Submitted by DIEGO SOUZA MOURA MOURA (diosmoura@yahoo.com.br) on 2016-12-09T13:03:07Z No. of bitstreams: 1 Diego Souza Moura Dissertação depois da defesa para arquivar on line.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-13T10:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moura_ds_me_bot.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T10:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moura_ds_me_bot.pdf: 16424035 bytes, checksum: fdfeaf59a20fcfe3cbd802420a342a7b (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / No ciclo estral das vacas ocorre uma série de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise, pela presença do embrião no útero, que provoca alterações no organismo materno de ordens hormonais, anatômicas e comportamentais. Apesar disso, a colheita de oócitos em vacas gestantes é uma alternativa para a produção in vitro de embriões. No entanto, em vista do perfil hormonal durante a gestação, os fatores envolvidos no desenvolvimento folicular podem ser comprometidos. Em vista disso, este estudo objetivou descrever o perfil proteico do líquido folicular de vacas gestantes. Foram colhidos ovários de 36 vacas gestantes em terço inicial de gestação. O líquido folicular foi puncionado e o diâmetro de cada folículo foi mensurado pela ultrassonografia, sendo classificados em três categorias ≤6,4mm, 6,5mm a 8,9mm e ≥9. Após duas centrifugações para remoção dos componentes celulares, as proteínas totais foram mensuradas e a eletroforese unidimensional realizada sob condições desnaturantes e redutoras. As bandas foram recortadas e a digestão in gel realizada objetivando a espectrometria de massas. A concentração de estrógeno e progesterona foi mensurada no líquido folicular para determinar a viabilidade dos folículos. Foram encontradas 46 bandas de proteínas na eletroforese em 67 amostras de líquido folicular. A média da concentração ± desvio padrão da progesterona foi de 71,32 ± 80,06 ng/mL e estrógeno de 27,57 ± 30,62 ng/mL, considerando todos os folículos. Houve expressão diferenciada de proteínas nas diferentes categorias de folículos. Na espectrometria de massas foram encontradas diversas proteínas, sendo as principais apolipoproteina, angiotensinogênio, heat shock protein, glutationa e suas isoformas. / Estorus cycle of cows has a series of events that are repeated until the luteolysis impediment, because the presence of embryo in the uterus, which causes hormonal, anatomical and behavioral orders, changes in the maternal organism. Nevertheless, the ovum pick-up in pregnant cows is an alternative to the in vitro production of embryos. However, in view of the hormonal profile during pregnancy, the factors involved in follicular development may be impaired. Thus, this study aimed to describe the protein profile of follicular fluid from pregnant cows. Ovaries were collected from 36 pregnant cows with gestational age 1-4 months. Follicular fluid was punctured and the diameter of each follicle was measured by ultrasonography, classified into three categories ≤6.4mm, 6.5 to 8.9 mm and ≥9. After two centrifugation to remove the cellular components, total protein were measurement and unidimensional electrophoresis was performed under denaturing and reducing conditions. The bands were cut and digestion in gel was carried out aiming to mass spectrometry. The concentration of estrogen and progesterone in follicular fluid was measured to determine the viability of follicles. We found 46 protein bands in electrophoresis in 67 follicular fluid samples. The mean ± standard deviation of progesterone concentration was 71.32 ± 80.06 considering all follicles. There was differential expression of proteins in different categories of follicles. In mass spectrometry were found many proteins, being main apolipoprotein, angiotensinogen, heat shock protein, glutathione and their isoforms.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA135.pdf: 267002 bytes, checksum: 8293274ee87b3870ff68763d1a4e7cbe (MD5) Previous issue date: 2013-11-01 / Due to the drastic reduction of the number of animals, the Flemish Red breed is endangered. This study aims to generate knowledge on the follicular development and serum progesterone (P4) profiles in females of the Flemish Red breed, created in Southern Brazil, in order to subsidize the choice of reproductive biotechniques more adequate for the reproduction of the breed. Two groups of non-lactating pubescent females with ages between four and six years old, Flemish Red (FLE, n=7) and Holstein (HOL, n=7), received two doses of Sodium Cloprostenol in order to synchronize their estrus. Starting from the estrus, the ovaries were assessed through the use of transrectal ultrasound every 24 hours for 21 days or until the second ovulation was detected. The diameter of the dominant follicle (DF) and the subordinate follicle (SF) were recorded according to the day of the cycle. The diameter of the DF and the SF were assessed when the follicle emerged, the day and the diameter of the DF in the divergence, the daily growth of the ovulatory follicle and the non-ovulatory dominant follicle (NODF). Blood samples were collected every five days for P4 administration by radioimmunoassay. None of the variables assessed in the FLE group differed significantly of the HOL group or of the values described for other European cattle breeds. In wave emergence DF measured 3.97 ± 0.19 mm for FLE and 4.00 ± 0.35 mm for the HOL, while the SF reached 3.40 ± 0.22 mm in FLE and 3 , 07 ± 0.26 mm in the HOL. The FLE daily growth rate was 1.10 ± 0.04 mm for DF and 0.67 ± 0.06 mm for the SF , whereas the HOL daily growth rate was 1.01 ± 0.05 mm for DF and 0.72 ± 0.09 mm for the SF . Since the emergence