As células tumorais prosperam como consequência da capacidade de resistir aos mecanismos de morte celular e de evasão da vigilância imunológica. Nós propomos que, em cânceres que possuem o supressor de tumor p53 selvagem, a remediação de ambas dessas defesas pode ser promovida pela transferência genica combinada de vetores adenovirais portadores dos transgenes de p19Arf (proteína supressora de tumor, parceira funcional de p53) e de interferon-beta (IFNbeta, citocina imunomoduladora). De fato, em resultados anteriores, notamos que a transdução combinada (p19Arf/IFNbeta), mas não os tratamentos individuais, em células de melanoma murino B16F10 resulta em aumento massivo de morte celular. Porém a capacidade destas células em processo de morte de desencadear imunidade antitumoral não foi analisada. Nesta tese e em estudos complementares, buscamos investigar os mecanismos moleculares de morte celular envolvidos na resposta imune estimulada por p19Arf/IFNbeta e explorar sua aplicação como imunoterapia do câncer. Inicialmente, em modelo de vacinação profilática, revelamos que o tratamento combinado em células B16F10 promove a expressão de IL-15, ULBP1, dos receptores de morte FAS/APO1 e KILLER/DR5, assim como uma resposta de células natural killer que rejeitam estas células tratadas quando inoculadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Após desafio tumoral no flanco oposto, a progressão desses tumores foi fortemente reduzida devido ao engajamento de linfócitos T CD4+ e CD8+, que apresentaram produção aumentada das citocinas IFN-? e TNF-alfa e medeiam proteção antitumoral de longo prazo. Em seguida, explorando um contexto de imunização diferente, a transferência de gênica in situ foi realizada em carcinoma heterotópico de pulmão e exibiu proteção significativa contra um desafio tumoral secundário, apenas quando o tumor primário foi tratado com p19Arf/IFNbeta. Análise de transcriptoma destes tumores indicou uma assinatura quimiotáxica de neutrófilos e linfócitos T CD8+ através das quimiocinas CCL3, CXCL3 e da IL-1beta. Em apoio destas observações, análises mecanicistas in vitro revelaram que células tratadas com p19Arf/IFNbeta ativam programas apoptóticos de p53 e antivirais de IFNbeta, enquanto sucumbem a um processo de morte por necroptose que também libera moléculas de morte celular imunogênica (MCI), calreticulina, ATP e HMGB1. No entanto, procurando potencializar ainda mais o benefício terapêutico dos nossos vetores, exploramos sua associação com o quimioterápico imunogênico doxorrubicina (Dox), que também é indutor de MCI. E nesta associação, percebemos que a Dox aumenta não apenas os níveis de morte celular, mas também a imunogenicidade das células tratadas, proporcionando em um modelo de vacina terapêutica, um controle tumoral superior em camundongos que já portavam antes da vacinação tumores B16F10 ou MCA205. Além disso, a associação in situ destas terapias restaurou a eficácia de uma dose sub-terapêutica de Dox, que em contraste com sua dose terapêutica, não prejudica a função cardíaca. Finalmente, também exploramos a associação com o bloqueio dos pontos de controle imunológicos PD-1 ou CTLA-4, que no modelo de vacina terapêutica, sua associação induziu maior rejeição completa de tumores B16F10. Em conclusão, aqui apresentamos evidências sobre a capacidade da combinação p19Arf/IFNbeta de induzir morte celular e estimulação imunológica. E ressaltamos seu potencial como uma estratégia de imunoterapia do câncer / Cancer cells thrive as a consequence of resisting cell death mechanisms and escaping from immune surveillance. We propose that, in cancers that harbor the wild-type tumor suppressor p53, remediation of both of these defenses can be achieved by harnessing the adenoviral vector mediated gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein, p53 functional partner) together with interferon-beta (IFNbeta, immunomodulatory cytokine). Indeed, in our initial observations, it was noticed that combined-transduction (p19Arf/IFNbeta), but not the individual treatments, of B16F10 mouse melanoma cells results in massive cell death levels. Yet, the capability of these dying cells to unleash antitumor immunity was not investigated. Here in this thesis and in complementary studies, we sought to investigate the molecular mechanisms of cell death involved in the p19Arf/IFNbeta immune stimulation and explore its potential as a mediator of cancer immunotherapy. First, in a prophylactic B16F10 vaccine model, we revealed that the dual treatment led to the up-regulation of IL-15, ULBP1, FAS/APO1 and KILLER/DR5 death receptors, plus a natural killer cell response that completely rejects treated cells when inoculated in syngeneic immunocompetent mice. Whereas, upon a contralateral tumor challenge, progression was strongly reduced by engaging both CD4+ and CD8+ T cells, which displayed augmented production of IFN-? and TNF-alpha cytokines and provided long term antitumor protection. Next, exploring different immunization context, in situ gene transfer in a heterotopic lung carcinoma exhibited significant protection against a secondary tumor challenge only when the primary tumor was treated with p19Arf/IFNbeta. Transcriptome analysis of these treated tumors indicated a chemotaxic signature of neutrophils and CD8+ T cells with the involvement of CCL3, CXCL3 chemokines and IL-1beta. Moreover, in support of this evidence, mechanistic in vitro studies revealed that p19Arf/IFNbeta treated cells reactivate p53 apoptotic and IFNbeta antiviral programs, while succumbing to a necroptosis cell death processes that also releases immunogenic cell death (ICD) molecules, calreticulin, ATP and HMGB1. Yet, aiming to potentiate therapeutic benefit of our vectors, we explored their association with doxorubicin (Dox) immunogenic chemotherapy, which is also an inducer of ICD. And in this setting, this association with Dox enhances not only cell death levels but also immunogenicity of treated cells, providing superior tumor control in a therapeutic vaccine model, where mice were already bearing B16F10 tumors or MCA205 sarcomas before vaccination. Moreover, associated use of these therapies in situ rescued efficacy of a sub-therapeutic dose of Dox, which in contrast to its therapeutic dose, does not impair cardiac function. Finally, we also evaluated the association with PD-1 or CTLA-4 checkpoint blockade immunotherapy, which in the therapeutic vaccine model induced full tumor rejection in a greater number of mice. In sum, here we provide compelling evidence for the ability of the p19Arf/IFNbeta combined gene transfer to promote cell death and immunogenic stimuli and underscored its potential to be applied as a cancer immunotherapy strategy

A incidência de melanomas tem crescido mundialmente. Apesar de representar um potencial problema de saúde pública pela sua incidência crescente, melanomas ainda se apresentam como tumores de difícil tratamento, especialmente quando diagnosticados em estadios avançados. A taxa de resposta a quimioterapia não ultrapassa 30% de resposta clínica objetiva nestes casos. As bases moleculares da quimiorresistência não são ainda completamente esclarecidas e seu conhecimento será útil para o delineamento de estratégias de quimiossensibilização. Em estudos anteriores, observamos que o tratamento de linhagem de células de melanoma metastático humano com o quimioterápico cisplatina induz o acúmulo de proibitina nas células sobreviventes. Proibitina é uma molécula expressa ubiquamente na maioria das células. Há evidências de que a forma nuclear esteja envolvida com o processo de morte celular e inibição de E2F1 enquanto a forma citoplasmática parece atuar como chaperona mitocondrial, garantindo sua homeostasia. O objetivo deste projeto foi avaliar a compartimentalização subcelular e a expressão de proibitina, após tratamento com 25 M de cisplatina por 24 horas em diferentes linhagens de melanoma metastático humano; e, o efeito de sua subexpressão, usando-se small interference (si) RNA. Nós mostramos que nas linhagens de melanoma humano LB373Mel, SKMel 37 e Mel 85, a proibitina foi encontrada predominantemente no citoplasma, associada, pelo menos em parte, com a mitocôndria. Após tratamento com cisplatina, uma porção da proibitina também foi encontrada no núcleo, como pode ser detectado utilizando-se anticorpo monoclonal (clone II-14-1). Experimentos de knockdown de proibitina por siRNA obtiveram sucesso em duas de três linhagens. Nessas duas linhagens (LB373Mel e Mel 85), o bloqueio do acúmulo de proibitina após tratamento com cisplatina levou à quimiossensibilização. A quimiossensibilização à cisplatina não foi observada na linhagem SKMel 37, que foi capaz de acumular proibitina mesmo quando tratada com siRNA específico para proibitina. A conclusão deste projeto é que a expressão de proibitina é parte da resposta celular que leva a sobrevivência de células de melanoma expostas à cisplatina / The incidence of melanomas has grown world-wide. Besides representing a potential problem of public health for its increasing incidence, melanomas are tumors of difficult treatment, especially when diagnosed in advanced phases. The clinical objective response rate does not exceed 30% in these cases. The molecular bases of chemoresistance are not completely clarified and their understanding will be useful for the delineation of chemosensitization strategies. In previous studies, we observed that the treatment of a human metastatic melanoma cell line with the chemotherapeutic agent cisplatin induced the accumulation of prohibitin in the surviving cells. Prohibitin is ubiquitously expressed molecule in most cells. There is evidence that the nuclear form is involved with the process of cell death and inhibition of E2F1, while the cytoplasmic form seems to act as mitochondrial chaperone, guaranteeing its homeostasis. The aim of this project was to evaluate the subcellular compartmentalization and protein expression profile of prohibitin, after treatment with 25M of cisplatin for 24 hours in different human metastatic melanoma cell line, and the effect of its underexpression, using siRNA. We showed that, in human melanoma cell lines, LB373Mel, SKMel 37 and Mel 85, prohibitin was found predominantly in the cytoplasm, associated at least in part with the mitochondria. Upon cisplatin treatment, a fraction of prohibitin was also found in the nucleus, as detected by using a monoclonal antibody (clone II-14-10). Knockdown experiments were successful in two out of three cell lines. In these two cell lines (LB373Mel and Mel 85) blockage of the accumulation of prohibitin upon cisplatin treatment led to chemosensitization. Chemosensitization to cisplatin was not observed for SKMel 37 cells, which accumulated prohibitin even when treated with prohibitin specific siRNA oligonucleotides. Altogether, we concluded that expression of prohibitin is part of the cellular response that leads to cell survival in melanoma cells exposed to cisplatin

