A indução de tolerância imunológica ao aloenxerto, no contexto clínico, permanece um grande desafio para pesquisa científica de tradução. A retirada da imunossupressão em indivíduos transplantados leva à rejeição do enxerto, na grande maioria dos casos. Entretanto, um grupo muito raro de indivíduos transplantados, chamados de tolerantes operacionais (TO), consegue manter a função estável do enxerto após a retirada dos imunossupressores. O estudo desses indivíduos pode contribuir para melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância ao enxerto em humanos, assim como, para a determinação de biomarcadores desse estado de homeostase. Nosso objetivo foi determinar se o estado de tolerância operacional no transplante renal induz um perfil diferencial do componente humoral da resposta imune. Para tal, analisamos o perfil de reatividade de autoanticorpos dirigidos a peptídeos da proteína de choque térmico 60 (HSP60), de alo e autoanticorpos dirigidos às moléculas HLA, o repertório do receptor de células B (BCR) e o perfil funcional de células B supressoras CD19+CD24hiCD38hi (Bregs), comparativamente, nos indivíduos com: TO (n=5), Rejeição Crônica (RC, n=13), função estável do enxerto usando doses habituais de imunossupressores (Est, n=19) e nos indivíduos saudáveis (Sau, n=11). Não observamos um perfil diferencial claro de alo/autorreatividade de anticorpos dirigidos aos peptídeos da HSP60, nem às moléculas HLA, que diferenciasse os grupos do estudo. O estado de tolerância operacional apresentou uma diversidade do repertório do receptor de células B similar à observada em Sau e Est, enquanto o grupo RC teve uma menor diversidade desse repertório. Além disso, o grupo TO apresentou uma expansão de clones linfócitos B com expressão de 2 tamanhos distintos de CDR3 (de 16aa, família VH3 isotipo IgM, e de 5aa, família VH1 isotipo IgG), diferenciando-os dos grupos Sau, RC e Est (p<0,01 e p<0,05; e p<0,01, respectivamente para VH3M e VH1G). Os números de células B com fenótipo imunorregulador CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) circulantes, no grupo TO e Sau, foram similares, enquanto o grupo RC apresentou menores números (p<0,05). Funcionalmente, após estímulo via CD40, o grupo TO teve capacidade de gerar células Breg ativadas para STAT3 semelhante ao grupo Sau, enquanto na rejeição crônica esta capacidade foi menor (p<0,05). Concluímos que o estado de tolerância operacional envolve, principalmente, a manutenção do perfil do componente imune humoral, similar ao apresentado por indivíduos saudáveis, em contraste com o estado de rejeição crônica. Além disso, o estado de tolerância foi o único que apresentou expansões expressivas de determinados tamanhos de CDR3, se destacando de todos os grupos. A expansão diferencial desses clones de células B pode ter uma relevância funcional no estado de tolerância operacional, além de potencial valor para o diagnóstico desse estado. Esses dados, em conjunto, nos indicam que a preservação do componente humoral da resposta imune desempenha um papel importante neste estado de homeostase no transplante humano / Operational tolerance in human kidney transplantation: repertoire of B lymphocytes and alo and autoantibodies Sta individuals (p<0.01 and p<0.05; and p<0.01, respectively for VH3M and VH1G). The circulating B cell numbers with the suppressive phenotype CD19+CD24hiCD38hi (Bregs) were similar between the OT and HI groups, while CR presented lower numbers (p<0.05). In addition, the OT group exhibited a similar capacity of generate activated cells for STAT3 to HI, whereas the CR group exhibited an impaired capacity (p<0.05). We conclude that the operational tolerance state involves the maintenance of the B cell compartment profile similar to the one observed in healthy individuals, in contrast with chronic rejection. In addition, the state of operational tolerance was the only one exhibiting expressive expansions of specific CDR3 lengths, which differentiated OT from all other groups. This indicates that the expansion of B cell populations expressing specific CDR3 lengths could play a relevant role in operational tolerance and may be potential biomarkers for OT. Taken together, we suggest that the preservation of the B cell component of the immune response can play an important role in this homeostatic state in human transplantation

