A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico de origem natural ou antropogênica, encontrada em grandes concentrações no cigarro, além de ser produto da biotransformação do benzeno. Nosso grupo de pesquisa tem demonstrado que a exposição à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Dando continuidade a estas investigações, este trabalho visou investigar os efeitos da exposição in vivo à HQ sobre funções do tecido traqueal e atividades de macrófagos alveolares. Para tanto, camundongos Swiss machos foram expostos à HQ 25ppm (1,5mg/60mL/1h; 5 dias) ou veículo (solução salina etanol 1:20) por via sistêmica (nebulização). Concentrações de mediadores inflamatórios (interleucina (IL) 1β, IL-6, IL-10, IL-4, IL-12 fator de necrose tumoral-α (TNF-α) ou proteína quimiotáxica de monócitos (MCP-1); ensaio imunoenzimático (ELISA) e óxido nítrico (NO; reação de Griess) foram quantificados no lavado bronco-alveolar (LBA) em condições basais ou 3 horas após estímulo inflamatório (LPS in vivo; 100µL/mL; 10min) e no sobrenadante de macrófagos (MΦs) alveolares ou de cultura da traquéia obtidos dos animais e posteriormente estimulados in vitro (MΦs: 5µg/mL de LPS + 10ng/mL de IFN-γ; traquéia: 1µg/mL de LPS; 24h). Atividades fagocítica e fungicida (microscopia óptica) e a expressão de receptores envolvidos na fagocitose toll-like receptor (TLR, TLR-2, TLR4 e dectina-1; citometria de fluxo) foram determinadas após incubação in vitro de MΦs alveolares com o fungo Candida albicans e a expressão protéica de MyD88 foi realizada em MΦs alveolares (western blot). Quantificação do RNAm para MCP-1 (reação da transcriptase reversa em cadeia de polimerase, RT-PCR) foi realizada em tecido traqueal e células de linhagem monocítica humana THP-1 foram empregadas em ensaios de quimiotaxia in vitro (Câmara de Boyden) frente a diferentes concentrações de MCP-1. Reatividade do tecido traqueal foi quantificada frente à metacolina. Os resultados obtidos mostraram que a exposição in vivo à HQ reduziu a concentração de MCP-1 (54,98% vs. controle LPS) e IL-12 (51,45% vs. controle LPS) no LBA após inflamação; reduziu a secreção de MCP-1 por MΦs (basal: 87,96%; LPS+INF-γ: 61,20%) e tecido traqueal em cultura (79,77% vs. controle LPS). Neste último tecido, a diminuição foi dependente da menor expressão gênica. Concentrações de MCP-1 semelhantes à detectada no sobrenadante de cultura de traquéia de animais expostos à HQ induziram migração de células THP-1 menor (38,2%) que à provocada pela concentração de MCP-1 no sobrenadante da cultura traquéia de animais controles. Traquéias de animais expostos à HQ apresentaram hiperreatividade (193,48%), a qual foi revertida pela remoção do epitélio traqueal. Adicionalmente, cultura de MΦs obtidos de animais expostos à HQ apresentaram maior atividade fagocítica (porcentagem de fagocitose: 36,30%; índice de fagocitose: 83,97%) e fungicida (68,47%), que não foram dependentes de alterações nos receptores TLR2, TLR4 e dectina-1, mas podem ser decorrentes da menor expressão protéica de MyD88. Em conjunto, os dados obtidos apontam para alterações importantes resultantes da exposição in vivo à HQ sobre funções de MΦs alveolares e do tecido traqueal que, em conjunto, podem ser determinantes para a toxicidade observada nestes animais que culmina com prejuízo na defesa do organismo. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound of natural or anthropogenic source, also found in high concentrations in cigarette, as well as benzene´s metabolite. Our research group has demonstrated that exposure to HQ impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of in vivo exposure to HQ on tracheal tissue and alveolar macrophages (MΦs) activities. For this purpose, male Swiss mice were systemically (aerolised) exposed to 25ppm HQ (1.5 mg/60mL/1h; 5 days) or vehicle (saline ethanol solution, 1:20). Concentrations of inflammatory mediators (interleukin (IL) IL-1β, IL- 6, IL-10, IL-4, IL-12 tumor necrosis factor-α (TNF-α ) or monocyte chemoattractant protein (MCP-1); (enzyme immune assay, ELISA)) and nitric oxide (NO; Griess reaction) were quantified in bronchoalveolar lavage (BAL) at baseline or 3 hours after inflammatory stimulus (in vivo LPS, 100µL/mL; 10min); in the supernatant of cultured alveolar macrophages (MΦs) or trachea obtained from animals and subsequently in vitro stimulated (MΦs: 5µg/mL of LPS plus 10ng/mL IFN-γ; trachea: 1µg/mL LPS; 24 hours). Phagocytic and fungicidal activities (light microscopy) and expression of receptors involved in phagocytosis (toll-like receptor (TLR, TLR2, TLR4 and dectin-1, flow cytometry) were determined after in vitro incubation of alveolar MΦs with Candida albicans fungus and expression of MyD88 pathway was held in alveolar MΦs (western blot). Quantification of mRNA for MCP-1 (reaction of reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) was performed in tracheal tissue and cells human monocytic THP-1 were used in in vitro chemotaxis assays (Boyden chamber) using different concentrations of MCP-1. Tracheal reactivity was measured in response to methacholine. The results showed that in vivo HQ exposure reduced the concentration of MCP-1 (54.98% vs. control) and IL-12 (51.45% vs. control) in the BAL after inflammation; decreased secretion of MCP-1 by MΦs (basal: 87.96%, LPS+INF-γ: 61.20%) and in tracheal culture after LPS stimulation (79.77% vs. control). In the latter tissue, the MCP-1 protein content was dependent on impaired gene expression. Concentrations of MCP-1 similar to those detected in the supernatant of tracheal from HQ exposed rats induced smaller migration of THP-1 cells (38.2%) than that evoked by the MCP-1 concentration obtained in trachea supernatants collected from control animals. Tracheas from HQ exposed rats showed hyper reactivity (193.48%), which was reversed by removal of the tracheal epithelium. Additionally, culture of MΦs obtained from HQ exposed rats showed increased phagocytic (percentage of phagocytosis: 36.30%; phagocytosis index: 83.97%) and fungicide activity (68.47%), which were not dependent on changes in the receptors TLR2, TLR4 and dectin-1, but could be due to reduced MyD88 expression. Together, these data point out important alterations on MΦs and trachea after in vivo HQ exposure, which may be crucial for the toxicity observed in these animals that culminates with impaired host defense.

