A Leishmaniose é uma doença parasitária emergente em algumas regiões do Brasil causada por protozoário do gênero Leishmania. No ano de 2002 foi notificado o primeiro caso humano autóctone de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no município de Porto Alegre/RS, Bairro Lomba do Pinheiro. No meio urbano, o cão tem papel importante, servindo como fonte de infecção e reservatório do protozoário. Este estudo teve como objetivo avaliar o emprego de ELISA e PCR no diagnóstico da LTA em cães domiciliados na Estrada do Rincão, Bairro Lomba do Pinheiro, Porto Alegre. JESUS (2006) coletou e submeteu 200 amostras de soro de cães oriundos desta área de risco à Imunofluorescência Indireta (IFI) encontrando uma soroprevalência de 3,5% (7/200). Em nosso estudo, empregaram-se o ensaio imunoenzimático para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina, kit Biomanguinhos/FIOCRUZ, com 61 (30,5%) dos 200 soros caninos sororeagentes e nestes foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) na qual apenas a amostra 12C de uma fêmea, sem raça definida, com quatro anos de idade, replicou o DNA de Leishmania spp. Utilizando o Teste Exato de Fisher para a análise estatística quanto à idade, sexo e raça, observou-se que houve associação significativa com a positividade em ELISA e a idade dos cães (p=0,0037), enquanto que quanto ao sexo (p=0,0687) e raça (p=0,1261) não encontramos associação significativa na positividade em ELISA. O Teste de McNemar`s foi aplicado aos resultados obtidos pelas técnicas de ELISA e IFI evidenciando uma diferença muito significativa entre as duas técnicas (p<0,0001). A identificação de cães soropositivos, sem sintomatologia, em área de baixa endemicidade no município de Porto Alegre, com casos humanos autóctones, serve como alerta e ponto de partida para mais investigações sobre a epidemiologia da LTA no RS e também sobre o emprego de outras técnicas de diagnóstico mais sensíveis. / Leishmaniasis is an emerging parasitic disease in some areas of Brazil caused by a protozoa of the genus Leishmania. In the year of 2002 it was notify the first autochthon human case of American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) in the city of Porto Alegre /RS, Bairro Lomba do Pinheiro. In the urban way, the dog has important paper, serving as source of infection and reservoir of the protozoa. This study it had as objective to evaluate the job of ELISA and PCR in the diagnosis of the ATL in dogs domiciliated in the Road of the Rincão, Bairro Lomba do Pinheiro, Porto Alegre. JESUS (2006) collected and submitted 200 samples of serum of deriving dogs of this area of risk to Indirect immunofluorescent reaction (IFI) finding a soroprevalence of 3,5% (7/200). In our study, they had used for diagnosis Canine Visceral Leishmaniasis, kit Biomanguinhos/FIOCRUZ, with 61 (30.5%) positives samples of the 200 canine serum and in these the reaction in chain of polimerase in which only the sample 12C of a female, without defined race, with four years of age, presented the response of the DNA of the Leishmania genus in the PCR. Using the Accurate Test of Fisher for the analysis statistics how much to the age, sex and race, it was observed that it had significant association it enters the positividade in ELISA and the age of the dogs (p=0,0037), whereas how much to the sex (p=0,0687) and race (p=0,1261) we do not find significant association with the positividade in ELISA. The Test of McNemar `s was applied to the results gotten for the techniques of ELISA and IFI having evidenced a significant difference very between the two techniques (p< 0,0001). The identification of soropositives dogs, without symptons, in area of low endemicity in the city of Porto Alegre, with autochthon human case, also serves as alert and starting point for more inquiries on the epidemiology of the ATL in the RS and on the job of others techniques of more sensible diagnosis.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T17:10:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Walker Oliveira.pdf: 646440 bytes, checksum: 715267f8e674a7d1a347adde1fef2b75 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T17:10:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Walker Oliveira.pdf: 646440 bytes, checksum: 715267f8e674a7d1a347adde1fef2b75 (MD5) / NIH Grant; CAPES / Introdução: A forte resposta do tipo Th1, com produção exagerada de IFN- e TNF-α, observada na leishmaniose tegumentar humana causada por Leishmania braziliensis está associada com a destruição tecidual e desenvolvimento de lesão observada em pacientes com leishmaniose cutânea (LC) e em pacientes com leishmaniose mucosa (LM). Em contraste com essas formas clínicas, 10% dos indivíduos residentes em área endêmica, apesar de apresentarem reação de hipersensibilidade tardia para o antígeno de Leishmania, não apresentam evidências de doença clínica e são considerados como tendo a forma subclínica (SC) da doença. A produção de IFN-γ e TNF-α nestes indivíduos é menor quando comparada com pacientes com LC. Existem várias evidencias que a forte resposta inflamatória não modulada está associada com a patogênese da LC e da LM. Embora os indivíduos SC apresentem uma resposta inflamatória mais fraca, ainda não é bem conhecido como eles controlam a infecção. Uma resposta Th1 eficiente e modulada pode estar envolvida na proteção da infecção por L. braziliensis. A modulação da resposta imune é feita principalmente por citocinas moduladoras como IL-10, TGF-β e mais recentemente por IL-27. Objetivo: Avaliar o papel de citocinas regulatórias e de antagonistas de citocinas na modulação da resposta imune na