For biomedical electronics the compatibility to the biological environment should be well-considered. Therefore this paper evaluates dispensed carbon nanotubes (CNT's) on polyimide (PI) foil for conductive tracks and electrodes for flexible, biomedical applications. A CNT based ink is investigated regarding biocompatibility, flexibility, conductivity and suitability for electrode materials with contact to artificial body fluids. The testing methods comprise bending tests with resistance monitoring, adhesion tests and the utilization of dynamic fluidic and electrical load on dispensed structures. The CNT ink showed good bending properties up to 2653 cycles with an average sheet resistance of 32.5 Ohm/sq. A demonstration of biocompatibility using the adherent cell line HFFF2 resulted negatively. No delamination or dissolving effects occurred during exposure to 0.9 % sodium chloride solution.

This paper describes the evaluation of screen printed materials fabricated with an additive manufacturing process for flexible biomedical applications. Five different conductive polymeric thick film pastes, printed on a polyimide substrate have been investigated. For the intended biocompatible applications, the cytotoxicity of the used materials was tested through adherent cell test. Furthermore, the electrical resistance, the printed structure thickness, the surface energy and roughness have been examined. Additionally, the mechanical resilience of the printed materials was tested through a bending test. During the bending the electrical resistance of printed meander structures could be monitored indicating failures. Two out of five materials were qualified as non-toxic, all of the materials are useable for flexible electronics, as they provide good electrical and mechanical properties.

The benefit of regular physical activity and exercise training for the prevention of cardiovascular and metabolic diseases is undisputed. Many molecular mechanisms mediating exercise effects have been deciphered. Personalised exercise prescription can help patients in achieving their individual greatest benefit from an exercise-based cardiovascular rehabilitation programme. Yet, we still struggle to provide truly personalised exercise prescriptions to our patients. In this position paper, we address novel basic and translational research concepts that can help us understand the principles underlying the inter-individual differences in the response to exercise, and identify early on who would most likely benefit from which exercise intervention. This includes hereditary, non-hereditary and sex-specific concepts. Recent insights have helped us to take on a more holistic view, integrating exercise-mediated molecular mechanisms with those influenced by metabolism and immunity. Unfortunately, while the outline is recognisable, many details are still lacking to turn the understanding of a concept into a roadmap ready to be used in clinical routine. This position paper therefore also investigates perspectives on how the advent of ‘big data’ and the use of animal models could help unravel interindividual responses to exercise parameters and thus influence hypothesis-building for translational research in exercisebased cardiovascular rehabilitation.

CRISPR-Cas ist ein adaptives Immunsystem, dass Bakterien und Archaeen vor eindringenden Nukleinsäuren schützt. Es besteht aus einem sogenannten CRISPR-Array, der als genetisches Gedächtnis vorangegangene Infektionen speichert und einem cas Lokus, welcher für die Abwehr essentielle Proteine codiert. Das CRISPR-assoziierte Protein 9 (Cas9) des Typ II CRISPR-Cas Systems aus Streptococcus pyogenes ist heutzutage das Mittel der Wahl für Gentherapie und Genom-Modifikationen. Allerdings gibt es nach wie vor Probleme mit der Ungenauigkeit dieses Systems, welche für eben genannte Ansätze behoben werden müssen. Aus diesem Grund ist es besonders wichtig zu verstehen, in welcher Weise die Spezifität von Cas9 beeinflusst wird. In dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für eine spezifische Erkennung der Zielsequenz durch drei verschiedene Cas9 Proteine des Typs II-A und ein Cas12a Protein des Typs V-A CRISPR-Cas Systems untersucht. Wir zeigen, dass Arginin Seitenketten der sogenannten „bridge“ Helix in Cas9 von S. pyogenes eine wichtige Rolle in der Bindung und Spaltung der DNS spielen. Diese Seitenketten können in zwei Gruppen unterteilt werden, welche die Spezifität von Cas9 entweder vergrößern oder verkleinern. Die Aminosäuren R63 und R66 reduzieren die Spezifität von Cas9 indem sie den sogenannten R-loop in Anwesenheit einer Fehlpaarung stabilisieren. Wir zeigen außerdem, dass Q768 eine erhöhte Toleranz von Cas9 zu Fehlpaarungen an Position 15 der Zielsequenz vermittelt und dass das Entfernen dieser Aminosäure die Spezifität von Cas9 im Bereich der Zielsequenz, die am weitesten von der PAM entfernt ist, erhöht. Eine Kombination der Mutationen der oben genannten Arginin und Glutamin Seitenketten führt zur Erhöhung der Gesamtspezifität von Cas9. