Orientador: Jacks Jorge Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:09:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SenaFilho_Marcondes_M.pdf: 9539347 bytes, checksum: ecd31e3eb890ecb3fcf26cc3dc064e25 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Sabe-se que a transição da mucosa normal para um carcinoma invasivo é um processo complexo, de múltiplas etapas e com etiologia multifatorial, onde as Lesões Potencialmente Malignas (LPMs) são de extrema importância. As LPMs são caracterizadas por uma maior possibilidade de malignização, quando comparadas à mucosa normal. Dentre estas, a Leucoplasia Bucal (LB) é a principal representante. Alguns estudos sugerem que há aumento da atividade de metaloproteinases (MMPs) 2 e 9 em mucosas com displasia epitelial e carcinomas espinocelulares (CECs) bucais, porém isso ainda não está totalmente claro e necessita de mais estudos. Os objetivos deste trabalho foram: 1) Avaliar a expressão imunoistoquímica das metaloproteinases 2 e 9; 2) Mensurar a atividade gelatinolítica total in situ; 3) Avaliar a integridade da lâmina basal através da expressão de colágeno IV; 4) Correlacionar e co-localizar a atividade gelatinolítica total in situ com a imunofluorescência de dupla marcação para colágeno IV e metaloproteinases 2 ou 9; 5) Correlacionar os achados anteriores com os aspectos clínicos e anatomopatológicos;. Foram realizadas 50 coletas (45 lesões e 5 controles) de biópsias oriundas de pacientes com suspeita clínica de lesões potencialmente malignas ou carcinomas bucais. Deste total, 30 (60%) receberam diagnóstico clínico de LB e 15 (30%) de CEC. Histopatologicamente, observou-se que 12 amostras tratavam-se apenas de hiperqueratose e acantose, 08 de displasia epitelial leve/moderada, 08 de displasia epitelial intensa, 10 CEC bem diferenciados e 04 carcinomas pouco diferenciados. Nas analises imunoistoquímicas, observou-se que a MMP-2 é fortemente expressa nos epitélios livres de displasia, diminuindo de acordo com a progressão da displasia epitelial ou indiferenciação da lesão. Ambas as MMPs foram expressas no estroma das lesões com displasia epitelial intensa e CEC's, porém a MMP-9 foi mais acentuada, principalmente nos CEC's indiferenciados. A atividade gelatinolítica in situ foi maior no epitélio dos controles e das hiperqueratoses e acantoses, se co-localizando apenas com a MMP-2. Todos os CEC's e 63% das displasias epiteliais intensas apresentaram descontinuidade da lâmina basal, onde houve co-localização das MMPs com atividade gelatinolítica. Nestas mesmas lesões, houve regiões de co-localização das MMP's, atividade gelatinolítica em lâminas basais ainda íntegras. A baixa expressão gelatinolítica das lesões displásicas e CEC's, correlacionado com as rupturas de lâmina basal e aumento da expressão das MMP's no estroma, além da co-localização das mesmas nas regiões de descontinuidade da lâmina basal, sugerem que as MMP's expressas no estroma das lesões provavelmente estão mais relacionadas com a progressão do tumor do que as expressas pelo parênquima / Abstract: The transition from normal oral mucosa to invasive carcinoma has a complex and multifactorial etiology. Oral leukoplakia (OL) is regarded as the most prevalent potentially malignant oral lesion, with a higher tendency for malignant transformation if compared to normal oral mucosa. Although an increased activity of matrix metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 in oral mucosa presenting varying degrees of epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinomas (OSCCs) has been suggested, but further investigation is necessary for confirming such association. Therefore, the aim of this research is to evaluate the immunohistochemical expression and the total in situ gelatinolytic activity of MMP-2 and MMP-9 in OL and OSCC, as well as to evaluate the integrity of the basal lamina through the expression of collagen IV, correlating the results obtained with clinical and pathological features. Immunohistochemical, immunofluorescent and in situ zymography reactions were carried out in 5 normal oral epithelium, 12 cases presenting hyperkeratosis and acanthosis with no epithelial dysplasia, 8 mild/moderate epithelial dysplasia, 8 severe epithelial dysplasia, 10 well differentiated and 4 poorly differentiated OSCC's. It was found that MMP-2 expression was higher in oral epithelium devoid of dysplasia, if compared to dysplastic and neoplastic oral epitheliums. In addition, despite both MMPs were expressed in the stroma of severe epithelial dysplasia and OSCC's samples, MMP-9 expression revealed to be more pronounced, especially in poorly differentiated OSCCs. in situ gelatinolytic activity was higher in normal epithelium and those presenting only hyperkeratosis and acanthosis, co-localizing only with MMP-2. All cases of OSCC and 63% of lesions with severe epithelial dysplasia showed discontinuity of the basal lamina, revealing co-localization of MMPs with in situ gelatinolytic activity in regions with continuous and discontinuous basal lamina. Taken together, the results obtained revealed that a low gelatinolytic activity in the parenchyma of dysplastic lesions and OSCC correlated with disruption of the basal lamina and with an increased expression of MMPs in the stroma, suggesting that MMP's expressed in the stroma of the lesions would be more related with tumor progression than MMP's expressed in the lesional parenchyma / Mestrado / Estomatologia / Mestre em Estomatopatologia