infecção por L. braziliensis. Metodologia: Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de 40 pacientes com LC, 18 com LM e 13 indivíduos com infecção subclínica foram estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA) na presença e ausência de citocinas regulatórias (IL-10, IL-27 e TGF-β) ou antagonistas de citocinas (α-TNF-α e α-IFN-γ). A produção de citocinas (IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-γ) foi mensurada através da técnica de ELISA e de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Resultados: IL-10 e TGF-β apresentaram atividade moduladora da produção de TNF-α e IL-17, sobretudo na LC, enquanto IL-27 não apresentou efeito modulador na produção de TNF-α, IFN-γ e IL-17 em nenhuma das formas clínicas da leishmaniose tegumentar. A neutralização de TNF-α diminuiu a produção de IFN-γ, mas não alterou a produção de IL-10, enquanto a neutralização de IFN-γ diminuiu a produção de TNF-α e aumentou a produção de IL-10 nesses pacientes. A produção de IL-17 foi maior nos indivíduos SC, embora sem significância estatística e a neutralização de IL-10 não alterou a produção de IFN-γ nesses indivíduos. Entretanto a expressão de IL-27 foi maior em pacientes com LC quando comparado com os indivíduos SC. Conclusões: IL-10 e TGF-β parecem ser as citocinas mais envolvidas na modulação da resposta imune em pacientes com LC e LM, principalmente IL-10, desde que a neutralização de IFN-γ diminui a produção de TNF-α de uma forma dependente de IL-10. A produção de IL-17 nos indivíduos SC sugere que essa citocina pode estar envolvida na proteção contra a infecção por L. braziliensis. / Salvador

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-08-14T17:17:44Z No. of bitstreams: 1 dissertação Fernanda Alvarenga Cardoso 1.pdf: 1458584 bytes, checksum: a3070865cab7509b6900f5f36ab2b623 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-14T17:17:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação Fernanda Alvarenga Cardoso 1.pdf: 1458584 bytes, checksum: a3070865cab7509b6900f5f36ab2b623 (MD5) Previous issue date: 2013 / Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) vem sendo utilizada para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) com diferentes objetivos: o diagnóstico da infecção, da doença e o controle de cura. Para utilização em larga escala, a etapa de eletroforese para detecção dos produtos amplificados na PCR, torna a técnica complexa e onerosa. A PCR-ELISA representa uma alternativa de detecção do produto amplificado por PCR através de um ensaio imunoenzimático (ELISA). Esta técnica é capaz de conferir maior sensibilidade e rapidez para a análise de grandes números de amostras clínicas com o uso de equipamentos utilizados para processamento de ELISA e, portanto, permite realizar PCR para fins de diagnóstico em laboratórios de média complexidade. Assim, este estudo objetivou desenvolver e validar o método de detecção colorimétrica dos produtos de amplificação gerados pela reação de PCR para o diagnóstico da LV em amostras de sangue periférico.O método de PCR-ELISA foi desenvolvido para detecção de fragmento de DNA do cinetoplasto (kDNA), complexo Donovani-específico. Utilizando-se cepas referências de Leishmania em cultivo e de painel de amostras de sangue periférico humano de 11 indivíduos não infectados, moradores de área endêmica e 14 casos de LV, caracterizadas clínica e parasitologicamente, determinou-se o limite de detecção da reação, medidas de precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) e limite entre positivo e negativo (cut-off). A avaliação do desempenho do ensaio foi realizada com amostras de sangue periférico de 105 pacientes portadores de LV, 25 pacientes portadores da co-infecção Leishmania/HIV e de 73 indivíduos moradores de área endêmica para a LV. Foi desenvolvido ainda um ensaio de PCR-ELISA para detecção do DNA amplificado do gene humano ACTB, para uso como controle do processo de extração de DNA e amplificação por PCR das amostras clínicas. O ensaio PCR-ELISA kDNA desenvolvido apresentou limite de detecção de 1 parasito/mL de sangue e 0,07fg/µL de DNA de L. (L.) infantum, sensibilidade de 100% (IC 95%: 97,1 a 100%) e especificidade de 95% (IC 95%: 83,5 a 98,6%). Todos os indivíduos assintomáticos de área endêmica, com positividade por outras técnicas diagnósticas, foram também positivos pela PCR-ELISA. Todas as amostras foram testadas satisfatoriamente para o ensaio de PCR-ELISA ACTB. O ensaio de PCR-ELISA kDNA, desenvolvido e validado neste estudo, apresenta simplicidade metodológica e operacional, permite interpretação objetiva da amplificação por PCR do DNA de Leishmania do complexo Donovani e desempenho adequado no diagnóstico da LV em laboratórios de referência. / In recent decades, the polymerase chain reaction (PCR) has been used for the diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) with different goals: diagnosis of infection, disease control and cure. For large-scale use, the step of electrophoresis to detect amplified products of PCR makes this technique more complex and costly. The PCR-ELISA is an alternative for the detection of the amplified PCR product through an immunoenzymatic assay (ELISA). This technique offers higher sensitivity and speed for the analysis of large numbers of clinical specimens, using equipment widely used for processing sets of ELISA and therefore allows performing PCR for diagnostic purposes in laboratory of medium complexity. Thus, this study aimed to develop and validate the colorimetric detection method (ELISA) for amplification products generated by PCR targeting the diagnosis of VL.The method of