Orientador: Marcos Nogueira Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Steola_MarcosPaulo_M.pdf: 3243022 bytes, checksum: 9b7450eb5a75ce0b22ccba84584755de (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A utilização da espectrometria de massas como ferramenta de quantificação de moléculas em matrizes biológicas complexas vem sendo difundida durante os últimos anos, devido ao sua versatilidade, facilidade no preparo das amostras, alta sensibilidade e rapidez na quantificação. A utilização da cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas uniu o poder de separação da cromatografia líquida com o poder de identificação da espectrometria de massas, proporcionando corridas analíticas mais rápidas e menores limites de detecção. O presente trabalho teve como objetivo validar metodologia para a quantificação de 5 hormônios esteroides (estradiol, cortisol, testosterona, progesterona e androstenediona) em plasma e 2 hormônios esteroides ( estradiol e progesterona) em fluído folicular bovino, utilizando-se cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas, para uso na quantificação de amostras provenientes de duas raças diferentes, Bós taurus e Bós indicus, principais constituintes do rebanho brasileiro, submetidas a duas dietas diferentes. Devido à dificuldade de encontrar matrizes biológicas isentas de hormônios esteroides optou-se pelo uso da técnica de diluição isotópica na validação da metodologia, técnica em que o sinal do hormônio a ser analisado é comparado com seu análogo deuterado, minimizando o efeito da matriz biológica. A metodologia desenvolvida e validada poderá ser utilizada na quantificação de hormônios em matrizes biológicas provenientes de outras raças bovinas, bem como ser aplicada para a quantificação de hormônios esteroides em plasma e fluído folicular em humanos / Abstract: The use of mass spectrometry and quantification of molecules in complex biological matrices tool has been widespread over the last years due to its versatility, ease of sample preparation , high sensitivity and fast quantification . The use of high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry attached the separation power of the liquid chromatography and identification mass spectrometry, giving analytical runs faster and lower detection limits. This study aims to validate the methodology for quantification of 5 steroid hormones ( estradiol , cortisol , testosterone , progesterone and androstenedione ) in plasma and 2 steroid hormones ( estradiol and progesterone ) in bovine follicular fluid , using liquid chromatography with mass spectrometry detector , for use in the quantification of samples from two different breeds , Bos taurus and Bos indicus , the main constituent of the Brazilian herd , subjected to two different diets . Due to the difficulty of finding in biological matrices free steroid hormones, we opted for the use of the isotope dilution technique to validate the methodology , a technique in which the signal of the hormone being examined is compared with its deuterated analogue, minimizing the effect of the biological matrix . The methodology developed and validated may be used in the quantification of hormones in biological matrices from other cattle breeds , as well as be applied to quantify steroid hormones in plasma and follicular fluid in humans / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Nitric oxide (NO) is an important regulator of ovarian activity, and is produced by a family of nitric oxide synthases (NOS), being inducible (iNOS) and endothelial (eNOS) isoforms present in the ovaries of several species. In cows, even though NO production had been demonstrated in follicular fluid and by granulosa cells (GC) cultured in vitro, it is not known which enzyme is responsible for NO synthesis or how expression is regulated during follicular development. The objectives of the present study were to determine the abundance of iNOS and eNOS mRNAs in dominant and subordinate follicles in vivo, to determine the regulation of iNOS expression by FSH, growth factors and estradiol (E2) in vitro, to stimulate NO production in bovine CG and to determine the action of iNOS on bovine granulosa cell health/apoptosis. The two largest follicles on days 1 to 5 of the first follicular wave of the cycle were collected from each pair of ovaries from six cows. Dominant follicles presented higher levels of mRNA for iNOS compared to subordinate follicles (P<0.01). GC cultures were performed with ovaries collected at abattoir. FSH (P<0.05) and IGF1 (P<0.01) stimulated E2 secretion and upregulated iNOS mRNA abundance in a dose-dependent manner. Moreover, both FGF2 (P<0.05) and EGF (P<0.01) decreased iNOS expression and E2 secretion in FSH and IGF-treated cells, respectively. Graded doses of FSH in the presence of a non-aromatizable androgen (DHT) did not stimulate iNOS mRNA level. In addition, both FSH and IGF1 in the presence of an estrogen receptor antagonist were not able to upregulate iNOS mRNA abundance, whereas E2 alone stimulated NO production in vitro. In terms of cell health/apoptosis, the treatment with an iNOS-selective inhibitor increased the pro-apoptotic factor FasL mRNA levels and the percentage of dead cells (P<0.05). In