DF was larger than the SF and divergence occurred on the third day , with the DF measuring 8.04 ± 0.37 mm and 8.39 ± 0.47 in FLE and HOL, respectively. The maximum diameter of the ovulatory follicle in FLE cows was 13.16 ± 0.33 mm and the average maximum diameter of the non- ovulatory dominant follicle was 13.01 ± 0.48 mm . Holstein cows showed values of 14.20 ± 0.60 and 13.00 mm ± 0.59 mm , respectively, for the same measurements . These values are in accordance with generally accepted for European breeds, situated between 13-20 mm . The P4 concentration was adjusted to a cubic regression , and in FLE group ranged from 0.155 ± 0.016 ng/ml to 6.651 ± 1.868 ng/ml. In HOL group, P4 ranged from 0.300 ± 0.048 ng/ml to 5.957 ± 1.233 ng/ml.The conclusion was that cows of the Flemish Red breed have similar follicle development and P4 profile to the Holstein cows, which suggests it is possible to use reproductive biotechnologies applicable to animals of the Holstein breed in animals of the Flemish Red breed / Em função da drástica redução no número de animais, a raça Flamenga corre risco de extinção. Este estudo teve objetivo de gerar conhecimento sobre o perfil de desenvolvimento folicular e de Progesterona sérica (P4) hormonal em fêmeas da raça Flamenga criadas no Sul do Brasil, visando subsidiar a escolha das biotécnicas reprodutivas mais apropriadas para multiplicação desta raça. Dois grupos de fêmeas púberes, não lactantes com idade variando entre quatro e seis anos, Flamenga (FLA, n=7) e Holandesa (HOL, n=7), tiveram seus estros sincronizados com Cloprostenol. A partir do estro, os ovários foram avaliados a cada 24 horas por ultrassonografia transretal até que a segunda ovulação fosse detectada. Os diâmetros do folículo dominante (FD) e do subordinado (FS) foram registrados em função do dia do ciclo. Foram avaliados o diâmetro do FD e do FS na emergência folicular, o dia e o diâmetro do FD na divergência, o crescimento diário de FD e FS, o diâmetro máximo do folículo ovulatório e do dominante não ovulatório. Amostras de sangue foram coletadas a cada cinco dias para dosagem de progesterona sérica (P4) por radioimunoensaio. Nenhuma das variáveis avaliadas no grupo FLA diferiu significativamente do grupo HOL ou dos valores descritos para outras raças taurinas. Na emergência da onda os FD mediram 3,97 ± 0,19 mm para vacas Flamengas e de 4,00 ± 0,35 mm para as Holandesas, enquanto o FS chegou a 3,40 ± 0,22 mm nas Flamengas e 3,07 ± 0,26 mm nas Holandesas. O crescimento folicular diário das Flamengas foi de 1,10 ± 0,04 mm para o FD e de 0,67 ± 0,06 mm para o FS; já nas Holandesas o crescimento diário foi de 1,01 ± 0,05 mm para o FD e de 0,72 ± 0,09 mm para o FS. Desde a emergência o FD foi maior que o FS e a divergência ocorreu no terceiro dia, com o FD medindo 8,04 ± 0,37 mm e 8,39 ± 0,47, em Flamengas e Holandesas, respectivamente. O diâmetro máximo do folículo ovulatório em vacas Flamengas foi de 13,16 ± 0,33 mm e o valor médio do diâmetro máximo do folículo dominante não ovulatório foi de 13,01 ± 0,48 mm. Vacas Holandesas apresentaram valores de 14,20 ± 0,60 mm e 13,00 ± 0,59 mm, respectivamente, para as mesmas medidas. Estes valores estão de acordo com os normalmente aceitos para raças taurinas, situados entre 13 20 mm. A concentração de progesterona sérica ajustou-se a um modelo cúbico de regressão e, em vacas Flamengas variou de 0,155 ± 0,016 ng/ml até 6,651 ng/ml ± 1,868 ng/ml. Para vacas Holandesas os limites da concentração da progesterona oscilaram entre 0,300 ± 0,048 ng/ml e 5,957 ± 1,233 ng/ml. Conclui-se que vacas da raça Flamenga possuem desenvolvimento folicular e perfil de P4 semelhantes ao de vacas Holandesas, sugerindo ser possível a utilização das biotecnologias reprodutivas aplicáveis em animais da raça Holandesa em animais da raça Flamenga

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Resumo: Vários são os componentes que tem a capacidade de interferir no metabolismo e desenvolvimento do oócito no interior do folículos, dentre esses fatores estão As EVs. Sendo assim o objetivo deste estudo foi avaliar a modulação da maturação oocitária in vitro pelas EVs extraídos de vacas submetidas ao estresse térmico (ET) ou não. Para tanto 12 vacas da raça holandesa foram submetidas ao ET e 12 vacas foram mantidas em condições de termo-neutralidade, em seguida tiveram seus folículos aspirados em dois momentos do ciclo estral (pré-ovulação e desvio). Após a separação das EVs do fluido folicular, e visualizados pela microscopia eletrônica. Então As EVs foram colocados em meio de maturação para avaliação da ação destas vesículas durante a maturação oocitária. Após 22 horas de maturação, os oócitos e as células do cummulus foram recuperados para posterior análise de progressão da maturação e também para expressão de genes de interesse. Não foi observada diferença estatística entre os grupos na análise de progressão meiótica nem na integridade do DNA. Indicando que As EVs não interferiram na morfologia oocitária. A expressão gênica no entanto demonstrou que genes relacionados a expansão do cummulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), metabolismo energético (BMP15,CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 e 4) e apoptose (BCL2 e STAT3), apresentaram expressão diminuída no grupo termo-neutro. Os dados do nosso estudo indicam que o ambiente termo-neutro levou a uma sinalização intrafolicular das EVs com a fin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: There are several components that have the ability to interfere with the metabolism and development of the oocyte in side of follicles, among these factors are the EVs. Thus the aim of this study was to evaluate the modulation of