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nilton_cunha_filho.pdf: 562698 bytes, checksum: 8ecca8a95ee4af63a3925be6db47b247 (MD5) Previous issue date: 2007-06-29 / Neospora caninum is a protozoan parasite that causes neurological problems in dogs. It has been shown that it may act as definitive hosts of the parasite. There is a need for more information on the occurrences of N. caninum in due to the wide range of its incidence in several Brazilian states, and the lack of animals diagnosed serum positive in Rio Grande do Sul. Rural dogs from (meat and dairy producers) and urban areas from the city of Pelotas were examined. Serum samples of 339 dogs were tested for the detection of antibodies against N. caninum by indirect immunofluorescence (RIFI ≥1:50). Antibodies for N. caninum were found in 53 (15,6%) of the dogs serum samples. The occurrence in the urban area was 5,5%, among the rural dogs 14,1% (18 dogs) belonged to dairy and 28,4% (29 dogs) from cattle farms. Dogs over three years old present the higher levels of serum positively and its presence increased with age. The dogs antibody titers were 1:50 (12 dogs), 1:100 (07 dogs), 1:200 (08 dogs), 1:400 (19 dogs), 1:800 (05 dogs) and 1:1600 (02 dogs). None of the dogs examined presented clinical signs of neosporosis when the blood was collected. The study of the variables (risk factors for N. caninum) in the logistic regression between the rural and urban environment has shown that older animals are 3,75 times more likely to get infected by the N. caninum then the younger ones. Also in farms where the carcasses of dead animals are not removed there is a risk 2,67 times greater (IC 95% = 1,31 5,42) of a N. caninum infection. In the rural environment, dogs from cattle raising farms have a chance 2,24 times greater of being infected by N. caninum then dogs from dairy farms. In addition, the risk of having serum positive dogs in farms where the carcasses are not removed was more significant (OR = 6,11 IC 95% = 1,00 37,17). The data suggest that Neospora caninum is present in the southern region of Rio Grande do Sul and afflicts both rural and urban dogs. The probability of serum positive dogs in the rural area is grater, possibly by the easy access they have to infected material and the canine/bovine contact, which is characteristic of the cattle raising in the region. The main form of infection by N. caninum among the dogs studied is the horizontal (post natal), suggested by the fact that serum prevalence increase with the age. / Neospora caninum é um protozoário parasito que causa problemas neurológicos em cães. Foi demonstrado que os cães podem atuar como hospedeiros definitivos do parasito. Devido às diferenças entre as ocorrências e prevalências de N. caninum nos diversos estados brasileiros, e a falta de diagnóstico de animais soropositivos no Rio Grande do Sul, revelam a necessidade de maiores informações a respeito de ocorrências do N. caninum em cães no sul do Rio Grande do Sul. Cães provenientes do Município de Pelotas, de diferentes ambientes, rural (corte e leite) e urbanos domiciliados foram examinados. Amostras de soro de 339 cães foram testadas para a detecção de anticorpos para N. caninum mediante a reação de imunofluorescência indireta (RIFI ≥1: 50). Anticorpos para N. caninum foram encontrados em 53 (15,6%) amostras de soro dos cães. Na área urbana a ocorrência foi de 5,5%, entre os cães rurais, 14,1% (18 cães) eram de propriedades de criação de gado de leite e 28,4% (29 cães) de propriedade de corte. Foi observado que cães acima de três anos de idade são mais soropositivos para N. caninum e a soropositividade dos cães aumentou conforme aumentou a idade. Os títulos de anticorpos dos cães foram 1:50 (12 cães), 1:100 (07 cães), 1:200 (08 cães), 1:400 (19 cães), 1:800 (05 cães) e 1:1600 (02 cães). Nenhum dos cães examinados apresentou sinais clínicos de neosporose no momento da coleta de sangue. O estudo das variáveis (fatores de risco para N. caninum) na regressão logística feita entre o ambiente urbano e rural demonstrou que nos ambientes estudados, animais mais velhos tem 3,75 vezes mais chances de se infectarem com N. caninum do que animais jovens, até três anos de idade. Em propriedades que os proprietários não recolhem carcaças de animais mortos do campo representou um risco 2,67 vezes maior (IC 95% = 1,31- 5,42) de infecção por N. caninum. Quando analisou-se em separado o ambiente rural (leite e corte) observou-se que, cães provenientes de propriedades de criação de gado de corte tem 2,24 vezes mais chance de serem infectados por N. caninum do que cães de propriedades de produção leiteira, e o risco de cães serem soropositivos em propriedades onde os proprietários não tem o hábito de recolher carcaças de animais mortos do campo foi maior (Odds Ratio = 6,11 IC 95% = 1,00- 37,17). Os dados sugerem que Neospora caninum está presente na região sul do Rio Grande do Sul, infectando cães urbanos domiciliados e rurais (leite e corte). A probabilidade de cães da área rural da região serem soropositivos para N. caninum é maior neste ambiente, provavelmente pelo fácil acesso destes animais a material infectado e ao grande contato cão/bovino, característico da bovinocultura da região. A principal forma de infecção por N. caninum entre os cães analisados é a horizontal (pós-natal), uma vez que a soroprevalência aumenta conforme aumenta a faixa etária.