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zum Verständnis bei, wie Cas9 Fehlpaarungen innerhalb der Zielsequenz detektiert und können dabei helfen weitere Strategien für eine verbesserte Spezifität von Cas9 zu entwickeln. / CRISPR-Cas (CRISPR-associated) systems are adaptive immune systems that have evolved in bacteria and archaea for protection against invading nucleic acids. They consist of a CRISPR array, where the genetic memory of the infection is stored and ultimately transcribed and processed into CRISPR RNAs (crRNAs), and of an operon of cas genes that encodes the Cas proteins. This thesis is focused on class 2 CRISPR-Cas systems that employ single RNA-guided nucleases in the interference phase. Dual-RNA guided CRISPR-associated protein 9 (Cas9) of the type II CRISPR-Cas system has become the tool of choice for genome editing applications in life sciences. However, off-target cleavage by Cas9 is one major issue that needs to be addressed for applications of the CRISPR-Cas9 technology for therapeutic purposes. Therefore, understanding the features that govern Cas9 specificity is of great importance. In this thesis, seed sequence requirements of three Cas9 proteins from the class 2 type II-A and one Cas12a protein from the class 2 type V-A CRISPR-Cas system have been investigated. We analyze the influence of mismatches and show that they affect target binding and/or cleavage by S. pyogenes Cas9. Additionally, we demonstrate that the arginine residues from the bridge helix of S. pyogenes Cas9 are important for target DNA binding and cleavage. Furthermore, these residues comprise two groups that either increase or decrease Cas9 sensitivity to mismatches i.e. specificity. R63 and R66 reduce Cas9 specificity by stabilizing the R-loop in the presence of mismatches. We also show that Q768 mediates Cas9 tolerance to a mismatch at target position 15 and removal of Q768 increases Cas9 specificity in the PAM-distal part of the target. Combination of arginine mutations and Q768A increased overall the sensitivity to mismatches. The results of this thesis elucidate how Cas9 senses PAM-adjacent mismatches and provide a basis to develop strategies for Cas9 variants with enhanced specificity.

Wir nutzten in dieser Studie den apikomplexen Parasiten Eimeria falciformis als Modell. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das in infizierten Wildtypmäusen dominierende Zytokin IFN-γ für Immunschutz und für die Entwicklung der Darmpathologie entbehrlich war. E. falciformis-infizierte IFN-γR-/- and IFN-γ-/- Mäuse zeigten extremen Körpergewichtsverlust und starke Pathologie im Darm. Die Entwicklung des Parasiten in diesen Mäusen war überraschenderweise reduziert. Diese Beobachtungen gingen mit einer drastisch erhöhten Produktion von parasiten-spezifischem IL-17A und IL-22 durch CD4+ T Zellen einher. Gleichzeitige Neutralisierung von IL-17A und IL-22 in E. falciformis-infizierten IFN-γR-/- Mäusen verringerte den Körpergewichtsverlust und die Darmpathologie, und führte zu einer erhöhten Ausscheidung von Parasiten. Die Behandlung einer E. falciformis-infizierten intestinalen Epithelzelllinie mit IL-17A oder IL-22 führte zu einer signifikant reduzierten Entwicklung von E. falciformis in vitro. Diese Daten demonstrieren erstmalig einen anti-parasitären Effekt von IL-22 im Darm und deuten auf redundante Rollen von IL-17A und IL-22 im Hinblick auf die Förderung von Darmpathologie in Abwesenheit von IFN-γ hin. Um E. falciformis als Modellsystem weiter zu entwickeln, haben wir die Transfektion von E. falciformis Sporozoiten mit verschiedenen Plasmiden die den Reporter YFP und den Resistenzmarker DHTS enthalten etabliert. Rektal in Mäuse injizierte Sporozoiten entwickelten sich erfolgreich zu Oocysten, wenn auch mit geringerer Effizienz im Vergleich zur oralen Infektion mit Oozysten. Wiederholte in vivo Selektion YFP-exprimierender Oozysten führte zu Populationen mit maximal 34 % YFP-exprimierenden Parasiten. Wir demonstrieren in dieser Arbeit zum ersten Mal die Transfektion von E. falciformis und zeigen Perspektiven im Hinblick auf die Etablierung einer stabil transgenen Parasitenlinie auf. / The roles of Th1 and Th17 responses as mediators of host protection and pathology in the intestine are the subjects of intense research. Here we investigated a model of intestinal inflammation driven by the intracellular apicomplexan parasite Eimeria falciformis. Although IFN-γ was the predominant cytokine during E. falciformis infection in wild type mice, it was found to be dispensable for host defence and the development of infection-driven intestinal inflammation. E. falciformis-infected IFN-γR-/- and IFN-γ-/- mice developed dramatically exacerbated body weight loss and intestinal pathology, but surprisingly harboured fewer parasites. This was associated with a striking increase in parasite-specific IL-17A and IL-22 