oocyte maturation in vitro by EVs extracted from cows under heat stress or not. For that, 12 Holstein cows were subjected to heat stress and 12 cows were kept in a thermo-neutral conditions, then had their follicles aspirated in two stages of the estrous cycle (pre-ovulation and deviation). After separation of the EVs from follicular fluid, and visualized by electron microscopy. The EVs were placed in maturation medium for evaluation of the action of these vesicles during oocyte maturation. After 22 hours of maturation, oocytes and cummulus cells were recovered for further analysis of meiotic progression and for expression of genes of interest. There was no statistical difference between the groups in meiotic progression analysis or the DNA integrity. Indicating that the EVs not interfere in oocyte morphology. Gene expression however demonstrated that genes related to the expansion of the cumulus (BMP15, HAS2, GDF9, PTX3), energy metabolism (BMP15, CPT1B, PFKP), IGF (IGFBP2 and 4) and apoptosis (BCL2 and STAT3) showed decreased expression the thermo-neutral group. The data from our study indicate that the thermo-neutral environment led to a intrafollicular signaling EVs in order to indicate a favorable situation for the oocyte. / Mestre

Resumo não disponível

A produção in vitro de embriões, no Brasil, ocupa lugar de destaque dentre as biotecnologias da reprodução animal e o atual desafio é torná-la cada vez mais acessível, para tanto, é fundamental aproximar os resultados de produção e sobrevivência dos embriões produzidos in vitro daqueles desenvolvidos naturalmente. Boa parte desta variação do potencial de desenvolvimento do embrião está relacionada à características do oócito. Há a possibilidade de essa capacidade estar relacionada ao perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo, neste sentido, este projeto teve como objetivo principal avaliar a correlação do potencial de desenvolvimento de oócitos com o conteúdo do perfil lipídico no líquido folicular e das células foliculares, baseado no sistema de ativação partenogenética, cultivo individual e analise retrospectiva. Não existe, até o momento, uma caracterização detalhada do microambiente folicular, um componente importante dos fluídos são os lipídios e recentemente tem sido demonstrado que eles estão envolvidos em vários aspectos do metabolismo além de também funcionarem como moléculas sinalizadoras ou até mesmo serem capazes de induzir modificações na cromatina. Os íons oriundos do estudo do perfil lipídico foram avaliados em comparação ao potencial de desenvolvimento do oócito. No conjunto de dados do MALDI observou-se maior concentração de triacilglicerídeos, principalmente contendo ácidos graxos como o oleico, linoleico e esteárico nos líquidos foliculares e células do folículo provenientes do ambiente folicular de oócitos que clivaram. No perfil lipídico do líquido folicular feito por LC-MS/MS os lipídios identificados foram de classes diversas, com participação expressiva no modo positivo de triacilgliceróis, fosfatidilcolinas, esfingomielinas, monoacildiacilglicerídeos entre outros e no modo negativo a classe lipídica que prevaleceu foi dos lipídios mitocondriais, as cardiolipinas. Também foram detectados lipídios citosólicos como o CE e alguns pouco descritos no líquido folicular como o PIP2 e PIP3, além disso, alguns lipídios foram característicos dos grupos clivados e blastocistos. O perfil lipídico do líquido folicular e das células do folículo é complexo e alguns lipídios deste ambiente tem potencial para serem biomarcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production in Brazil occupies a prominent place among the animal reproduction biotechnology, the current challenge is to make it increasingly accessible so it is essential to approach the results of production and survival of in vitro produced embryos of those developed naturally. Much of this potential change of embryo development is related to the oocyte characteristics. There is the possibility of this ability is related to the lipid profile of follicular fluid and follicle cells , in this sense, this project aimed to evaluate the correlation of the oocytes development potential with the content of the lipid profile in follicular fluid and cells follicular, based on parthenogenetic activation , individual cultivation and retrospective analysis system. There isn\'t, to date, a detailed characterization of the follicular microenvironment, an important component of the follicular fluid and cels are the lipids and recently has been shown that they are involved in various aspects of metabolism in addition also function as signaling molecules or even be capable of inducing changes in chromatin. Derived ions from the study of lipid profile were evaluated compered with oocyte developmental potential. In MALDI dataset observed triacylglycerides higher concentration, mainly containing fatty acids such as oleic, linoleic and stearic acids in follicular fluid and follicle cells from follicular environment of cleaved oocytes. In follicular fluid lipid profile done by LC-MS/MS lipids were identified in diferent classes, with significant participation in positive mode of triacylglycerols, phosphatidylcholines, sphingomyelins, monoacildiacilglicerídeos among others and in negative mode prevailed lipid class was of mitochondrial lipids, the cardiolipin. Cytosolic lipids were also detected as CE and some little follicular fluid as described in the PIP2 and PIP3, and others lipids were characteristic of cleaved and blastocysts groups. The lipid profile of follicular fluid and follicle cells is complex and some of this lipid environment has the potential to be biomarkers of oocyte quality.

