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Avaliação na linhagem endotelial tEnd dos efeitos diretos da transferência gênica de IFNbeta e p19arf e efeitos parácrinos mediados pela linhagem B16 transduzida pelos mesmos vetores adenovirais / Distinct roles of direct transduction versus exposure to the tumor secretome on murine endothelial cells after melanoma gene therapy with interferon-? and p19ArfVieira, Igor de Luna 18 March 2016 (has links)
A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais / The vasculature plays a central role in tumor progression and represents a therapeutic target of great interest. Inhibition of angiogenesis has the potential to slow down tumor progression and inhibit metastasis. As a result, anti-angiogenic therapies have been shown to be promising for the control of tumor growth. According to the literature, interferon ? (IFN?, activator of the innate and adaptive immune systems) and p19Arf (tumor suppressor and functional partner of p53) when studied individually alter tumor vasculature. Our group has constructed and used recombinant adenovirus vectors carrying the cDNAs of INFbeta and p19Arf and noted that the transfer of this combination of genes induced cell death and decreased tumor progression, as observed in the B16 murine model of in situ melanoma gene therapy as well as prophylactic and therapeutic vaccine approaches. In this study, we explore the idea that the combination of adenoviral vectors bearing INFbeta and p19Arf produce anti-angiogenic effects due to their impact on endothelial cells. To test this hypothesis, murine endothelial cells (tEnd) were transduced with adenoviral vectors, revealing that Ad-p19 vector confers inhibition of proliferation, tube formation, migration and induces increased expression of genes related to the p53 cell death pathway. The Ad-IFNbeta vector alone had no significant impact on these tests. Alternatively, influences on paracrine effects are evaluated on endothelial cells co-cultured with B16 cells that were previously transduced with adenoviral vectors. When the B16 cells were transduced with Ad-IFNbeta or co-transduced with Ad-IFNbeta + Ad-p19, co-culture resulted in the inhibition of proliferation of the endothelial cells. When B16 cells were transduced with Ad-p19 only, co-culture did alter endothelial cell behavior. Following the co-culture assay, we produce conditioned medium from B16 cells that were transduced with the vectors and applied the media on tEnd cells. We noted that conditioned medium derived from B16 transduced with Ad-IFN alone or in combination with Ad-19 decreased the viability and proliferation and induced cell death of tEnd. In this work, we show that inhibition of endothelial cells can be performed directly by transduction with Ad-19 or when such cells are exposed to the environment modulated by tumor cells transduced with Ad-IFNbeta. Even though the gene transfer of both IFNbeta and p19 was not found to be superior to the application of single genes, we observed that our approach may have an important impact on the inhibition of angiogenesis through endothelial cells
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Transplante experimental, subcutâneo e intraperitoneal, de ovário em suínos: estudo histomorfométrico e imunoistoquímico / Experimental transplantation, subcutaneous and intraperitoneal, ovary in pigs: immunohistochemical and histomorphometric studyLia Cruz Vaz da Costa Damásio 26 July 2011 (has links)
O transplante autólogo de tecido ovariano constitui alternativa relevante na preservação da fertilidade e da função hormonal ovariana em mulheres sujeitas à falência ovariana prematura e infertilidade, por causas malignas, tratamentos adjuvantes ou cirurgias. É a única opção para crianças, fase pré-puberal e para mulheres que não podem retardar a quimioterapia ou não podem ser submetidas à estimulação do ciclo. O transplante ovariano autólogo pode ser, quanto ao local de reimplantação, ortotópico ou heterotópico e, quanto à conservação, a fresco ou após o período de criopreservação. As várias etapas envolvidas neste transplante são estudadas mundialmente na atualidade, como a retirada e preservação do tecido ovariano, as técnicas de criopreservação, o local apropriado para o reimplante e as possibilidades de redução da perda folicular. A avaliação da apoptose - morte celular programada - é útil na avaliação da rejeição e viabilidade dos enxertos de transplantes estabelecidos na