production in the mesenteric lymph nodes and at the site of infection. Concurrent neutralisation of IL-17A and IL-22 in E. falciformis infected IFN-γR-/- mice resulted in a reduction in infection induced body weight loss and inflammation and significantly increased parasite shedding. Taken together these data demonstrate for the first time an anti-parasitic effect of IL-22 during an intestinal infection and suggest that IL-17A and IL-22 have redundant roles in driving intestinal pathology in the absence of IFN-γ signalling. To further develop E. falciformis as a model system, we established transfection of E. falciformis sporozoites using various plasmids that contain the fluorescent reporter YFP and the resistance marker DHTS. Sporozoites applied rectally to mice were shown to complete their life cycle, albeit with a lower efficiency in comparison to oral infection with oocysts. Repeated in vivo selection using pyrimethamine and/or FACS and manual sorting led to a maximum percentage of 34 % YFP-expressing oocysts. Taken together, we demonstrate for the first time transfection of E. falciformis and provide perspectives for further work on the establishment of a stable transgenic parasite line.

LBP vermittelt im Wirtsorganismus die direkte Immunantwort auf bakterielle Liganden wie das Lipopolysaccharid (LPS) von Gram-negativen oder Lipopeptide von Gram-positiven Bakterien. In dieser Arbeit wurde die Funktionsweise von LBP weiter aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine natürlich vorkommende Mutation des LBP (c998t), die an Position 333 zu einem Austausch der Aminosäure Prolin zu Leucin führt, hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Struktur und Funktionalität des Proteins untersucht. Westernblot-Analysen des rekombinant hergestellten Proteins und humaner Seren von Mutationsträgern weisen auf einen Zerfall des mutierten Proteins hin. Es kommt zu einer Beeinträchtigung der Bindung bakterieller Liganden und einer deutlichen Reduktion der LBP-vermittelten Zytokinausschüttung von Immunzellen. Der hier untersuchte Polymorphismus hat eine Allelfrequenz von 0,072 in einer gesunden europäischen Population. Genotypanalysen von Patientengruppen zeigten, dass es durch die Mutation zu einer deutlich erhöhten Mortalität bei Patienten mit septischen Komplikationen und einer durch Gram-negative Erreger verursachten Pneumonie kommt. Unsere Ergebnisse zur eingeschränkten Funktion des LBP-c998t bieten eine erste Erklärung dafür, wie diese Mutation vermutlich die Fähigkeit, Krankheiten zu bewältigen, beeinträchtigt. Innerhalb dieser Arbeit ging es um die Analyse der Bindung von bakteriellen Liganden an LBP. Dabei wurde eine potentiell gemeinsame Bindungsstelle für Liganden untersucht, die von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien stammen und später von den Toll-like Rezeptoren (TLRs) 2 und -4 erkannt werden. Dazu wurden Bindungsversuche zwischen Lipopeptiden und LPS mit einer zweiten LBP-Variante (LBP-E94/95) durchgeführt. Beim LPS führt dies zu einem Bindungsverlust. Auch für die Lipopeptide war durch die Mutationen die Interaktion mit LBP beeinträchtigt, was die These einer gemeinsamen Bindungsstelle von TLR2- und TLR4-Liganden an das Protein weiter unterstützt. / LBP enhances the innate immune reaction against bacterial ligands like LPS from gram negative or lipopeptides from gram positive bacteria in the host. Here we investigated the function of LBP using two recombinant mutants of the protein. The first part of this work examines a natural occurring mutation of LBP (c998t) leading to an amino acid exchange of proline to leucine at position 333 with regard to the impact on structure and function of the protein. Western blot analyses of the recombinant protein and sera obtained from individuals differing in the LBP genotype indicate the disaggregation of the mutated protein. Thereby binding of bacterial ligands to LBP is diminished and the LBP mediated cytokine secretion of immune cells is reduced. The gene polymorphism leading to the occurrence of the mutation is present with an allelic frequence of 0.072. A recent study has shown that this LBP-SNP led to a higher mortality in patients with septic complications and gram negative pneumonia. The results presented here, showing the negative impact on the function of LBP due to the mutation, may therefore be a first explanation on how this mutation affects the ability of people to deal with disease. Within this work binding of ligands to LBP was also explored. It was investigated whether ligands which are later recognized by Toll-like receptors (TLRs) 2 and – 4 share a common binding site on LBP. Assays with immobilized lipopeptides and LPS were performed with a second mutated LBP (LBP-E94/95). LPS binding to LBP is diminished completely. Here we showed that binding of lipopeptide to LBP is affected likewise, furthermore supporting the hypothesis of a common binding site for TLR2- and TLR4- ligands.