O uso da gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido considerado uma potencial ferramenta nos protocolos de estimulação e superovulação para melhorarem o desempenho reprodutivo dos rebanhos. Este fato levou a hipótese de que o tratamento com eCG altera as vias de sinalização intracelular no corpo lúteo (CL) formado. Para testá-la, 18 vacas mestiças de Nelore (Bos indicus) foram divididas em três grupos: controle, estimulado e superovulado. O protocolo de sincronização da ovulação com o uso do dispositivo de P4 foi descrito anteriormente (FÁTIMA et al., 2013). O grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia da remoção do dispositivo de P4 e o superovulado recebeu 2000 UI de eCG 4 dias antes. Os animais dos grupos controle e estimulado receberam GnRH no dia 10, enquanto os animais superovulados receberam no dia 8. No sétimo dia após após a administração do GnRH, todos os animais foram abatidos e os CL foram coletados. Foi realizada análise de microarranjo, a partir da qual foram eleitos genes envolvidos na sinalização da esteroidogênese (ADM, MMP9, NOS2), da ativação das metaloproteinases da matriz e do receptor ativado de protease que regula a homeostase e inflamação (PRSS2, PLAU) e da angiogênese (ANG e ANGPT1) e validados por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. A expressão gênica e proteica do PRSS2 e MMP9 foi menor e as células luteínicas grandes e pequenas positivas apresentaram marcação menos intensa nos grupos estimulado e superovulado (P <0,05). A expressão proteica da ANG foi maior no estimulado (P=0,01) e superovulado (P=0,03) e da proteína ANGPT1 foi maior no estimulado (P=0,008). O número de células luteínicas grandes e pequenas positivas para ANG e ANGPT1 foram maiores nos grupos tratados (P <0,05). No estimulado, houve correlação negativa entre os níveis de progesterona e o MMP9 (r = -0,66 e P = 0,03) e com a proteína do PRSS2 (r = -0,63 e P = 0,04). No entanto, houve correlação positiva com a proteína ANG (r = 0,69 e P = 0,03). No superovulado, houve correlação positiva entre a ANG e ANGPT1 (r = 0,96 e P = 0,001). Não houve diferença na expressão de ADM, NOS2 e PLAU nos grupos tratados em relação ao controle. Em resumo, os resultados obtidos são indicativos de que a eCG altera a expressão relativa de genes e proteínas envolvidas nas vias de sinalização de inflamação e a modelação da membrana celular com uma diminuição na expressão do MMP9 e da PRSS2 e na via da angiogênese com maior expressão de ANG em ambos os tratamentos e ANGPT1 em vacas estimuladas. / The use of equine chorionic gonadotropin (eCG) have been considered a potential tool in stimulation and superovulation protocols to improve the reproductive performance of the herd. This fact led to the hypothesis that eCG treatment alters the intracellular signaling pathways in the formed CL. To test that, 18 crossbred Nellore (Bos indicus) cows were divided into three groups: control, stimulated and superovulated. The synchronization protocol with the use of P4 device was previously described (FÁTIMA et al., 2013). The stimulated group received 400 IU eCG at the P4 device removal and superovulated received 2000 IU eCG 4 days before it. Both control and stimulated animals received GnRH on day 10, while superovulated ones received it on day 8. On the seventh day after GnRH administration, CL were collected by slaughter. Microarray analysis was preformed, from which were selected genes involved in the signaling of steroidogenesis (ADM, MMP9, NOS2), activation of matrix metalloproteinases and protease activated receptor that regulates homeostasis and inflammation (PRSS2, PLAU), and angiogenesis (ANG and ANGPT1). They were evaluated by qPCR, western blot and immunohistochemistry. The gene and protein expression of MMP9 and PRSS2 decreased and large and small luteal cells showed weaker staining in stimulated and superovulated groups related to the control group (P <0.05). ANG protein expression was higher on superovulated (P=0.01) and stimulated (P=0.03) and ANGPT1 protein was higher only in stimulated (P=0.008). The number of positive large and small luteal cells for ANG and ANGPT1 were higher in treated groups (P<0.05). In stimulated, there were a negative correlation between progesterone levels and MMP9 (r = 0.03 and P = -0.66) and the PRSS2 protein expression (r = 0.04 and P = -0.63). However, there were a positive correlation with ANG protein expression (r = 0.69 and P = 0.03). In superovulated, there were a positive correlation between ANG and ANGPT1 (r = 0.96 and P = 0.001) and PRSS2 protein expression was negatively correlated with the ANG protein (r = 0.04 and P = -0.96). There was no difference in ADM, NOS2 and PLAU expression in treated groups compared to control. In summary, these findings indicate that eCG alters the relative expression of genes and proteins involved in inflammation and cell modeling signaling pathways by decreasing MMP9 and PRSS2 expression, and on angiogenesis pathway, increasing ANG expression in both stimulated and superovulated animals and ANGPT1 in stimulated cows.