Orientador: Regina Maura Bueno Franco / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T02:37:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leal_DiegoAveraldoGuiguet_D.pdf: 4157800 bytes, checksum: 6b17942eb61d5ff1784bbd719d71b15b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Surtos de doenças gastrointestinais associados com a ingestão de moluscos bivalves crus ou mal cozidos têm sido reportados em todo o mundo. O procedimento mais utilizado para purificar os tecidos dos bivalves, consiste na utilização de água desinfetada com radiação UV aplicada em tanques de depuração, previamente à introdução dos animais no mercado. Os riscos de aquisição de infecções mediante o consumo de bivalves são maximizados quando estes são cultivados em áreas inapropriadas, ou quando são comercializados sem serem submetidos ao procedimento de depuração. Os objetivos deste estudo foram: avaliar a contaminação por cistos de Giardia duodenalis e oocistos de Cryptosporidium em ostras destinadas ao consumo humano, antes e após o procedimento de depuração com luz UV, e em águas salobras, nas etapas relacionadas com a cadeia produtiva de ostras no estuário de Cananéia, litoral sul de São Paulo; realizar a caracterização molecular de cistos de Giardia em diferentes etapas da produção de ostras para verificar os genótipos circulantes e aqueles relacionados com a infecção em humanos; enumerar a concentração de indicadores bacteriológicos de contaminação fecal, da área de cultivo até a etapa de depuração para verificar se atende à regulamentação do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Quatro pontos foram selecionados para coleta de água e ostras e pesquisa de protozoários: ponto 1: região de cultivo e engorda das ostras; ponto 2: captação de água; ponto 3: etapa de filtração de água e ponto 4: tanque de depuração. As amostras de água foram analisadas por filtração em membranas seguida de separação imunomagnética (IMS) e reação de imunofluorescência direta (RID). A contaminação das ostras foi verificada mediante análise de conteúdo líquido interno e lavado branquial por IMS e RID. A reação em cadeia da polimerase e o sequenciamento foram realizados para pesquisa de Giardia duodenalis e caracterização de seus genótipos. Giardia foi o patógeno mais prevalente em todos os pontos de água, sendo detectada em: 50,0%, 25,0%, 33,3% e 50,0% das amostras dos pontos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. O subgenótipo AII foi detectado em algumas amostras hídricas dos pontos 1, 2 e 4 e o genótipo C em duas amostras (pontos 3 e 4). Oocistos de Cryptosporidium foram detectados em 16,6% das amostras de água após a depuração. As ostras da região de cultivo continham cistos de Giardia duodenalis em 41,6% das amostras; o subgenótipo AII foi evidenciado em uma amostra. As ostras depuradas apresentaram a maior contaminação: 58,3% das amostras albergavam cistos de Giardia e 3 delas pertenciam ao subgenótipo AII. As análises bacteriológicas revelaram que o ponto de engorda (P1) estava adequado para o cultivo das ostras. Estes resultados refletem a ineficiência do procedimento de depuração com UV aplicado nesta planta de tratamento e a contaminação do produto - na etapa final que precede sua comercialização - por Giardia duodenalis pertencente ao subgenótipo AII, potencialmente infectante para seres humanos. Os resultados evidenciam a necessidade de monitoramento contínuo de patógenos e adequação da legislação do cultivo de moluscos bivalves no Brasil, a fim de garantir a segurança alimentar / Abstract: Many shellfish-borne associated outbreaks have been reported worldwide especially related to its ingestion raw or lightly cooked. In the shellfish industry, the most commonly utilized procedure to purify shellfish tissues consists in the utilization of UV disinfected water employed at depuration tanks, before they are placed on the market. The risks of acquiring gastroenteric diseases, through its consumption, are maximized when they are cultured on inappropriate growing areas or whenever they are sold without depuration procedure. The purposes of this study were: evaluate the contamination by Giardia duodenalis cysts and Cryptosporidium oocysts in oysters destined to human consumption, before and after UV depuration procedure, and in brackish waters at stages related to the food chain of edible oysters, from Cananéia estuary located on the south coast of São Paulo; perform molecular characterization of Giardia cysts at different stages of the production of oysters to verify the main circulating genotypes and those associated with human infection; enumerate bacteriological indicators of fecal contamination from growing site up to depuration site, to check if it complies with the National Environmental Council (CONAMA). Four sampling sites were selected for water and oysters harvesting and protozoa search: site 1- oysters growing area; site 2: catchment water; site 3: filtration stage of water treatment and site 4: oyster's depuration tank. Water samples were analyzed through membrane filtration technique followed by immunomagnetic separation (IMS) and direct immunofluorescence assay (IFA). Oysters' contamination was verified through the analysis of innerwater and gill wash using IMS and IFA. The polymerase chain reaction and sequencing reactions were performed to search for Giardia duodenalis and characterization of its genotypes. Giardia was the most prevalent pathogens in all water sites, where it was detected: 50.0%, 25.0%, 33.3% and 50.0% of water from sites 1, 2, 3 and 4 respectively. The subgenotype AII was detected in several water samples from sites 1, 2 and 4 and the genotype C in two samples (sites 3 and 4). Cryptosporidium oocysts were found in 16.6% of depuration water tank. Oysters from growing area