Orientador: Luciane Alarcão Dias-Melicio / Resumo: Recentemente, a deficiência de vitamina D vem se tornando um problema de abrangência mundial em virtude de hábitos rotineiros da população, como o trabalho por períodos prolongados em ambientes fechados e diminuição da exposição solar. Trabalhos recentes demonstram que a vitamina D age não somente na homeostase do cálcio, mas também na regulação do sistema imune. Diante da multiplicidade de funções dessa vitamina, sua deficiência tem sido associada ao risco de desenvolvimento de uma série de doenças, entre elas doenças infecciosas como as causadas por S. aureus. As infecções por essa bactéria têm trazido expressiva preocupação para a população humana em decorrência do aumento da prevalência de cepas resistentes aos fármacos antibacterianos, dificultando, dessa maneira, o tratamento e contribuindo para a busca de métodos alternativos para combater esse tipo de infecção. Além disso, o S. aureus conta com um potente arsenal de fatores de virulência que contribuem para a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nesse contexto, torna-se importante avaliar se a vitamina D pode modular os efeitos bactericidas de neutrófilos humanos através de mecanismos intra e extracelulares, favorecendo, portanto, o combate a infecções, especialmente aquelas causadas por microrganismos resistentes aos principais tratamentos. Dessa maneira, nós demonstramos que neutrófilos tratados com vitamina D e desafiados com duas cepas de S. aureus tiveram um aumento nas taxas de fagocitose e atividade bacteric... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the last years, vitamin D deficiency has become a worldwide problem due to routine population habits, such as prolonged work indoors and increased use of sunscreen/decreased sun exposure in attempt to avoid high rates of skin cancer. Recent studies demonstrated that vitamin D acts not only on calcium homeostasis, but also on the regulation and function of the immune system. Facing the countless functions of vitamin D, its deficiency has been associated with the risk of development of many diseases, including infectious diseases such as those caused by S. aureus. Infections caused by these bacteria have brought significant concern to the human population due to the increased prevalence of strains resistant to antibiotics, thus making it difficult to treat and contributing to the search for alternative methods to combat this type of infection. In addition, S. aureus have a variety of virulence factors, which confer the ability to evade host immune responses. In this context, it is important to evaluate whether vitamin D can modulate the bactericidal effects of human neutrophils through intra- and extracellular mechanisms, such as phagocytosis, bacterial killing and release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), thus contributing to the response against infections, especially those caused by microorganisms resistant to the main treatments. Thus, we demonstrated that neutrophils treated with Vitamin D and challenged with two strains of S. aureus had an increase in phagocyti... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-07-27T15:19:25Z No. of bitstreams: 1 JoãoBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-07-27T15:19:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JoãoBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-27T15:19:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoãoBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) Previous issue date: 2018-06-14 / Projections of the increase in absolute and relative numbers of elderly represent new challenges for public health. Aging is accompanied by gradual decline of physiological functions, immune function and muscle strength. In this way, the elderly is more susceptible to sarcopenia, osteoporosis, cancer and cardiovascular, metabolic and neurodegenerative diseases. Resistance Training (RT) has been shown to be an important intervention for increased muscle strength and decreased chronic inflammation in the elderly. However, little is known about the influence of RT on the functional response of cells that constitute the first line of defense during immunosenescence. In this sense, the present study aimed to investigate an association between RT adaptations induced by a program and a functional response of circulating phagocytes in elderly. The present cross-sectional study was composed of 54 elderly women, 71.3 ± 6.3 years, apparently healthy, non-institutionalized and divided into two distinct groups: Trained (n = 28) and Sedentary (n = 26). The elderly of the Trained group were participants of a RT program for 8.6 ± 0.3 months and performed a training consisting of 12 exercises, 3 sessions weekly, with intensity of 70% of a maximum repetition, while the Sedentary group did not participate of any physical activity program during the same period. Body mass, height, body mass index, waisthip ratio, fat free mass and fat mass were evaluated. The total energy intake and macronutrients in the usual diet were assessed. TNF-a, IL-6 and IGF-1 analyzes, total and differential leukocyte count, monocyte or neutrophil phagocytosis test, phagocytosis index (IF) and microbicidal activity of phagocytes were performed. Data analysis was performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program and considered statistically significant P <0.05 for two-tailed tests. The results show that the IF of neutrophils (but not of monocytes) in the Trained group was significantly higher (! <0.001, effect size, (") = 0.90, 95% CI: [0.75-1.04]) compared to that in Sedentary group. In contrast, the microbicidal activity of phagocytic cells was not significantly influenced by RT. Also, total energy and carbohydrate intake, as well as serum levels of IL-6, had a significant influence on the phagocytic activity of neutrophils (! = 0.04), being considered in the model. Multivariate regression identified the physical condition of the subject (β = 0.425; ! = 0.01) as a