In beef cows, long-acting injectable progesterone (iP4) supplementation in the early diestrus has paradoxical effects, as it both increases fertility in the field as well as induces anticipation of luteolysis in part of the treated animals. Considering that estradiol (E2) from the ovarian follicles during the luteal phase plays a central role in the induction of uterine PGF2&#945; release and luteal regression, here we tested the central hypothesis that the absence of post-deviation follicles (i.e., a low E2 tone) delays the early onset of luteolysis and extends the estrous cycle in Bos indicus cows supplemented with iP4. This dissertation consists of two studies. A first study was carried out to validate the use of cytologic brushes (cytobrush) as a tool to collect sequential samples of endometrium to characterize temporal changes in the transcriptome along the estrous cycle. It was concluded that the cytobrush technique was confirmed as a reliable, repeatable, and safe method for studying bovine uterine biology in vivo. In the second study, cyclic Nelore cows were synchronized and distributed in a 2 x 2 factorial arrangement to receive treatment with placebo or 300 mg iP4 three days after ovulation (D0), and to be subjected or not to follicular aspiration (FA) during the luteal phase. Endometrial samples were collected on D15, D17 and D19 using the cytobrush technique, and abundance of transcripts was measured by qPCR. The iP4 decreased the size of the largest follicle on D6 and the area of the CL between D8 and 10 compared to the placebo groups. Cows submitted to FA had a longer cycle but timing of luteolysis was similar to non-FA cows. Treatment with iP4 and submitted to FA tended to advance the timing of structural luteal regression ( &le;D16). Furthermore, in the moments preceding luteolysis (D11 to D16), cows from this group that underwent luteolysis before or at D16 presented a smaller CL compared with cows of the same group that underwent luteolysis after D16. In addition, cows treated with iP4 that presented early luteolysis had a smaller CL across the luteal phase. There were no significant differences in the abundance of endometrial transcripts related to programming (PGR, ESR1) or execution (OXTR, PTGS2) of PGF2&#945; release. In summary, supplementation of P4 at early diestrus affected CL growth but did not modulate endometrial transcripts associated with luteolysis, suggesting that the uterine component might not be involved in this process. It is concluded that CLs impaired by exposure to iP4 during luteogenesis are most likely to undergo early luteal regression, and this may be exacerbated by low E2 concentrations resulting from FA. In conclusion, we rejected the hypothesis that reduced follicular E2 could prevent iP4-induced early onset of luteolysis in Bos indicus cows. / Em vacas de corte, a suplementação com progesterona injetável de longa ação (iP4) no diestro inicial tem efeitos paradoxais, uma vez que tanto aumenta a fertilidade a campo quanto induz a antecipação da luteólise em uma parte dos animais tratados. Considerando que o estradiol (E2) proveniente dos folículos ovarianos durante a fase luteal desempenha um papel central na indução da liberação de PGF2&#945; uterina e regressão luteal, testou-se a hipótese central de que a ausência de folículos pós-desvio previne a antecipação do momento da luteólise e prolonga o ciclo estral em vacas Bos indicus suplementadas com iP4. Esta dissertação consiste em dois estudos. Um primeiro estudo foi realizado para validar a utilização de escovas citológicas (cytobrush) como uma ferramenta para coletar amostras sequenciais do endométrio para caracterizar as mudanças temporais no transcriptoma ao longo do ciclo estral. Concluiuse que a técnica de cytobrush foi confirmada como um método confiável, repetível, e seguro para o estudo da biologia uterina bovina in vivo. No segundo estudo, vacas Nelore cíclicas foram sincronizadas e distribuídas em um arranjo fatorial 2 x 2 para receber tratamento com placebo ou 300 mg de iP4 três dias após a ovulação (D0), e serem submetidos ou não à aspiração folicular (AF) durante a fase lútea. Amostras endometriais foram coletadas no D15, D17 e D19 usando a técnica de cytobrush, e a abundância de transcritos foi medida por qPCR. A iP4 diminuiu o tamanho do maior folículo no D6 e a área do CL entre D8 e D10 comparado aos grupos placebo. Vacas submetidas à AF tiveram um ciclo mais longo, porém o momento da luteólise foi semelhante ao das vacas não aspiradas. O tratamento com iP4 e AF tendeu a adiantar o momento da regressão lútea estrutural (&le; D16). Além disso, nos momentos precedentes à luteólise (D11 ao D16), vacas desse grupo detectadas em luteólise antes ou no D16 apresentaram um CL menor em comparação com vacas do mesmo grupo em luteólise após o D16. Adicionalmente, vacas tratadas com iP4 com luteólise precoce apresentaram um menor CL ao longo da fase lútea. Não houve diferenças significativas na abundância de transcritos endometriais relacionados com a programação (PGR, ESR1) ou execução (OXTR, PTGS2) da liberação de PGF2&#945;. Em resumo, a suplementação com iP4 no início do diestro afetou o crescimento do CL mas não modulou os transcritos endometriais associados com a luteólise, sugerindo que o componente uterino pode não estar envolvido neste processo. Conclui-se que CLs comprometidos pela exposição à iP4 durante a luteogênese são mais susceptíveis à regredir antecipadamente, e isto pode ser exacerbado por baixas concentrações de E2 resultantes da AF. Em conclusão, rejeitamos a hipótese de que a redução do E2 folicular previne a antecipação da luteólise induzida pela iP4 em vacas Bos indicus.

