol e clorpromazina), antidepressivos (mirtazapina, paroxetina, citalopram, sertralina, imipramina, clomipramina e fluoxetina), anticonvulsivantes (carbamazepina e lamotrigina), e ansiolíticos (diazepam e clonazepam) em amostras de plasma de pacientes esquizofrênicos para fins de monitorização terapêutica. O método PPT/LC-MS/MS apresentou linearidade do LIQ (0,2 ng mL-1 - 5,0 ng mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -9,7 a 8,0%, e precisão com CV de 0,1 a 12%. Já o método LC-MS/MS no modo column switching apresentou linearidade do LIQ (63,0 pg mL-1 - 1250,0 pg mL-1) ao LSQ (40,5 ng mL-1 - 10,5 g mL-1), exatidão com EPR de -14 a 12% e precisão com CV de 0,6 a 6,5%. A pré-concentração seletiva dos fármacos na coluna monolítica com grupos cianopropil incorporados e a remoção dos componentes endógenos da amostra biológica, antes da separação cromatográfica, favoreceram a seletividade e detectabilidade do método LC-MS/MS no modo column switching. Este método quando comparado ao de referência PPT/LC-MS/MS, através da análise de 10 amostras de pacientes esquizofrênicos, não apresentou diferença significativa (teste t) entre as concentrações plasmáticas, podendo ser aplicado na monitorização terapêutica. Além deste fato, este método automatizado favoreceu a precisão, a exatidão e a freqüência analítica. / Schizophrenia is a chronic neuropsychiatric disorder that affects approximately 1% of the world population. According to neurobiological theories, schizophrenia stems from biochemical and structural alterations in the brain due to dysfunction in the glutamatergic, dopaminergic, and serotonergic systems. Determining the concentrations of amino acids and neurotransmitters in plasma samples from schizophrenic patients may assist evaluation of therapy effectiveness. In addition to antipsychotics (the first-line drug in the initial treatment of schizophrenia), most patients concomitantly use other classes of drugs such as antidepressants, anticonvulsants, and anxiolytics to minimize the symptoms associated with this disease. To evaluate treatment efficacy, in this thesis a method based on protein precipitation (PPT) and hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) has been properly developed and validated to determine amino acids (aspartate, serine, glycine, alanine, methionine, leucine, tyrosine, and tryptophan) and neurotransmitters (glutamate and -aminobutyric acid) in plasma samples obtained from 35 schizophrenia patients treated with clozapine (27 patients) or olanzapine (8 patients); 38 healthy volunteers served as controls. The HILIC-MS/MS method was linear for concentrations ranging from the LLOQ (9.7 pmol mL-1 - 13.3 nmol mL-1) to the ULOQ (19.4 nmol mL-1 - 800 nmol mL-1). The analysis time was 3.0 min. In the case of accuracy, RSE ranged from -18 to 19%. As for precision, CV lay between 0.1 and 16% (LLOQ). Analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc Duncan showed that the average methionine serum levels (nmol mL-1) (F2.70 = 3.14, p = 0.049) in schizophrenic patients treated with olanzapine were significantly higher as compared with the control group (healthy volunteers). The glutamate level in schizophrenic patients treated with clozapine tended to higher values (F2.70 = 2.50, p = 0.090). Concerning the analytical methods, PPT/LC-MS/MS and LC-MS/MS operating in the column-switching mode were developed and validated to determine antipsychotic (olanzapine, quetiapine, clozapine, haloperidol, and chlorpromazine), antidepressants (mirtazapine, paroxetine, citalopram, sertraline, imipramine, clomipramine, and fluoxetine), anticonvulsants (carbamazepine and lamotrigine), and anxiolytics (diazepam and clonazepam) in plasma samples taken from schizophrenic patients for therapeutic drug monitoring. A monolithic hybrid column containing silica with cyanopropyl groups in the first dimension was employed. The PPT/LC-MS/MS method was linear from the LLOQ (0.2 ng mL-1 - 5.0 ng mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). In the case of accuracy, RSE ranged from -9.7 to 8.0%; as for precision, CV