conclusion, bovine granulosa cells express predominantly iNOS, and increased iNOS mRNA levels are associated with emergence of the dominant follicle. FSH and IGF1 stimulate iNOS mRNA levels through increased E2 secretion, and physiological levels of NOS activity may contribute to growth and survival of bovine granulosa cells. / O óxido nítrico (NO) é um importante regulador da atividade ovariana que é produzido a partir da ação de uma família de enzimas denominadas sintases do óxido nítrico (NOS). As isoformas induzível (iNOS) e endotelial (eNOS) estão presentes nos ovários de diversas espécies. Em vacas, embora a produção de NO já tenha sido detectada no fluído folicular e também no meio de cultivo de células da granulosa (CG), não se sabe qual enzima é responsável pela síntese de NO nem como ocorre a regulação de sua expressão ao longo do desenvolvimento folicular. Os objetivos do presente estudo foram determinar a abundância de RNAm para iNOS e eNOS em CG provenientes de folículos dominantes e subordinados in vivo; determinar a regulação da expressão da iNOS por FSH, fatores de crescimento e estradiol (E2) in vitro; estimular a produção de NO e determinar a ação da iNOS na relação entre saúde e apoptose das CG bovina. Foram coletados os dois maiores folículos presentes em cada par de ovários de seis vacas entre os dias 1 e 5 da primeira onda folicular do ciclo estral. Folículos dominantes apresentaram níveis mais elevados de RNAm para iNOS comparados aos folículos subordinados (P<0.01). Cultivos de CG foram realizados com ovários coletados em abatedouro. Ambos FSH (P<0.05) e IGF1 (P<0.01) estimularam a secreção de E2 e a expressão de iNOS de maneira dose-dependente. Além disso, tanto FGF2 (P<0.05) como EGF (P<0.01) diminuiram a expressão de iNOS e a secreção de E2 em células tratadas com FSH e IGF1, respectivamente. Utilizando diferentes doses de FSH na presença de um andrógeno não-aromatizável (DHT), não foi possível estimular a expressão de iNOS. Ainda, tanto o FSH como o IGF1 não foram capazes de elevar a abundância de RNAm para iNOS na presença de um antagonista não seletivo dos receptores de E2, enquanto que, E2 sozinho estimulou a produção de NO em CG in vitro. No que diz respeito à relação saúde/apoptose das CG, o tratamento com um inibidor seletivo da iNOS aumentou os níveis de RNAm para o fator pró-apoptótico FasL e o percentual de células mortas (P<0.05). Concluindo, células da granulosa bovina expressam predominantemente iNOS, sendo que o aumento da expressão dessa isoforma está associado com a emergência do folículo dominante. FSH e IGF1 promovem o aumento dos níveis de RNAm para a iNOS através do estímulo da secreção de E2 e, níveis fisiológicos da atividade das NOS podem contribuir para o crescimento e sobrevivência das células da granulosa bovina.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-04T17:40:43Z No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-07T03:23:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T03:23:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sabinewohlresviana.pdf: 8250469 bytes, checksum: d5749466ebaf01dd23c74317cbef4a6a (MD5) Previous issue date: 2015-01-27 / O objetivo geral deste estudo foi investigar variações genômicas e transcriptômicas do receptor de hormônio luteinizante (LHR) e seu papel nos processos de dominância folicular e resposta à superovulação em bovinos. Foram realizados três experimentos, sendo que em todos se utilizou cDNA sintetizado a partir do RNA total extraído de células da granulosa (CG) folicular. Para a caracterização do transcrito do LHR, CG foram recuperadas de folículos dominantes de vacas das raças Gir (n=16) e Holandês (n=16). Após a PCR e o sequenciamento, os dados foram analisados para a presença de polimorfismos, frequência alélica, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). Vinte e um polimorfismos de base única (SNPs) foram identificados, sendo 17 em Gir e 14 em Holandês. A classificação dos SNPs de acordo com os valores de PIC identificou 12 como altamente informativos em Gir e cinco em Holandês. Em relação a HWE, oito SNPs não estavam em equilíbrio em Gir e 10 em Holandês. Duas isoformas derivadas de splicing alternativo também foram identificadas, uma no éxon 1 e outra no éxon 10. Conclui-se que o LHR em bovinos leiteiros apresenta uma alta frequência de polimorfismos e múltiplas isoformas. Para avaliar o papel das isoformas do LHR nas CG durante a divergência folicular, a emergência da onda folicular foi sincronizada em novilhas Gir (n=10) e Holandês (n=10) e os folículos foram aspirados individualmente em diâmetros correspondentes aos períodos de pré-divergência, divergência, e pós-divergência. A expressão relativa das isoformas de LHR foi determinada por PCR em Tempo Real e os resultados foram relacionados com as concentrações intrafoliculares de estradiol (E2if). Em ambas as raças, houve um aumento progressivo na concentração de E2if ao longo do desenvolvimento folicular. O E2if foi maior em Holandês quando comparado com Gir antes, durante, e depois da divergência; mas foi similar em folículos de mesmo diâmetro nas duas raças. Observou-se um pico de expressão de LHR total após o início da divergência folicular. A expressão das isoformas