Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-10T16:53:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6078357 bytes, checksum: 26dd06f3cc777f1681a5e8f5d8395eab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T16:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6078357 bytes, checksum: 26dd06f3cc777f1681a5e8f5d8395eab (MD5) Previous issue date: 2002-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Avaliaram-se a resistência de berinjela ‘Embú’ controle e transgênica, contendo a região codante do gene orizacistatina, às espécies Meloidogyne incognita, M. javanica e M. arenaria. Foi verificado que a berinjela transgênica foi altamente suscetível a M. incognita, M. arenaria e M. javanica, assim como a berinjela controle as espécies M. incognita e M. javanica com grande número de galhas e número de ovos. Portanto, a transgênese não afetou a resposta de berinjela ‘Embú’ aos nematóides avaliados. A resistência às espécies de pulgões (Myzus persicae e Macrosiphum euphorbiae) e lagartas (Mechanitis polymnia e Mechanitis lysimnia) também foi avaliada. Trabalhou-se com uma geração de M. persicae e de M. euphorbiae para elaboração de tabelas de vida. Foram detectados efeitos significativos das linhagens da planta quanto às características (Ro - taxa líquida de reprodução, rm - razão infinitesimal de aumento populacional e λ - razão finita de aumento populacional) estudadas, exceto para tempo de geração (T). O efeito da espécie de pulgão foi significativo para todas as características, enquanto que o efeito da interação entre linhagem da planta e espécie de pulgão não foi significativo para nenhuma das características. Conclui-se que o ciclo biológico de M. persicae e M. euphorbiae foi alterado, sendo que Ro, rm e λ foram menores nas plantas transgênicas. Para o teste de resistência à lagartas, foram avaliados a área foliar consumida, o número de indivíduos e sua mortalidade, nas fases de desenvolvimento (da lagarta até a fase adulta). Não foram observadas significâncias para as características (duração do período pupal, e mortalidade larval e pupal) avaliadas, à exceção da duração larval. Em relação à área foliar consumida pelas lagartas, observou-se que não houve diferença entre as linhagens da planta e na interação entre linhagem e espécie da lagarta, porém houve diferença em todos os parâmetros avaliados (área foliar total e diária consumida em centímetros quadrado e em porcentagem) quando analisada as espécies de lagarta. Assim, as plantas transgênicas utilizadas não apresentam atividade sobre a mortalidade e duração das fases larval e pupal de Mechanitis polymnia e M. lysimnia. Atividade genotóxica de extratos de berinjela transgênicos utilizados como alimento na dieta de larvas de Drosophila melanogaster, na forma de extratos de frutos in natura e aquecidos em banho-maria a 45oC foi avaliada pelo SMART (somatic mutation and recombination test). Em berinjela ‘Embú’, foram incorporados os genes das construções pRGG hpt, pOZC6 e pCLDO04541, chamados de HPT-1, OZC-2 e SW5-3, respectivamente. Foram realizados dois experimentos independentes nos quais foram testados os mesmos frutos de cada linhagem in natura. No experimento II foram acrescentados os mesmos frutos aquecidos e mais dois frutos: OZC-4 e SW5-5. Além desses, diluiu-se o triturado do fruto OZC-2 a uma concentração de 25%. Em cada experimento também foram incluídos um controle positivo (Ciclofosfamida) e um negativo (água). Em ambos experimentos, resultados positivos foram observados para o controle positivo e em algum dos tratamentos com berinjela transgênica in natura e aquecidos. Por comparação das progênies obtidas no SMART, observou que ocorreu recombinação em alta frequência. Frações de todos os frutos liofilizados das plantas transgênicas e controle, utilizados no SMART, foram mantidos a –80oC e foram, posteriormente, utilizados para detecção de Agrobacterium tumefaciens. Após a rehidratação dos tecidos, com água destilada e estéril, esses foram plaqueados, sob condições assépticas, e avaliado o crescimento de bactérias e sua natureza pelo teste ketolactose. Dos seis frutos utilizados (Berinjela controle, HPT-1; OZC-2, SW5-3, OZC-4, SW5-5) foram isoladas 10 colônias de bactérias, apenas dos fruto SW5-3 e SW5-5. Dessas, 5 colônias foram identificadas pelo teste Ketolactose como Agrobacterium tumefaciens. À luz dos resultados, conclui-se que apesar das evidências de que extrato de berinjela induziu a recombinação somática em D. melanogaster, a ausência de dados na literatura acerca da aplicação deste teste na caracterização de efeitos genótoxicos, advindos dos produtos dos transgenes, sugere que outros estudos devem ser conduzidos, para determinar o(s) agente(s) indutor(es) de recombinação, inclusive aqueles advindos de bactérias residentes nos tecidos de frutos transformados e de possíveis situações de estresses de natureza biótica ou abiótica. / Control and transgenic eggplants for the orizacystatin gene were evaluated as for resistance to nematode species Meloidogyne incognita, M. javanica, and M. arenaria. Transgenic eggplants were highly susceptible to M. incognita, M. arenaria, and M. javanica, as well as the control eggplants were to M. incognita and M. javanica, with high number of galls and eggs produced in the roots. Therefore, the transgenesis did not affect the response of ‘Embú’ eggplant to the nematodes evaluated. The resistance to species of aphids (Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae) and butterfly larvae (Mechanitis polymnia and Mechanitis lysimnia) was also evaluated. For elaboration of life tables, a generation of Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae was used. Significant effects of plant lines were detected for the parameters studied (Ro - net reproductive rate, rm - intrinsic rate of population increase e λ - finite rate of population increase), except for generation time (T). The effect of aphid species was significant