Introdução: O fragmento C4d e os anticorpos anti-HLA doador específicos (DSA) são marcadores de resposta humoral em enxertos renais com rejeição, mas o papel das células B nesse processo ainda não é claro. Neste estudo foi avaliada a correlação entre C4d, DSA e células B de enxertos com disfunção e sua associação com aspectos morfológicos, função e sobrevida do rim transplantado. Material e Métodos: A marcação para C4d, células B CD20+ e plasmócitos CD138+ foi realizada por imunoperoxidase em biópsias por indicação de 110 receptores de transplante renal. Positividade para CD20 e CD138 foi definida por curva ROC (≥5 céls./mm2). O soro coletado concomitante a biópsia foi testado para DSA classe I e classe II. Estes marcadores foram correlacionados com dados clínicos e do transplante, a histopatologia de Banff e a evolução do rim transplantado. Resultados: Depósitos de C4d e DSA circulantes foram detectados em 100% e 70% dos pacientes com rejeição mediada por anticorpos (RMA) respectivamente, e nos casos de rejeição aguda celular (RAC) em 42% (p<0,001, vs. RMA) e 28% (p=0,003, vs. RMA). Estes dois marcadores correlacionaram-se positivamente (r=0,31, p=0,016). Houve correlação significativa entre DSA e plasmócitos CD138+ (r=0.32 p=0,006), mas as células CD20 e CD138 não se correlacionaram entre si. As células CD138+ predominaram na RMA, associadas com maior painel pré-transplante e DSA, mas não a C4d, e as células CD20+ predominaram na RAC e nas biópsias com fibrose intersticial/atrofia tubular, associadas a maior incompatibilidade HLA e a retransplantes. Pacientes com C4d+ tiveram pior função e sobrevida do enxerto em três anos de transplante, e aqueles com DSA+ uma pior 7 sobrevida do enxerto. Positividade para CD20 ou CD138 não foi preditiva da função ou sobrevida do enxerto. Na análise multivariada, somente o C4d foi fator de risco para perda do enxerto. Conclusões: Esses resultados confirmam o valor prognóstico do C4d e dos DSA para uma pior evolução do enxerto renal, e sugerem uma associação das células B CD20+ com parâmetros de rejeição celular e dos plasmócitos CD138+ com marcadores de resposta humoral. Entretanto, nesse estudo o infiltrado de células B na biópsia do enxerto não foi preditivo de uma pior evolução do rim transplantado. / Introduction: The fragment C4d and the donor specific anti-HLA antibodies (DSA) are markers of the humoral response in rejecting kidney grafts, but the role of B cells in this process is still unclear. In this study we evaluated the correlation between C4d, DSA and B cells in dysfunctional grafts, and their association with morphological features, and graft function and survival. Material and Methods: The staining for C4d, CD20+ B cells and CD138+ plasmocytes were done by immunoperoxidase in 110 kidney graft biopsies for cause. Positivity for CD20 and CD138 were established by ROC curve (≥5 cells/mm2). Serum collected at biopsy were tested for anti-HLA class I and II antibodies. These markers were correlated with clinical and transplant characteristics, Banff histopathology and graft outcomes. Results: C4d deposits and circulating DSA were detected in 100% and 70% of the patients with antibody-mediated rejection (AMR) respectively, and in cases with acute cellular rejection (ACR) in 42% (p<0.001, vs. AMR) and 28% (p=0.003, vs. AMR), respectively. Both markers were positively correlated (r=0.31, p=0.016), and there was also a significant correlation between DSA and plasmocytes CD138+ (r=0.32 p=0.006). CD20 and C138 cells were not siginificantly correlated. Plasmocytes CD138+ predominated in AMR, and were associated with higher pre transplant PRA and DSA positivity, but not with C4d. CD20+ B cells were highly expressed in ACR and in biopsies with interstitial fibrosis and tubular atrophy, in association with more HLA mismatches and re-transplants. Patients with C4d had poorer graft function