de LHR foi ou baixa (Holandês) ou sub-regulada (Gir) durante este mesmo período. Os resultados sugerem que a divergência precoce do folículo dominante em raças de Bos indicus podem estar relacionados à maior sensibilidade ao feedback negativo do estradiol. Além disso, mudanças sequenciais na expressão das isoformas de LHR podem regular a função do LHR durante da divergência folicular em bovinos. A avaliação do comportamento das isoformas de LHR durante a indução exógena do crescimento folicular foi realizada em novilhas Gir caracterizadas com boa (n=5) ou má (n=5) resposta à superovulação. Em ambos os grupos, foram coletadas CG de folículos (8 mm) cujo crescimento ocorreu sem (Controle) ou com estimulação por FSH (SOV). No grupo de boa resposta, não houve diferença na expressão de LHR total entre os tratamentos Controle e SOV. No grupo de má resposta, a expressão de LHR total foi menor em SOV comparado com Controle, mas não houve diferença na expressão das isoformas. Conclui-se que o LHR é diferencialmente expresso em folículos dominantes de novilhas caracterizadas com boa ou má resposta a superovulação. / The aim of this study was to evaluate genomic and transcriptomic variations at the luteinizing hormone receptor (LHR) and its role at the follicular dominance establishment and superovulation outcome in bovine. Three experiments were performed, and for all evaluations cDNA synthesized from total RNA extracted from follicular granulosa cells (GC) were used. To characterize the LHR transcript, GC were recovered from dominant follicles from Gir (n=16) and Holstein (n=16) cows. After PCR and sequencing, data were analized to identify polymorphisms, allelic frequency, polymorphic information content (PIC) and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Twenty one single nucleotide polymorphism (SNP) were identified, being 17 in Gir and 14 in Holstein. The classification of SNP according to PIC values identified 12 as highly informative in Gir and five in Holstein. Considering HWE, eight SNP were not in equilibrium in Gir and 10 in Holstein. Two isoforms were also identified, one in exon 1 and other in exon 10. We concluded that LHR in dairy cattle shows a high frequency of polymorphism and multiple isoforms. To evaluate the LHR isoforms role in GC during follicular divergence, the follicular wave emergence was synchronized in Gir (n=10) and Holstein (n=10) heifers and follicles were individually aspirated at the corresponding sizes of pre-, divergence, and post-. The relative expression of LHR isoforms was determined by real time PCR and results were correlated to the intrafollicular estradiol (E2if) concentrations. In both breeds, there was a progressive increase in E2if concentration during follicular development. The E2if in Holstein was higher when compared to Gir before, during, and after divergence; but was similar in follicles of same size in both breeds. We observed a peak for the total LHR expression after the beginning of the follicular divergence. The expression of LHR isoforms was low (Holstein) or under-regulated (Gir) during this same period. The results suggest that the early follicular divergence of the dominat follicle in Bos indicus breeds can be related to a higher sensitivity to the estradiol negative feedback. Besides, sequential changes in LHR isoforms expression can act regulating the LHR function during folicullar divergence in bovine. The evaluation of LHR isoforms behavior during the exogenous induction of follcilualr development was performed in Gir heifer previously characterized as good (n=5) or poor (n=5) responders to superovulation. In both groups, GC were collected from follicles (8 mm) which growth occurred without (Control) or with FSH stimulation (SOV). In good responders group, there was no difference in the LHR expression between the Control and SOV treatments. In the poor responders group, the total LHR expression was lower in SOV when compared to Control, but there was no difference in the expression of the isoforms. We concluded that LHR is differentially expressed in dominant follicles from heifers characterized as good or poor responders to superovulation.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TatimaraMariaMiyauchi-dissertacao.pdf: 241249 bytes, checksum: 31d06c5c53ccc213a1ec299452cee268 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Efficiency of in vitro bovine embryo production has been affected by low quantity and quality of recovered oocytes from ultrasound-guided follicular aspiration (OPU). The objective of this study was to evaluate the effect of different synchronization of follicular wave protocols in the production of oocytes and embryos in vitro, of Bos taurus taurus and Bos taurus indicus and heifers. We used three hundred forty-four results of follicular aspiration. The management regime was semi- confinement of animals with positive energy balance ten days prior to the aspirations. Animals were randomly distributed in the following treatments: TI or control (N=81) - OPU independent of estrous cycle with no previous hormone treatment; TII (N=97) - Estradiol benzoate (3mg), four days before OPU; TIII (N= 97) - Estradiol benzoate (3mg), insertion of subcutaneous implant of