significant predictor of the IF. In conclusion, the circulating neutrophils of elderly women who had TR showed higher phagocytic activity, whereas microbicidal activity did not present a statistically significant difference between groups, demonstrating a positive effect of RT in the first line of defense of the organism. / As projeções do aumento nos números absoluto e relativo de idosos representa novos desafios para a saúde pública. O envelhecimento vem acompanhado declínio gradual das funções fisiológicas, da função imunológica e da força muscular. Dessa forma, idosos são mais susceptíveis a sarcopenia, osteoporose, câncer e doenças cardiovasculares, metabólicas e neurodegenerativas. O Treinamento Resistido (TR) tem se mostrado importante intervenção para aumento da força muscular e diminuição da inflamação crônica em idosos. No entanto, pouco se conhece a respeito da influência do TR na resposta funcional de células que constituem a primeira linha de defesa durante a imunossenescência. Nesse sentido, o presente estudo buscou investigar a associação entre adaptações induzidas por um programa de TR e a resposta funcional de fagócitos circulantes em idosas. O presente estudo de caráter transversal, foi composto por 54 idosas com idade 71.3 ± 6.3 anos, aparentemente saudáveis, não institucionalizadas e divididas em dois grupos distintos: Treinadas (n=28) e Sedentárias (n=26). As idosas do grupo Treinadas eram participantes de um programa de TR há 8,6 ± 0,3 meses e realizaram um treino composto por 12 exercícios, 3 sessões semanais, com intensidade de 70% de uma repetição máxima, enquanto o grupo Sedentárias não participou de nenhum programa de atividades físicas durante o mesmo período. Avaliou-se a massa corporal, estatura, índice de massa corporal, relação cintura-quadril, massa livre de gordura e massa gorda. Foi avaliado o consumo de energia total e de macronutrientes na dieta habitual. Foram realizadas análises de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 6 (IL-6) e Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1), contagem total e diferencial de leucócitos, teste de fagocitose por monócitos ou neutrófilos, índice de fagocitose (IF) e atividade microbicida de fagócitos. A análise dos dados foi realizada por meio do programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) e considerado P < 0.05 estatisticamente significante para testes bicaudais. Os resultados demonstram que o IF de neutrófilos, mas não de monócitos, no grupo Treinadas foi significativamente maior (! <0,001; tamanho do efeito, (") = 0,90, IC 95%: [0,75–1,04]) em comparação com o grupo Sedentárias. Em contraste, a atividade microbicida das células fagocítica não foi influenciada significativamente pelo TR. Além disso, a ingestão total de energia e carboidratos, bem como os níveis séricos de IL-6, tiveram influência significativa na atividade fagocítica dos neutrófilos (! = 0,04), sendo considerados no modelo. Em conclusão, os neutrófilos circulantes de mulheres idosas que praticaram TR expressaram maior atividade fagocitária, enquanto atividade microbicida não apresentou diferença estatisticamente significante entre grupos, demonstrando efeito positivo do TR na primeira linha de defesa do organismo.

A aquicultura sofre diferentes pressões por um lado o impacto que as doenças causam na produção, e por outro a pressão por parte de grupos ambientalistas e do governo devido ao impacto ambiental. Diferentes soluções foram propostas para esses problemas como probióticos e imunoestimulantes para prevenir e controlar doenças com nenhum ou algum sucesso. Outra opção seria o biofloco para minimizar o impacto ambiental, com excelentes resultados zootécnicos. Porém não sabemos se o sistema de biofloco estimula ou inibe o sistema imune de camarões (Litopenaeus vannamei). Esse é o objetivo desse estudo, saber se o sistema de biofloco altera a contagem total e diferencial de hemócitos, os índices fagocíticos, utilizando ensaio de fagocitose in vitro com Sacaromises cerevisae e a produção de ânion superóxido pelo ensaio de Nitroblue tetrazolium (NBT). Na contagem total de hemócitos nos 2 primeiros meses os animais criados em água clara possuem uma contagem maior que os criados em biofloco enquanto que no 4° mês os animais de biofloco possuem uma contagem maior. Na contagem diferencial no 4°mês as células hialinas estão em maior porcentagem nos animais criados em biofloco enquanto que as granulares e simi-granulares estão em menor porcentagem nesses animais, quando comparamos com os animais criados em água clara. Os índices fagocíticos e a produção de ânion superóxido não apresentam diferença entre os animais criados em água clara e os criados em biofloco. / The aquaculture production suffers different pressure in one hand disease, and in the other its environment impact. Different solutions are offered to solve this problems such as probiotics and immunostimulant to prevent and control the diseases with some or no success. Another option is the biofloc to minimize its environmental impact, with excellent results to zootechincal characteristics. But it is not known whether biofloc stimulate or inhibits the shrimp (Litopenaeus vannamei) immune system. That is what our study aim to answer if the biofloc system affects or not the total and differential hemocytes count, the phagocityc indexes of in vitro phagocytosis with Sacaromises cerevisae and the production of superoxide anion with the Nitroblue Tetrazolium (NBT) assay. At the first 2 month the animal rare in clear water had a higher total hemocyte count, while it was higher in the animals rare in the biofloc at the 4th month. At the 4th month the hyalines cells had a higher concentration in animals rare at biofloc system, while the granular and semi-granular cells had a lower concentration in this animals when compared with the ones rare at the clear water system. The phagocityc indexes and the production of superoxide anion did not have any difference between animals rare at clear water system and biofloc system.