PCR-ELISA was developed to detect a fragment of DNA of kinetoplast (kDNA) specific from Leishmania donovani complex. Using reference strains of Leishmania in cultivation and a panel of human peripheral blood samples of 11 non-infected individuals, residents of endemic area and 14 cases of VL with clinical and parasitological characterization, we determined the detection limit of the reaction, precision measurements (repeatability and reproducibility) and limit between positive and negative (cut-off). The performance of the assay was evaluated with peripheral blood samples of 105 patients with VL, 25 patients showing the co-infection Leishmania/HIV and 73 individuals living in endemic areas for VL. A PCR-ELISA assay for detection of DNA from the human ACTB gene was also developed for use as control for the process of DNA extraction and amplification by PCR of clinical samples. The PCR-ELISA kDNA assay developed showed a detection limit of 1 parasite/ml blood and 0.07 fg/µL of DNA from L. (L.) infantum. The assay showed a sensitivity of 100% (IC 95%: 97.1 to 100%) and specificity of 95% (IC 95%: 83.5 to 98.6%). All asymptomatic individuals from an endemic area, who were diagnosed for LV by other techniques, were also positive by PCR-ELISA kDNA. All samples were tested satisfactorily by PCR-ELISA ACTB assay. The PCR-ELISA kDNA assay was developed and validated in this study. It presents methodological and operational simplicity; enables objective interpretation of PCR amplification of DNA from Leishmania donovani complex and have sufficient performance for diagnosis of VL in reference laboratories.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T12:22:27Z No. of bitstreams: 1 tese_08jan07.pdf: 1988366 bytes, checksum: 584c0ca6f9da69b72d85326e595be0af (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T12:22:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_08jan07.pdf: 1988366 bytes, checksum: 584c0ca6f9da69b72d85326e595be0af (MD5) Previous issue date: 2011-08-08 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Sinais acústicos são importantes na corte de diversos insetos. Esse som é geralmente espécie-especifico sendo importante para o isolamento reprodutivo de espécies próximas. Machos de Lutzomyia longipalpis produzem sinais acústicos durante a cópula. Existem fortes evidências de que este taxa constitui um complexo de espécies. Lutzomyia cruzi é uma espécie próxima a L. longipalpis que possivelmente também faz parte deste complexo. Em nosso trabalho, foram analisados detalhadamente os sons de cópula de machos de 14 populações brasileiras de L. longipalpis, sendo seis destas provenientes de três localidades (Sobral, Estrela de Alagoas e Jaíba) onde análises prévias indicavam a ocorrência de espécies simpátricas cujos machos diferem no número de pintas abdominais (uma ou duas pintas, chamados respectivamente de 1P e 2P). Foi analisado também o som de machos de L. cruzi. A análise mostrou que o som produzido durante a cópula, tanto por machos de diferentes populações de L. longipalpis quanto de L. cruzi, é composto por um som primário mais rápido e um secundário mais lento. O som secundário é semelhante em todas as populações estudadas, enquanto que, o primário apresenta variação significativa tendo sido encontrados três tipos diferentes: o som pulsado, o de “burst” e o misto. O tipo pulsado é diversificado e foi encontrado nas populações de Jacobina, Lapinha, Sobral 1P, Teresina, Jaíba 1P e Estrela 1P. Cinco padrões diferentes foram observados entre estas populações. Estes padrões diferem significativamente em todos os parâmetros analisados (intervalo entre pulsos, número de pulsos, tamanho do trem, freqüência e ciclos por pulso). As populações de Sobral 2P, Jaíba 2P, Estrela 2P, Natal, Marajó, Pancas e Nova Porterinha produzem som do tipo “burst”. A comparação destas populações mostrou diferenças significativas apenas no intervalo entre “bursts”. Além disso, o padrão em si não é diferente entre elas. Esse tipo de som foi observado também em L. cruzi. O padrão misto foi observado apenas em machos de Mesquita. Este padrão apresenta características dos outros dois padrões apesar de mostrar diferenças significativas em todos os parâmetros quando comparados com os outros dois. Neste trabalho foi analisado também o som de machos de duas colônias de L. longipalpis (Jacobina e Marajó) mantidas há muitos anos no laboratório. Constatou-se que apesar de serem observadas diferenças significativas em alguns parâmetros, o padrão se mantém inalterado. Os resultados encontrados confirmam a hipótese da existência de um complexo longipalpis no Brasil e evidência o som de cópula como uma boa ferramenta para identificar as espécies crípticas deste complexo. / Acoustic signals are important in the courtship of many insects. This song is usually species-specific and is important in the reproductive isolation of closely related species. Lutzomyia longipalpis males produce acoustic signals during copulation. There are strong evidences that this taxon represents a species complex. Lutzomyia cruzi is closely related to L. longipalpis and is probably part of this complex. We analyzed de copulation songs of 14 Brazilian populations of L. longipalpis, six of them from three localities (Sobral, Estrela de Alagoas e Jaíba) where previous analyzes indicated the occurrence of sympatric species, which the males differ in the number of abdominal tergal spots (one and two spots, called respectively 1P and 2P). We also analyzed the copulation song of L. cruzi. This analysis showed that the song produced during copulation by males of both L. longipalpis and L. cruzi has