harbored Giardia duodenalis cysts in 41.6% of the samples and subgenotype AII was evidenced once. Depurated oysters were the most contaminated: 58.3% were harboring Giardia duodenalis cysts and 3 belonged to subgenotype AII. Bacteriological analysis demonstrated that site 1 was adequate to growing oysters. These results indicate the ineffectiveness of the UV depuration applied in this shellfish treatment plant, and the contamination of the product - in the final stage which precedes its commercialization - by Giardia duodenalis belonging to subgenotype AII, potentially infectious to humans. The results highlight the need for continued monitoring of pathogens and suit the legislation on the cultivation of bivalve molluscs in Brazil in order to ensure food safety / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Intimina é o principal fator de virulência envolvido na lesão attaching/effacing em E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC), que são responsáveis pela diarreia infantil e colite hemorrágica/síndrome hemolítico-urêmica, respectivamente. Nos países em desenvolvimento, o diagnóstico desses patógenos ou é demorado e caro, ou não é realizado em laboratórios de rotina. No entanto, a detecção é essencial para definição do tratamento da infecção. O objetivo do presente trabalho foi definir o vetor de expressão mais apropriado e avaliar a sensibilidade e especificidade do scFv-intimina obtido. O gene scFv-intimina anteriormente obtido foi clonado nos vetores de expressão pAE e pSMT3, transformados em uma E. coli BL21 (DE3). A expressão foi induzida com 1 mM de IPTG. Em ambos os vetores, a proteína expressa foi direcionada para o citoplasma bacteriano, dessa forma a construção pAE-scFv-intimina foi utilizada na obtenção do anticorpo recombinante. Após cromatografia de afinidade ao níquel o scFv-intimina foi empregado no ensaio de imunofluorescência indireta para definir um teste de ensaio rápido e confiável, analisando-se 199 isolados de E. coli e isolados de outras Enterobactérias, dos quais 132 resultaram em isolados eae-positivos e 67 isolados eae-negativos. O teste de imunofluorescência mostrou a detecção de 132 isolados eae-positivos (100% de sensibilidade) e a não detecção de 67 isolados eae-negativos (100% especificidade). Assim, o ensaio de imunofluorescência é um método eficaz e rápido, e o scFv-intimina é uma excelente ferramenta para o imunodiagnóstico de EPEC e EHEC. / Intimin is the main virulence factor involved in the attaching/effacing lesion of enteropathogenic E. coli (EPEC) and enterohemorrhagic E. coli (EHEC), which are responsible for infantile diarrhea and hemorrhagic colitis/hemolytic uremic syndrome, respectively. In developing countries, their diagnosis is either time-consuming and expensive or is not done in the routine laboratory. Nevertheless, their detection is essential in defining the infection treatment. The aim of the study was to define the most suitable expression vector and evaluate the sensitivity and specificity of the scFv-intimin obtained. The scFv-intimin gene previously obtained was cloned into pAE and pSMT3 expression vectors and transformed into an E. coli BL21 (DE3) strain. Expression was induced with 1 mM IPTG. In both vectors, recombinant protein was expressed as inclusion bodies, so pAE was chosen as the expression vector for nickel affinity chromatography. Once purified, scFv-intimin was employed in an indirect immunofluorescence assay to define a rapid and reliable assay testing 199 E. coli strains and other Enterobacteriaceae isolates, of which 132 isolates were eae-positive and 67 isolates were eae-negative. The immunofluorescence assay showed the detection of 132 eae-positive isolates (100% sensitive) and no detection in the 67 eae-negative isolates (100% specific). Thus, immunofluorescence is an effective and rapid method and scFv-intimin an excellent tool for the immunodiagnosis of EPEC and EHEC.

Anticorpos recombinantes vêm sendo utilizados como ferramenta diagnóstica por serem produzidos com baixo custo e em larga escala. Partiu-se de um gene sintético que codifica um fragmento de anticorpo (scFv) específico contra a toxina termoestável, com otimização de códons para expressão em Escherichia coli. Esse gene foi amplificado no vetor de clonagem e subclonado em vetor de expressão pET28a. Células E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o plasmídeo recombinante e induzidas em meio de expressão. O fragmento de anticorpo obtido estava contido na fração insolúvel, portanto foi submetido a purificado por cromatografia de afinidade ao níquel na presença de ureia, seguido de renaturação. A molécula se apresentou funcional e sem reatividade com inespecífica por ensaios de imunofluorescência e ELISA. Além disso, mostrou-se estável quando armazenada a 4ºC, sendo assim uma ferramenta promissora para ser utilizada no diagnóstico de ETEC para detecção da toxina ST. / Recombinant antibodies have been used as diagnostic tools since they can be produced at low cost and on a large scale. A synthetic gene encoding an antibody fragment (scFv) specific for the heat-stable toxin (ST) with optimized codon for Escherichia coli expression was employed. This gene was amplified in the cloning vector and subcloned into pET28a expression vector. E. coli BL21(DE3) cells were transformed with the recombinant plasmid and induced. Large amounts of antibody fragment were found in the insoluble fraction. Thus it is submitted to nickel-affinity chromatography in urea presence, followed by refolding step. By immunofluorescence assay and ELISA, the obtained antibody showed to be functional with no cross-reaction to the negative controls. Furthermore, it was stable when stored at 4 °C, therefore a promising tool for ETEC diagnosis detecting the ST toxin.