A citometria de fluxo é um método preciso, rápido e eficaz na avaliação de múltiplos parâmetros celulares, tanto estruturais como funcionais, propiciando a separação e o estudo de diferentes populações e sub-populações de células. No presente estudo, foram empregados métodos citométricos para caracterização dos diferentes tipos celulares sangüíneos de Centropomus parallelus, assim como para verificação da viabilidade celular, avaliação da atividade fagocítica e ativação do burst respiratório. Foram identificadas três sub-populações representativas de leucócitos: linfócitos, monócitos e trombócitos. Estas células foram estimuladas, in vitro, com Staphylococcus aureus, marcado com iodeto de propídeo (SAPI), lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS) e zymosan, partículas de Saccharomyces cerevisiae. As respostas frente aos estímulos foram distintas de acordo com o tipo celular e o estímulo apresentado. Os monócitos apresentaram maiores percentuais de fagocitose frente ao estímulo provocado pela SAPI e pelo Zymosan; já a população que continha trombócitos entre outros tipos celulares (por exemplo: linfócitos), apresentou \"fagocitose\" significativa apenas para SAPI. O burst oxidativo detectado pela fluorescência emitida pelo diacetato 2´7´diclorofluoresceína (DCFH) foi significativo apenas quando estimulado com PMA (miristato-acetato de forbol), não apresentando resposta estatisticamente significante para os estímulos SAPI e LPS. Após a exposição ao naftaleno nas concentrações 10-3, 10-6, 10-9 M durante quatro horas, in vitro, houve um aumento na fagocitose realizado pelos monócitos e trombócitos, porém uma diminuição no burst oxidativo apresentado nas concentrações 10-6 e 10-9 M de naftaleno. Este resultado reflete, in vitro, uma resposta ao contaminante com significado imunológico desfavorável para o peixe, já que as células estão aumentando a atividade fagocítica sem conseguirem, teoricamente, destruir o agente invasor. A partir desses resultados preliminares, podemos avaliar melhor, algumas características da resposta imune inata desta espécie de peixe, presente na costa litorânea brasileira. Estes parâmetros imunofisiológicos podem servir como base para futuros estudos ecotoxicológicos tanto em laboratório mas também a campo. Estudos que utilizam a imunidade inata como indicador biológico de alterações ambientais causadas por poluentes diversos, podem evidenciar o grau de impacto toxicológico sobre esta espécie e agregar valor a sua importância econômica e ecológica. / Flow cytometry is a precise, fast, and effective method for the evaluation of several cellular parameters, both structural and functional, allowing the sorting and analysis of particular populations and sub-populations of cells. In this study, we employed cytometric methods on the caractherization of different blood cell types from Centropomus parallelus, and also verified cell viability, phagocytic activity and oxidative burst in these cells. Three sub-populations were identified: lymphocytes, monocytes, and trombocytes. These cells were stimulated in vitro with propidium iodide-conjugated Staphylococcus aureus (SAPI), Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS), or zymosan (Saccharomyces cerevisae particles). Responses to each individual stimulus differed according to cell type. Monocytes displayed the higher percentages of phagocytosis in presence of SAPI or zymosan; on the other hand, the population that included trombocytes, among other cell types (such as lymphocytes) only performed phagocytosis in a relevant level in the presence of SAPI. The oxidative burst, detected by fluorescence emitted by 2´7´dichlorofluorescein diacetate (DCFH) was significant only after stimulation with PMA (phorbol myristate-acetate), but not when the stimulus was SAPI or LPS. Based on these preliminary results, the innate immune response in these animals (ubiquitous coastal waters of the Brazilian shore) can be further evaluated. Immunophysiological parameters in these species can build a solid ground for future ecotoxicological studies. Approaching innate immunity as a biological indicator of environmental changes induced by pollutants may support the degree of toxicological impact over these animals, and aggregate value to its current ecological and economical importance.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-09T11:38:28Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Anielle Carvalho Bandeira - 2016.pdf: 3728087 bytes, checksum: 11425e90569d00c562e5046dfd39fd10 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-09T12:50:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Anielle Carvalho Bandeira - 2016.pdf: 3728087 bytes, checksum: 11425e90569d00c562e5046dfd39fd10 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-09T12:50:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Anielle Carvalho Bandeira - 2016.pdf: 3728087 bytes, checksum: 11425e90569d00c562e5046dfd39fd10 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-09-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Nanotechnology involves the creation and use of materials, devices and systems through control of matter on the manometer scale. It has positive impact on medicine involving the treatment and diagnosis. Drug delivery systems prepared with nanostructures have the ability to overcome biological barriers and optimizing drug release. However, one of the main challenges in the use of these systems is their internalization by macrophages. This study aims to prepare and characterize polymer nanoparticles formed by biodegradable polymers and investigate its impact on the function of macrophages in vitro by the observation of cell viability, phagocytic activity and cytokine production. Also, was investigate the cytokine profile in serum and splenocytes culture supernatant from Balb/C mice injected with chitosan nanoparticles. The chitosan and chitosan-containing magnetic nanoparticles were prepared by ionic gelation crosslinking, resulting in a morphology "nearly spherical" and positive zeta potential. The PLGA prepared by emulsification and solvent evaporation method presented spherical morphology and negative zeta potential. All preparations had a diameter smaller than 300 nanometers and polydispersity index lower than 0.5. Nanoparticles of chitosan and PLGA affected the viability of macrophages in vitro only at the highest concentration tested (4 mg/mL). The chitosan nanoparticles containing magnetic nanoparticles were internalized by macrophages after 4h and 24h of incubation. Different nanoparticles triggered high production of TNF- and low IL12p40 production and IL-10. Serum and splenocytes culture supernatant was observed in both the production of IFN- as IL-4. However, IL-4 production was higher than that of IFN-. / A nanotecnologia envolve a criação e utilização de materiais, dispositivos e sistemas através do controle da matéria na escala manométrica. Apresenta impactos positivos na medicina que envolve desde o diagnóstico ao tratamento de doenças. Sistemas de entrega de fármacos apresentam a capacidade de superar barreiras biológicas e otimizar a liberação de um fármaco. No entanto, um dos principais desafios na utilização desses sistemas é a sua internalização pelos macrófagos. Esse estudo objetiva preparar e caracterizar nanopartículas poliméricas formadas por polímeros biodegradáveis e investigar o seu impacto na função dosmacrófagos in vitro através da observação da viabilidade celular, atividade fagocítica e produção de citocinas. Além do perfil de citocinas no soro e sobrenadante de cultura de esplenócitos provenientes de camundongos Balb/C que foram injetados com uma suspensão de nanopartículas de quitosana. As nanopartículas de quitosana e quitosana contendo magnéticas foram preparadas por gelificação iônica apresentando morfologia reticular e “quase esférica”, respectivamente, e potencial zeta positivo. As de PLGA preparadas por emulsificação e evaporação do solvente apresentaram morfologia esférica e potencial zeta negativo. Todas apresentaram diâmetro menor que 300 nanômetros e índice de polidispersão menor que 0,5. As nanopartículas de quitosana e de PLGA afetaram a viabilidade de macrófagos in vitro apenas na maior concentração testada (4mg/mL). As nanopartículas de quitosana contendo magnética foram internalizadas pelos macrófagos em 4h e 24h de incubação. As diferentes nanopartículas desencadearam a produção elevada de TNF- e baixa produção de IL12p40 e IL-10. No soro e no sobrenadante da cultura de esplenócitos foi observada tanto a produção de INF- quanto de IL-4. No entanto, a produção de IL-4 foi maior que a de IFN-.