two different components: a faster primary song and a slower secondary song. The latter is similar in all studied population, whereas the primary song has significant variation with three different types been found: pulse type, burst type and intermediary type songs. The pulse type is diversified and was found in the populations of Jacobina, Lapinha, Sobral 1P, Teresina, Jaíba 1P e Estrela 1P. Five different patterns were observed among these populations. These patterns are significantly different in all parameters analyzed (inter pulse interval, pulse number, train size, frequency and cycles per pulse). The populations of Sobral 2P, Jaíba 2P, Estrela 2P, Natal, Marajó, Pancas e Nova Porterinha produce the burst type song. The comparison of these populations showed significant differences only in the inter burst interval. In addition, the pattern itself is similar between them. This type of song was also found in L. cruzi. The intermediary type song was observed only in males from Mesquita. This type presents characteristics of both pulse and burst type songs even though it shows significant differences in all parameters when compared to the other two types. We also analyzed the songs of males from two colonies of L. longipalpis (Jacobina and Marajó) kept in laboratory for many years. We observed that although significant differences are found in some parameters, the pattern itself does not change. Our results confirm the hypothesis of the existence of a longipalpis complex in Brazil and show the copulation song as a good tool to identify cryptic species in this complex.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:14:55Z No. of bitstreams: 1 TESE ROSIMERY merged (2).pdf: 13670043 bytes, checksum: 3d066fc62d2695e641494985db2b5801 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:14:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE ROSIMERY merged (2).pdf: 13670043 bytes, checksum: 3d066fc62d2695e641494985db2b5801 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A história natural da leishmaniose visceral americana apresenta poucos estudos relacionados ao conhecimento dos reservatórios associados à Leishmania. Para os estudos de infectividade, foram realizados experimentos com os seguintes roedores silvestres: Nectomys squamipes, Rattus rattus e Galea spixii para incriminação de hospedeiros reservatórios de Leishmania (Leishmania) infantum , foram realizados duas repetições, com 10 roedores de cada espécie perfazendo um total de 60 animais, todos colonizados em laboratório. Como grupo controle foi utilizado seis hamsters (Mesocricetus auratus) para cada grupo de dez animais. Nas duas repetições, os animais foram inoculados com 2,8x105 /ml de promastigotas de fase log de Leishmania (leishmania) infantum. Amostras de pele, baço e fígado dos animais foram processadas para a detecção de DNA por meio de PCR específica para o subgênero Leishmania. Como resultado obtivemos dos 60 animais inoculados, 36 roedores positivos em amostras de pele, baço e fígado bem como 3 hamsters de controle (50%). Foram capturados entre 2009/2010 95 roedores silvestres para detecção de infecção natural. Destes, 9 animais das espécies: Nectomys squamipes, Necromys lasiurus e Rattus rattus foram positivos por PCR em amostras de pele, baço e fígado para Leishmania. As capturas de flebotomíneos utilizando armadilhas do tipo CDC para detecção de infecção natural dos espécimes coletados 420 flebotomíneos (fêmeas) de mais de 3.000 capturados foram processadas, 110 fêmeas em amostras individuais e 31 pools de 10 fêmeas cada um, destes, 6 foram positivos para Leishmania pela técnica de PCR e pela técnica de Dot-Blot hibridização, foram positivos 2 (33,3%) flebotomíneos para Leishmania (L.) infantum e 4 (66,6%) flebotomíneos para Leishmania (V.) braziliensis. Com a utilização da armadilha de Disney modificada em região de mata, utilizando como isca o roedor silvestre Galea spixii, foram capturados 131 flebotomíneos fêmeas e todas identificadas como da espécie Lutzomyia complexa. / The natural history of American visceral leishmaniasis presents few studies related to knowledge of reservoirs associated with Leishmania. In order to characterize the experimental infectivity in wild rodents of the following species: Nectomys squamipes, Rattus rattus and Galea spixii for trials of reservoir hosts of Leishmania (Leishmania) infantum , two experiments were conducted with 10 rodents of each species for a total 60 animals, all colonized in the laboratory. For the control was used six hamsters (Mesocricetus auratus) for each group of ten animals. In both experiments, the animals were inoculated with 2.8 x105 / ml log phase promastigotes of Leishmania infantum. Samples of skin, liver and spleen of animals were processed for DNA detection by PCR specific for the subgenus Leishmania. As a result we obtained the 60 injected animals, 36 (%) positive for samples of rodent skin, spleen and liver and 3 (50%) control hamsters. During 2009/2010 were collected 95 wild rodents for the detection of natural infection. Of these, nine animals: Nectomys squamipes, Bolomys lasiurus and Rattus rattus were positive by PCR in samples of skin, liver and spleen for Leishmania. The catch of sandflies using CDC traps for detecting natural infection, 420 female sand flies out of 3.000 were processed in 110 individual samples and 31 pools of 10 females sandflies each of these, 6 were positive by PCR and Dot-Blot hybridization technique, 2 (33.3%) were positive for L. (L.) infantum and, four (66.6%) for Leishmania (V.) braziliensis. During two years several attempts were made to obtain a colony of the Lutzomyia migonei for xenodiagnosis, however after several attempt no sufficient number of sandflies was able to perform this procedure, because of early mortality of the adults. Modified Disney trap baited with Galea spixii were used during a period of four months to capture sandflies in a forest area São Vincente Férrer. 