Norgestomed and application of D-Chloprostenol Sodium (0.150 mg), four days before OPU; TIV (N= 69) the same treatment used in TIII, plus two doses of FSH (100 to 150 UI) one day before OPU, with an interval of 12 hours, OPU after 12 to 16 hours. Viable recovered oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured and presumptive zygotes were cultured until the time of embryo transfer. Zebu showed greater recovery of viable oocytes and total production of embryos in relation to taurine respectively (14.2± 0.7 vs 8.8± 0.5; 17.7± 0.9 vs 11.9± 0.6; 4.3± 0.3 vs 2.1± 0.2). A significant increase in quality and oocyte recovery in groups III and IV in relation to control group, respectively (13.2± 1.0 vs 13.8± 1.1 vs 8.1± 0.8; 16.8± 1.2 vs 17.8± 1.4 vs 10.7± 1.0 , P <0.05). In relation to the total quantity and quality of embryos, all treatments were superior to control (P <0.05), but T IV was superior to other treatments according to the breeds studied. Treatments III and IV showed a greater recovered oocyte number in Bos taurus; the same was not observed in Zebu. A better average conversion was observed in Zebu cows. Bos indicus presented greater quality and recover rate of oocytes in summer compared to winter (15.7± 1.6 vs 12.0± 1.0; 19.3± 1.3 vs 15.3± 1.2). Bos indicus produced more embryos in both seasons and, in winter, both subspecies converted more oocytes into embryos compared with to summer (41.5± 3.5 vs 33.1± 2.4; 28.5± 3.2 vs 19.5± 2.6). Synchronization treatments were efficient in oocyte recovering of Bos taurus donors and Bos indicus embryos. Regarding the season of the year, winter has proved to be the most favorable period for conversion of embryos for the two subspecies. / A eficiência na produção in vitro de embriões bovinos é limitada pela quantidade e qualidade dos oócitos recuperados na aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU). Objetivou-se com o presente estudo avaliar os efeitos de diferentes protocolos de sincronização da onda folicular na recuperação de oócitos e produção de embriões bovinos in vitro, das subespécies Bos taurus taurus e Bos taurus indicus em diferentes épocas do ano. Foram utilizados trezentos e quarenta e quatro resultados de aspirações foliculares. O regime de manejo dos animais foi o semi- confinamento com balanço energético positivo dez dias antes das aspirações. Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: T I ou controle (N=81) - OPU independente do ciclo estral - sem tratamento hormonal prévio; T II (N=97) - Benzoato de Estradiol (3mg), cinco dias antes da OPU; T III (N= 97) - Benzoato de Estradiol (3mg), inserção de implante subcutâneo de Norgestomed e aplicação de D-Cloprostenol Sódico (0,150 mg), quatro dias antes da OPU; T IV (N= 69) - mesmo tratamento utilizado em TIII, acrescido de duas aplicações de FSH (100 a 150 UI) um dia antes da OPU, com intervalo de 12 horas, sendo a OPU realizada de 12 a 16 horas após a última aplicação. Os oócitos viáveis recuperados foram maturados, fertilizados e os prováveis zigotos foram cultivados até o momento da transferência dos embriões. Os animais do grupamento genético zebuíno apresentaram maior recuperação de oócitos viáveis, totais e produção de embriões em relação aos taurinos respectivamente (14,2± 0,7 vs 8,8± 0,5; 17,7± 0,9 vs 11,9± 0,6; 4,3± 0,3 vs 2,1± 0,2; P<0,05). Houve aumento significativo na qualidade e recuperação de oócitos nos tratamentos III e IV em relação ao controle, respectivamente (13,2± 1,0 vs 13,8± 1,1 vs 8,1± 0,8; 16,8± 1,2 vs 17,8± 1,4 vs 10,7± 1,0; P<0,05). Em relação à quantidade de embriões totais e qualidade, todos os tratamentos foram superiores ao controle (P<0,05), porém o T IV foi superior aos outros tratamentos de acordo com as raças estudadas (4,6± 0,6 e 1,5± 0,3). Em relação à recuperação de oócitos de acordo com as raças, os tratamentos III e IV recuperaram mais oócitos nos taurinos; o mesmo não foi observado nos zebuínos. Uma melhor conversão média em embriões foi observada nas fêmeas zebuínas. Nos Bos indicus houve melhor recuperação de oócitos no período do verão em relação ao inverno (15,69± 1,64 vs 12,04± 1,05; 19,32± 1,31 vs 15,30± 1,21; P<0,05). Fêmeas Bos indicus produziram mais embriões nas duas épocas do ano, e no inverno as duas subespécies converteram mais oócitos em embriões em relação ao verão (41,50± 3,50 vs 33,12± 2,40; 28,55± 3,25 vs 19,48± 2,64; indicus vs taurus, respectivamente). Os tratamentos de sincronização foram eficientes para recuperação de oócitos em doadoras taurinas e produção de embriões nas doadoras zebuínas. Quanto à época do ano, foi o inverno o período mais favorável para produção de embriões nas duas subespécies.