Três experimentos foram realizados para testar a hipótese de que a resposta superestimulatória de doadoras Nelore (Bos indicus) com tratamentos iniciados próximo à ovulação durante a primeira onda de crescimento folicular seria maior ou comparável àquela decorrente de tratamentos convencionais. Os animais foram aleatoriamente alocados em três grupos. As doadoras dos Grupos 1 - Onda 1 s/P4 e 2 - Onda 1 c/P4 foram superestimuladas na primeira onda de crescimento folicular, e as do Grupo 3 - SincBE+P4/P4 quatro dias após a sincronização da emergência folicular com estradiol e progesterona. Os animais receberam dispositivo intravaginal de Progesterona (CIDR) associado a 50mg de Progesterona e 2,5mg de Benzoato de Estradiol (IM) no Dia 0. Os animais dos Grupos 1 e 2 receberam PGF2&alpha; no Dia 5 e 12,5mg Armour de LH (Lutropin) 24 horas após a remoção do CIDR (Dia 9), e no Dia 11 iniciou-se o tratamento superovulatório. As doadoras do Grupo 2 receberam um novo CIDR juntamente com a primeira dose de FSH (Dia 11). Todos os animais foram superestimulados com 133mg NIH-FSH-P1 de Folltropin diluídos em 10ml, em duas aplicações diárias de 1ml, por cinco dias. No último dia de tratamento, junto com o FSH foram aplicadas doses luteolíticas de PGF2&alpha; nos Grupos 2 e 3 o CIDR foi removido na ultima aplicação. Todas as doadoras receberam 25mg de LH 24 horas após a ultima dose de FSH e foram inseminadas 12 e 24 horas após o LH. Os embriões foram coletados e avaliados pelo mesmo veterinário sete dias após a inseminação. No primeiro experimento, as quantidades de embriões transferíveis não foi significativamente diferente entre os grupos 2 e 3 (8,0 ± 1,8 x 6,6 ± 2,0), e ambas foram maiores que as do 1 (0,2 ± 0,2; P<0,05). Como não houve diferença entre os Grupos 2 e 3 nos parâmetros analisados, o Grupo 3 foi excluído dos outros dois experimentos. No segundo experimento, as doadoras receberam os mesmos tratamentos dos Grupos 1 e 2, mas foram abatidas 12 horas após receberem 25mg de LH (Dia 16) e tiveram seus ovários removidos e levados para o laboratório, para classificação. Os oócitos foram aspirados e avaliados quanto à maturação pela expansão do COC. Os animais que não receberam dispositivo de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram maior número de oócitos não maturados (6,4 ± 2,7 x 1,2 ± 0,9; P< 0,05). O terceiro experimento foi semelhante ao segundo, com a diferença de que os animais foram inseminados 12 horas após o tratamento com 25mg de LH, e tiveram as estruturas coletadas 7 dias após a IA. Os resultados desse experimento confirmaram os do primeiro, no qual animais sem suplementação exógena de P4 durante o tratamento superovulatório apresentaram menor número de embriões transferíveis que o grupo com P4 (0,0 ± 0,0 x 3,9 ± 1,1; P<0,05). Os resultados obtidos retificam a hipótese, demonstrando que a superovulação durante a primeira onda de crescimento folicular em novilhas Nelore é eficiente somente com suplementação exógena de P4 / Three experiments were design to test the hypothesis that superovulatory (SPO) response of Nelore (Bos indicus) donors to treatments administered during the first follicular wave, initiated at the expected time of ovulation, will elicited a higher or a comparable response to traditional protocols. In the first experiment, cows were randomly allocated into 1 of 3 treatment groups. Cows in Group Wave 1 without P4 e Group Wave 1 with P4 were superstimulated during the first follicular wave and cows in the Control Group were superstimulated after synchronized follicular wave emergence using estradiol and progesterone. All cows received a CIDR device and an injection of 50mg of P4 and 2.5mg EB on Day 0. Cows in Groups Wave 1 with P4 and Wave 1 without P4 were also treated with PGF2&alpha; on Day 5 and 12,5mg Armour of pLH (Lutropin) 24 h after CIDR removal (Day 9), to synchronize ovulation. The SPO treatments were initiated on Day 11; donor cows in Group Wave 1 with P4 also received a new CIDR device at the time of the first FSH injection. All donors in three groups were superstimulated with a total dose of 133mg NIH-FSH-P1 of Folltropin-V, divided into twice daily injections of the same dosage (13,3mg diluted in 1ml) over 5 days. On the last day of FSH treatment, all animals received PGF2&alpha; after each FSH injection and cows in Group Wave 1 with P4 and Control Group had their CIDR removed at the time of the last FSH injection. All cows received 25 mg of pLH 24h after the last FSH treatment and were AI 12 and 24h later. Ova/embryo collection and evaluation was done 7d after, aIl by the same veterinarian. Results indicate that there was no difference in the numbers of transferable embryos in CIDR treated donor cows when SPO treatments were initiated at the time of emergence of either the first follicular wave Group Wave 1 with P4 (8.0 ± 1.8) or following synchronization of follicular wave emergence with BE + P4, control Group (6.6 ± 2.0), but both were greater than when SPO treatments were initiated at the first follicular wave without the use of a CIDR device, Wave 1 without P4 (0.2 ± 0.2; P<0,05). Since there were no differences between Groups Wave 1 with P4 and control on all the end points, this group was dropped from the others experiments. A second experiment was performed in order to evaluate the quality of oocyte recovered after animals were treated under the same protocol of Groups Wave 1. The SPO treatments were the same described previously, however 12h after the injection of 25mg of pLH animals were slaughtered and their ovaries were taken to an IVF lab. Follicles were aspirated and the oocyte was evaluated and those with an expanded COC were considered mature. Animals in Group Wave 1 without P4 showed a greater (P<0,05) number of immature oocyte (6.4 ± 2.7) than Group Wave 1 with P4 (1.2 ± 0.9). The third experiment was performed to confirm the results of the first experiment. The treatments were similar as the second experiment, however, animals were AI 12 and 24h after the 25mg of pLH and had ova/embryos collection and evaluation 7 d after by the same veterinarian. Results of this experiment confirmed the first experiment presenting a greater (P<0,05) number of transferable embryos in Group Wave 1 with P4 (3.9 ± 1,1) when compared to Group Wave 1 without P4 (0.0 ± 0.0). The results did not support the hypothesis, showing that exogenous P4 is necessary in order to superovulate Nelore during the first follicular wave