131 sand flies captured were identified as Lutzomyia complexa.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T13:25:42Z No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T13:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. / Leishmaniasis is zoonosis caused by parasite protozoa belonging to the genus Leishmania, which comprises about 30 species, and of these about 20 are responsible for causing human diseases. Leishmaniasis is characterized by considerable clinical pleomorphism and epidemiological variability. Diagnosis of Leishmania infection associated with the identification of the causative species is important for prognosis, definition of appropriate treatment schemes and epidemiological surveillance of the disease. In this context, PCR-based methods have been the most investigated and therefore many methods have been described, although there are still limitations in terms of validation and ability to discriminate between different Leishmania species. In Brazil there are at least seven species associated with human cutaneous Leishmaniasis (CL) and one species associated with visceral Leishmaniasis. The main goal of this study was to establish a methodology presenting both good sensitivity and capacity to identify the causative etiologic agent of the infection at species level. To this end, this study employed different methodologies based on PCR already used in several studies focusing on the molecular diagnosis of Leishmaniasis: kDNA PCR, ITS1 PCR and g6p PCR. The limit of detection, sensitivity in the face of clinical samples obtained from patients diagnosed with CL and the ability of these methodologies to discriminate between species related to human CL in Brazil were evaluated. Furthermore, considering previous results from our group showing that regions of the hsp70 gene could be used to achieve this goal, we developed PCR-based methodologies targeting fragments that correspond to different hsp70 gene regions, with sizes ranging from the 230pb to 390pb. Considering the four regions that were analyzed, we chose one (here named as hsp70C PCR) for having presenting the best detection limit of Leishmania DNA and the capacity of discriminating human pathogens Leishmania species that circulate in Brazil, when reference strains were analyzed by PCR RFLP hsp70C. The sensitivity of hsp70C PCR using DNA extracted from tissue collected from patients diagnosed with CL compared with the other methods mentioned above. In addition, the ability of hsp70C PCR-RFLP to identify Leishmania species has been validated using a panel of 70 Leishmania strains, representing different species and geographic regions aditionaly clinical material was also analyzed. The results suggest that kDNA PCR is a very sensitive method and therefore suitable for the molecular diagnosis of Leishmaniasis, but does not allow the identification of the species envolved in the infection. The ITS1 PCR is quite sensitive for the diagnosis of Leishmaniasis, but the non ability to identify the sympatric species like L.guyanensis and L.braziliensis, by PCR-RFLP limits its use in some in the South America. Finally, PCR-RFLP hsp70C, combines good sensitivity to detect Leishmania DNA extracted from clinical material and the ability to identify all Leishmania species that circulate in Brazil, being particularly useful in areas where Leishmania species are simpatric.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T12:18:31Z No. of bitstreams: 1 sarah_falcao. Avaliação...2013.pdf: 3048010 bytes, checksum: 6d0d112498f296909639914a28ec6b23 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T12:18:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sarah_falcao. Avaliação...2013.pdf: 3048010 bytes, checksum: 6d0d112498f296909639914a28ec6b23 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) tem como principal agente etiológico a L. braziliensis e é uma das afecções dermatológicas que merece mais atenção, por seu alto coeficiente de detecção e sua capacidade de produzir deformidades. O neutrófilo é considerado a primeira linha de defesa contra agentes infecciosos ou substâncias estranhas e o seu rápido recrutamento para os tecidos é fundamental para o sistema imune inato. No modelo murino de infecção por L. braziliensis, mostramos um constante recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. Baseados nesses resultados, nós formulamos uma hipótese que os neutrófilos desempenham um papel importante durante os estágios iniciais de infecção com L. braziliensis. Assim, conduzimos experimentos com neutrófilos recrutados com tioglicolato e neutrófilos derivados de medula óssea. Inicialmente, observamos que os neutrófilos são prontamente infectados com parasitas opsonizados com soro fresco. O contato entre neutrófilos e L. braziliensis ativou os neutrófilos, aumentando a expressão de CD18 e diminuindo a expressão de CD62L. Essa ativação levou à produção de superóxido, secreção de elastase e liberação de TNF-a. O contato com L. braziliensis não impediu a apoptose dos neutrófilos e a destruição dos parasitas internalizados. Utilizando anticorpos específicos para neutrófilos, observamos o aumento significativo no número de parasitas em animais depletados de neutrófilos. Em paralelo, o contato dos neutrófilos com L. braziliensis levou à secreção