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:55:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TatimaraMariaMiyauchi-dissertacao.pdf: 241249 bytes, checksum: 31d06c5c53ccc213a1ec299452cee268 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Efficiency of in vitro bovine embryo production has been affected by low quantity and quality of recovered oocytes from ultrasound-guided follicular aspiration (OPU). The objective of this study was to evaluate the effect of different synchronization of follicular wave protocols in the production of oocytes and embryos in vitro, of Bos taurus taurus and Bos taurus indicus and heifers. We used three hundred forty-four results of follicular aspiration. The management regime was semi- confinement of animals with positive energy balance ten days prior to the aspirations. Animals were randomly distributed in the following treatments: TI or control (N=81) - OPU independent of estrous cycle with no previous hormone treatment; TII (N=97) - Estradiol benzoate (3mg), four days before OPU; TIII (N= 97) - Estradiol benzoate (3mg), insertion of subcutaneous implant of Norgestomed and application of D-Chloprostenol Sodium (0.150 mg), four days before OPU; TIV (N= 69) the same treatment used in TIII, plus two doses of FSH (100 to 150 UI) one day before OPU, with an interval of 12 hours, OPU after 12 to 16 hours. Viable recovered oocytes were in vitro matured, fertilized and cultured and presumptive zygotes were cultured until the time of embryo transfer. Zebu showed greater recovery of viable oocytes and total production of embryos in relation to taurine respectively (14.2± 0.7 vs 8.8± 0.5; 17.7± 0.9 vs 11.9± 0.6; 4.3± 0.3 vs 2.1± 0.2). A significant increase in quality and oocyte recovery in groups III and IV in relation to control group, respectively (13.2± 1.0 vs 13.8± 1.1 vs 8.1± 0.8; 16.8± 1.2 vs 17.8± 1.4 vs 10.7± 1.0 , P <0.05). In relation to the total quantity and quality of embryos, all treatments were superior to control (P <0.05), but T IV was superior to other treatments according to the breeds studied. Treatments III and IV showed a greater recovered oocyte number in Bos taurus; the same was not observed in Zebu. A better average conversion was observed in Zebu cows. Bos indicus presented greater quality and recover rate of oocytes in summer compared to winter (15.7± 1.6 vs 12.0± 1.0; 19.3± 1.3 vs 15.3± 1.2). Bos indicus produced more embryos in both seasons and, in winter, both subspecies converted more oocytes into embryos compared with to summer (41.5± 3.5 vs 33.1± 2.4; 28.5± 3.2 vs 19.5± 2.6). Synchronization treatments were efficient in oocyte recovering of Bos taurus donors and Bos indicus embryos. Regarding the season of the year, winter has proved to be the most favorable period for conversion of embryos for the two subspecies. / A eficiência na produção in vitro de embriões bovinos é limitada pela quantidade e qualidade dos oócitos recuperados na aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU). Objetivou-se com o presente estudo avaliar os efeitos de diferentes protocolos de sincronização da onda folicular na recuperação de oócitos e produção de embriões bovinos in vitro, das subespécies Bos taurus taurus e Bos taurus indicus em diferentes épocas do ano. Foram utilizados trezentos e quarenta e quatro resultados de aspirações foliculares. O regime de manejo dos animais foi o semi- confinamento com balanço energético positivo dez dias antes das aspirações. Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes tratamentos: T I ou controle (N=81) - OPU independente do ciclo estral - sem tratamento hormonal prévio; T II (N=97) - Benzoato de Estradiol (3mg), cinco dias antes da OPU; T III (N= 97) - Benzoato de Estradiol (3mg), inserção de implante subcutâneo de Norgestomed e aplicação de D-Cloprostenol Sódico (0,150 mg), quatro dias antes da OPU; T IV (N= 69) - mesmo tratamento utilizado em TIII, acrescido de duas aplicações de FSH (100 a 150 UI) um dia antes da OPU, com intervalo de 12 horas, sendo a OPU realizada de 12 a 16 horas após a última aplicação. Os oócitos viáveis recuperados foram maturados, fertilizados e os prováveis zigotos foram cultivados até o momento da transferência dos embriões. Os animais do grupamento genético zebuíno apresentaram maior recuperação de oócitos viáveis, totais e produção de embriões em relação aos taurinos respectivamente (14,2± 0,7 vs 8,8± 0,5; 17,7± 0,9 vs 11,9± 0,6; 4,3± 0,3 vs 2,1± 0,2; P<0,05). Houve aumento significativo na qualidade e recuperação de oócitos nos tratamentos III e IV em relação ao controle, respectivamente (13,2± 1,0 vs 13,8± 1,1 vs 8,1± 0,8; 16,8± 1,2 vs 17,8± 1,4 vs 10,7± 1,0; P<0,05). Em relação à quantidade de embriões totais e qualidade, todos os tratamentos foram superiores ao controle (P<0,05), porém o T IV foi superior aos outros tratamentos de acordo com as raças estudadas (4,6± 0,6 e 1,5± 0,3). Em relação à recuperação de oócitos de acordo com as raças, os tratamentos III e IV recuperaram mais oócitos nos taurinos; o mesmo não foi observado nos zebuínos. Uma melhor conversão média em embriões foi observada nas fêmeas zebuínas. Nos Bos indicus houve melhor recuperação de oócitos no período do verão em relação ao inverno (15,69± 1,64 vs 12,04± 1,05; 19,32± 1,31 vs 15,30± 1,21; P<0,05). Fêmeas Bos indicus produziram mais embriões nas duas épocas do ano, e no inverno as duas subespécies converteram mais oócitos em embriões em relação ao verão (41,50± 3,50 vs 33,12± 2,40; 28,55± 3,25 vs 19,48± 2,64; indicus vs taurus, respectivamente). Os tratamentos de sincronização foram eficientes para recuperação de oócitos em doadoras taurinas e produção de embriões nas doadoras zebuínas. Quanto à época do ano, foi o inverno o período mais favorável para produção de embriões nas duas subespécies.