Toll-like Rezeptoren (TLR) und Nod-like Rezeptoren (NLR) sind Muster-erkennende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die bakterielle Zellwandbestandteile erkennen können. Interleukin (IL)-1beta ist ein streng reguliertes Zytokin. Durch eine erste Stimulation wird der TLR-Rezeptor ausgelöst und führt zur Expression des Vorläuferproteins proIL-1beta. Durch einen zweiten Stimulus wird ein zytoplasmatischer NLR-Rezeptor zur Caspase1-Aktivierung angeregt. Dies führt zur post-translationalen Reifung von proIL-1beta zu reifem IL-1beta und zur Aktivierung weiterer Mechanismen der Pathogen-Eliminierung während einer bakteriellen Meningitis. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die synergistische Beziehung zwischen TLRs und NOD2 in Bezug auf die IL-1beta-Sekretion in Astrozyten und Mikroglia untersucht. Primäre murine WT-Astrozyten und eine humane Zelllinie, die mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipopeptid sowie Muramyldipeptid (MDP) stimuliert wurden, zeigten signfikant erhöhte IL-1beta-Werte. IL-1beta war in NOD2-/- Astrozyten nicht erhöht. NOD2 trägt demnach als MDP-ausgelöster Rezeptor in Astrozyten, vermutlich zusammen mit dem Inflammasom-Komplex, zur Caspase-1-Aktivierung bei. In Mikrogliazellen lässt sich der bei Astrozyten gezeigte Effekt nicht reproduzieren. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die TLR-abhängige IL-1beta-Antwort durch NOD2-Beteiligung in murinen und humanen Astrozyten synergistisch erhöht wird. In einem weiteren Versuchsteil wurde in primären murinen Peritonealmakrophagen von adulten Mäusen der TLR/NLR-Synergismus untersucht. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass weibliche NOD2-/- Mäuse zu einer synergistisch erhöhten IL-1beta-Sekretion fähig waren. SiRNA-Versuche mit in Östrogen vorinkubierten RAW264.7-NOD2-/- Zellen zeigten eine eindeutige Synergie der TLR4- und NOD2-Rezeptoren in der IL-1beta-Ausschüttung. Östrogen scheint weiblichen Individuen einen protektiven Vorteil vor Infektionen bei NOD2-Defizienz zu verschaffen. / Toll-like receptors (TLR) and nod-like receptors (NLR) are pattern-recognition receptors that recognize lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides and myramyldipeptide (MDP) derived from bacterial cell wall. We focus our question on the regulation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1beta during bacterial meningitis in primary murine astrocytes and microglia as well as cell lines and the synergism of TLR4 or TLR2 and NOD2 to amplify IL-1beta-expression. ProIL-1beta is expressed by TLR-stimulation and activation of NF-kB signal transduction. Through the activation of Caspase-1, possibly through NOD2 and the inflammasome, proIL-1beta is cleaved on post-translational level and obtains its activated status, leading to pathogen elimination during bacterial meningitis. Primary murine WT-astrocytes and a human cell line primed with LPS or lipopeptide and stimulated with MDP show significantly increased IL-1beta levels in the supernatant. NOD2-/- astrocytes do not show elevated IL-1beta levels. After screening of cytoplasmic proCaspase-1 and activated Caspase-1 by Western blot it became clear, that stimulation of NOD2 with MDP led to Caspase-1 activation and thus to IL-1beta maturation in primary murine WT-astrocytes. We demonstrate for the first time that the synergism between TLR4 and NOD2 leads to significantly elevated IL-1beta levels and that NOD2 is capable of activating caspase-1 in primary murine astrocytes. Another part of the work was to test the TLR/NLR-synergism on primary peritoneal macrophages from adult mice. Surprisingly, female NOD2-/- mice showed significantly elevated IL-1beta levels. SiRNA- and stimulation-experiments with RAW264.7-NOD2-/- cells pre-incubated in estrogen show a clear synergy in IL-1beta secretion through TLR4 and NOD2 receptors. Estrogen seems to protect females from infection when having a NOD2 deficiency.