de quimiocinas, capazes de induzir o recrutamento de células dendríticas. Os neutrófilos, portanto, desempenham um papel importante no combate ao parasita no período inicial da infecção por L. braziliensis. / L. braziliensis is the main etiological agent of American Cutaneous Leishmaniasis, a disease that deserves further attention due to the high detection rate and ability to produce deformities. The neutrophil is considered the first line of defense against infectious agents or foreign substances and their rapid recruitment into tissues is critical for the innate immune system. In a murine model of infection with L. braziliensis, we showed a constant recruitment of neutrophils to the site of infection. Based on this finding, we hypothesized that neutrophil may a play an important role during the initial stages of L. braziliensis infection. Experiments were conducted used thyoglycolate-recruited and bone marrow-derived neutrophils. We initially observed that neutrophils are readily infected by fresh serum-opsonized parasites. Neutrophil upon L. braziliensis interaction, neutrophil became activated, increasing the expression of CD18 and decreasing the expression of CD62L. This activation led to the production of superoxide, neutrophil elastase secretion and release of TNF-a. Neutrophil infection with L. braziliensis did not prevented neutrophil apoptosis or destruction of internalized parasites. Using a neutrophil depleting antibody, we detected a significant increase in parasites numbers in neutrophil-depleted mice. In parallel, the contact of neutrophils with L. braziliensis led to secretion of chemokines, able to induce the recruitment of dendritic cells. Therefore, we can conclude that neutrophils play an important role in combating parasite during initial infection by L. braziliensis

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-16T19:35:07Z No. of bitstreams: 1 Vinicius Pinto Costa Rocha. Avaliação da atividade antileishmania...2012.pdf: 1625526 bytes, checksum: 4407e0cb5e7b4ade8175d66ca2a59a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T19:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vinicius Pinto Costa Rocha. Avaliação da atividade antileishmania...2012.pdf: 1625526 bytes, checksum: 4407e0cb5e7b4ade8175d66ca2a59a34 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose compreende um complexo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania, e é endêmica em 88 países, com uma população de 350 milhões de indivíduos sob o risco de contrair a infecção. O tratamento convencional da leishmaniose é realizado com antimoniais pentavalentes, e está associado a inúmeros efeitos adversos e falha terapêutica. Dessa forma, a busca por novas alternativas terapêuticas para esta doença é de extrema relevância. O presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade antileishmania de fármacos antimaláricos in vitro e em modelo murino de leishmaniose tegumentar causada por Leishmania amazonensis. Os fármacos antimaláricos testados foram o artesunato, a cloroquina, a hidroxicloroquina, a mefloquina e a primaquina. Destes, a cloroquina e a hidroxicloroquina não reduziram, de forma significativa, o crescimento de formas promastigotas do parasito na concentração de 50 μM. Entretanto, estes dois fármacos foram eficazes em reduzir o número de amastigotas em macrófagos murinos, apresentando valores de IC50 de 0,78 ± 0,08 μM e 0,67 ± 0,12 μM, respectivamente. A mefloquina apresentou valor de IC50 de 8,4 ± 0,70 μM contra promastigotas do parasito, enquanto que, contra formas amastigotas o IC50 foi 1,56 ± 0,19 μM. A análise ultraestrutural de células infectadas e tratadas com a cloroquina ou com a mefloquina mostrou o acúmulo de corpos multivesiculares no citoplasma do parasito. Este resultado sugere o comprometimento da via endocítica da Leishmania após o tratamento com estas moléculas. O tratamento oral de camundongos CBA infectados com L. amazonensis reduziu a lesão e o parasitismo nos animais infectados. Diferente destes resultados, o tratamento com a mefloquina não reduziu o parasitismo nos animais infectados, apesar de ter reduzido o tamanho da lesão. Com base nestes resultados é possível concluir que a cloroquina pode representar uma alternativa terapêutica ao tratamento convencional da leishmaniose tegumentar. / Leishmaniasis comprises a complex of diseases caused by parasites of the genus Leishmania and is endemic in 88 countries, with a population of 350 million individuals at risk of contracting the infection. The conventional treatment of leishmaniasis based on pentavalent antimonials is associated with several adverse effects and treatment failure. Thus, the search for new therapeutic alternatives for this disease is extremely relevant. This study aims to evaluate the antileishmanial activity of antimalarial drugs in vitro and in a murine model of cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania amazonensis. The antimalarial drugs tested were artesunate, chloroquine, hydroxychloroquine, mefloquine and primaquine. Of these, chloroquine and hydroxychloroquine did not reduce, significantly, the growth of promastigotes of the parasite at a concentration of 50 μM. However, these two drugs were effective in reducing the number of amastigotes in murine macrophages, with IC50 values of 0.78 ± 0.08 μM and 0.67 ± 0.12 μM, respectively. Mefloquine had an IC50 value of 8.4 ± 0.70 μM against promastigote forms, whereas the IC50 against amastigotes was 1.56 ± 0.19 μM. The ultrastructural analysis of infected cells and treated with chloroquine or mefloquine showed accumulation of multivesicular bodies in the cytoplasm