Os mecanismos envolvidos na etiopatogênese da infertilidade em pacientes com endometriose não foram totalmente elucidados. A infertilidade apresentada por pacientes com as formas moderada e grave (estadios III e IV, respectivamente) seria, parcialmente, decorrente de alterações anatômicas pélvicas associadas à endometriose. Entretanto, há evidências de que lesões sutis ou implantes endometrióticos em estágios iniciais (estágio mínimo e leve) também poderiam contribuir com a etiopatogênese da infertilidade. Uma pior qualidade oocitária pode estar envolvida nas menores taxas de implantação após fertilização in vitro encontradas nessas pacientes. Questionamos a possibilidade de haver alterações no microambiente folicular de pacientes inférteis com endometriose, as quais poderiam afetar a aquisição de competência oocitária e, consequentemente, comprometer a fertilidade natural e os resultados dos tratamentos de reprodução assistida em mulheres com esta doença. Sabe-se que, para ser competente e poder ser fertilizado, o oócito precisa estar maduro e ter um fuso morfologicamente funcional, que garanta a fidelidade da segregação cromossômica durante a meiose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial impacto de diferentes concentrações de fluido folicular (FF) de mulheres inférteis com e sem endometriose leve sobre a integridade do fuso, alinhamento cromossômico e organização dos microfilamentos de actina de oócitos bovinos maturados in vitro. Realizou-se um estudo experimental, onde amostras de fluido follicular foram consecutivamente obtidas de 22 pacientes inférteis (11 com endometriose leve e 11 com infertilidade por fator tubário e/ou masculino) submetidas à estimulação ovariana para injeção intracitoplasmática de espermatozóide. Oócitos bovinos imaturos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) sem adição de fluido follicular (sem fluido) e com 4 concentrações (1%, 5%, 10%, e 15%) de duas amostras de fluido folicular (uma de paciente com endometriose e outra de paciente sem endometriose). Foram realizadas 11 MIVs e cada amostra de fluido follicular foi usada apenas uma vez. Os oócitos foram fixados, marcados por imunofluorescência para visualização morfológica de microtúbulos, cromatina e microfilamentos de actina e, então, analisados por microscopia confocal. A porcentagem de anormalidade de oócitos em MII (fuso normal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos desalinhados, fuso anormal e cromossomos alinhados) foi significativamente maior naqueles maturados com FF de pacientes com endometriose (1%: 55,56%, 5%: 63,26%, 10%: 54,54%, 15%: 48,84%) quando comparados com oócitos maturados com FF de pacientes controles (1%: 19,15%, 5%: 23,44%, 10%: 25%, 15%: 23,81%) e oócitos maturados sem fluido (23,53%), sem haver diferença entre as concentrações testadas em cada grupo. Pode-se concluir que oócitos bovinos maturados in vitro na presença de FF de mulheres inférteis com endometriose leve têm maior freqüência de anormalidade meiótica. Estes dados sugerem que o FF de mulheres com endometriose pode comprometer a qualidade oocitária por promover danos ao fuso e/ou cromossomos / The mechanisms involved in the etiopathogenesis of infertility in patients with endometriosis have not been fully elucidated. The infertility presented by patients with moderate and severe disease (stages III and IV, respectively) would be partly due to anatomical pelvic changes associated with endometriosis. However, there are evidences that subtle lesions or endometriosis implants in the early stages (stages I and II) might also contribute to the etiophatogenesis of infertility. Impaired oocyte quality may be involved in lower implantation rates after in vitro fertilization in these patients. We question if alterations in the follicular microenvironment of infertile patients with endometriosis might affect oocyte competence acquisition and compromise the natural fertility and assisted reproduction treatment outcomes in women with this disease. It is known that to be competent and capable of fertilizing, the oocyte must be mature and have a morphologically functional spindle, which ensure the fidelity of chromosome segregation during meiosis. Thus, the aim of this study was to evaluate the potential impact of different concentrations of follicular fluid (FF) of infertile women with and without mild endometriosis on spindle integrity, chromosomes alignment and actin microfilaments organization of bovine oocytes in vitro matured. We performed an experimental study, where FF samples were consecutively obtained from 22 infertile patients (11 with mild endometriosis and 11 with tubal or male factors of infertility) submitted to ovarian stimulation for intracytoplasmic sperm injection. Immature bovine oocytes were submitted to in vitro maturation (IVM) without FF and with 4 concentrations (1%, 5%, 10%, and 15%) of 2 samples of FF (1 from a woman with endometriosis and one from a woman without endometriosis). We performed 11 