Introdução: O remodelamento da matriz extracelular no líquen escleroso (LS) caracteriza-se histologicamente por uma faixa hialinizada situada predominantemente na derme superficial, semelhante ao que ocorre na lipoidoproteinose (LPE), uma genodermatose rara, na qual ocorre deficiência na produção da proteína 1 da matriz extracelular (ECM-1). Recentemente, em casos de LS foram descobertos auto-anticorpos contra a ECM-1 e um novo caminho foi proposto para desvendar a sua etiopatologia. O LS também é freqüentemente comparado com a Esclerodermia, visto que alguns autores consideram que são espectros de uma mesma doença. Na Esclerodermia e na LPE há aumento do colágeno tipo V (COL V), mas pouco se sabe sobre este tipo de colágeno no LS. Assim, o objetivo do presente trabalho foi demonstrar a localização e a quantidade de COL V e ECM-1 nas vulvas de pacientes com LS. Materiais e métodos: foram estudadas 21 biópsias de pacientes com LS vulvar e 21 biópsias de vulvas normais. A morfometria foi realizada nas imagens geradas através da imunofluorescência marcada com anticorpos contra os colágenos I (COL I), III (COL III) e V, e também nas de imunoistoquímica para ECM-1. Ademais, utilizou-se microscopia confocal a laser para visualizar o COL V e a ECM-1 na mesma lâmina. Resultados: Peles do grupo controle mostraram fraca e homogênea distribuição das fibras de COL I, III e V na imunofluorescência. Em contraste, peles com LS exibiram desarranjo da arquitetura da derme superficial e difuso aumento da fluorescência das fibras de COL I, III e V na faixa hialina. A fração de área das fibras de COL I, III, e V foram significativamente maiores nas peles de pacientes com LS em relação ao controle (p<0,05). Peles controles mostraram co-localização da ECM-1 e do COL V na parede de pequenos vasos e ao longo da membrana basal. Entretanto, no LS houve perda de expressão da ECM-1 na parede dos vasos sanguíneos (p<0,001) e difuso aumento da fluorescência verde do COL V (p<0,001). Conclusão: Houve inversa relação entre o COL V e a proteína ECe constatado pela histomorfometria, imunofluorescência, imunoistoquímica e reconstrução tridimensional, sugerindo que estratégias terapêuticas para prevenir o aumento da síntese de COL V e a diminuição da ECM-1 poderão ser promissoras no prognóstico e tratamento do LS / Background: The extracellular matrix remodeling in lichen sclerosus (LS) is characterized in routine light microscopy by a hyalinized band predominantly located in the superficial dermis. The same pattern occurs in the lipoid proteinosis (LPE), a rare genodermatosis, in which the production deficiency of extracellular matrix protein 1 (ECM-1) is responsible for triggering the disease. Recently, in cases of LS, autoantibodies were discovered against ECM-1 and a new way to unravel their aetiopathology was proposed. LS is also frequently compared with Scleroderma, since some authors consider that they are spectra of a similar disease. In Scleroderma and LPE there is an increase of type V collagen (COL V), but little is known about this type of collagen in LS. Thus, the objective of the current study was to demonstrate the location and quantity of COL V and ECM-1 on the vulvas of patients with LS. Materials and methods: Twenty one biopsies from patients with vulvar LS matched with 21 biopsies from normal vulvas were included in this study. Immunofluorescence against type I (COL I), (COL III) and V collagen and immunohistochemistry for ECM-1 was performed and the slides were analysed by morphometry. Furthermore, laser confocal microscopy was used to visualize the COL V fibers and the ECM-1 protein on the same slide. Results: Skins of the control group showed low and homogeneous distribution of fibers COL I, III and V in immunofluorescence. In contrast, skins with LS exhibited disruption of the architecture of the superficial dermis and diffuse increase in fluorescence fibers COL I, III and V in the range hyaline. The area fraction of fibers COL I, III, and V were significantly higher in the skin of patients with LS compared to control (p <0.05). Skins controls showed colocalization of ECM-1 and COL V the wall of small vessels and along the basement membrane. However, the LS had loss of expression of ECM-1 the wall of blood vessels (p <0.001) increase the fluorescence and diffuse green COL V (p <0.001). Conclusion: There was an inverse relationship between COL V and ECM-1 protein in LS as demonstrated by histomorphometry, immunofluorescence, immunohistochemistry and three-dimensional reconstruction, suggesting that therapeutic strategies to prevent the increased synthesis COL V and ECM-1 protein in LS as demonstrated by histomorphometry, immunofluorescence, immunohistochemistry and three-dimensional reconstruction, suggesting that therapeutic strategies to prevent the increased synthesis COL V and decreased ECM-1 may be promising in the prognosis and treatment of the LS

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é uma doença infecciosa causada por Rickettsia rickettsii, transmitida pelo carrapato-estrela Amblyomma sculptum no interior do estado de São Paulo, onde equinos e capivaras são utilizados como sentinelas para FMB por serem considerados hospedeiros primários deste carrapato. Objetivou-se com este trabalho verificar a ocorrência de anticorpos anti-Rickettsia rickettsii em sentinelas clássicos (equinos) e potenciais (ovinos, bovinos e gambás) para FMB que vivem em diferentes ambientes do Campus \"Luiz de Queiroz\", da Universidade de São Paulo, em Piracicaba-SP. De fevereiro de 2017 a janeiro de 2018 foram amostrados 156 hospedeiros, 48 que habitam áreas urbanas, sem a presença ou trânsito de capivaras (15 equinos e 33 gambás), 60 ovinos que frequentam pastagens sem presença de capivaras, mas adjacentes a matas ciliares ocupadas pelos roedores, e 48 que frequentam pastagens por onde transitam capivaras (31 bovinos e seis equinos) ou matas ciliares ocupadas pelos roedores (11 gambás). Quando possível, a amostragem envolveu a coleta de ectoparasitos. O soro obtido após centrifugação do sangue colhido foi analisado em duas etapas, triagem e