prática clínica, tanto autólogos como heterólogos. Com o intuito de utilizar animais de maior porte, conseguir seguimento de médio prazo e realizar os procedimentos cirúrgicos por via laparoscópica, padrão ouro em humanos, o presente estudo utilizou como modelo experimental fêmeas suínas, em idade reprodutiva, da raça Minipig. Este projeto teve como propósito avaliar a influência da criopreservação e do local de implante na qualidade e na viabilidade do transplante autólogo de ovário, a fresco e após criopreservação, no tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. Foram avaliados a quantidade e a densidade folicular dos implantes e os aspectos morfológicos e histomorfométricos, bem como a apoptose, por meio da imunoexpressão de proteínas proapoptóticas- Bax e antiapoptóticas-Bcl-2, além da Caspase 3-clivada, fase final das vias extrínseca e intrínseca dos mecanismos de apoptose.Quarenta animais foram divididos em cinco grupos: Controle com ooforectomia (Grupo I), ooforectomia e transplante a fresco subcutâneo (Grupo II), a ooforectomia e transplante fresco intraperitoneal (Grupo III), ooforectomia e transplante criopreservado subcutâneo (Grupo IV) e ooforectomia e transplante criopreservado intraperitoneal (GrupoV). Os resultados mostraram que independente da técnica empregada, havia folículos em desenvolvimento e corpos lúteos em todos os tecidos ovarianos transplantados; que a contagem de folículos antrais não degenerados foi menor nos grupos após criopreservação em relação ao grupo controle e que a imunoexpressão sugestiva de apoptose ocorreu em todos os grupos transplantados, sendo maior nos transplantes intraperitoneais. Concluiu-se que a técnica utilizada para o transplante de ovário e criopreservação foi viável no modelo suíno, em tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. O transplante autólogo heterotópico subcutâneo apresentou melhores taxas de apoptose que o transplante ortotópico. / Autotransplantation of ovarian tissue is an important alternative to preserve fertility and hormonal ovarian function in women undergoing ovarian failure and premature infertilidade, because of cancer or surgery. It is the only option for infants, pre-pubertal patients and for women who can not delay chemotherapy or not may be subjected to stimulation of the cycle. The various steps involved in the transplant are studied worldwide today, as the removal and preservation of ovarian tissue, the techniques of cryopreservation, the appropriate site and mechanisms to reduce follicular loss. Assessment of apoptosis - programmed cell death-is useful in the study of the viability of the grafts and rejection of transplants established in clinical practice, both autologous and heterologous. In order to use larger animals, getting following medium term (over 21 days) and to perform surgical procedures by laparoscopy (gold standard in humans), this study used an experimental model sows, reproductive age, Minipig race. This project aims to evaluate the influence of cryopreservation and implantation site of the quality and viability of ovarian autografts, fresh and after cryopreservation, at subcutaneous site and at intraperitoneal site. We analyzed the quantity and density of follicular implants and the morphological and histomorphometric as well as apoptosis, by proteins immunoexpression antiapoptotic and proapoptotic. Forty animals were divided into five groups: Control with oophorectomy (Group I), oophorectomy and fresh transplantation to subcutaneous site (Group II), oophorectomy and fresh transplantation to intraperitoneal site (Group III), oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to subcutaneous site (Group IV) and oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to intraperitoneal site (Group V). We concluded that the autologous ovarian transplantation was feasible in the technical proposals, in subcutaneous and intraperitoneal site in the porcine model; that regardless of the technique, there was developing follicles and corpora lutea in all ovarian tissue transplanted; that antral non-degenerate follicle count was lower in groups after cryopreservation that in the control group and that the immunoexpression of apotposis occurred in all transplanted groups, more evident in intraperitoneal transplants