IVM and each FF sample was used only once. The oocytes were then fixed, stained by immunofluorescence for morphological visualization of microtubules, chromatin and actin microfilaments, and then, analyzed by confocal microscopy. The percentage of abnormal MII oocytes was significantly higher for those matured with FF from patients with endometriosis (1%: 55.56%, 5%: 63.26%, 10%: 54.54%, 15%: 48.84%) when compared with oocytes matured with FF from patients without endometriosis (1%: 19.15%, 5%: 23.44%, 10%: 25%, 15%: 23.81%) and those matured without FF (23.53%), with no differences among the tested concentrations in each group. We can conclude that bovine oocytes matured in vitro in the presence of FF from infertile women with mild endometriosis have higher frequency of meiotic abnormalities. These data suggest that FF from women with endometriosis may compromise oocyte quality by promoting spindle and/or chromosomal damage

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

A fase lútea tardia (FLT) é citada pela literatura como crítica para exacerbação de todos os transtornos psiquiátricos, o que pode significar maior consumo alcoólico por indivíduos dependentes e risco de recaídas para aqueles abstinentes. Paralelamente, é freqüente o relato clínico de aumento do consumo alimentar nesta fase. Conter a compulsividade e impulsividade alimentar é um dos inúmeros aspectos da atuação nutricional na recuperação de mulheres dependentes de álcool, uma vez que a eutrofia destas pacientes é importante para suas condições clínicas e psicológicas e, conseqüentemente, prevenir recaídas. Desta forma, conhecer a influência do ciclo menstrual feminino no consumo alimentar e alcoólico de mulheres em tratamento torna-se importante. OBJETIVOS: Comparar a composição alimentar e o consumo alcoólico entre a fase folicular (FF) e a FLT de mulheres dependentes de álcool. METODOLOGIA: estudadas 30 mulheres alcoolistas em tratamento no Programa de Atenção à Mulher Dependente Química (PROMUD) do Instituto de Psiquiatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Todas elas preencheram diários alimentares (que continham consumo alcoólico) durante dois meses. Foram aplicados também questionários relativos a dados sócio-demográficos, comportamento alimentar e comorbidades psiquiátricas. Os diários foram avaliados pelo Programa Virtual Nutri versão 1.0. RESULTADOS: A correlação do consumo energético (p=0,688), lipídico (0,500) e alcoólico (p= 0,673) entre a FF e FLT foi positivo. Foi possível dividir a amostra em dois clusters, onde constatou-se diferença significativa no consumo energético e de carboidratos entre os dois grupos, que possuíam tempo de tratamento e Índice de Massa Corpórea (IMC) diferentes, mas não estatisticamente significantes. CONCLUSÕES: Não parece existir diferença de consumo alimentar ou alcoólico em mulheres alcoolistas entre a FF e FLT. Se dividirmos a amostra em subgrupos, aquelas com mais tempo de tratamento IMC mais elevado tendem a ingerir mais álcool e não relatar corretamente seu consumo alimentar e alcoólico / The late luteal phase (LLF) of the menstrual cycle is often associated with exacerbation of psychiatric disorders. Increased food intake due to mechanism not yet established can be seen during LLF. A key component of nutritional intervention for the treatment of alcoholic women is to approach the so-called binge and impulsive eating behaviors. It is thus necessary to know the impact of the menstrual cycle on food and alcohol intake of women in alcohol dependence treatment. OBJECTIVES: To compare food composition and alcohol consumption between follicular phase (FP) and LLF in alcohol dependent women. METHODS: Thirty alcoholic women in treatment at the Women Drug Dependent Treatment Center (PROMUD) at Clínicas Hospital Psychiatry Institute of Universidade de São Paulo Medical School completed food diaries (including alcohol consumption) for two months. Data on sociodemographic characteristics, eating behaviors and psychiatric comorbidities were also collected using specific questionnaires. Food diaries were assessed using Virtual Nutri Program version 1.0. RESULTS: There was no statistically significant difference of energy and alcohol consumption, as well as macronutrient intake (carbohydrates, proteins and lipids), between FP and LLF. But when the study sample was divided into two groups according to nutritional variables, a significant difference was evidenced in energy and carbohydrate intake. Length of treatment and body mass index (BMI) differed in both subgroups but not statistically significant. CONCLUSIONS: There does not seem to be a difference in food or alcohol consumption in alcoholic women between FP and LLF. The two subgroups studied showed that longer treatment and higher BMI are associated with higher alcohol consumption and misreporting of food and alcohol intake