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Eine Melanomerkrankung im metastasierten Stadium ist heute noch eine nicht heilbare und in den meisten Fällen tödlich verlaufende Erkrankung. Über 50% der Patienten mit metastasierendem malignen Melanom entwickeln Lungenmetastasen. Nach dem Auftreten von Lungenmetastasen beträgt die durchschnittliche Überlebenszeit noch 7,3 Monate. Demnach ist die Entwicklung von Therapiestrategien notwendig, um das Fortschreiten von Tumormetastasen oder sogar deren Entstehung zu verhindern. Die lokale Stimulation der angeborenen Immunabwehr durch Behandlung mit Toll-like-Rezeptor-Agonisten käme hierfür in Frage. Inhalative Behandlungen mit Immunmodulatoren, wie sie für IL-2 beschrieben wurden, könnten insbesondere für die Behandlung pulmonaler Metastasen genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das pulmonale angeborene Immunsystem im Mausmodell durch den TLR2/6-Agonisten MALP-2 stimuliert und die Auswirkung dieser Immunstimulation auf experimentell induzierte pulmonale Melanommetastasen untersucht. Intratracheale Instillationen von 0,5 µg MALP-2 führten zu starker Einwanderung neutrophiler Granulozyten (6-fach) und Makrophagen (3,4-fach) in die Lunge von C57/BL6-Mäusen. Innerhalb von 24 h war das Maximum der Immunzelleinwanderung erreicht. Der Leukozyteneinstrom fiel dann innerhalb von 72 h wieder auf das Ursprungsniveau zurück. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass MALP-2 auch zu einer deutlichen Steigerung der Expression von VCAM-1 in pulmonalen Blutgefäßen führt. In vitro Experimente zeigten, dass dieses Adhäsionsmolekül die Bindung von B16-F10-Melanomzellen vermitteln kann.  Außerdem führte die MALP-2-Behandlung weder in vitro noch in vivo zu einer signifikanten Steigerung der Fähigkeit von Immunzellen, B16-F10-Melanomzellen zu lysieren.  So konnte, im Gegensatz zu Rückschlüssen aus früheren Publikationen, trotz der ausgeprägten Stimulation des pulmonalen Immunsystems und unabhängig vom Applikationsregime durch MALP-2 vor oder nach Tumorinokulation im Mausmodell keine signifikante Änderung der pulmonalen Metastasen erreicht werden. Durch Markierung von Melanomzellen, die stabil mit Green fluorescent Protein transfiziert waren, war es möglich, Melanomzellen kurz nach Tumorzellaussaat zu untersuchen. Eine lokale TLR2/6-Aktivierung durch MALP-2-Instillation 24 h vor Tumorinokulation führte aber in vivo zu keiner Beeinflussung des pulmonalen Melanomzellarrests im Mausmodell. Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch das „Boostern“ des Immunsystems durch wiederholte intratracheale MALP-2-Applikation an bereits etablierten pulmonalen Metastasen zu keiner Änderung des klinischen Gesamtresultates führt. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass diese teilweise unerwarteten Ergebnisse deutlich machen, dass klinische Vorhersagen bezüglich immunmodulierender Therapien mit Vorsicht zu stellen sind, insbesondere, da multiple, sich wechselseitig beeinflussende Effekte durch die Immunstimulantien selbst das Gesamtergebnis einer Tumortherapie beeinflussen können.

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