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Investigação da resposta imunológica antitumoral induzida por células B16F10 tratadas pela combinação p19Arf e interferon-beta em um modelo de vacinação profilático para melanoma murino / Investigation of the antitumor immune response induced by B16F10 cells treated with the p19Arf and Interferon-beta combination in a murine prophylatic model of melanoma vaccineRuan Felipe Vieira Medrano 25 April 2013 (has links)
Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer
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Estresse oxidativo como um mecanismo dos efeitos deletérios causados pela hiperglicemia neonatal em cérebro de ratosRosa, Andréa Pereira January 2018 (has links)
A diabetes é um distúrbio endócrino do metabolismo dos carboidratos, clinicamente caracterizada por hiperglicemia, resultante da incapacidade do organismo em secretar insulina, defeitos na sua ação ou ambos. Na última década, houve um crescente aumento no número de trabalhos sobre a múltipla hereditariedade de um tipo de diabetes rara e não imunológica diagnosticada antes dos 6 meses de vida, a diabetes neonatal (DN). A maioria dos estudos, existentes na literatura referentes à DN, foi realizada em pacientes e aborda principalmente aspectos clínicos, etiológicos e terapêuticos. No entanto, existe uma deficiência de estudos realizados em modelos animais, a fim de avaliar danos moleculares em tecidos submetidos à hiperglicemia neonatal. Recentemente, as consequências da diabetes no sistema nervoso central (SNC) têm recebido maior atenção, uma vez que os recentes estudos mostram que a hiperglicemia é capaz de promover a ruptura da homeostase redox no cérebro de ratos. Neste sentido, o estresse oxidativo (EO) parece representar um dos mecanismos pelos quais a hiperglicemia danifica o tecido cerebral em um período crucial de desenvolvimento. Diante disso, o presente trabalho objetivou estudar não só a relação do EO com a hiperglicemia neonatal em cérebro de ratos, mas também avaliar se os danos oxidativos promovidos pelas espécies reativas de oxigênio (ERO) na condição hiperglicêmica podem estar envolvidos no processo de morte celular neuronal. Para isso, foram utilizados ratos Wistar de 5 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e diabético. O modelo de diabetes foi induzido pela administração intraperitoneal de estreptozotocina (STZ) em uma única dose de 100 mg/Kg peso corporal, sendo que foram considerados diabéticos os ratos com glicemia >200mg/dL. Os animais foram sacrificados com 10 dias de vida, ou seja, 5 dias após a administração de STZ. O cérebro total dos animais foi homogeneizado, centrifugado e o homogeneizado utilizado para as medidas de parâmetros de EO e expressão proteica. Além disso, o cérebro total foi utilizado em cortes histológicos para análise do parâmetro de morte celular neuronal, avaliada pela técnica FluoroJade C. Os parâmetros de EO analisados foram o metabolismo da glutationa, que engloba a atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR), glutamato-cisteína ligase (GCL) e a 8 determinação da concentração de glutationa total e reduzida (GSH/GSSG). A medida do peróxido de hidrogênio (H2O2) também foi avaliada, juntamente com a quantificação proteica por “Western Blot” do fator nuclear eritroide relacionado ao fator 2 (Nrf2), da superóxido dismutase (SOD), da catalase (CAT), da glutationa peroxidase (GPx), da heme oxigenase 1 (HO-1) e da tiorredoxina (TRX). Os parâmetros relativos à sobrevivência e morte celular avaliados foram a quantificação proteica por “Western Blot” da proteína cinase B (AKT), da proteína cinase B fosforilada (p-AKT), da glicogênio sintase cinase 3 β (GSK3β), da p38 proteína cinase ativada por mitógenos (p38), proteína cinase c-Jun N-terminal (JNK), da célula-B de linfoma 2 (Bcl2) e da proteína X associada a Bcl2 (Bax). Os ratos submetidos ao modelo de hiperglicemia neonatal não apresentaram diferenças significativas nos parâmetros relacionados ao metabolismo da glutationa (GST, GR, GCL e GSH/GSSG), tampouco nas concentrações de H2O2 quando comparados ao grupo controle. A expressão proteica do Nrf2 foi diminuída no grupo diabético, enquanto que a expressão da CAT, HO-1 e TRX se apresentaram aumentadas no grupo diabético quando comparado ao grupo controle. Não foram encontradas diferenças significativas nas expressões proteicas da SOD e GPx. As expressões proteicas das proteínas p38 e Bcl2 foram aumentadas, enquanto a expressão da p-AKT se mostrou reduzida no grupo diabético. Já com relação à expressão das proteínas JNK, GSK3β e Bax não houve diferença significativa nos grupos analisados. Finalmente, com