lay between 0.1 and 12%. LC-MS/MS in the column-switching mode was linear from the LLOQ (63.0 pg mL-1 - 1250.0 pg mL-1) to the ULOQ (40.5 ng mL-1 - 10.5 g mL-1). RSE ranged from -14 to 12%; CV lay between 0.6 and 6.5%. The drugs were selectively pre-concentrated in the monolithic column containing silica incorporated with cyanopropyl groups. For the LC-MS/MS method operating in the column-switching mode, the endogenous components of the biological sample of the LC-MS/MS method were removed before analysis. Analysis of 10 plasma samples obtained from schizophrenic patients did not reveal any significant differences (t test) between the LC-MS/MS method and the reference PPT/LC-MS/MS method. Therefore, LC-MS/MS can be applied in therapeutic monitoring, with the advantage that this method offers improved precision, accuracy, and analytical frequency.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / No romance A defesa Lujin, de Vladimir Nabokov, publicado em russo em 1930, o texto procura levar o leitor a adotar processos mentais similares ao de um jogador de xadrez e de um esquizofrênico, características do personagem-título do romance. Delineiam-se as expectativas e circunstâncias de um ser de papel que se vê jogando um xadrez em que também é peça e traçam-se paralelos com as expectativas e circunstâncias do leitor perante esse texto literário. O prefácio de Nabokov à edição em inglês de 1964 é tomado como indício de um leitor e um autor implícitos que ele procura moldar. Para análise dos elementos textuais e níveis de abstração mental envolvidos, recorre-se à estética da recepção de Wolfgang Iser e a diversas ideias do psiquiatra e etnólogo Gregory Bateson, entre elas o conceito de duplo vínculo, com atenção às distinções entre mapa/território e play/game. Um duplo duplo vínculo é perpetrado na interação leitor-texto: 1) o leitor é convidado a sentir empatia pela situação do personagem Lujin e a considerá-lo lúcido e louco ao mesmo tempo; e 2) o leitor é colocado como uma instância pseudo-transcendental incapaz de comunicação com a instância inferior (Lujin), gerando uma angústia diretamente relacionável ao seu envolvimento com a ficção, replicando de certa forma a loucura de Lujin. A sinestesia do personagem Lujin é identificada como um dos elementos do texto capaz de recriar a experiência de jogar xadrez até para quem não aprecia o jogo. Analisa-se a conexão entre a esquizofrenia ficcional do personagem Lujin e a visão batesoniana do alcoolismo / In Vladimir Nabokovs novel, The Luzhin Defense, published in Russian in 1930, the text beckons the reader on to adopt mental processes similar to a chess players and a schizophrenic persons both traits of the novels title character. This character sees himself both as player and piece of an ongoing game of chess; his expectations and predicaments are traced in parallel to the readers own as he or she navigates the text. Nabokovs preface to the 1964 English edition is taken as an indication that he tries to shape both an implicit reader and an implicit author. In order to analyze the elements of the text and degrees of mental abstraction involved in this, we refer to Wolfgang Isers reader-response theory and also many of psychiatrist and ethnologist Gregory Batesons ideas, such as the double bind, with special regard to map vs. territory and play vs. game distinctions. A double double bind is built within the reader-text interplay as follows: 1) the reader is invited to feel empathy for Luzhins predicament and to regard him at once as sane and insane; and 2) the reader is posited as a pseudo-transcendental instance unable to communicate with his nether instance (Luzhin) in such a way that it brews a feeling of anxiety directly relatable to his or her engagement in the work of fiction, reproducing, in a way, Luzhins madness. Luzhins synesthesia is identified as one of the text elements with the ability to recreate the chess-playing experience even to readers who are not fond of the game. The connection between Luzhins fictional schizophrenia and Batesons views on alcoholism is analyzed