and survival, and those 9 with DSA + also had a worse graft survival in three years of transplant. CD20 or CD138 cells were not predictive of graft outcomes. In multivariated analysis, only C4d remained a risk factor for graft loss. Conclusion: These results confirm the prognostic value of C4d and circulating DSA for a worse kidney graft outcome, and suggest an association of CD20+ B cells with parameters of cellular rejection whereas CD138+ plasmocytes correlated with markers of the humoral response. However, in this study the B cell infiltrate in graft biopsy was not predictive of adverse outcomes to the transplanted kidney.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Dentre os efeitos moduladores da Propionibacterium acnes (P. acnes), um de grande importância, verificado em nosso laboratório em um modelo murino de hipersensibilidade imediata à ovoalbumina (OVA), é a sua capacidade de direcionar a resposta imune para Th1 ou Th2, dependendo do esquema de tratamento dos animais. Efeito semelhante foi induzido pelo polissacarídeo solúvel extraído da bactéria (PS), porém, como apenas a sua capacidade de modular a resposta Th1 havia sido verificada, nós nos propusemos a investigar, no presente estudo, se o PS poderia também potencializar a resposta Th2. De fato, verificamos que o polissacarídeo solúvel extraído da P. acnes foi capaz de potencializar a reação de hipersensibilidade imediata na pata de camundongos, como demonstrado pelo aumento do número de eosinófilos no infiltrado inflamatório, predominância do número de esplenócitos produtores de IL-4 e aumento da produção de IgG1 anti-OVA, concomitantemente à diminuição de IgG2a, compatível com padrão Th2 de resposta. Além disso, nós também avaliamos se os efeitos de potencialização ou supressão da hipersensibilidade imediata induzidos pela P. acnes ou seu polissacarídeo estariam relacionados com diferenças no número e grau de ativação de células apresentadoras de antígenos (APCs) e linfócitos B1. Observamos que o aumento da quantidade de APCs esplênicas positivas para moléculas co-estimuladoras, TLR4 e IL-4 em animais tratados com P. acnes ou PS e a maior expressão de CD80 por linfócitos B1c peritoneais estava relacionada com exacerbação da resposta Th2. Por outro lado, o aumento do número de linfócitos B2 esplênicos TLR2+, bem como maior expressão de TLR9 intracelular por células dendríticas, e também menor número de células B1a peritoneais positivas para TLR2 e TLR9 intracelular em camundongos tratados com P. acnes ou PS, estava relacionado com supressão da reação. Quanto à síntese de citocinas, verificou-se um aumento menos pronunciado do número de APCs IL-4+ e também maior quantidade de células produtoras de IL-12 nos grupos em que a reação foi suprimida, em relação aos submetidos ao protocolo de exacerbação. In vitro, o estímulo concomitante de P. acnes e OVA em co-culturas de células dendríticas e linfócitos T aumentou a liberação de IL-5 e IL-17, em relação às culturas estimuladas apenas com OVA, e o estímulo concomitante de PS e OVA aumentou a síntese de IL-17. Já o estímulo com P. acnes ou PS, seguido do estímulo com OVA no dia seguinte, induziu uma diminuição da liberação de IL-5 e IL-17, em comparação com as culturas estimuladas apenas com OVA, sugerindo que a P. acnes e o polissacarídeo atuam diretamente sobre células apresentadoras de antígenos. / Among Propionibacterium acnes (P. acnes) immunomodulatory effects, one of great importance, verified in our laboratory in a murine model of type I hypersensitivity to ovalbumin (OVA), is its capacity to direct the immune response to Th1 or Th2, depending on the animals treatment. Similar effect was induced by the soluble polysaccharide extracted from the bacteria (PS), however, since only its capacity to modulate the Th1 response has been verified, we decided to investigate, in the present study, if PS could also potentiate the Th2 response. In fact, this compound was able to potentiate or suppress the immediate hypersensitivity reaction in mice, depending on the protocol used. Besides, we investigated, in this work, whether the number