A leptina é um hormônio peptídico multifuncional, produzido principalmente pelo tecido adiposo, possuindo receptores (Ob-Rs) nos órgãos reprodutivos, hipotálamo e hipófise. Os glicocorticóides, como o cortisol, também influenciam diretamente a produção de leptina. A importância desses dois hormônios na atividade reprodutiva tem sido descrita por diversos autores, que observaramo envolvimento de ambos, na melhoria dos índices reprodutivos, seja por sua influência direta no eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal, na maturação dos oócitos ou na preparação uterina para receber o concepto. No entanto, quando em excesso na circulação, podem influênciar negativamente o sistema reprodutivo. Marcadores como a leptina e seu receptor funcional de cadeia longa, estão sendo estudados no endométrio de espécies como humanos, bovinos e suínos, apresentando resultados que correlacionam a diminuição destes, com a infertilidade ou perda embrionária, porém até o momento não foi possível encontrar estudos que abordassem esse tema em equinos. Neste estudo foram avaliados: 1) a presença de leptina (Ob) e seu receptor (Ob-Rb) no endométrio de éguas, observando a influência da obesidade e do ciclo estral nesses marcadores e 2) em uma condição de manejo adverso e estressante, a influência do cortisol intrafolicular, nos níveis de leptina no fluido folicular (FF) e nos marcadores de Ob e Ob-Rb no endométrio durante as fases do ciclo estral. Os resultados demonstraram que existe a presença da leptina e seu receptor (Ob-Rb) no endométrio de equinos, com imunomarcação no epitélio luminal e glandular em todas as fases do ciclo estral avaliadas, apresentando, no entanto, uma marcação imunológica mais intensa nos Ob-Rb (142.68±4.97, P< 0,0001) no epitélio glandular durante o diestro em éguas de escore corporal moderado. Não foi possível observar a influência do aumento do cortisol intrafolicular (FF) nas variáveis avaliadas, pois o cortisol se manteve dentro dos valores fisiológicos para a espécie, no entanto pode-se verificar uma correlação positiva entre os níveis intrafoliculares de cortisol e leptina, estando o cortisol aumentado 8 (30.1±0.07ng/ml, P< 0,05) nos folículos mais próximos a ovulação. Pode-se perceber também, que a marcação imunológica do receptor de leptina no epitélio glandular foi mais intensa (144.52±3.17, P< 0,0001) nos animais que apresentavam folículos até 22 mm, estando a imunomarcação de ambos Ob e Ob-Rb correlacionado de forma negativa (r: -0.7836; P < 0.0001, r:- 0.7343; P < 0.0001), com os níveis de cortisol no FF. / Leptin is a multifunctional peptidic hormone, mainly produced by adipose tissue, having receptors (Ob-Rs) in the reproductive organs, hypothalamus and pituitary. Glucocorticoids, such as cortisol, also directly influence leptin production. The importance of these two hormones in reproductive activity has been described by several authors, who observed the involvement of both, in the improvement of reproductive indices, either by their direct influence on the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, oocyte maturation or the uterine preparation to receive the concept. However, when in excess in circulation, they can negatively influence the reproductive system. Markers such as leptin and its long-chain functional receptor are being studied in the endometrium of species such as humans, cattle and pigs, presenting results that correlate the decrease of these with infertility or embryonic loss, but to date it has not been possible to find studies to address this issue in horses. In this study we evaluated: 1) the presence of leptin (Ob) and its receptor (Ob-Rb) in the endometrium of mares, observing the influence of obesity and estrous cycle on these markers and 2) in an adverse and stressful management condition, the influence of intrafollicular cortisol, leptin levels in the follicular fluid (FF), and the Ob and Ob-Rb markers in the endometrium during the estrous cycle phases. The results showed that leptin and its receptor (Ob-Rb) are present in the equine endometrium, with immunostaining in the luminal and glandular epithelium in all stages of the estrous cycle evaluated, however, showing a more intense immunological labeling in Ob -Rb (142.68 ± 4.97, P <0.0001) in the glandular epithelium during the diestrous in mares of moderate body score. It was not possible to observe the influence of intrafollicular cortisol (FF) on the variables evaluated, because cortisol remained within the physiological values for the species, however a positive correlation can be observed between intrafollicular cortisol and leptin levels, being the 10 cortisol increased (30.1 ± 0.07ng/ml, P <0.05) in the follicles closest to ovulation. It can also be noticed that the immunological labeling of the leptin receptor in the glandular epithelium was more intense (144.52 ± 3.17, P <0.0001) in the animals that presented follicles up to 22 mm, and the immunostaining of both Ob and Ob-Rb correlated negatively (r: -0.7836; P <0.0001, r: - 0.7343; P <0.0001), with cortisol levels in FF.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.