relação à técnica que avaliou morte celular neuronal, o grupo diabético apresentou três vezes mais marcações de neurônios fluorescentes, ou seja, com morte celular quando comparado com o grupo controle. Portanto, esses resultados sugerem que o EO pode representar um mecanismo envolvido nos efeitos da hiperglicemia no SNC de ratos neonatos. Além disso, as alterações na expressão de proteínas envolvidas em vias de sobrevivência/morte celular colaboram para o resultado de morte celular verificado no cérebro de animais com hiperglicemia neonatal e mostram os efeitos nocivos da DN em um período crucial de desenvolvimento cerebral. / Diabetes is an endocrine disorder of the carbohydrates metabolism clinically characterized by hyperglycemia, resulting from the inability of the body to secrete insulin, defeats in its action and both. In the last decade, there has been an increasing number of studies about neonatal diabetes (DN), a type of diabetes non-immunological diagnosed before 6 months of life. The most studies related to DN was developed in patients and mainly deal with clinical, etiological and therapeutic aspects. However, there is a few of studies in animal models in order to assess molecular damage in tissues submitted to neonatal hyperglycemia. Recently, the consequences of diabetes in the central nervous system (CNS) have received increased attention, as recent studies show that hyperglycemia is capable of promoting the rupture of redox homeostasis in the rat brain. Wherefore, the present work aimed to study not only the relationship between EO and neonatal hyperglycemia in rat brain, but also evaluate if the oxidative damage promoted by reactive oxygen species (ROS) in the hyperglycemic condition may be involved in the neuronal cell death process. For this, 5-day-old Wistar rats were used to promote the induction of diabetes, which was done with a single intraperitoneal streptozotocin (STZ) administration (100 mg/kg body weight). Rats with glycemia> 200 mg/dL were considered diabetic. The rats were sacrificed in 10 days of life, wherefore five days after STZ adiminstration. The whole brain of the rats was homogenized, centrifuged and homogenized used for EO techniques and protein expression measurements. In addition, total brain was used in histological sections for analysis of the neuronal cell death. The EO parameters evaluated were the activity of the glutathione S-transferase (GST), glutathione reductase (GR), glutamate-cystein ligase (GCL) and the determination of total and reduced glutathione concentration (GSH/GSSG). Hydrogen peroxide (H2O2) was evaluated along with Western Blot protein quantification of catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), heme oxygenase (HO-1) and thioredoxin (TRX). Relative to cell survival and death were evaluated protein kinase B (Akt), phosphorylated protein kinase B (p-Akt), glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), p38 mitogen-activated protein kinase (p38), c-Jun amino-terminal kinases (JNK), phosphorylated c-Jun amino-terminal kinases (p-JNK), B-cell 10 lymphoma 2 (Bcl2) and Bcl2-associated protein X (Bax) by western blot. The neonatal hyperglycemia was not able to promote significant differences in the glutathione metabolism (GST, GR, GCL and GSH / GSSG) nor in the H2O2 measurement when compared to the control group. Nrf2 protein expression was decreased whereas CAT, HO-1 and TRX protein expression were increased in the diabetic group when compared to the control group. No significant differences were found in the protein expression of SOD and GPx. Also, p38 and Bcl2 protein expression was increased, whereas p-Akt was decreased in the diabetic group, already regarding the expression of JNK, p-JNK, Jsk3β and Bax proteins there were no significant difference in the analyzed groups. Finally, relative to neuronal cell death technique, the diabetic group presented three fold more neuronal cell death with fluorescent marking characteristic, when compared to the control group. Therefore, these results suggest that OE may represent a mechanism involved in the effects of hyperglycemia in the central nervous system of neonatal rats. In addition, changes in the expression of proteins involved in survival/death cell pathways contribute to the outcome of cell death, result found in the brain of animals with neonatal hyperglycemia and finally show the harmful effects of neonatal diabetes in a crucial period of brain development.