of spleen cells and peritoneal B1 lymphocytes would be different between the treatment protocols, being related to potentiation or suppression of the OVA response, and also if the activation status of antigen presenting cells (APCs) and B1 lymphocytes could interfere on reaction modulation. We verified that the higher numbers of APCs expressing co-stimulatory molecules and the higher expression levels of these molecules on cell surface are probably related to potentiation of the Th2 response to OVA induced by P. acnes or PS. The higher CD80 expression by peritoneal B1c lymphocytes is also possibly involved with OVA response exacerbation in these animals. Besides, there seems to be a correlation between higher number of APCs expressing TLR4 and exacerbation of the immediate hypersensitivity reaction in P. acnes- or PS-treated mice. Differences on TLRs expression by spleen and peritoneal B1 lymphocytes can also be related to the type I hypersensitivity modulation. Analysis of cytokines synthesis by spleen APCs confirmed the Th2 potentiation or suppression in this model. Finally, in vitro experiments using co-cultures of dendritic cells and T lymphocytes indicated that P. acnes and PS seem to perform their effects of Th2 response potentiation or suppression by direct action on antigen presenting cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by ACACIO DUARTE PACHECO (acacio@fmva.unesp.br) on 2016-09-01T16:16:58Z No. of bitstreams: 1 Acácio Impressão Tese Final.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T18:54:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pacheco_ad_dr_araca.pdf: 1381975 bytes, checksum: 5982f80f260a714c02111156f309cccb (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocárdica e o perfil de citocinas no tecido cardíaco, à resposta imunológica sistêmica são indicados para confirmação da resposta imunológica presente no miocárdio de cães acometidos por LV. / Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflammatory process seems not enough to trigger the production of cytokines normally involved in VL, possibly due to a low parasite load in dogs myocardium, especially when compared to other organs such as spleen, liver and bone marrow. Further studies evaluating at the same time the presence of myocardial inflammation and the behavior of these circulating cytokines in target organs with immune activity are indicated to confirm the immune response present in the myocardium of dogs affected by VL. / FAPESP: 2013/12129-8 / CNPq: 141536/2013-6

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Katia denise Saraiva Bresciani / Banca: Heitor Flavio ferrari / Banca:fernanda Muller de Oliveira Ravai / Resumo: A ocorrência de miocardite em cães naturalmente acometidos por Leishmania infantum chagasi tem sido demonstrada em estudos recentes, contudo o tipo de resposta imune incitada no tecido cardíaco de cães com leishmaniose visceral (LV) ainda não foi determinada. Sendo assim, foram avaliados fragmentos da: parede livre de átrio direito (AD), parede livre de ventrículo direito (VD), parede livre de ventrículo esquerdo (VE) e septo interventricular (SIV) de 20 cães naturalmente acometidos por LV para determinação das alterações histopatológicas e da resposta imune no tecido cardíaco. A presença de miocardite foi observada em 75% dos animais avaliados, sendo o infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário a alteração mais comum nesses fragmentos. A imunomarcação de Leishmania spp. foi observada em 60% dos animais. Não houve correlação entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a presença de Leishmania sp. no miocárdio (p=0,0682). A imunomarcação do parasito apresentou correlação com a presença de linfócitos T CD4+ (p<0,0001) e T CD8+ (p=0,0002), linfócitos B CD79+ (p=0,046) e IgG (p=0,040). Os níveis de IL-4 (p=0,030), IL-12 (p=0,002), IFN- (p<0,0001) foram menores em cães infectados em relação ao grupo controle, independente da presença ou não do parasito no miocárdio (p>0,05). No presente estudo, a presença de alterações miocárdicas, associadas a resposta imunológica mista foram comuns em cães com LV. Novos estudos avaliando paralelamente, a presença de inflamação miocá... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Recent studies have demonstrated the occurrence of myocarditis in dogs naturally infected with Leishmania infantum chagasi, however the type of immune response in cardiac tissue of dogs with visceral leishmaniasis (VL) has not been determined. For this purpose, fragments from right atrial free wall (AD), right ventricular free wall (RV), left ventricular free wall (LV) and interventricular septum (IVS) of 20 dogs naturally affected by VL were evaluated to determine the histopathological changes and the immune response in heart tissue. The presence of myocarditis has been reported in 75% of the evaluated animals, and an lymphoplasmocytic inflammatory infiltrate was the most common change in these fragments. The immunostaining of Leishmania sp. was observed in 60% of the evaluated animals. There was no correlation between the intensity of the inflammatory infiltrate and the presence of Leishmania sp. (p = 0.0682). The immunostaining of the parasite correlated with the presence of CD4 + (p <0.0001) and CD8 + T lymphocytes (p = 0.0002), CD79 + B lymphocytes (p = 0.046) and IgG (p = 0.040). IL-4 (p = 0.030), IL-12 (p = 0.002) and IFN- levels (p <0.0001) were lower in the infected dogs when compared to control group, regardless of the presence or absence parasite in the myocardium (p> 0.05). The results obtained in this study suggest that the presence of myocardial changes is common in dogs with VL, associated with a mixed immune response in heart tissue. However, the local inflam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: O fragmento C4d e os anticorpos anti-HLA doador específicos (DSA) são marcadores de resposta humoral em enxertos renais com rejeição, mas o papel das células B nesse processo ainda não é claro. Neste estudo foi avaliada a correlação entre C4d, DSA e células B de enxertos com disfunção e sua associação com aspectos morfológicos, função e sobrevida do rim transplantado. Material e Métodos: A marcação para C4d, células B CD20+ e plasmócitos CD138+ foi realizada por imunoperoxidase em biópsias por indicação de 110 receptores de transplante renal. Positividade para CD20 e CD138 foi definida por curva ROC (≥5 céls./mm2). O soro coletado concomitante a biópsia foi testado para DSA classe I e classe II. Estes marcadores foram correlacionados com dados clínicos e do transplante, a histopatologia de Banff e a evolução do rim transplantado. Resultados: Depósitos de C4d e DSA circulantes foram detectados em 100% e 70% dos pacientes com rejeição mediada por anticorpos (RMA) respectivamente, e nos casos de rejeição aguda celular (RAC) em 42% (p<0,001, vs. RMA) e 28% (p=0,003, vs. RMA). Estes dois marcadores correlacionaram-se positivamente (r=0,31, p=0,016). Houve correlação significativa entre DSA e plasmócitos CD138+ (r=0.32 p=0,006), mas as células CD20 e CD138 não se correlacionaram entre si. As células CD138+ predominaram na RMA, associadas com maior painel pré-transplante e DSA, mas não a C4d, e as células CD20+ predominaram na RAC e nas biópsias com fibrose intersticial/atrofia tubular, associadas a maior incompatibilidade HLA e a retransplantes. Pacientes com C4d+ tiveram pior função e sobrevida do enxerto em três anos de transplante, e aqueles com DSA+ uma pior 7 sobrevida do enxerto. Positividade para CD20 ou CD138 não foi preditiva da função ou sobrevida do enxerto. Na análise multivariada, somente o C4d foi fator de risco para perda do enxerto. Conclusões: Esses resultados confirmam o valor prognóstico do C4d e dos DSA para uma pior evolução do enxerto renal, e sugerem uma associação das células B CD20+ com parâmetros de rejeição celular e dos plasmócitos CD138+ com marcadores de resposta humoral. Entretanto, nesse estudo o infiltrado de células B na biópsia do enxerto não foi preditivo de uma pior evolução do rim transplantado. / Introduction: The fragment C4d and the donor specific anti-HLA antibodies (DSA) are markers of the humoral response in rejecting kidney grafts, but the role of B cells