A galectina-3 (gal-3) pertence a uma família de proteínas com domínios de ligação a beta-galactosídeos e está relacionada com diversos aspectos tumorais, como proliferação e adesão celular, angiogênese e proteção contra morte celular. Estudos mostram sua relação com o fenômeno da hipóxia, característica de diversos tumores sólidos que apresentam altas taxas de proliferação celular. A adaptação à hipóxia é mediada principalmente pelo Fator Induzido por Hipóxia (HIF-1), a qual atua na indução de diversos genes de sobrevivência em ambientes com baixas concentrações de oxigênio. Além de HIF, outros fatores são importantes nesse processo, como NF-kB, por exemplo, sendo um fator de transcrição responsivo a diversos estresses celulares, entre eles, a hipóxia. Alguns modelos tumorais apresentam-se ideais para o estudo dos efeitos da hipóxia no microambiente tumoral, como os glioblastomas. Estes são tumores do sistema nervoso central com altas taxas de letalidade, são refratários aos principais métodos de tratamento por sua plasticidade, crescimento infiltrativo e heterogeneidade. Histologicamente, estes tumores apresentam atipia nuclear, altas taxas de mitose e áreas de pseudopaliçada. Postula-se que estas áreas sejam compostas por células migrantes de ambientes necróticos, os quais são também hipóxicos devido a sua distância de vasos sanguíneos e é demonstrado que estas células expressam tanto HIF-1alfa quanto gal-3. Ensaios in vitro realizados por nosso grupo demonstraram que a gal-3 é positivamente regulada pela hipóxia em uma linhagem de glioma híbrido, NG97ht, além de demonstrar que esta proteína é um fator chave na proteção destas células contra a morte celular induzida pela privação de oxigênio e nutrientes, mimetizando condições necróticas de pseudopaliçada in vivo, destacando-se as habilidades antiapoptóticas desta proteína. Embora uma de suas possíveis funções tenha sido elucidada, os mecanismos de atuação e de indução da gal-3 ainda são obscuros. Deste modo, este projeto visa explorar os papéis pró-tumorais da gal-3, podendo torná-la um possível alvo em terapias anti-neoplásicas, entendendo melhor seus mecanismos de proteção contra a morte celular e controle de expressão em ambientes hipóxicos, além de estudar suas possíveis funções in vivo no desenvolvimento de tumores, e também estendendo seus estudos para outras linhagens de glioblastoma. Nossos resultados demonstraram que a gal-3 está co-localizada com mitocôndrias nestas linhagens de glioma, podendo sofrer alterações pós-traducionais em hipóxia, como a fosforilação e que houve acúmulo de HIF-1alfa nuclear nestas células em hipóxia. Vimos também que a gal-3 na linhagem NG97ht apresentou-se proveniente de dois alelos diferentes e que fatores intermediários deveriam ser expressos previamente pela célula antes da indução de gal-3 em hipóxia. Também demonstramos que houve dependência de NF-kB na indução transcricional de gal-3 nestas condições. Estes experimentos também demonstraram que a exposição de células à hipóxia e privação de nutrientes é capaz de induzir tanto espécies reativas de oxigênio como o aumento da autofagia nestas células, fatores importantes na indução da morte celular, além de demonstrar que na linhagem NG97ht a indução da morte nestas condições ocorreu por necrose, sem apresentar apoptose celular. Expandimos esta teoria da participação da gal-3 como molécula protetora contra a morte em hipóxia e privação de nutrientes para outra linhagem de glioma humano, a T98G. E finalmente, demonstramos que a diminuição da expressão de gal-3 em células tumorais da linhagem U87MG levou a diminuição das taxas de estabelecimento e crescimento tumoral in vivo / Galectin-3 (gal-3) belongs to a family of proteins with beta-galactoside binding domains and is related to various tumoral aspects, such as cell proliferation and adhesion, angiogenesis and protection against cell death. Studies show its relationship with the hypoxia phenomenon, a characteristic of many solid tumors that have high cell proliferation rates. The adaptation to hypoxia is mainly mediated by Hypoxia Induced Factor (HIF-1), which acts in the induction of several survival genes in environments with low oxygen concentrations. In addition to HIF, other factors are important in this process, such as NF-kB, for example, which is a transcription factor responsive to various cellular stresses, including hypoxia. Some tumor models are ideal for studying the effects of hypoxia in the tumor microenvironment, e.g. glioblastomas. These central nervous system tumors with high mortality rates are refractory to the main treatment methods due to their plasticity, heterogeneity and infiltrative growth. Histologically, these tumors exhibit nuclear atypia, high mitotic rates and pseudopalisading areas. It is postulated that these areas are composed of migrating cells out of necrotic microenvironments, which are also hypoxic due to their distance from the blood vessels and it is shown that these cells express both HIF-1alfa and gal-3. In vitro assays performed by our group demonstrated that gal-3 is positively regulated by hypoxia in a hybrid glioma cell line, NG97ht, and demonstrated that this protein is a key factor in protecting these cells against cell death induced by oxygen and nutrient deprivation conditions mimicking necrotic pseudopalisading areas in vivo, highlighting the pro-survival abilities of this protein. Although one of its possible functions has been elucidated, gal-3 mechanisms of action and induction are still unclear. Thus, this project aims to explore the gal-3 pro-tumoral effects, which may make it a possible target for anti-neoplastic therapies, better understanding the mechanisms of protection against cell death and expression in hypoxic environments, and also study its possible functions in vivo, extending these studies to other glioma cell lines. Our results demonstrated that