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Efeitos agudos do exercício resistido sobre marcadores da resposta inflamatória e imunePereira, Guilherme Borges 11 December 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-12-11 / Universidade Federal de Sao Carlos / The purpose of the present study was to examine the acute effects of resistance training (RT) on CD4+ and CD8+ T lymphocytes apoptosis (annexin V+) and migration (CX3CR1). Twelve subjects performed two RT sessions (3 sets of 9 exercises) with 1 min (Hyper-1) and 3 min (Hyper-3) of rest-interval length between sets and exercises. CD4+ and CD8+ cells count displayed no change following Hyper-1 and Hyper-3 (p > 0.05). There was an increase in the percentage of CD4+ positive for annexin V+ and CX3CR1+ immediately after and 24 h post Hyper-1 (p < 0.05). Percentage of CD4+ positive for annexin V+ increased 2 and 24 h post Hyper- 3, and decreased after CX3CR1+ for the same time-points (p < 0.05). There was an increase in CD8+ positive for annexin V+ and CX3CR1+ immediately after, 2 and 24 h post Hyper-1 and Hyper-3 (p < 0.05), while no differences were found between Hyper-1 and Hyper-3 (p > 0.05). Acute RT increase the apoptosis and migration of CD4+ and CD8+ lymphocytes even 24 h after exercise, with minimal effects of restinterval length. / O objetivo dos pesquisadores do presente estudo foi examinar os efeitos agudos do Exercício Resistido (ER) sobre a apoptose (Anexina V+) e a migração (CX3CR1) de linfócitos T CD4+ e CD8+. 12 sujeitos adultos realizaram duas sessões de ER (3 séries em 9 exercícios) com 1 minuto (Hiper-1) e 3 minutos (Hiper-3) de intervalo entre as séries e exercícios. Não foi observada alteração significativa na contagem celular de linfócitos CD4+ e CD8+ após os protocolos Hiper-1 e Hiper-3 (p > 0,05). Foi observado aumento no percentual de linfócitos T CD4+ positivos para anexina V+ e CX3CR1 imediatamente após e 24 horas após Hiper-1 (p < 0,05). A porcentagem de linfócitos T CD4+ positivos para anexina V+ aumentou 2 e 24 horas após Hiper-3 e diminuiu para CX3CR1 nos mesmos momentos (p < 0,05). Houve aumento nos linfócitos T CD8+ positivos para anexina V+ e CX3CR1+ imediatamente e 24 horas após os protocolos Hiper-1 e Hiper-3 (p < 0,05), enquanto que não foram observadas diferenças significativas entre Hiper-1 e Hiper-3 (p > 0,05). O ER aumenta marcadores celulares de apoptose e migração em linfócitos T CD4+ e CD8+ mesmo 24 horas após uma sessão aguda de exercício, com mínimo efeito da duração do intervalo de descanso entre as séries e exercícios.
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Análise do perfil imunofenotípico das células NK e sua correlação com a expressão de PD-1 e PD-L1 em indivíduos infectados pelo HIV / Analysis of immunophenotypic profile of NK cells and correlation to PD-1 and PD-L1 expression in HIV-infected individualsPoliana Alves Patah 25 November 2016 (has links)
A evolução do conhecimento sobre o HIV e seus efeitos sobre as diferentes células do sistema imune possibilitaram a criação e o aperfeiçoamento de um grande arsenal terapêutico. Atualmente, a sobrevida de casos recém- diagnosticados é medida em décadas; entretanto, alguns pacientes não apresentam recuperação do sistema imune após a agressão inicial sofrida pelo vírus, a despeito de tratamento adequado. As células NK são identificadas como componentes da imunidade inata, responsáveis pelo combate a infecções virais e tumores. Elas são divididas em CD56dim e CD56hi, com diferentes capacidades citotóxicas e de produção de citocinas; uma terceira subpopulação composta por células CD56neg está presente em proporções mínimas em adultos saudáveis, porém tem maior importância em neonatos e está expandida em indivíduos cronicamente infectados pelo HIV, podendo ser identificada pelos marcadores CD7 e CD16. Dentre diversos outros, as células NK expressam receptores ativadores e inibitórios chamados KIR, que interagem com moléculas HLA, identificando células próprias e aquelas que reduzem sua expressão como mecanismo de escape imunológico; a interação entre KIR e HLA tem papel na evolução clínica da infecção por HIV/AIDS, particularmente envolvendo o receptor KIR3DL1. PD- 1 é um checkpoint do sistema imunológico que pode ter sua expressão aumentada em tumores e infecções virais crônicas. A expressão de PD-1 em células T correlaciona-se a marcadores prognósticos na infecção por HIV/AIDS; sua expressão em células NK já foi documentada, porém temos poucas informações a respeito. Este trabalho buscou detalhar a expressão de PD-1 e seu ligante PD-L1 em células NK e monócitos em participantes infectados pelo HIV