in this process is still unclear. In this study we evaluated the correlation between C4d, DSA and B cells in dysfunctional grafts, and their association with morphological features, and graft function and survival. Material and Methods: The staining for C4d, CD20+ B cells and CD138+ plasmocytes were done by immunoperoxidase in 110 kidney graft biopsies for cause. Positivity for CD20 and CD138 were established by ROC curve (≥5 cells/mm2). Serum collected at biopsy were tested for anti-HLA class I and II antibodies. These markers were correlated with clinical and transplant characteristics, Banff histopathology and graft outcomes. Results: C4d deposits and circulating DSA were detected in 100% and 70% of the patients with antibody-mediated rejection (AMR) respectively, and in cases with acute cellular rejection (ACR) in 42% (p<0.001, vs. AMR) and 28% (p=0.003, vs. AMR), respectively. Both markers were positively correlated (r=0.31, p=0.016), and there was also a significant correlation between DSA and plasmocytes CD138+ (r=0.32 p=0.006). CD20 and C138 cells were not siginificantly correlated. Plasmocytes CD138+ predominated in AMR, and were associated with higher pre transplant PRA and DSA positivity, but not with C4d. CD20+ B cells were highly expressed in ACR and in biopsies with interstitial fibrosis and tubular atrophy, in association with more HLA mismatches and re-transplants. Patients with C4d had poorer graft function and survival, and those 9 with DSA + also had a worse graft survival in three years of transplant. CD20 or CD138 cells were not predictive of graft outcomes. In multivariated analysis, only C4d remained a risk factor for graft loss. Conclusion: These results confirm the prognostic value of C4d and circulating DSA for a worse kidney graft outcome, and suggest an association of CD20+ B cells with parameters of cellular rejection whereas CD138+ plasmocytes correlated with markers of the humoral response. However, in this study the B cell infiltrate in graft biopsy was not predictive of adverse outcomes to the transplanted kidney.

A Imunodeficiência de Variável Comum (ICV) é caracterizada por baixos níveis de imunoglobulinas com susceptibilidade a. Analisamos a distribuição de linfócitos, apoptose espontânea e a expressão gênica de receptores de morte, ligantes, adaptadores, moléculas reguladoras, inibidoras e anti-apotóticas em células CD4+ e CD8+ de 19 pacientes ICV e 19 controles. Pacientes com ICV apresentam diminuição na frequência de linfócitos TCD4+ e CD4+CD45RA+ e menor relação CD4/CD8 que indivíduos saudáveis. O grupo de pacientes mostrou maior frequência de apoptose espontânea em linfócitos totais e CD4+. Células CD4+ dos indivíduos afetados apresentaram menor expressão gênica de TRAIL-R, BCL-2, FLIPL e FADD; células CD8+ apresentaram diminuição da expressão gênica de TRAIL, FADD, BCL-2, BCL -xL e um aumento de FLIPs. Os resultados sugerem um desequilíbrio nos mecanismos que controlam a apoptose de linfócitos nestes pacientes, o que pode ajudar a elucidar as alterações observadas no compartimento de células T dos pacientes com ICV. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is is characterized by low immunoglobulins levels with susceptibility to infections. We have analyzed T cell distribution and spontaneous apoptosis in peripheral blood of CVID, as well as gene expression of several molecules involved in apoptosis, including death receptors, ligands, adapters, regulatory and anti-apototic molecules in CD4+ and CD8+ cells of 19 CVID patients and 19 healthy subjects. CVID subjects present decreased frequency of TCD4+ and CD4+ CD45RA+ cells and lower CD4/CD8 ratio than healthy controls. CVID group also presented higher frequency of spontaneous apoptosis in lymphocytes and CD4+ cells. CD4+ showed lower expression of TRAIL-R, BCL-2, FLIPL and FADD; CD8+ cells presented lower expression of TRAIL, FADD, BCL-2, BCL-xL and a augment of FLIP. Results suggest an imbalance in mechanisms controlling cell death of those patients lymphocytes, which might help to elucidate the changes observed in T cell compartment of CVID patients.