O presente trabalho teve como objetivo o estudo da dinâmica folicular da ovelha Santa Inês no protocolo de nove dias de sincronização de cios, com e sem a administração do eCG, utilizando um novo dispositivo intravaginal de silicone Primer-PR® (Tecnopec Brasil). No experimento 1, dez ovelhas receberam o dispositivo vaginal no D0, retirada no D9 e aplicação de 0,4mL de d-cloprostenol. Os exames ultrassonográficos foram diários, desde D-3 da colocação do dispositivo vaginal até o D9 e a partir deste, de 12 em 12 horas até a ovulação. Concomitantemente ao experimento 1, as coletas de sangue foram realizadas entre as ovelhas que receberam o dispositivo (grupo GP, n=10) e àquelas em estado fisiológico (grupo GF, n=12). No experimento 2, nove ovelhas receberam igual tratamento do experimento 1 e 250UI de eCG na retirada do dispositivo. Os exames ultrassonográficos para o acompanhamento da dinâmica folicular ocorreram de 12 em 12 horas do D9 até a ovulação. Neste experimento, o sangue foi coletado em dias intervalados desde D-1 até D13. No experimento um, a emergência folicular ocorreu em 8,5 dias ± 16 horas após a colocação do dispositivo vaginal. As ovelhas entraram e saíram do cio, respectivamente, 45,6 ± 12,71h e 72 ± 12,96h após a retirada do mesmo e a ovulação ocorreu em 73 ± 14,38 h. O diâmetro inicial médio do folículo foi de 3,48 ± 0,28 mm e do ovulatório de 5,22 ± 0,72 mm, diferindo significativamente (p=0,006) entre o primeiro e o segundo folículo ovulatório e entre o primeiro folículo de animais com simples (5,77 ± 0,34mm) ou dupla (4,83 ± 0,18mm) ovulação (P=0,003). A taxa de crescimento no período foi 0,73 ± 0,43 (mm/dia). No experimento 2, o estro iniciou-se às 36 ± 6,4h, finalizou às 81 ± 8,46h com a ovulação em 74,3 ± 7,56 h após a retirada do dispositivo vaginal. O diâmetro inicial médio do folículo foi de 4,04 ± 0,78 mm e do ovulatório de 5,40 ± 0,59 mm, diferindo significativamente entre o primeiro folículo de animais com simples (5,91± 0,27mm) ou dupla (5,2 ± 0,22mm) ovulação (P=0,007). A taxa de crescimento folicular no período foi de 0,66 ± 0,43 mm ao dia. No experimento 1, o dispositivo Primer-PR® elevou a concentração plasmática de progesterona do grupo GP a 6,56 ± 2,32 ng/mL, enquanto o grupo fisiológico (GF) ficou em 3,8 ± 2,69 ng/mL no mesmo período. No experimento 2 a concentração plasmática de progesterona durante a permanência do dispositivo vaginal foi de 11,50 ± 3,11ng/mL. Conclui-se que foi possível realizar o acompanhamento da dinâmica folicular dentro do protocolo de nove dias de sincronização de cios na ovelha Santa Inês e que o novo dispositivo utilizado foi eficiente em sincronizar a emergência da onda folicular ovulatória. / The present study aimed the assessment of follicular dynamics in Santa Inês ewes during the nine day estrus synchronization protocol, with or without the administration of eCG, using a new intravaginal silicon device, Primer-PR® (Tecnopec Brasil). In Experiment 1, ten ewes received the vaginal device on D0, which was removed on D9 and received 0,4mL of d-cloprostenol. Ultrasound exams were performed daily, since D-3 of the device placement until D9 and every 12 hours thereafter, until ovulation. During Experiment 1, blood samples were taken from the ewes that received the device (grupo GP, n=10) and the ewes that were in physiological state (grupo GF, n=12). In Experiment 2, nine ewes received the same treatment in Experiment 1 and 250UI of eCG on the day of the device removal. Ultrasound exams for follicular development were performed every 12 hours starting on D9 until ovulation. Blood samples were taken every other day from D-1 until D13. In Experiment 1, follicular emergence occurred in 8,5 days ± 16 hours after the vaginal device placement. The ewes started and ended estrus at, respectively, 45,6 ± 12,71h and 72 ± 12,96h after device removal and ovulation was detected in 73 ± 14,38 h. The mean initial follicle diameter was 3,48 ± 0,28 mm and the mean ovulatory follicle diameter was 5,22 ± 0,72 mm, being statistically different (p=0,006) between the first and second ovulatory follicle and between the first follicle of single ovulation (5,77 ± 0,34mm) or double ovulation individuals (4,83 ± 0,18mm) (P=0,003). The follicular growth rate during this period was 0,73 ± 0,43 (mm/day). In Experiment 2, estrus started at 36 ± 6,4h, ended at 81 ± 8,46h with ovulation occurring in 74,3 ± 7,56 h after the vaginal device removal. The mean initial follicle diameter was 4,04 ± 0,78 mm and the mean diameter ovulatory follicle was 5,40 ± 0,59 mm, differing statistically between the first follicle of single ovulation individuals (5,91± 0,27mm) or double ovulation individuals (5,2 ± 0,22mm) (P=0,007). Follicular growth rate during the period was 0,66 ± 0,43 mm per day. In Experiment 1, Primer-PR® device increased plasmatic progesterone concentration in group GP to 6,56 ± 2,32 ng/mL, whereas physiological group (GF) had 3,8 ± 2,69 ng/mL during the same period. In Experiment 2 plasmatic progesterone concentration throughout the vaginal device use was 11,50 ± 3,11ng/mL. It can be concluded that it was possible to perform ultrasound evaluation of follicular dynamics during the nine day estrus synchronization protocol in Santa Inês ewes and that the new device used was efficient in synchronizing the emergence of ovulatory follicular wave.