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-14T17:40:15Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Isabella Inês Rodrigues Rosa - 2016.pdf: 1910068 bytes, checksum: 8f551746fe8c21347507aecf98f02609 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2016-09-14T17:41:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Isabella Inês Rodrigues Rosa - 2016.pdf: 1910068 bytes, checksum: 8f551746fe8c21347507aecf98f02609 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-14T17:41:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Isabella Inês Rodrigues Rosa - 2016.pdf: 1910068 bytes, checksum: 8f551746fe8c21347507aecf98f02609 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Staphylococcus saprophyticus is a pathogenic bacterium of the urinary tract and the main etiological agent of urinary tract infections by Gram-positive bacteria. Although S. saprophyticus potentially can cause serious infections such as pyelonephritis, septicemia, endocarditis and nephrolithiasis, and also multidrug resistance has been reported, not much is known about the mechanisms used by this bacterium during infection. Secreted proteins might be essential on those mechanisms if their role is accomplished during phagocytosis by their assistance of an active infection in phagocytic cells, protecting against oxidative stress and increasing the persistence of bacterial cells within phagocytes, and / or causing lysis of the host cell. Recently our group identified the immunogenic protein SsaA in the secretome of S. saprophyticus. This protein had been previously identified in S. aureus proteome, and it appears to be controlled by regulatory systems for known virulence factors. It also presents similarities with lytic proteins and proteins that assist the persistence within phagocytic cells. However, no approach had analyzed the contribution of SsaA during infection, therefore, through the construction a cloning vector containing the S. saprophyticus gene ssaA, heterologous expression of the recombinant protein and the production of specific polyclonal antibodies, it was able to verify the interaction of SsaA and proteins from macrophages infected by bacterial cells. Through immunofluorescence microscopy, it was verified that the dispersion of SsaA is not limited to phagocytic cells but it was throughout their cytoplasm after internalization of the bacterium. These findings together with other evidence in the literature suggest that SsaA is used during infection by S. saprophyticus, more specifically during phagocytosis. Further approaches are required to confirm if SsaA has a lytic activity and also characterize this protein as a virulence factor, contributing to elucidate strategies used by S. saprophyticus during infection in the human host. / Staphylococcus saprophyticus é uma bactéria patogênica do trato urinário e principal agente etiológico de infecções urinárias por bactérias Gram-positivas. Apesar de potencialmente S. saprophyticus ocasionar infecções graves como pielonefrite, septicemia, nefrolitíase e endocardite, e relatos de multirresistência a antibióticos, relativamente pouco é conhecido sobre os mecanismos utilizados por esta bactéria durante infecção. Proteínas secretadas podem ser essenciais nesses mecanismos se seus papéis forem durante fagocitose auxiliando uma internalização ativa na célula fagocítica, protegendo contra o estresse oxidativo e aumentando a persistência de células bacterianas no interior de fagócitos, e/ou causando lise da célula hospedeira. Recentemente nosso grupo identificou a proteína imunogênica SsaA no secretoma de S. saprophyticus. Essa proteína já havia sido identificada em S. aureus como altamente imunogênica, e parece estar relacionada a fatores de virulência como o Antígeno Imunodominante A (IsaA), a proteína Urease, a hidrolase de peptideoglicano LytM, a Proteína Repressora de Toxinas (Rot) e a proteína de choque térmico HslU. Contudo, poucos estudos conseguem identificar a proteína SsaA secretada e nenhum analisa sua contribuição durante infecção por bactérias do gênero Staphylococcus. Através da construção de um vetor de clonagem contendo o gene ssaA de S. saprophyticus, expressão heteróloga da proteína recombinante e produção de anticorpos policlonais específicos, foi possível verificar a interação entre SsaA e proteínas de macrófagos infectados por células de S. saprophyticus. Através de microscopia de imunofluorescência, foi verificado que a secreção de SsaA não é limitada à fagossomos, mas esta proteína é dispersa em todo o citoplasma da célula fagocítica após internalização de células bacterianas. Os resultados encontrados sugerem que SsaA é utilizada por S. saprophyticus durante infecção, especificamente durante fagocitose. Estudos posteriores serão necessários para confirmar se SsaA possui atividade lítica e caracteriza-la como fator de virulência, contribuindo para elucidar estratégias utilizadas por S. saprophyticus durante infecção no hospedeiro humano.