e controles. Foram recrutados participantes diagnosticados e acompanhados desde a infecção aguda, participantes diagnosticados após um intervalo de tempo desconhecido desde a soroconversão e controles não infectados sob alto risco por exposição sexual. As amostras foram processadas a fresco no LIM-60; PD-1 e outros marcadores foram analisados por citometria de fluxo multicor. A expressão de PD-1 em células NK correlacionou-se a contagens de células T CD4+ e expressão de PD-1 em células T nos participantes infectados; dentre estes, os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram menor expressão de PD-1. Os participantes seguidos desde a infecção aguda tiveram ainda menor expressão de PD-L1 em monócitos quando comparados aos participantes diagnosticados em fase desconhecida da doença, e também quando comparados aos controles não infectados. Houve aumento expressivo da proporção de células KIR3DL1+ entre as células CD56neg nos participantes infectados em comparação ao grupo não infectado. Concluímos que a expressão de PD-1 em células NK está aumentada em pessoas infectadas pelo HIV e correlaciona-se a outros parâmetros imunológicos, como contagem de células T CD4+ e expressão de PD-1 em células T. A exaustão das células NK pode, portanto, contribuir para o dano imunológico causado pelo HIV e pode ser explorada como um alvo para novas modalidades terapêuticas / The expansion of our knowledge about the HIV and its effects on the entire immune system has led the development of a vast therapeutic arsenal. Survival for newly diagnosed cases is now measured in decades;? some patients, however, never recover full immune function following the initial aggression inflicted by HIV, despite adequate treatment. NK cells are identified as innate immunity components, responsible for fighting viral infections and tumors. They are separated in CD56dim and CD56hi cells, which present different cytotoxicity and cytokine production capacity. A third distinct subpopulation constituted by CD56neg cells can be found in minimal counts in healthy adults, but is present in newborns and is expanded in chronically HIV- infected subjects;? these cells can be identified as CD7+CD16+. Among others, NK cells express activating and inhibitory receptors called KIR, which interact with HLA molecules and identify \"self\" cells and cells that have downregulated its expression as an immunologic evasion strategy. Studies have documented the importance of KIR and HLA interaction in HIV/AIDS infection clinical course, particularly involving the receptor KIR3DL1. PD-1 is an immune checkpoint that can be upregulated by tumors and chronic viral infections. PD- 1 expression on T cells is correlated to prognostic factors in HIV/AIDS infection; NK cells have been shown to express it, but further information is necessary. This study aimed at investigating PD-1 and its ligand PD-L1 expression on NK and monocytes in HIV-infected participants and controls. We recruited a group of participants who were diagnosed during acute phase of HIV infection and have been followed ever since, a group of participants who were diagnosed after unknown interval since seroconversion, and a group of uninfected controls who have a high risk due to sexual exposure. Samples were freshly processed at LIM-60; PD-1 and other markers were analyzed by multicolor flow cytometry. We found PD-1 expression on NK cells was correlated to T CD4+ cell counts and PD-1 expression on T cells, in infected participants; among them, participants followed since acute infection expressed less PD-1. They also expressed less PD-L1 in monocytes, as compared to participants diagnosed after unknown interval since seroconversion, as well as compared to the uninfected group. We found significant increase in proportion of KIR3DL1-expressing cells among CD56neg cells in infected participants compared to the uninfected group. We concluded that PD-1 expression on NK cells is increased in people infected by HIV and correlated to other immunologic parameters such as T CD4+ counts and PD-1 expression on T cells. NK cell exhaustion may, therefore, contribute to the immune damage induced by HIV-1 infection and can be also explored as a target to find new ways to restore antiviral immunity
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Avaliação na linhagem endotelial tEnd dos efeitos diretos da transferência gênica de IFNbeta e p19arf e efeitos parácrinos mediados pela linhagem B16 transduzida pelos mesmos vetores adenovirais / Distinct roles of direct transduction versus exposure to the tumor secretome on murine endothelial cells after melanoma gene therapy with interferon-? and p19ArfIgor de Luna Vieira 18 March 2016 (has links)