O objetivo do presente estudo foi avaliar as características de dinâmica ovariana, aspectos do processo de involução uterina e características da hemodinâmica uterina e ovariana em éguas durante o período pós-parto (n = 10). Para isso, o conteúdo apresentado nesta dissertação está dividido em dois capítulos. No primeiro capítulo, os aspectos do processo de involução uterina e características de vascularização endometrial e mesometrial foram avaliados. Uma drástica redução (P<0,05) no diâmetro uterino foi observada durante os primeiros 7 dias pós-parto, com subsequente diminuição nas taxas de involução uterina, sendo que este processo se completou em torno de 21 dias para o corno anteriormente não gravídico (CNG) e 24 dias para o corno anteriormente gravídico (CG). Em relação às quantidades de fluido intrauterino, foi observado aumento nas quantidades entre os dias 1 e 2 pós-parto (d1 e d2), com significativa redução entre o d4 e d7, sendo que nenhuma quantidade de fluido foi observada em nenhum animal após o d16, ou após o terceiro dia pós-ovulação (D3). Nenhuma diferença (P>0,05) foi observada entre os cornos uterinos (CG e CNG) em relação às características de vascularização. Neste contexto, foi observado aumento (P<0,05) nos escores de vascularização endometrial entre d1 e d4, permanecendo semelhante até o d13, assim como aumento (P<0,05) de vascularização mesometrial entre o d1 e d2. No entanto, houve redução (P<0,05) nos escores de vascularização mesometrial do d2 ao d10. Após a ovulação, foi observado aumento de vascularização endometrial do D0 ao D5, com redução dos escores do D5 ao D11 e um novo aumento entre o D11 e o D14. De forma semelhante, o padrão de vascularização mesometrial foi similar ao observado no endométrio. No segundo capítulo, foram avaliados os aspectos de desenvolvimento e vascularização folicular durante o primeiro estro pós-parto, assim como as características de desenvolvimento e vascularização do corpo lúteo (CL) e níveis séricos de progesterona (P4) durante os 16 dias após a primeira ovulação pós-parto. Adicionalmente, os animais foram divididos em dois grupos, sendo o grupo precoce (ovulação antes do d10) ou tardia (ovulação após o d10). Em relação ao desenvolvimento folicular, nenhuma diferença foi observada entre os grupos nos dias relativos à primeira ovulação pós-parto, no entanto, quando avaliados os dias relativos ao parto, diferenças foram observadas entre os grupos. Neste contexto, o grupo precoce apresentou maior diâmetro (P<0,05) do folículo dominante (F1) em todos os dias no período pós-parto inicial (d1-d7), assim como apresentou um maior número de folículos (P<0,05) na classe > 25 mm durante os primeiros dias pós-parto (d1-d3). Adicionalmente, os animais do grupo tardia apresentaram maior número de folículos (P<0,05) na classe de 20-25 mm durante período pós-parto inicial (d4-d7). Em relação às características de vascularização, nenhuma diferença (P>0,05) foi observada entre os grupos quanto a vascularização do F1, pedículo ovariano ipsilateral ao F1, área e vascularização do CL ou níveis séricos de P4. Portanto, no período pós-parto inicial, padrões distintos nas características de vascularização uterina foram observados, porém, após a primeira ovulação pós-parto, os padrões observados assemelham-se aos de éguas não prenhes, possivelmente refletindo um retorno às características uterinas pré-gestacionais. Em relação às características de desenvolvimento folicular, não foram observadas diferenças entre os grupos em relação aos dias precedendo a primeira ovulação pós-parto, assim como as características de dinâmica folicular se assemelham aos resultados obtidos em ciclos de éguas não gestantes. No entanto, quando avaliadas as características em relação ao pós-parto imediato, diferenças no perfil de desenvolvimento folicular foram observadas entre os grupos, devido ao maior desenvolvimento folicular no grupo precoce durante a primeira semana pós-parto. Portanto, apesar do número reduzido de animais, os resultados observados sugerem que eventos cruciais ocorrem antes do parto, levando ao maior desenvolvimento folicular em alguns animais, principalmente os que apresentam rápido desenvolvimento folicular e ovulação pós-parto. / The aim of this study was to evaluate the characteristics of ovarian dynamics, aspects of the uterine involution process and characteristics of uterine and ovarian hemodynamic during the postpartum period in mares (n = 10). Thus, the content presented in this thesis is divided into two chapters. In the first chapter, the aspects of the uterine involution process and characteristics of endometrial and mesometrial vascularization were evaluated. A rapid reduction (P<0,05) in uterine diameter was observed during the first 7 days postpartum, with subsequent decrease in the rate of uterine involution, and this process was completed in about 21 days for formerly nongravid horn (CNG) and 24 days for the formerly gravid horn (CG). For intrauterine fluid accumulations, an increase (P<0,05) was observed between days 1 and 2 postpartum (d1 and d2), with a significant reduction between d4 and d7, and no amount of fluid collections was observed in the animals after d16 or after the third day post-ovulation (D3). No differences (P>0,05) was observed between the uterine horns (CG and CNG) in relation to vascular perfusion characteristics. In this context, an increase (P<0,05) in the endometrial vascularity scores was observed between d1 and d4, remaining similar until d13, as well as an increase (P<0,05) in mesometrial vascularization occurred between d1 and d2. However, a reduction (P<0,05) in scores of mesometrial vasculature was observed from d2 to d10. After ovulation, an increase of endometrial vascularization was observed from D0 to D5, with reduction in scores from D5 to D11 and a further increase between D11 and D14. Similarly, the pattern of mesometrial vascularization was similar to that observed in the endometrium. In the second chapter, follicular development and vascularization were assessed during the first postpartum estrus, as well the characteristics of development and vascular perfusion of the corpus luteum (CL) and serum progesterone (P4) during the 16 days after the first postpartum ovulation. Additionally, the animals were divided into two groups: the group early (ovulation before the d10) or late (ovulation after d10). With regard to follicular development, no difference was observed between groups in days relative to the first postpartum ovulation, however, when evaluated on the day of parturition, differences were observed between groups. In this respect, the early group had a larger diameter (P<0,05) of the dominant follicle (F1) each day in the early postpartum period (d1-d7) and had a greater number of follicles (P<0,05) in the > 25 mm class during the first days postpartum (d1-d3). Additionally, the animals in the late group showed a greater number of follicles (P<0,05) in the 20-25 mm class during early postpartum period (d4-d7). Regarding the characteristics of vascular perfusion, no difference (P>0,05) was observed between groups regarding the vascularization of F1, ipsilateral ovarian pedicle blood flow, area and vascularization of the CL or serum P4. Therefore, in the initial postpartum period, distinct patterns in the characteristics of uterine vascularization was observed, however, after the first ovulation postpartum, the observed patterns resemble those observed in non-pregnant mares, possibly reflecting a return to nonpregnant uterine characteristics. Regarding the characteristics of follicular development, no differences were observed between groups in relation to the days prior to the first postpartum ovulation, as well the characteristics of follicular dynamics are similar to the results obtained in cycles of non-pregnant mares. However, when the characteristics were evaluated concerning the immediate postpartum period, differences in the profile of follicular development were observed between groups, due to increased follicular development in the early group during the first week postpartum. Therefore, although a small number of animals, the results suggest that critical events occur before foaling, leading to increased follicle development in some animals, particularly those with rapid follicular development and postpartum ovulation.