titulação, pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Na triagem todas as amostras foram testadas contra R. rickettsii, e consideradas positivas se apresentassem título de anticorpos >= 64. As amostras positivas foram diluídas na etapa de titulação e testadas contra R. rickettsii, R. parkeri, R. bellii, R. ambyommatis e R. rhipicephali para determinação do título máximo de anticorpos para cada espécie. Das 156 amostras testadas, 15 estavam soropositivas, 1/60 ovinos, 1/31 bovinos, 7/21 equinos e 6/44 gambás; os títulos finais variaram de 64 a 4.096. Foi possível determinar o possível antígeno envolvido em reação homóloga (PAERH) em seis amostras, um equino (R. bellii) e quatro gambás e um ovino (R. rickettsii). Foram registrados os carrapatos Amblyomma ovale, Amblyomma dubitatum, Amblyomma sculptum, Dermacentor nitens e Rhipicephalus microplus, e as pulgas Ctenocephalides felis e Siphonaptera: Rhopalopsyllidae cf. Rhopalopsyllus nos hospedeiros amostrados. Conclui-se que equinos e gambás podem ser utilizados como sentinelas para FMB no Campus \"Luiz de Queiroz\", mas os ovinos não. Não foi possível concluir se os bovinos podem ser utilizados com esta função. R. bellii, ou um microrganismo muito semelhante, ocorre na área urbana do Campus \"Luiz de Queiroz\" e é capaz de infectar cavalos. R. rickettsii, ou um microrganismo muito semelhante, ocorre no Campus \"Luiz de Queiroz\" em áreas de permanência e trânsito de capivaras / Brazilian Spotted Fever (BSF) is an infectious disease caused by Rickettsia rickettsii, transmitted by the tick Amblyomma sculptum outside the metropolitan region in the State of São Paulo, where horses and capybaras are used as sentinels for BSF as they are considered primary hosts for this tick. This survey aimed to verify the occurrence of antibodies against Rickettsia rickettsii in sentinels (horses) and potential sentinels (sheep, cattle and opossums) for BSF that lives in different environments of the \"Luiz de Queiroz\" Campus, University of São Paulo, in Piracicaba, SP, Brazil. A total of 156 host were sampled between February of 2017 and January of 2018; 48 that live in urban areas, with no presence or transit of capybaras (15 horses and 33 opossums), 60 sheep that regularly graze on capybara-free pastures adjacent to a riparian forest occupied by these rodents, and 48 that occupy, cross or regularly graze on pastures (31 cows and six horses) or riparian forests (11 opossums) that are areas used by capybaras. Whenever possible, host sampling included ectoparasites collection. Sera obtained after centrifugation of the collected blood was analyzed in two steps, screening and titration, by the indirect immunofluorescence assay technique (IFA). All samples were tested against R. rickettsii during the screening, and those that presented antibodies titers >= 64 were considered positive. Positive samples were diluted during titration and tested against R. rickettsii, R. parkeri, R. bellii, R. ambyommatis and R. rhipicephali for determination of maximum antibodies titers for each species. Of the 156 tested samples, 15 were seropositive, 1/60 sheep, 1/31 cows, 7/21 horses and 6/44 opossums; antibodies endpoint titers ranged from 64 to 4.096. Possible antigen involved in a homologous reaction (PAIHR) was determined for six samples, one horse (R. bellii), four opossums and one sheep (R. rickettsii). The ticks Amblyomma ovale, Amblyomma dubitatum, Amblyomma sculptum, Dermacentor nitens and Rhipicephalus microplus, and the fleas Ctenocephalides felis and Siphonaptera: Rhopalopsyllidae cf. Rhopalopsyllus were collected from the sampled hosts. Results showed that horses and opossums may be used as sentinels for BSF in the \"Luiz de Queiroz\" Campus, but the sheep do not. It wasn\'t possible to determine if the cows may be used as sentinels. R. bellii, or a very closely related microorganism, occurs in the urban area of the \"Luiz de Queiroz\" Campus and is capable to infect horses. R. rickettsii, or a very closely related microorganism, occurs in capybara-transit areas of the \"Luiz de Queiroz\" Campus

O mecanismo de formação e origem das alterações nucleares ainda é pouco conhecido, sendo o micronúcleo a mais estudada. As células tumorais geralmente apresentam vários tipos de alterações nucleares que estariam associadas à instabilidade genética. O objetivo deste trabalho foi analisar as possíveis associações entre alterações nucleares e citoesqueleto em células HK2 e A549, derivadas de carcinoma de pulmão humano. Otimizamos a metodologia de uso do MCVL para redefinir as alterações nucleares e caracterizar os principais filamentos do citoesqueleto em preparações coradas por Feulgen ou imunofluorescência. As células da linhagem HK2 apresentaram fibras de actina dispostas concentricamente e em "clusters" e os filamentos de tubulina apareceram de forma radial, enquanto que o padrão de distribuição em A549 foi mais semelhante ao das células normais (BRL3A). Os filamentos de lamina B foram os mais importantes para evidenciar as alterações nucleares, porém essas alterações não puderam ser relacionadas com alterações do citoesqueleto. / The origin and mechanism of formation of the nuclear alterations is largely unknown, with the micronucleus being the most well studied alteration. Tumor cells generally present various types of nuclear alterations witch can be associated with genetic instability. The propose of this study was to analyze the possible association between nuclear alterations and the cytoskeleton in the human lung carcinoma cells HK2 and 549. The method of LSM was optimized to redefine the nuclear alterations and to characterize the principal cytoskeletal filaments in preparations stained with Feulgen’s reagent or submitted to imunofluorescent methods. The HK2 cells presented actin fibres arranged either concentrically or in clusters and tubulin filaments arranged radially, while in the A549 cells the distribution pattern was similar to that of normal cells (BRL3A). The lamin B filaments were the most important to identify nuclear alterations, as these alterations could not be related to cytoskeletal alterations.