gal-3 is located within the mitochondria in these glioma cell lines and may undergo posttranslational modifications in hypoxia, such as phosphorylation and that there is accumulation of nuclear HIF-1alfa in these cells under hypoxia. We have also seen that gal-3 in the NG97ht cell line presents two different alleles and that intermediate factors must be expressed previously by the cell before gal-3 induction in hypoxia. We also demonstrated that there is dependence on the NF-kB transcriptional factor for the gal-3 induction under these conditions. These experiments also demonstrated that exposure of cells to hypoxia and nutrient deprivation is capable of inducing reactive oxygen species and increased autophagy in these cells, which are important factors in the induction of cell death. In addition, we demonstrated that the induction of the NG97ht cell death in these conditions is due to necrosis. We expanded this theory of the participation of gal-3 as a protective molecule against cell death in hypoxia and nutrient deprivation to another human glioma cell line, T98G. And finally, we demonstrated that decreased expression of gal-3 in the U87MG glioma cell line leads to lower tumor establishment rates and decreased growth in vivo

Dissialogangliosídios, como GD3 e derivados são marcadores da progressão de melanomas. Para avaliar as possíveis funções desta molécula, transfectamos células de melanócitos com o gene da enzima ST8Sia I, que converte GM3 em GD3. Mostramos que GD3 não interfere na capacidade proliferativa dessas células, porém a expressão de GD3 mostrou-se associada à sobrevivência celular. Melanomas adquirem autonomia quanto às vias dependentes do fator de crescimento de fibroblastos (FGF-1 e -2). A expressão de GD3 não interfere na resposta proliferativa a estes fatores, porém GD3 e outros glicoesfingolipídios de membrana modulam a resposta migratória induzida por FGF-2. A expressão de GD3 sensibiliza as células à morte celular induzida por diferentes quimioterápicos, como cisplatina e vimblastina; porém, torna as células resistentes ao tratamento com temozolamida. A sensibilização ao tratamento com vimblastina, mas não às outras drogas, depende da presença de GD3, como observado por ensaios de depleção metabólica / Disialoganglioside GD3 and its derivatives are melanoma progression markers. To evaluate the possible roles of these molecules along melanoma progression, we have transfected the GD3 synthase gene (ST8Sia I) in a melanocyte cell line. Accumulation of GD3 did not confer any proliferative advantage to melanocytes. However, GD3 expression was associated with cell survival. The autonomic growth of melanomas is in part related to a constitutive activation of fibroblast growth factor dependent pathways. GD3 expression did not alter the proliferative response to either FGF-1 or FGF-2. However, GD3 and other membrane glycospingolipids modulate the motogenic activity of FGF-2. GD3 expression sensitizes melanocytes to chemotherapeutic agent-induced cell death, as cisplatin and vimblastin. On the other hand, GD3 turned melanocytes more resistant to temozolomide. Chemosensitization to vimblastin, but not to the other drugs, was dependent on the presence of GD3 within the cells, as shown by metabolic depletion of glycosphingolipids

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T02:56:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendes_MariaCarolinaSantos_D.pdf: 2658779 bytes, checksum: 153ed5344815e7e59a41c04c4a965670 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína mTOR é um proteína reguladora chave de vários processos celulares, dentre eles proliferação, crescimento e sobrevivência celular. Fatores de crescimento, oxigênio, status energético e a presença de aminoácidos são fundamentais para que todos esses processos ocorram normalmente. Descobertas realizadas nas últimas décadas mostraram que a via da mTOR encontra-se ativada em vários processos celulares, incluindo formação tumoral e angiogênese. A leucina é um aminoácido de cadeia ramificada que tem o maior potencial em ativar a via da mTOR. Devido sua capacidade de promover a síntese proteica e ganho de massa muscular, seu uso é constantemente estimulado em pacientes com câncer. No entanto, seus efeitos no crescimento tumoral não está claro. Dessa forma, realizamos um estudo cujo objetivo principal foi investigar os efeitos da dieta suplementada com leucina na modulação do crescimento tumoral em diferentes linhagens de células tumorais que se diferenciem em relação à ativação constitutiva da via IRS1/Akt/mTOR. Estudos in vivo e in vitro realizados demonstraram que as células que se diferenciam em relação à ativação da via IRS1/AKT/mTOR respondem de maneira distinta à suplementação com leucina. Linhagens de células tumorais que possuem a via da mTOR constitutivamente ativada, PC-3 e MCF-7, quando suplementadas com doses elevadas de leucina in vitro reduziram a proliferação celular e causaram retenção das células na fase G1 do ciclo celular. Já o xenoenxerto tumoral da PC-3 reduziu sua proliferação e aumentou a morte celular quando os animais foram suplementados com leucina na dieta. Nós também observamos aumento da atividade da mTOR e da p70S6K em todas as linhagens celulares quando suplementadas com leucina. O aumento da atividade da proteína mTOR foi acompanhado de redução na fosforilação de AKTser473 nas células que possuíam a via da PI3K hiperativada (PC-3 e MCF-7). Esse fato pode estar ocorrendo devido a ativação das alças de contraregulação ocasionadas pela estimulação excessiva provocada pela suplementação com leucina, naquelas linhagens celulares que já possuem a via hiperativada. Fato este comprovado pelo aumento da fosforilação em serina 307 da proteína IRS1. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a ativação da via da mTOR é central para determinar a sensibilidade de tumores à dieta suplementada com leucina, podendo modular o desenvolvimento tumoral naquelas células que já possuem a via IRS1/AKT/mTOR constitutivamente ativada. O mecanismo pelo qual a leucina pode retardar o desenvolvimento tumoral em células que possuem a via da mTOR hiperativada parece estar relacionado com o eixo de regulação negativa p70S6K-PI3K, com consequente redução da fosforilação de AKT e liberação das vias apoptóticas nos tecidos tumorais / Abstract: mTOR is a key regulatory protein in various cellular processes including proliferation, cell growth and survival. Growth factors, oxygen, energy status and amino acids are all essential to these processes. New findings in the last few decades have shown that the mTOR pathway is activated in many cellular processes, including tumorigenesis and angiogenesis. The branched chain amino acid leucine has the greatest potential to activate the mTOR pathway. Due to its ability to promote protein synthesis and muscle mass gain, use of leucine is frequently utilized in patients with cancer. However, the effect of leucine on tumor growth is not clear. The aim of this study is therefore to investigate the effect of diet-supplemented leucine on the modulation of tumor growth in several tumor cell lines that differ in the constitutive activation status of the insulin receptor substrate 1 (IRS1)/AKT/mTOR pathway. Both in vitro and in vivo experiments demonstrated different cell proliferation responses when cells were exposed to high doses of leucine. Tumor cell lines PC-3 and MCF-7, which have a constitutively activated mTOR signaling, displayed reduced cell proliferation and G1 phase cell cycle arrest when supplemented with high doses of leucine in vitro. Likewise, leucine-supplemented PC-3 cell tumor xenografts displayed reduced proliferation and increased cell death. We also observed increased activity of mTOR and its downstream substrate p70S6K in all cell lines supplemented with leucine. Increased mTOR activity was accompanied by a reduction in AKT serine 473 (ser473) phosphorylation in cell lines with a hyperactivated PI3K pathway (PC-3 and MCF-7). This most likely occurred because leucine supplementation further increased mTOR and p70S6K activity, triggering the inhibitory p70S6K/IRS1 axis. In fact, we found increased IRS1 ser307 phosphorylation in hyperactivated cell lines (PC-3 and MCF-7) supplemented with high doses of leucine. Therefore, our results suggest that mTOR pathway activation is central to determining the sensitivity of tumors to leucine supplementation. Furthermore, this could affect the response to leucine-supplemented therapies of those tumors in which the PI3K pathway is constitutively activated. The mechanism for this appears to be related to the negative p70S6K/IRS1 regulation axis, with consequent reduction of AKT phosphorylation and the release of apoptotic pathways in tumor tissues / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

O transplante autólogo de tecido ovariano constitui alternativa relevante na preservação da fertilidade e da função hormonal ovariana em mulheres sujeitas à falência ovariana prematura e infertilidade, por causas malignas, tratamentos adjuvantes ou cirurgias. É a única opção para crianças, fase pré-puberal e para mulheres que não podem retardar a quimioterapia ou não podem ser submetidas à estimulação do ciclo. O transplante ovariano autólogo pode ser, quanto ao local de reimplantação, ortotópico ou heterotópico e, quanto à conservação, a fresco ou após o período de criopreservação. As várias etapas envolvidas neste transplante são estudadas mundialmente na atualidade, como a retirada e preservação do tecido ovariano, as técnicas de criopreservação, o local apropriado para o reimplante e as possibilidades de redução da perda folicular. A avaliação da apoptose - morte celular programada - é útil na avaliação da rejeição e viabilidade dos enxertos de transplantes estabelecidos na prática clínica, tanto autólogos como heterólogos. Com o intuito de utilizar animais de maior porte, conseguir seguimento de médio prazo e realizar os procedimentos cirúrgicos por via laparoscópica, padrão ouro em humanos, o presente estudo utilizou como modelo experimental fêmeas suínas, em idade reprodutiva, da raça Minipig. Este projeto teve como propósito avaliar a influência da criopreservação e do local de implante na qualidade e na viabilidade do transplante autólogo de ovário, a fresco e após criopreservação, no tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. Foram avaliados a quantidade e a densidade folicular dos implantes e os aspectos morfológicos e histomorfométricos, bem como a apoptose, por meio da imunoexpressão de proteínas proapoptóticas- Bax e antiapoptóticas-Bcl-2, além da Caspase 3-clivada, fase final das vias extrínseca e intrínseca dos mecanismos de apoptose.Quarenta animais foram divididos em cinco grupos: Controle com ooforectomia (Grupo I), ooforectomia e transplante a fresco subcutâneo (Grupo II), a ooforectomia e transplante fresco intraperitoneal (Grupo III), ooforectomia e transplante criopreservado subcutâneo (Grupo IV) e ooforectomia e transplante criopreservado intraperitoneal (GrupoV). Os resultados mostraram que independente da técnica empregada, havia folículos em desenvolvimento e corpos lúteos em todos os tecidos ovarianos transplantados; que a contagem de folículos antrais não