A hidroquinona (HQ) é um composto fenólico de origem natural ou antropogênica, encontrada em grandes concentrações no cigarro, além de ser produto da biotransformação do benzeno. Nosso grupo de pesquisa tem demonstrado que a exposição à HQ compromete a resposta inflamatória in vivo. Dando continuidade a estas investigações, este trabalho visou investigar os efeitos da exposição in vivo à HQ sobre funções do tecido traqueal e atividades de macrófagos alveolares. Para tanto, camundongos Swiss machos foram expostos à HQ 25ppm (1,5mg/60mL/1h; 5 dias) ou veículo (solução salina etanol 1:20) por via sistêmica (nebulização). Concentrações de mediadores inflamatórios (interleucina (IL) 1&#946;, IL-6, IL-10, IL-4, IL-12 fator de necrose tumoral-&#945; (TNF-&#945;) ou proteína quimiotáxica de monócitos (MCP-1); ensaio imunoenzimático (ELISA) e óxido nítrico (NO; reação de Griess) foram quantificados no lavado bronco-alveolar (LBA) em condições basais ou 3 horas após estímulo inflamatório (LPS in vivo; 100µL/mL; 10min) e no sobrenadante de macrófagos (M&#934;s) alveolares ou de cultura da traquéia obtidos dos animais e posteriormente estimulados in vitro (M&#934;s: 5µg/mL de LPS + 10ng/mL de IFN-&#947;; traquéia: 1µg/mL de LPS; 24h). Atividades fagocítica e fungicida (microscopia óptica) e a expressão de receptores envolvidos na fagocitose toll-like receptor (TLR, TLR-2, TLR4 e dectina-1; citometria de fluxo) foram determinadas após incubação in vitro de M&#934;s alveolares com o fungo Candida albicans e a expressão protéica de MyD88 foi realizada em M&#934;s alveolares (western blot). Quantificação do RNAm para MCP-1 (reação da transcriptase reversa em cadeia de polimerase, RT-PCR) foi realizada em tecido traqueal e células de linhagem monocítica humana THP-1 foram empregadas em ensaios de quimiotaxia in vitro (Câmara de Boyden) frente a diferentes concentrações de MCP-1. Reatividade do tecido traqueal foi quantificada frente à metacolina. Os resultados obtidos mostraram que a exposição in vivo à HQ reduziu a concentração de MCP-1 (54,98% vs. controle LPS) e IL-12 (51,45% vs. controle LPS) no LBA após inflamação; reduziu a secreção de MCP-1 por M&#934;s (basal: 87,96%; LPS+INF-&#947;: 61,20%) e tecido traqueal em cultura (79,77% vs. controle LPS). Neste último tecido, a diminuição foi dependente da menor expressão gênica. Concentrações de MCP-1 semelhantes à detectada no sobrenadante de cultura de traquéia de animais expostos à HQ induziram migração de células THP-1 menor (38,2%) que à provocada pela concentração de MCP-1 no sobrenadante da cultura traquéia de animais controles. Traquéias de animais expostos à HQ apresentaram hiperreatividade (193,48%), a qual foi revertida pela remoção do epitélio traqueal. Adicionalmente, cultura de M&#934;s obtidos de animais expostos à HQ apresentaram maior atividade fagocítica (porcentagem de fagocitose: 36,30%; índice de fagocitose: 83,97%) e fungicida (68,47%), que não foram dependentes de alterações nos receptores TLR2, TLR4 e dectina-1, mas podem ser decorrentes da menor expressão protéica de MyD88. Em conjunto, os dados obtidos apontam para alterações importantes resultantes da exposição in vivo à HQ sobre funções de M&#934;s alveolares e do tecido traqueal que, em conjunto, podem ser determinantes para a toxicidade observada nestes animais que culmina com prejuízo na defesa do organismo. / Hydroquinone (HQ) is a phenolic compound of natural or anthropogenic source, also found in high concentrations in cigarette, as well as benzene´s metabolite. Our research group has demonstrated that exposure to HQ impairs in vivo inflammatory response. Following these investigations, this work aimed to study the effects of in vivo exposure to HQ on tracheal tissue and alveolar macrophages (M&#934;s) activities. For this purpose, male Swiss mice were systemically (aerolised) exposed to 25ppm HQ (1.5 mg/60mL/1h; 5 days) or vehicle (saline ethanol solution, 1:20). Concentrations of inflammatory mediators (interleukin (IL) IL-1&#946;, IL- 6, IL-10, IL-4, IL-12 tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945; ) or monocyte chemoattractant protein (MCP-1); (enzyme immune assay, ELISA)) and nitric oxide (NO; Griess reaction) were quantified in bronchoalveolar lavage (BAL) at baseline or 3 hours after inflammatory stimulus (in vivo LPS, 100&#181;L/mL; 10min); in the supernatant of cultured alveolar macrophages (M&#934;s) or trachea obtained from animals and subsequently in vitro stimulated (M&#934;s: 5&#181;g/mL of LPS plus 10ng/mL IFN-&#947;; trachea: 1&#181;g/mL LPS; 24 hours). Phagocytic and fungicidal activities (light microscopy) and expression of receptors involved in phagocytosis (toll-like receptor (TLR, TLR2, TLR4 and dectin-1, flow cytometry) were determined after in vitro incubation of alveolar M&#934;s with Candida albicans fungus and expression of MyD88 pathway was held in alveolar M&#934;s (western blot). Quantification of mRNA for MCP-1 (reaction of reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) was performed in tracheal tissue and cells human monocytic THP-1 were used in in vitro chemotaxis assays (Boyden chamber) using different concentrations of MCP-1. Tracheal reactivity was measured in response to methacholine. The results showed that in vivo HQ exposure reduced the concentration of MCP-1 (54.98% vs. control) and IL-12 (51.45% vs. control) in the BAL after inflammation; decreased secretion of MCP-1 by M&#934;s (basal: 87.96%, LPS+INF-&#947;: 61.20%) and in tracheal culture after LPS stimulation (79.77% vs. control). In the latter tissue, the MCP-1 protein content was dependent on impaired gene expression. Concentrations of MCP-1 similar to those detected in the supernatant of tracheal from HQ exposed rats induced smaller migration of THP-1 cells (38.2%) than that evoked by the MCP-1 concentration obtained in trachea supernatants collected from control animals. Tracheas from HQ exposed rats showed hyper reactivity (193.48%), which was reversed by removal of the tracheal epithelium. Additionally, culture of M&#934;s obtained from HQ exposed rats showed increased phagocytic (percentage of phagocytosis: 36.30%; phagocytosis index: 83.97%) and fungicide activity (68.47%), which were not dependent on changes in the receptors TLR2, TLR4 and dectin-1, but could be due to reduced MyD88 expression. Together, these data point out important alterations on M&#934;s and trachea after in vivo HQ exposure, which may be crucial for the toxicity observed in these animals that culminates with impaired host defense.