A imunodeficiência comum variável (CVID) é caracterizada por hipogamaglobulinemia e infecções recidivantes. Neste estudo verificamos o papel da via Unfolded Protein Response (UPR) na patogênese da doença. Uma paciente com CVID apresentou expressão aumentada do RNAm XBP-1 unspliced e co-localização de IgM e BiP no retículo endoplasmático (RE). Verificamos a ausência de mutações nos produtos obtidos por RT-PCR de XBP-1 e nos domínios quinase/endonuclease da IRE-1a. Análises por Q-PCR dos RNAm XBP-1 spliced, IRE-1a e BiP após tratamento com LPS ou brefeldina A mostrou que, ao contrário dos controles saudáveis que respondem a estes estressores com ondas de transcrição destes três genes, esta paciente apresenta baixos níveis de transcrição, não atingindo o mesmo nível de resposta apresentado pelos indivíduos saudáveis. Nossos achados associam o splicing diminuído do RNAm XBP-1 ao acúmulo de IgM no RE e baixas taxas de transcrição de chaperonas, fornecendo um mecanismo para explicar a hipogamaglobulinemia observada em uma paciente com CVID. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) is characterized by hypogammaglobulinemia and recurrent infections. Herein we addressed the role of Unfolded Protein Response (UPR) in the pathogenesis of the disease. Augmented unspliced XBP-1 mRNA concurrent with co-localization of IgM and BiP was found in one CVID patient. Sequencing of RT-PCR amplicons did not reveal any mutation on XBP-1 neither on the kinase/endonuclease domains of IRE-1a. Q-PCR analysis of spliced XBP-1, IRE-1a and BiP after LPS or Brefeldin A treatment showed that, unlike healthy controls that respond to these ER stressors by presenting waves of transcription of these three genes, the cells presented lower rates of transcription, not reaching the same level of response of healthy subjects. Our findings associate diminished splicing of XBP-1 mRNA with accumulation of IgM within the ER and lower rates of chaperone transcription, therefore providing a mechanism to explain the observed hypogammaglobulinemia.

A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection

INTRODUÇÃO: A deficiência de IgA (DIgA) é a imunodeficiência primária mais comum e caracteriza-se pela presença de concentrações de IgA sérica abaixo de 7 mg/dL e níveis normais de IgM e IgG. A maioria dos indivíduos acometidos não apresenta doença aparente embora alguns possam apresentar infecções recorrentes ou crônicas de mucosas, atopia e/ou doenças autoimunes (DAIs). Presumivelmente, a doença resulta de um defeito na troca de isótipo para IgA ou de falha na maturação de linfócitos produtores de IgA. A imunodeficiência comum variável (ICV) constitui uma deficiência primária de anticorpos caracterizada por níveis séricos baixos de IgG, IgA e/ou IgM, ao lado de valores normais ou diminuídos de linfócitos B e/ou T, levando a infecções crônicas ou recorrentes principalmente dos tratos respiratório e gastrintestinal. Embora a fisiopatologia da ICV ainda não esteja esclarecida, em muitos pacientes ela pode ser decorrente de algum defeito intrínseco de linfócitos B. De modo especial, as células B de memória (CD27+) têm sido correlacionadas com alguns aspectos clínicos da doença. Números elevados de células B de memória com persistência de IgM (CD27+IgM+) parecem estar correlacionados com a presença de infecções, enquanto valores diminuídos de células B de memória clássicas ou class-switched (CD27+IgG-IgM-) parecem estar associados a baixos níveis de IgG e presença de autoimunidade. A progressão de DIgA para ICV tem sido descrita em alguns pacientes embora não constitua regra geral. Uma hipótese é a de que uma base genética comum e a associação com DAIs possam constituir fatores de risco para a progressão de DIgA para ICV. Há relato anterior de que a persistência de células B imaturas IgM+ IgD+ em alguns pacientes com DIgA estava associada à progressão para ICV. Adicionalmente, há evidências de que a diminuição de células B de memória em uma proporção de pacientes com ICV esteja associada à presença de autoimunidade. OBJETIVOS: comparar em pacientes com DIgA e ICV várias subpopulações de células B e analisar a relação entre estas populações celulares e a presença de DAIs em ambos grupos. MÉTODO: Este estudo incluiu 56 pacientes adultos de ambos sexos com DIgA e ICV, distribuídos em grupos de acordo com a associação com DAI: grupo DIgA sem DAI (14 pacientes), grupo DIgA com DAI (14 pacientes), grupo ICV sem DAI (14 pacientes) e grupo ICV com DAI (14 pacientes). As seguintes subpopulações de células B foram determinadas por citometria de fluxo de quatro-cores: células B naive (CD19+IgM+), células B de memória clássicas ou class-switched (CD27+IgM-IgD-) e células B de memória imaturas (CD27+IgM+ or CD27+IgD+). Na análise estatística foi aplicado o teste de ANOVA; valores significativos foram determinados pela correção de Bonferoni. RESULTADOS: os grupos analisados foram homogêneos quanto à idade e distribuição de gêneros. Os valores de linfócitos totais e de células B naive foram similares nos quatro grupos estudados. Os pacientes com deficiência de IgA e ICV com DAIs associadas apresentaram valores igualmente aumentados de células B de memória imaturas CD27+IgM+ e CD27+IgD+ quando comparados a pacientes sem doenças autoimunes. CONCLUSÕES: estes resultados sugerem que a persistência de células B de memória imaturas possa estar relacionada à presença de autoimunidade em pacientes com DIgA e ICV. Especula-se se a persistência destas células em pacientes com DIgA e DAI associada possa constituir fator preditivo da progressão de DIgA para ICV. / INTRODUCTION: IgA deficiency (IgAD) is the most common primary immunodeficiency disorder and is characterized by serum IgA concentration below 7 mg/dL and normal serum IgM and IgG levels. Most of the affected individuals have no apparent disease, whereas selected patients suffer from recurrent or chronic mucosal infections, atopy and/or autoimmune diseases (AIDs). This defect is presumed to result from impaired class-switching to IgA or from maturational failure of IgA-producing lymphocytes. Common variable immunodeficiency (CVID) is a primary antibody deficiency disease characterized by low serum levels of IgG, IgA and/or IgM, and normal or decreased B and/or T cell numbers, leading to chronic or recurrent infections, noted mostly in the respiratory and gastrointestinal tract. While the pathophysiology of CVID remains elusive, in many patients it may be due to an intrinsic B cell defect. Memory B cells (CD27+) in particular, have been noted to correlate with certain clinical aspects of the disease. High numbers of IgM+ memory B cells (CD27+IgM+) appear to correlate with the presence of infections, whereas decreased numbers of classic (class-switched) memory B cells (CD27+IgG-IgM- ) correlate with lower serum IgG levels and increased rates of autoimmune features. Progression from IgAD to common variable immunodeficiency (CVID) has been reported in some patients, but is not a general rule. It is postulated that a common genetic base and association with AIDs could be risk factors for progression from IgAD to CVID. OBJECTIVES: The aim of this study was to compare B cell subpopulations of patients with IgAD and with CVID, and to assess the relationship between these populations and the presence of autoimmune diseases in both group of patients: . METHOD: The study included 56 adult patients of both genders with IgAD or CVID. Patients were grouped, according to the association with autoimmune disease,as follows: group IgAD with AID (14 patients), group IgAD without AID (14 patients), group CVID with AID (14 patients) and group CVID without AID (14 patients). We determined by immunophenotyping of lymphocytes by four-colour cytometry the following subpopulations of B cells: naïve B cells (CD19+IgM+), class-switched memory B cells (CD27+IgM-IgD-) and immature B memory cells (CD27+IgM+ or CD27+IgD+). Statistical analysis was performed by the ANOVA test; significant P-values were determined by means of Bonferonis correction. RESULTS: there is no statistically significant difference between the average ages and the gender of patients between the groups. the distribution of the sample values seem to indicating that, there is no statistically significant difference in the CD19 levels between the groups. patients with AID represent greater values of CD27 IgM+ and CD27+ IgD+ than patients without AID, independent of the group studied. CONCLUSIONS: These results suggest that the persistence of immature memory B cells in patients with IgAD and CVID can be related to autoimmune diseases. We speculate if the persistence of immature B cells can constitute risk factor to progression of IgAD for CVID.