Hipopituitarismo congênito é caracterizado por deficiência hormonal múltipla devido a mutações de fatores de transcrição envolvidos na embriogênese hipofisária. As células-tronco estão presentes na hipófise e são caracterizadas por dar origem a uma célula progenitora e uma célula indiferenciada por divisão assimétrica. Estão envolvidas na hipófise em processos de alta demanda metabólica em diferentes fases da vida. Em estudos prévios, observou-se o acúmulo dos marcadores de células-tronco Sox2 e Nr2e1 no camundongo Ames, que apresenta mutação no gene Prop1. O Sox2 é o marcador consenso de células-tronco na hipófise enquanto que o Nr2e1, nunca antes caracterizado na hipófise, é essencial para a manutenção de células-tronco e neogenese no cérebro. A perda de função deste gene pode causar agressão e falta de instinto materno em camundongos. Com isso, o objetivo desse projeto foi utilizar o animal modelo zebrafish para avaliar o papel repressor do gene prop1 e caracterizar o gene nr2e1 bem como, confirmar se o mesmo está envolvido com a diferenciação terminal na hipófise, e sua interferência no comportamento do animal mutado. O zebrafish se encaixa adequadamente nesse projeto pois é de fácil manutenção, econômico e com rápido desenvolvimento. No presente estudo criou-se 2 modelos de zebrafish utilizando-se a técnica de edição genômica conhecida como CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para nocautear os genes prop1 e nr2e1. Esta técnica permite uma interrupção específica e substituição de bases no genoma, resultando em uma alta especificidade, baixa toxicidade celular e é herdável. O zebrafish homozigoto com mutação no gene nr2e1 se desenvolve e reproduz como o animal controle, porém apresenta um comportamento mais exploratório quando comparado com o animal selvagem e o heterozigoto. A imunofluorescência para o anticorpo Sox2 no animal mutado mostrou se diferente do selvagem, pois apresenta um aumento da expressão temporal e o mesmo não se colocaliza com o Nr2e1. A imunofluorescência feita com os hormônios não se mostrou diferente entre o mutado e o selvagem. Conclui-se diante dos achados de normalidade do desenvolvimento, fertilidade, ausência de co-localização com o gene Sox2 e presença de hormônios como Tsh, Fsh e Gh, que o gene nr2e1 não é crucial na diferenciação terminal na hipófise porém o animal mutado apresenta um comportamento diferente do animal selvagem. Os resultados da caracterização do zebrafish com mutação no gene prop1 ainda estão em andamento devido a dificuldade de se estabelecer essa linhagem / Congenital hypopituitarism is characterized by multiple hormone deficiencies due to mutations in transcription factors involved in pituitary embryogenesis. Stem cells, which by definition can each give rise to a progenitor and an undifferentiated cell by asymmetric division, are present in the pituitary gland and are important during periods of high metabolic demand in different phases of life. In previous studies, the accumulation of the stem cell markers Sox2 and Nr2e1 was observed in the Ames mouse, which harbors a mutation in Prop1. Sox2 is the consensus stem cell marker in the pituitary gland, while the role of Nr2e1 in the pituitary development has not been characterized although it is essential for neural stem cell maintenance and neogenesis in the brain and its loss of function causes pathological aggression and lack of maternal instinct in mice. In this project, the zebrafish animal model was used to characterize the role of nr2e1, to confirm whether this gene can be involved in the pituitary terminal differentiation, and to determine the effects of this gene on animal behavior. The zebrafish is a particularly appropriate model for use in this project because it is easy to maintain, is economical, and has a rapid metabolism and growth rate. In the present study, we created 2 zebrafish models by knocking out prop1 and nr2e1 using the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genome-editing technique. This technique enables highly specific gene/reading frame interruption and/or base substitution in the genome, with low cellular toxicity and high heritability. Zebrafish with homozygous nr2e1 mutations develop and reproduce similarly to wild-type zebrafish, but present a more exploratory behavioral pattern compared to wild-type and heterozygous zebrafish. Based on immunofluorescence, Sox2 expression was higher in the mutant zebrafish than in the wild type and was not co-localized with Nr2e1 expression. Hormone expression did not differ between wild-type and mutant zebrafish. We conclude that nr2e1 is not crucial in the terminal differentiation of the hormone-forming pituitary gland; however, it induces a distinct behavioral phenotype at the larval stage. Analyses of zebrafish harboring a prop1 mutation are ongoing owing to issues with the establishment of the lineage