Estudos anteriores demonstraram que o veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) apresenta ação antiinflamatória prolongada, bem como inibe o espraiamento e a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais, sendo a crotoxina (CTX), o principal componente do VCdt, a responsável por esses efeitos. Em relação aos neutrófilos, demonstrou-se que o VCdt inibe, in vitro e in vivo, a fagocitose por essas células, porém o componente do VCdt responsável por esse efeito não foi identificado. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar o componente responsável pelo efeito inibitório do VCdt sobre a fagocitose por neutrófilos, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos nessa ação. Além disso, foi também objetivo desse estudo investigar o efeito do VCdt e da CTX sobre a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. Inicialmente, foi avaliado o efeito in vitro dos três picos do VCdt, obtidos durante a purificação da CTX (pico I; pico II, que corresponde a CTX, e pico III), sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. A incubação dos neutrófilos com a CTX ou com os picos I ou III, em diferentes concentrações (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), mostrou que somente o pico II inibiu essa atividade, demonstrando que a CTX é o componente do VCdt responsável pelo seu efeito inibitório sobre a fagocitose por neutrófilos. Uma vez realizada essa identificação, foi investigado o efeito in vivo da CTX sobre essa função. O tratamento dos animais com a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes ou 1 hora após a administração de carragenina inibiu a fagocitose por neutrófilos, o que demonstra que esta toxina, além do efeito direto, apresenta efeito sistêmico sobre a atividade fagocítica dessas células. Esses resultados mostraram também que a CTX apresenta efeito inibitório prolongado sobre a atividade fagocítica de neutrófilos. Ainda, com o objetivo de elucidar os possíveis mecanismos envolvidos nesse efeito inibitório foram realizados ensaios imunocitoquímicos para avaliar a reorganização do citoesqueleto. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,5 ug/mL) ou com a CTX (0,08 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, inibiram a fosforilação de resíduos de tirosina e a polimerização da actina. Em relação ao efeito do VCdt e da CTX sobre outra função dos neutrófilos, foi investigado, em ensaios in vitro e in vivo, a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por essas células. A incubação dos neutrófilos com o VCdt (0,125; 0,25; 0,5; 1,0 ou 2,0 ug/mL) ou a CTX (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 ou 0,32 ug/mL), bem como o tratamento dos animais com o VCdt (0,18 mg/kg) ou a CTX (0,1 mg/kg), 2 horas antes da administração de carragenina, não alteraram a atividade microbicida e a produção de ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Em conclusão, a CTX é o componente do VCdt responsável por inibir a fagocitose por neutrófilos e um dos mecanismos envolvidos neste efeito é a inibição da fosforilação de proteínas sinalizadoras e a conseqüente polimerização de actina, importante evento para o início da formação do fagossoma e a completa internalização da partícula. Por outro lado, o VCdt e a CTX não alteram a atividade microbicida e a produção de espécies reativas do oxigênio por neutrófilos. Dessa forma, considerando-se o papel fundamental dessas células na inflamação, este estudo amplia os conhecimentos das ações moduladoras da CTX sobre a resposta inflamatória e, ainda, contribui para a elucidação dos mecanismos envolvidos nestas ações, particularmente, a inibição do processo de fagocitose por neutrófilos. / Previous studies showed that Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) has long-lasting anti-inflammatory properties and inhibits the spreading and the phagocytic activity of peritoneal macrophages. Crotoxin (CTX), the main component of CdtV, is responsible for these effects. In addition, CdtV inhibits, in vitro and in vivo, the phagocytic activity of neutrophils, but the component of the venom responsible for this effect was not identified. In this way, the aim of this study was to investigate the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils, as well as to investigate possible mechanisms involved on this effect. Besides, the aim of this study was also to investigate the effect of CdtV and CTX on the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. Initialy, it was avaliated the in vitro effect of the three peaks of CdtV, obtained during CTX purification (peak I, peak II that corresponds to CTX and peak III), on phagocytosis by neutrophils. The incubation of the cells with CTX, peak I or peak III, at different concentrations (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), showed that just peak II inhibited this activity, so CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils. Once realized this identification, it was investigated the in vivo effect of CTX on the same neutrophil function. Treating animals with CTX (0.1 mg/kg), 2 hours, 1, 4 or 14 days before or 1 hour after the administration of carrageenan inhibited the phagocytic activity of neutrophils, which demonstrates that this toxin, in addition to the direct effect, has systemic effect on phagocytosis by neutrophils. These results also show that CTX has a long-lasting inhibitory effect on the phagocytic activity of these cells. Further, to elucidate possible mechanisms involved on this inhibitoty effect, immunocytochemical assays was realized to evaluate the reorganization of the cytoskeleton. The incubation of the neutrophils with CdtV (0.5 ug/mL) or CTX (0.08 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carrageenan injection, inhibited the phosphorilation of tyrosine residues and actin polymerization. Regarding the effect of CdtV and CTX in other neutrophil function, it was investigated, in vitro and in vivo, the microbicidal activity and the production of reactive oxygen species by neutrophils. The incubation of the cells with CdtV (0.125, 0.25, 0.5, 1.0 or 2.0 ug/mL) or CTX (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 or 0.32 ug/mL), as well as the treatment of the animals with CdtV (0.18 mg/kg) or CTX (0.1 mg/kg), 2 hours before the carragennan injection, did not alter the microbicidal activity or the production of superoxide, hydrogen peroxide and hypochlorous acid. In conclusion, CTX is the CdtV component responsible for the inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils and a mechanism involved on this effect is the inhibition of phosphorilation of signaling proteins and the consequent actin polymerization, an important event for the phagosome formation and the complete internalization of the particle. On the other hand, CdtV and CTX did not alter the microbicidal activity or the production of reactive oxygen species. Thus, considering the essential role of these cells in inflammation, this study extends the knowledge of the actions of CTX on modulating the inflammatory response and also contributes to the elucidation of the mechanisms involved in these actions, particularly the inhibition of phagocytosis by neutrophils.