of the parasite. This result suggests the involvement of the endocytic pathway of Leishmania after treatment with these molecules. Oral treatment of CBA mice infected with L. amazonensis reduced lesion size and parasitism in infected animals. In contrast, treatment with mefloquine did not reduce the parasite load in infected animals, although it did reduce the size of the lesion. Based on these results we conclude that chloroquine may represent a therapeutic alternative to conventional treatment of cutaneous leishmaniasis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-07T16:47:38Z No. of bitstreams: 1 Isadora dos Santos Lima Desorganização da Polpa Branca Esplênica está associada...pdf: 823516 bytes, checksum: 6c64973b1a470182971fdecded62d3c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-07T16:47:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isadora dos Santos Lima Desorganização da Polpa Branca Esplênica está associada...pdf: 823516 bytes, checksum: 6c64973b1a470182971fdecded62d3c4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O baço é o maior órgão linfoide secundário em seres humanos e em cães. Em ambos, a ausência do baço está associada com um risco aumentado de ocorrência de infecções localizadas e disseminadas, incluindo sepse generalizada. A leishmaniose visceral e outras infecções podem alterar a estrutura histológica do baço, o que leva a uma destruição dos microambientes da polpa branca. Trabalhos anteriores mostraram que a ruptura da estrutura de polpa branca é mais frequente em cães com marcadores laboratoriais de suscetibilidade à leishmaniose visceral, como a cultura esplênica positiva e LST negativo, do que nos animais em que estes marcadores de susceptibilidade estavam ausentes. Neste estudo, o nosso objetivo é examinar a relação entre a desorganização histológica da polpa branca esplênica e a gravidade da leishmaniose visceral. As amostras e os dados utilizados neste estudo foram coletados de 206 cães de rua provenientes de uma área endêmica para leishmaniose visceral, a cidade de Jequié (Bahia, Brasil). Os animais foram examinados clinicamente e foram realizados os testes ELISA e LST. Aspirados de baço foram coletados para a cultura, e fragmentos de baço foram coletadas para estudos de biologia molecular e de estudos morfológicos. Os animais foram classificados de acordo com o grau de organização estrutural da polpa branca esplênica em grupos com baço (a), bem organizado, (b) ligeiramente desorganizado, (c) a moderadamente a extensivamente desorganizado. Em relação à positividade no ELISA juntamente com a desorganização do baço, conjuntivite ( P= 0,0116), hiperproteinemia (p= 0,021) foram mais frequentes no grupo de animais com ELISA positivo e baço desorganizado, quando comparado com os outros grupos. Os animais polissintomáticos são mais frequentes no grupo com ELISA positivo e baço do tipo 3 (p= 0,004). Os scores clínicos atribuídos à intensidade da conjuntivite (P <0,05), dermatite (P <0,05) e linfadenopatia (P <0,01), alopecia (P <0,01), onicogrifose (P <0,05) foram mais elevados nos animais com ELISA positivo e baço desorganizado do que outros grupos, bem como o número de sinais clínicos atribuíveis à leishmaniose visceral canina (p= 0,0014).Em relação à análise da positividade na cultura esplênica juntamente com a desorganização do baço, a frequência de cães polissintomáticos foi maior em animais com baço ligeiramente desorganizado (P <0,05) e baço desorganizado (P <0,005), do que em animais com baço organizado. Alopecia (P <0,01), conjuntivite (P <0,05), desidratação (P <0,001), dermatite (P <0,05), onicogrifose (p <0,01), anemia (P <0,05), úlcera (P <0,001 ) e alto escore clínico (P <0,001) foram mais frequentes em animais com cultura esplênica positiva e baço desorganizado, do que nos animais com cultura negativa e baço organizado. Em conclusão, os cães com desorganização do baço associada com leishmaniose visceral têm mais sinais clínicos e pior estado clínico do que os animais com leishmaniose visceral, mas sem desorganização do baço. / The spleen is the largest secondary lymphoid organ in human beings and in dogs. In both in human beings and in dogs, the absence of the spleen is associated with increased risk of localized and disseminated infection including overwhelm sepsis. Visceral leishmaniasis and other infections alter the histological structure of the spleen, leading to a disruption of the white pulp microenvironments. Previous works have shown that the disruption of the white pulp structure is more frequent in dogs with laboratorial markers of susceptibility to visceral leishmaniasis such as positive spleen culture and negative leishmanin skin test than in animals in which these susceptibility markers were absent. In this study, our goal is to examine the relationship between the histological disorganization of splenic white pulp and severity of visceral leishmaniasis.The samples and data used in this study were collected from 206 stray dogs from an endemic area for visceral leishmaniasis, the city of Jequie (Bahia, Brazil). The animals were examined clinically and ELISA and LST were performed. Splenic aspirates were collected for culture, and fragments of spleen were collected for molecular and morphological studies. The animals were ranked according to the degree of structural organization of splenic white pulp of the spleen in groups (a), well-organized, (b) slightly disordered, (c) moderately extensively disorganized. In relation to the positive in the ELISA with the disorganization of the spleen, conjunctivitis (P = 0.0116) hyperproteinemia (p = 0.021) were more frequent in