A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais / The vasculature plays a central role in tumor progression and represents a therapeutic target of great interest. Inhibition of angiogenesis has the potential to slow down tumor progression and inhibit metastasis. As a result, anti-angiogenic therapies have been shown to be promising for the control of tumor growth. According to the literature, interferon ? (IFN?, activator of the innate and adaptive immune systems) and p19Arf (tumor suppressor and functional partner of p53) when studied individually alter tumor vasculature. Our group has constructed and used recombinant adenovirus vectors carrying the cDNAs of INFbeta and p19Arf and noted that the transfer of this combination of genes induced cell death and decreased tumor progression, as observed in the B16 murine model of in situ melanoma gene therapy as well as prophylactic and therapeutic vaccine approaches. In this study, we explore the idea that the combination of adenoviral vectors bearing INFbeta and p19Arf produce anti-angiogenic effects due to their impact on endothelial cells. To test this hypothesis, murine endothelial cells (tEnd) were transduced with adenoviral vectors, revealing that Ad-p19 vector confers inhibition of proliferation, tube formation, migration and induces increased expression of genes related to the p53 cell death pathway. The Ad-IFNbeta vector alone had no significant impact on these tests. Alternatively, influences on paracrine effects are evaluated on endothelial cells co-cultured with B16 cells that were previously transduced with adenoviral vectors. When the B16 cells were transduced with Ad-IFNbeta or co-transduced with Ad-IFNbeta + Ad-p19, co-culture resulted in the inhibition of proliferation of the endothelial cells. When B16 cells were transduced with Ad-p19 only, co-culture did alter endothelial cell behavior. Following the co-culture assay, we produce conditioned medium from B16 cells that were transduced with the vectors and applied the media on tEnd cells. We noted that conditioned medium derived from B16 transduced with Ad-IFN alone or in combination with Ad-19 decreased the viability and proliferation and induced cell death of tEnd. In this work, we show that inhibition of endothelial cells can be performed directly by transduction with Ad-19 or when such cells are exposed to the environment modulated by tumor cells transduced with Ad-IFNbeta. Even though the gene transfer of both IFNbeta and p19 was not found to be superior to the application of single genes, we observed that our approach may have an important impact on the inhibition of angiogenesis through endothelial cells
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Avaliação do processo de morte celular em bactérias aquáticas em dois modelos de ecossistemas aquáticos tropicaisSilva, Thiago Pereira da 29 March 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-03-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O bacterioplâncton é um dos componentes da cadeia trófica em ecossistemas
aquáticos, sendo regulado por fatores como disponibilidade de nutrientes,
temperatura, predação e infecção viral. A morte de bactérias é caracterizada como o
processo de perda funcional e morfológica da célula e tem função de controlar a
abundância e produção bacteriana, com significado importante na ciclagem de
carbono e nutrientes nos ecossistemas aquáticos. No entanto, o processo de morte
celular em bactérias aquáticas é desconhecido. Ainda não se sabe se a morte celular
programada (MPC), processo regulado e bem conhecido em organismos eucariotos,
ocorre em bactérias aquáticas. Este trabalho teve por objetivo investigar a ocorrência
de MCP em bactérias aquáticas utilizando dois modelos de ecossistemas: lago Batata
e lago dos Manacás. O lago Batata é um ecossistema amazônico de inundação e
encontra-se divido em duas áreas: impactada e natural. O lago dos Manacás é um
ecossistema artificial localizado em Minas Gerais. Três grupos de bactérias,
provenientes do lago dos Manacás, lago Batata – área natural e lago Batata – área
impactada foram estudados. As amostras de água foram coletadas na sub-superfície
dos lagos e processadas para análises da viabilidade celular por microscopia de
fluorescência e da fragmentação de DNA por citometria de fluxo. Em paralelo,
amostras do lago Batata – área impactada foram processadas para microscopia
eletrônica de transmissão (MET) para caracterizar a diversidade ultraestrutural da
comunidade bacteriana e investigar a ocorrência de alterações celulares bacterianas.