O aquecimento global é uma realidade e seus efeitos são bastante estudados atualmente. No entanto, pouca atenção tem-se dado para as alterações que ocorrem com invertebrados marinhos em decorrência dessa alteração climática. Sabe-se que uma das alterações que ocorrem em consequência do aumento da temperatura da água do mar, é o aumento do aparecimento de doenças no ambiente marinho. Para tanto, é importante que se avalie sua resposta imune inata frente a esse fator estressor. Os ouriços-do-mar foram escolhidos como modelo por serem considerados bons biondicadores ambientais, além de serem filogeneticamente próximos aos cordados, partilhando com estes, amplo repertório de genes e receptores envolvidos no sistema imune inato. O presente trabalho avaliou a resposta imune inata de ouriços-do-mar antárticos (S. neumayeri) e tropicais (L. variegatus e E. lucunter) frente ao estresse térmico por diferentes temperaturas e períodos de exposição. No que se refere aos ouriços-do-mar tropicais, foram estudadas duas espécies, uma que habita regiões menos submetidas a variações de marés (L. variegatus) e outra constantemente exposta a variações de maré (E. lucunter). Constatou-se uma diferença entre a resposta ao estresse térmico nas três espécies estudadas. A espécie antártica demonstrou alterações mais significativas de aumento na porcentagem de esferulócitos vermelhos (EV) e da capacidade fagocítica no período agudo de exposição (24h) quando submetidos a temperaturas intermediárias. Por outro lado, a espécie tropical E. lucunter apresentou alteração somente na porcentagem de EV no período de exposição crônico (7 e 14 dias) a temperaturas altas, enquanto que L. variegatus apresentou alteração neste tipo celular em todas as temperaturas experimentais e períodos avaliados, além de uma importante redução da capacidade fagocítica nos mesmos períodos que foi diretamente proporcional ao aumento da temperatura. Buscando compreender tais diferenças entre animais que habitam uma mesma região, verificou-se que a espécie L. variegatus apresentou alteração na adesão e espraiamento celular, no citoesqueleto de actina dos amebócitos fagocíticos (AF), na migração celular sem adição de substância quimiotática e na resposta quimiotática frente a leveduras S. cerevisiae, além de diminuição do estresse oxidativo em elevadas temperaturas. Constatou-se também que os AF desta espécie apresentaram alterações morfométricas importantes, como diminuição na circunferência celular e alteração na área de espraiamento. Por outro lado, a espécie E. lucunter não apresentou alteração em nenhum parâmetro analisado. Conclui-se, assim, que o estresse térmico atua de maneiras diferentes em espécies polares e tropicais de ouriços-do-mar. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a espécie E. lucunter apresenta maior termotolerância em comparação à espécie L. variegatus permanecem imcompreendidos e merecem ser estudados. / Global warming is a reality and its effects are widely studied today. However, little attention has been given to the changes that occur to marine invertebrates due to this climate change. It is known that one of the changes that occur as a result of the seawater temperature rise is the increased occurrence of diseases in the marine environment. Therefore, it is important to evaluate the innate immune response against this stressor. The sea urchins were chosen as a model for being considered good environmental bioindicators, and are phylogenetically close to chordates, sharing with them large repertoire of genes and receptors involved in the innate immune system. This study evaluated the innate immune response of Antarctic (S. neumayeri) and tropical (L. variegatus and E. lucunter) sea urchins against thermal stress by different temperatures and exposure periods. With regard to tropical sea urchins, two species, one that inhabits sites less subject to tidal variations (L. variegatus) and the other constantly exposed to tidal oscilations (E. lucunter) were studied. A difference between the response to thermal stress in the three species was observed. The Antarctic species showed more significant changes regarding increase of the percentage of red spherule cells and phagocytic capacity in acute exposure period (24 h) when subjected to mild temperatures. On the other hand, tropical species E. lucunter presented only change in the percentage of red spherule cells during chronic exposure (7 and 14 days) at extreme temperatures, while L. variegatus showed a change in this cell type in all experimental temperatures and exposure periods evaluated, as well as a significant reduction in phagocytic capacity in the same periods that was directly proportional to the temperature increase. Trying to understand the differences between animals that inhabit the same region , it was found that the species L. variegatus showed changes in cell adhesion and spreading, actin cytoskeleton of phagocytic amoebocytes, cell migration without the addition of chemotactic substance and chemotactic response against yeasts S. cerevisiae, besides a reduction of oxidative stress at elevated temperatures. It was also found that the phagocytic amoebocyte of this species showed significant morphological changes, such as reduction in cell circunference and change in the area of spreading. On the other hand, the species E. lucunter presented no change in any parameter analyzed. Thus, it is concluded that the thermal stress acts differently in polar and tropical species of sea urchins. However, the molecular mechanisms by which the species E. lucunter shows higher thermotolerance compared to the species L. variegatus remain obscure and deserve to be studied.