degenerados foi menor nos grupos após criopreservação em relação ao grupo controle e que a imunoexpressão sugestiva de apoptose ocorreu em todos os grupos transplantados, sendo maior nos transplantes intraperitoneais. Concluiu-se que a técnica utilizada para o transplante de ovário e criopreservação foi viável no modelo suíno, em tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. O transplante autólogo heterotópico subcutâneo apresentou melhores taxas de apoptose que o transplante ortotópico. / Autotransplantation of ovarian tissue is an important alternative to preserve fertility and hormonal ovarian function in women undergoing ovarian failure and premature infertilidade, because of cancer or surgery. It is the only option for infants, pre-pubertal patients and for women who can not delay chemotherapy or not may be subjected to stimulation of the cycle. The various steps involved in the transplant are studied worldwide today, as the removal and preservation of ovarian tissue, the techniques of cryopreservation, the appropriate site and mechanisms to reduce follicular loss. Assessment of apoptosis - programmed cell death-is useful in the study of the viability of the grafts and rejection of transplants established in clinical practice, both autologous and heterologous. In order to use larger animals, getting following medium term (over 21 days) and to perform surgical procedures by laparoscopy (gold standard in humans), this study used an experimental model sows, reproductive age, Minipig race. This project aims to evaluate the influence of cryopreservation and implantation site of the quality and viability of ovarian autografts, fresh and after cryopreservation, at subcutaneous site and at intraperitoneal site. We analyzed the quantity and density of follicular implants and the morphological and histomorphometric as well as apoptosis, by proteins immunoexpression antiapoptotic and proapoptotic. Forty animals were divided into five groups: Control with oophorectomy (Group I), oophorectomy and fresh transplantation to subcutaneous site (Group II), oophorectomy and fresh transplantation to intraperitoneal site (Group III), oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to subcutaneous site (Group IV) and oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to intraperitoneal site (Group V). We concluded that the autologous ovarian transplantation was feasible in the technical proposals, in subcutaneous and intraperitoneal site in the porcine model; that regardless of the technique, there was developing follicles and corpora lutea in all ovarian tissue transplanted; that antral non-degenerate follicle count was lower in groups after cryopreservation that in the control group and that the immunoexpression of apotposis occurred in all transplanted groups, more evident in intraperitoneal transplants

A diabetes é um distúrbio endócrino do metabolismo dos carboidratos, clinicamente caracterizada por hiperglicemia, resultante da incapacidade do organismo em secretar insulina, defeitos na sua ação ou ambos. Na última década, houve um crescente aumento no número de trabalhos sobre a múltipla hereditariedade de um tipo de diabetes rara e não imunológica diagnosticada antes dos 6 meses de vida, a diabetes neonatal (DN). A maioria dos estudos, existentes na literatura referentes à DN, foi realizada em pacientes e aborda principalmente aspectos clínicos, etiológicos e terapêuticos. No entanto, existe uma deficiência de estudos realizados em modelos animais, a fim de avaliar danos moleculares em tecidos submetidos à hiperglicemia neonatal. Recentemente, as consequências da diabetes no sistema nervoso central (SNC) têm recebido maior atenção, uma vez que os recentes estudos mostram que a hiperglicemia é capaz de promover a ruptura da homeostase redox no cérebro de ratos. Neste sentido, o estresse oxidativo (EO) parece representar um dos mecanismos pelos quais a hiperglicemia danifica o tecido cerebral em um período crucial de desenvolvimento. Diante disso, o presente trabalho objetivou estudar não só a relação do EO com a hiperglicemia neonatal em cérebro de ratos, mas também avaliar se os danos oxidativos promovidos pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) na condição hiperglicêmica podem estar envolvidos no processo de morte celular neuronal. Para isso, foram utilizados ratos Wistar de 5 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e diabético. O modelo de diabetes foi induzido pela administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ) em uma única dose de 100 mg/Kg peso corporal, sendo que foram considerados diabéticos os ratos com glicemia >200mg/dL. Os animais foram sacrificados com 10 dias de vida, ou seja, 5 dias após a administração de STZ. O cérebro total dos animais foi homogeneizado, centrifugado e o homogeneizado utilizado para as medidas de parâmetros de EO e expressão proteica. Além disso, o cérebro total foi utilizado em cortes histológicos para análise do parâmetro de morte celular neuronal, avaliada pela técnica FluoroJade C. Os parâmetros de EO analisados foram o metabolismo da glutationa, que engloba a atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR), glutamato-cisteína ligase (GCL) e a 8 determinação da concentração de glutationa total e reduzida (GSH/GSSG). A medida do peróxido de hidrogênio (H2O2) também foi avaliada, juntamente com a quantificação proteica por “Western Blot” do fator nuclear eritroide relacionado ao fator 2 (Nrf2), da superóxido dismutase (SOD), da catalase (CAT), da glutationa peroxidase (GPx), da heme oxigenase 1 (HO-1) e da tiorredoxina (TRX). Os parâmetros