the group of animals with positive ELISA and disorganized spleen when compared to the other groups. Polisymptomatic animals are more frequent in the group with positive ELISA and spleen type 3 (p = 0.004). Clinical scores attributed to the intensity of conjunctivitis (P <0.05), dermatitis (P <0.05) and lymphadenopathy (P <0.01), alopecia (P <0.01), onychogryphosis (P <0.05 ) were higher in animals with positive ELISA and disorganized spleen than other groups, as well as the number of clinical signs attributable to canine visceral leishmaniasis (p = 0.0014). Regarding the analysis of positive spleen culture together with splenic disorganization, the frequency of polisymptomatic dogs was higher in animals with slightly disordered spleen (P <0.05) and disorganized spleen (P <0.005) than in animals with organized spleen. Alopecia (P <0.01), conjunctivitis (P <0.05), dehydration (P <0.001), dermatitis (P <0.05), onychogryphosis (p <0.01), anemia (P <0.05 ), ulcers (P <0.001) and high clinical score (P <0.001 were more frequent in animals with positive spleen culture and disorganized spleen than in animals with negative culture and organized spleen . In conclusion, dogs with disorganization of the spleen associated with visceral leishmaniasis have more clinical signs and worse clinical status than animals with visceral leishmaniasis, but without disruption of the spleen.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-07T19:06:15Z No. of bitstreams: 1 Graziele Quintela de Caravalho... O Papel do Neme na infecção....pdf: 1591650 bytes, checksum: 3f661f0e0b742c04c4ad3e8907c1cf24 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T19:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Graziele Quintela de Caravalho... O Papel do Neme na infecção....pdf: 1591650 bytes, checksum: 3f661f0e0b742c04c4ad3e8907c1cf24 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Laboratório de Engenharia Tecidual e Imunofarmacologia. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A Leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas em todo o mundo, sendo endêmica em muitas áreas. A doença pode apresentar diferentes manifestações clínicas, tais como a Leishmaniose Visceral (LV), que é a forma mais grave e letal, caso não seja tratada. As manifestações hematológicas são comumente associadas à LV, onde os mecanismos relacionados à hemólise e a presença do heme livre, podem interferir no comportamento de neutrófilos. Já foi descrito que o heme livre é uma molécula pró-inflamatória, com a capacidade de induzir migração e ativação dos neutrófilos. No entanto, o efeito do heme sobre neutrófilos humanos durante a infecção por Leishmania chagasi, ainda não foi explorado. A nossa hipótese é que o heme induz ativação de neutrófilos humanos favorecendo o processo inflamatório na infecção por L. chagasi. Nossos resultados mostraram que o heme induz a ativação e apoptose em neutrófilos humanos infectados com L. chagasi, seguido pela sobrevivência do parasita. Moléculas presentes na composição do heme, como a protoporfirina IX (PPIX) e o Fe+2, não alteram o status de ativação dos neutrófilos, mas mantêm o aumento do crescimento parasitário como observado em presença do heme. Além disso, o heme e o Fe+2 aumentam a produção do TGF-β e a atividade da SOD. A inibição farmacológica da enzima SOD com dietilditiocarbamato (DETC) reduz a taxa de proliferação da L. chagasi em neutrófilos infectados. Em conjunto, esses dados indicam que o heme e o Fe+2 podem contribuir como fonte nutricional e controlar o ambiente inflamatório, com a indução de TGF-β e SOD, permitindo a sobrevivência da L. chagasi em neutrófilos humanos. Esse estudo poderá abrir novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos imunopatogênicos envolvendo neutrófilos e suas implicações no processo inflamatório da LV. / The Leishmaniasis is a disease that affects millions of people worldwide, being endemic in many areas. The disease may present different clinical manifestations, such as Visceral Leishmaniasis (VL), which is the most severe form and fatal if left untreated. The hematologic manifestations are commonly associated with VL, where the mechanisms related to hemolysis and the presence of free heme may modify the behavior of neutrophils. It has been reported that the free heme is a pro-inflammatory molecule with the ability to induce migration and activation of neutrophils. However, the effect of the heme on human neutrophils during infection by Leishmania chagasi yet hasn't been explored. Our hypothesis is that the heme induces activation of human neutrophils favoring the inflammatory process on the infection by L. chagasi. The results showed that the heme induces activation and apoptosis in human neutrophils infected with L. chagasi, followed by parasite survival. Molecules present in the composition of heme, as protoporfirin IX (PPIX) and Fe+2, do not alter the activation status of neutrophils, but maintain the increased parasite growth as viewed in the presence of heme. Furthermore, the heme and Fe+2 increase the production of TGF-β and SOD activity. The pharmacological inhibition of SOD with diethyldithiocarbamate (DETC) reduces the rate of L. chagasi proliferation in infected neutrophils. Together, these data indicate that the heme and Fe+2 may contribute as a nutritional source and control the inflammatory environment with the induction of TGF-β and SOD, allowing the survival of the L. chagasi in human neutrophils. This study may open new perspectives for the understanding of the immunopathogenic mechanisms involving neutrophils and its implications in the inflammatory process of the VL.