Introdução: A bronquiolite aguda é a principal causa de internação de lactentes menores de um ano de idade e tem como principal agente etiológico o vírus sincicial respiratório (VSR). O diagnóstico baseia-se na apresentação clínica e epidemiologia. A maioria das medidas terapêuticas é controversa e apesar da etiologia viral, a prescrição de antibióticos sistêmicos é freqüente. Não está claro se a pesquisa etiológica viral pode influenciar na conduta nesses lactentes. Objetivo: Analisar o impacto da realização de pesquisa etiológica viral sobre a conduta terapêutica, em lactentes internados com bronquiolite aguda. Casuística e métodos: Foi realizado estudo de coorte histórica que incluiu lactentes menores de 12 meses, internados no Hospital Universitário da USP durante dois anos, com diagnóstico de alta de bronquiolite aguda e que tiveram coletado aspirado de nasofaringe, para pesquisa viral, por imunofluorescência indireta (IFI), à admissão. Foram excluídos os lactentes com fatores de risco conhecidos para desenvolver doença grave. As informações foram coletadas dos prontuários. As alterações de condutas realizadas até 24 horas após a divulgação do diagnóstico etiológico foram consideradas associadas ao resultado da IFI. Resultados: Dentre 1199 lactentes, menores de 12 meses hospitalizados, 71% apresentaram diagnóstico de doença aguda do aparelho respiratório, sendo que 33% apresentaram bronquiolite. Desses, 33 foram excluídos e 20 não puderam ter a análise concluída. A idade média, dos 230 lactentes estudados, foi de 4 meses (± 2,7) e 56% foram do sexo masculino. Broncodilatadores, corticosteróides e antibióticos foram prescritos, à admissão em 80%, 52% e 55% dos casos, respectivamente. A pesquisa viral foi positiva para algum vírus em 165 casos e negativa em 65. O VSR foi identificado em 146 casos e outros vírus em 19. Os grupos com pesquisa viral negativa e positiva foram semelhantes com relação à prescrição de antibióticos (52% x 56%, respectivamente, p = 0,636), corticosteróide (42% x 56% -p = 0,052) e broncodilatadores (74% x 83%, p = 0,114) à admissão. A suspensão de antibióticos predominou nos pacientes com pesquisa viral positiva (35,6% x 9,2%, p < 0,001). Não houve alteração significante quanto as prescrições de corticosteróides e broncodilatadores. Também na comparação entre pacientes VSR (+) e com resultado negativo para pesquisa viral, o padrão de alterações de conduta foi semelhante. Houve suspensão de antibióticos em 32,2% e 9,2%, respectivamente (p < 0,001). O resultado positivo da pesquisa viral foi o único fator independentemente associado à suspensão de antibióticos, tanto no grupo com pesquisa viral positiva para qualquer vírus (RR = 3,37, p = 0,005) como no grupo VSR(+) (RR = 3,33, p = 0,006) Conclusão: Em lactentes hospitalizados com BA, o resultado positivo da pesquisa viral por IFI, foi determinante da suspensão de antibióticos sistêmicos, prescritos à admissão. / Background: Acute bronchiolitis is the leading cause of infant hospitalization, and it is most commonly caused by respiratory syncytial virus (RSV). Etiological tests are not required for its diagnosis, which can be made clinically. The most prescribed therapeutic measures are controversial, and in spite of the viral etiology, the prescription of systemic antibiotics is frequent. It remains unclear whether viral screening could contribute to therapy adjustment. Objective: To analyze the impact of viral screening on the therapeutic management of hospitalized infants with acute bronchiolitis. Patients and methods: A retrospective cohort was performed to assess the impact of RSV screening on medication prescription. The study included infants up to 1 year of age who were hospitalized at the University Hospital USP for 2 years, with bronchiolitis as discharge diagnosis and who had nasopharyngeal samples collected on admission for virus screening, by indirect immunofluorescence assay (IFA). Infants were excluded if they had a known risk factors for developing severe disease. Clinical information was obtained from the patients medical records. Therapeutic changes were considered to be associated with viral screening when made within 24 hours of the release of IFA results. Result: Among 1199 hospitalized infants younger than 12 months, 71% were diagnosed with acute lower respiratory disease, of which 33% had bronchiolitis. Of these, 33 were excluded and 20 could not have the analysis completed. The average age of the 230 infants studied was 4 months (+/- 2.7) and 56% were male. Bronchodilators, steroids and antibiotics were prescribed on admission for 80%, 52%, and 55% of cases, respectively. The viral test was positive for some virus in 165 cases and negative in 65. RSV was identified in 146 cases and other viruses in the 19. At admission, the groups with negative or positive viral test were similar regarding the prescription of antibiotics (52% vs 56% respectively, p=0.636), corticosteroids (42% vs 56%, p=0.052) and bronchodilators (74% vs 83%, p=0.114). The discontinuation of antibiotics predominated in patients who tested positive for virus (35.6% vs 9.2%, p<0.001). There were no significant changes regarding the prescription of corticosteroids and bronchodilators. Also, when comparing patients with viral test positive for RSV or negative for any virus the patterns were similar. There was discontinuation of antibiotics in 32.2 % and 9.2%, respectively (p=0.001). The positive result of viral test was the only independent factor associated with the discontinuation of antibiotics, both in the group with positive viral test for any virus (RR=3.37, p=0.005) and in the RVS (+) group (RR=3.33, p=0.006). Conclusion: In hospitalized infants with acute bronchiolitis, the positive result for virus screening, by IFA was an independent factor associated to the discontinuation of systemic antibiotics prescribed at admission.