relativos à sobrevivência e morte celular avaliados foram a quantificação proteica por “Western Blot” da proteína cinase B (AKT), da proteína cinase B fosforilada (p-AKT), da glicogênio sintase cinase 3 β (GSK3β), da p38 proteína cinase ativada por mitógenos (p38), proteína cinase c-Jun N-terminal (JNK), da célula-B de linfoma 2 (Bcl2) e da proteína X associada a Bcl2 (Bax). Os ratos submetidos ao modelo de hiperglicemia neonatal não apresentaram diferenças significativas nos parâmetros relacionados ao metabolismo da glutationa (GST, GR, GCL e GSH/GSSG), tampouco nas concentrações de H2O2 quando comparados ao grupo controle. A expressão proteica do Nrf2 foi diminuída no grupo diabético, enquanto que a expressão da CAT, HO-1 e TRX se apresentaram aumentadas no grupo diabético quando comparado ao grupo controle. Não foram encontradas diferenças significativas nas expressões proteicas da SOD e GPx. As expressões proteicas das proteínas p38 e Bcl2 foram aumentadas, enquanto a expressão da p-AKT se mostrou reduzida no grupo diabético. Já com relação à expressão das proteínas JNK, GSK3β e Bax não houve diferença significativa nos grupos analisados. Finalmente, com relação à técnica que avaliou morte celular neuronal, o grupo diabético apresentou três vezes mais marcações de neurônios fluorescentes, ou seja, com morte celular quando comparado com o grupo controle. Portanto, esses resultados sugerem que o EO pode representar um mecanismo envolvido nos efeitos da hiperglicemia no SNC de ratos neonatos. Além disso, as alterações na expressão de proteínas envolvidas em vias de sobrevivência/morte celular colaboram para o resultado de morte celular verificado no cérebro de animais com hiperglicemia neonatal e mostram os efeitos nocivos da DN em um período crucial de desenvolvimento cerebral. / Diabetes is an endocrine disorder of the carbohydrates metabolism clinically characterized by hyperglycemia, resulting from the inability of the body to secrete insulin, defeats in its action and both. In the last decade, there has been an increasing number of studies about neonatal diabetes (DN), a type of diabetes non-immunological diagnosed before 6 months of life. The most studies related to DN was developed in patients and mainly deal with clinical, etiological and therapeutic aspects. However, there is a few of studies in animal models in order to assess molecular damage in tissues submitted to neonatal hyperglycemia. Recently, the consequences of diabetes in the central nervous system (CNS) have received increased attention, as recent studies show that hyperglycemia is capable of promoting the rupture of redox homeostasis in the rat brain. Wherefore, the present work aimed to study not only the relationship between EO and neonatal hyperglycemia in rat brain, but also evaluate if the oxidative damage promoted by reactive oxygen species (ROS) in the hyperglycemic condition may be involved in the neuronal cell death process. For this, 5-day-old Wistar rats were used to promote the induction of diabetes, which was done with a single intraperitoneal streptozotocin (STZ) administration (100 mg/kg body weight). Rats with glycemia> 200 mg/dL were considered diabetic. The rats were sacrificed in 10 days of life, wherefore five days after STZ adiminstration. The whole brain of the rats was homogenized, centrifuged and homogenized used for EO techniques and protein expression measurements. In addition, total brain was used in histological sections for analysis of the neuronal cell death. The EO parameters evaluated were the activity of the glutathione S-transferase (GST), glutathione reductase (GR), glutamate-cystein ligase (GCL) and the determination of total and reduced glutathione concentration (GSH/GSSG). Hydrogen peroxide (H2O2) was evaluated along with Western Blot protein quantification of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), heme oxygenase (HO-1) and thioredoxin (TRX). Relative to cell survival and death were evaluated protein kinase B (Akt), phosphorylated protein kinase B (p-Akt), glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), p38 mitogen-activated protein kinase (p38), c-Jun amino-terminal kinases (JNK), phosphorylated c-Jun amino-terminal kinases (p-JNK), B-cell 10 lymphoma 2 (Bcl2) and Bcl2-associated protein X (Bax) by western blot. The neonatal hyperglycemia was not able to promote significant differences in the glutathione metabolism (GST, GR, GCL and GSH / GSSG) nor in the H2O2 measurement when compared to the control group. Nrf2 protein expression was decreased whereas CAT, HO-1 and TRX protein expression were increased in the diabetic group when compared to the control group. No significant differences were found in the protein expression of SOD and GPx. Also, p38 and Bcl2 protein expression was increased, whereas p-Akt was decreased in the diabetic group, already regarding the expression of JNK, p-JNK, Jsk3β and Bax proteins there were no significant difference in the analyzed groups. Finally, relative to neuronal cell death technique, the diabetic group presented three fold more neuronal cell death with fluorescent marking characteristic, when compared to the control group. Therefore, these results suggest that OE may represent a mechanism involved in the effects of hyperglycemia in the central nervous system of neonatal rats. In addition, changes in the expression of proteins involved in survival/death cell pathways contribute to the outcome of cell death, result found in the brain of animals with neonatal hyperglycemia and finally show the harmful effects of neonatal diabetes in a crucial period of brain development.