Os resultados da viabilidade celular utilizando marcadores específicos para
integridade de membrana (LIVE/DEAD BacLight) mostraram diretamente a presença
de bactérias vivas/viáveis e mortas/inviáveis . O lago Batata apresentou maior
proporção de morte celular bacteriana (36,20%) em comparação com o lago dos
Manacás (19,66%). As análises de fragmentação de DNA (ensaio TUNEL) mostraram
que a MCP constitui um fenômeno presente nos ecossistemas aquáticos estudados,
com maior ocorrência na área impactada do lago Batata. A MET revelou a presença
de bactérias aquáticas com grande diversidade ultraestrutural, representada por
diferenças morfológicas quanto ao envoltório celular, cápsula, mesossomos, vesículas
membranosas, partículas aderidas e tilacóides. Além disso, 34,28% das bactérias
apresentavam vírus no citoplasma. A diversidade ultraestrutural pode representar a
ampla diversidade metabólica e adaptativa bacteriana, enquanto a presença de vírus
parece relacionada com a morte bacteriana. As análises de integridade ultraestrutural
mostraram que (i) a maior proporção de bactérias encontrava-se com alterações
ultraestruturais indicativas de processo de morte, (ii) a frequência de ocorrência de
cápsula foi menor nas bactérias vazias, (iii) bactérias com alterações apresentaram
maior frequência de partículas aderidas, e (v) o número médio de fagos por secção foi
significativamente maior nas bactérias alteradas em comparação com as bactérias
intactas. A MET mostrou a ocorrência de alterações ultraestruturais típicas de MCP,
como retração e condensação citoplasmáticas. Em conjunto, nossos dados ressaltam
morte bacteriana como um evento importante atuando na regulação da comunidade
bacteriana e demonstra, pela primeira vez, a ocorrência de MCP em bactérias
aquáticas. A MCP pode ter significado funcional como um dos mecanismos
desenvolvidos para sobrevivência da comunidade bacteriana. / The bacterioplankton is an important component of the food web structure in aquatic
ecosystems and it is regulated by many factors such as nutrient supply, temperature,
predation and virus infection. Bacterial death is characterized by functional and
morphological loss of the bacterial cell with roles in the control process of abundance
and bacterial production of aquatic ecosystems and functional meaning in the carbon
and nutrient cycles. However, the cell death process in aquatic bacteria remains to be
defined. Programmed cell death (PCD) is a regulated process largely known in
eukaryotic organisms. There are not studies dealing with PCD occurrence in aquatic
bacteria. This study aimed to investigate the occurrence of PCD in free-living aquatic
bacteria in two models of aquatic ecosystems: Batata lake and Manacás lake. Batata
Lake is located on floodplain Trombetas river in northern of Brazilian Amazon. This
ecosystem has been impacted for bauxite tailings over teen years and it is presently
divided in impacted and natural stations. Manacás Lake is an artificial system located
in Minas Gerais. Three groups of bacteria from Manacás Lake, Batata lake – impacted
area - and Batata lake – natural area -were studied. Water samples were collected
from the subsurface of these lakes and processed for analyses of bacterial viability by
fluorescence microscopy and DNA fragmentation by flow citometry. In parallel,
samples from Batata lake – impacted area - were processed for transmission electron
microscopy (TEM) for characterization of the bacterial community ultrastructural
diversity and investigation of bacteria alterations. Our cell viability results using
specific markers for membrane integrity (LIVE/DEAD BacLight) showed directly the
presence of live/viable and dead/ not viable bacteria. Batata lake presented a higher
proportion of bacterial death (36,20%) compared to Manacás lake (19,66%). DNA
fragmentation analyses (TUNEL assay) showed that PCD is a phenomenon occurring
in all aquatic ecosystems investigated, with higher frequency in the Batata lakeimpacted
area compared to the other ecosystems. Our TEM analyses revealed a great
bacterial ultrastructural diversity represented by morphological differences in the
cellular envelope, capsule, mesosomes, membrane vesicles, attached particles and
thylacoids. Moreover, around 34,28% of the bacteria showed virus in their cytoplasm.
The ultrastructural diversity may represent the large metabolic and adaptative diversity
of aquatic bacteria while the presence of virus may be related to bacterial death. Our
ultrastructural integrity analyses showed that (i) the higher proportion of bacteria was
in death process or dead (damaged and empty), (ii) the capsule frequency is lower in
empty bacteria, (iii) the higher bacteria-particle association was found in altered
bacteria, (iv) the mean number of viruses per cell section was higher in altered
compared to intact bacteria. TEM also showed the presence occurrence of typical
ultrastructural changes indicative of MPC, such as cell retraction and condensation.
Altogether, our data demonstrate that PCD occur in aquatic bacteria, and that this
event may be a survival mechanism for bacterial communities in these ecosystems.
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