A evolução do conhecimento sobre o HIV e seus efeitos sobre as diferentes células do sistema imune possibilitaram a criação e o aperfeiçoamento de um grande arsenal terapêutico. Atualmente, a sobrevida de casos recém-­ diagnosticados é medida em décadas; entretanto, alguns pacientes não apresentam recuperação do sistema imune após a agressão inicial sofrida pelo vírus, a despeito de tratamento adequado. As células NK são identificadas como componentes da imunidade inata, responsáveis pelo combate a infecções virais e tumores. Elas são divididas em CD56dim e CD56hi, com diferentes capacidades citotóxicas e de produção de citocinas; uma terceira subpopulação composta por células CD56neg está presente em proporções mínimas em adultos saudáveis, porém tem maior importância em neonatos e está expandida em indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, podendo ser identificada pelos marcadores CD7 e CD16. Dentre diversos outros, as células NK expressam receptores ativadores e inibitórios chamados KIR, que interagem com moléculas HLA, identificando células próprias e aquelas que reduzem sua expressão como mecanismo de escape imunológico; a interação entre KIR e HLA tem papel na evolução clínica da infecção por HIV/AIDS, particularmente envolvendo o receptor KIR3DL1. PD-­ 1 é um checkpoint do sistema imunológico que pode ter sua expressão aumentada em tumores e infecções virais crônicas. A expressão de PD-­1 em células T correlaciona-­se a marcadores prognósticos na infecção por HIV/AIDS; sua expressão em células NK já foi documentada, porém temos poucas informações a respeito. Este trabalho buscou detalhar a expressão de PD-­1 e seu ligante PD-­L1 em células NK e monócitos em participantes infectados pelo HIV e controles. Foram recrutados participantes diagnosticados e acompanhados desde a infecção aguda, participantes diagnosticados após um intervalo de tempo desconhecido desde a soroconversão e controles não infectados sob alto risco por exposição sexual. As amostras foram processadas a fresco no LIM-­60; PD-­1 e outros marcadores foram analisados por citometria de fluxo multicor. A expressão de PD-­1 em células NK correlacionou-­se a contagens de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T nos participantes infectados; dentre estes, os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram menor expressão de PD-­1. Os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram ainda menor expressão de PD-­L1 em monócitos quando comparados aos participantes diagnosticados em fase desconhecida da doença, e também quando comparados aos controles não infectados. Houve aumento expressivo da proporção de células KIR3DL1+ entre as células CD56neg nos participantes infectados em comparação ao grupo não infectado. Concluímos que a expressão de PD-­1 em células NK está aumentada em pessoas infectadas pelo HIV e correlaciona-­se a outros parâmetros imunológicos, como contagem de células T CD4+ e expressão de PD-­1 em células T. A exaustão das células NK pode, portanto, contribuir para o dano imunológico causado pelo HIV e pode ser explorada como um alvo para novas modalidades terapêuticas / The expansion of our knowledge about the HIV and its effects on the entire immune system has led the development of a vast therapeutic arsenal. Survival for newly diagnosed cases is now measured in decades;? some patients, however, never recover full immune function following the initial aggression inflicted by HIV, despite adequate treatment. NK cells are identified as innate immunity components, responsible for fighting viral infections and tumors. They are separated in CD56dim and CD56hi cells, which present different cytotoxicity and cytokine production capacity. A third distinct subpopulation constituted by CD56neg cells can be found in minimal counts in healthy adults, but is present in newborns and is expanded in chronically HIV-­ infected subjects;? these cells can be identified as CD7+CD16+. Among others, NK cells express activating and inhibitory receptors called KIR, which interact with HLA molecules and identify \"self\" cells and cells that have downregulated its expression as an immunologic evasion strategy. Studies have documented the importance of KIR and HLA interaction in HIV/AIDS infection clinical course, particularly involving the receptor KIR3DL1. PD-­1 is an immune checkpoint that can be upregulated by tumors and chronic viral infections. PD-­ 1 expression on T cells is correlated to prognostic factors in HIV/AIDS infection; NK cells have been shown to express it, but further information is necessary. This study aimed at investigating PD-­1 and its ligand PD-­L1 expression on NK and monocytes in HIV-­infected participants and controls. We recruited a group of participants who were diagnosed during acute phase of HIV infection and have been followed ever since, a group of participants who were diagnosed after unknown interval since seroconversion, and a group of uninfected controls who have a high risk due to sexual exposure. Samples were freshly processed at LIM-­60; PD-­1 and other markers were analyzed by multicolor flow cytometry. We found PD-­1 expression on NK cells was correlated to T CD4+ cell counts and PD-­1 expression on T cells, in infected participants; among them, participants followed since acute infection expressed less PD-­1. They also expressed less PD-­L1 in monocytes, as compared to participants diagnosed after unknown interval since seroconversion, as well as compared to the uninfected group. We found significant increase in proportion of KIR3DL1-­expressing cells among CD56neg cells in infected participants compared to the uninfected group. We concluded that PD-­1 expression on NK cells is increased in people infected by HIV and correlated to other immunologic parameters such as T CD4+ counts and PD-­1 expression on T cells. NK cell exhaustion may, therefore, contribute to the immune damage induced by HIV-­1 infection and can be also explored as a target to find new ways to restore antiviral immunity