for all parameters evaluated, whereas the effect of interaction between plant line and aphid species was not significant for the parameters analyzed. It can be concluded that the biological cycle of M. persicae and M. euphorbiae was alterated, since Ro, rm and λ were smaller in the transgenic plants. For the resistance test to butterfly larvae, consumed leaf area, individual number and mortality were evaluated during the different stages of its development (from larval to adult stage). Significant differences for the parameters evaluated (time period of pupal stage and larval and pupal mortality) were not observed, with exception of time period of larval stage. In relation to consumed leaf area by the larvae, it was observed no difference between the plant lines and no interaction between the plant lines and larvae species; however, differences in all parameters evaluated (total and daily leaf area consumed) were observed depending on larvae species. Thus, the transgenic plants analized did not have any influence on the mortality and time period of larval and pupal stages of Mechanitis polymnia and M. lysimnia. The genotoxic activity of fruit extracts (in natura and preheated at 45 o C) from transgenic eggplants, used as food in the diet of Drosophila melanogaster larvae, was evaluated by the somatic mutation and recombination test (SMART). The T-DNAs from the constructs pRGG hpt [containing the genes hygromycin phosphotransferase (hpt) and β -glucuronidase (uidA), pOZC6 [containing the genes orizacystatin (ozc), uidA, and neomycin phosphotransferase II (nptII), and pCLDO04541 [containing the genes npt and Sw5], were incorporated into eggplant cv. Embú, called of HPT-1, OZC-2 and SW5-3, respectively. Two independent experiments were performed, in which the same fruits from each line were tested in natura. In the experiment II, it was added the same preheated fruits and additional two fruits: OZC-4 and SW5-5. Besides, the triturated from the fruit OZC-2 was diluted to a concentration of 25%. It was also included, in each experiment, a positive (Cyclophosphamide) and a negative (water) control. In both experiments, positive results were observed for the positive control and also in some treatments with transgenic eggplant in natura and preheated. Comparing the progenies obtained in the SMART, it was verifyed the occurrence of recombination at high frequency. Fractions of all lyophilized fruits from transgenic and control plants, used in the SMART, were kept at –80oC, and then utilized for the detection of Agrobacterium tumefaciens. After re-hydration of the tissues, with sterile destilled water, they were plaqued, under asseptic conditions, and the bacterial growth and nature were evaluated by the ketolactose test. Among six fruits analized (control, HPT-1, OZC-2, SW5-3, OZC-4, and SW5-5), bacterial colonies (total of 10) were isolated only from SW5-3 and SW5-5 fruits. Five colonies were identifyed by the ketolactose test as Agrobacterium tumefaciens. Despite evidences that extracts from transgenic eggplant induced somatic recombination in D. melanogaster, it can be concluded that the absence of data in the literature, concerning the application of SMART in the characterization of genotoxic effects of transgenic products, suggests that other studies need to be accomplished, aiming to determine the inductive agent(s) of recombination, including those from bacteria resident in transformed fruit tissues and from possible situations of stress of biotic and abiotic nature. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-30Bitstream added on 2014-06-13T18:09:01Z : No. of bitstreams: 1 mazzeo_dec_me_rcla.pdf: 466729 bytes, checksum: 3469c8aa04564a66b2f72475c7602465 (MD5) / Derivados de petróleo como benzeno, tolueno, etilbenzeno e xileno (BTEX) são hidrocarbonetos monoaromáticos muito utilizados como solventes e matéria-prima em diversos processos industriais, além de estarem presentes, em grandes quantidades, nos combustíveis fósseis. Pelo seu amplo uso e alta solubilidade em água, o BTEX vem caracterizando um poluente freqüente das águas, em especial, as subterrâneas. A aplicação do processo de biorremediação parece constituir uma metodologia promissora para o tratamento de águas contaminadas por essa mistura. Testes citogenéticos são adequados e eficientes para identificar e avaliar efeitos danosos de substâncias sobre os organismos, em suas diversas concentrações e tempos de exposição. Neste trabalho foi avaliado o efeito de cinco concentrações do BTEX, antes e após o processo de biodegradação por microrganismos selecionados de efluente bruto de refinaria de petróleo, sobre os sistemas testes de Allium cepa e cultura de células HTC. A comparação do total de aberrações cromossômicas e nucleares (alterações genotóxicas) realizada entre as concentrações de BTEX não biodegradadas e biodegradadas revelou uma diminuição significativa destas anormalidades para as concentrações BTEX 1, 2 e 4. As alterações mutagênicas, avaliadas pelo teste do micronúcleo (MN) em células meristemáticas, foram significativas para as concentrações BTEX 1, 2, 4 e 5 não biodegradadas. Ao se comparar as freqüências de MN entre a concentração preparada de BTEX com a sua respectiva concentração biodegradada, observouse uma redução significativa para as biodegradadas 1 e 4. Não houve indução significativa de MN para as células F1 para nenhuma das concentrações testadas. O BTEX não provocou nenhum efeito citotóxico significativo para este organismo. O teste do MN realizado com células HTC revelou que o BTEX foi mutagênico... / Oil products as benzene, toluene, ethylbenzene and xylene (BTEX) are monoaromatics hydrocarbons widely used as solvents and raw materials in several industrial processes, and are present in large quantities in fossil fuels. By its widespread use and high solubility in water, the BTEX is featuring a common pollutant of water, particularly groundwater. Implementation of the bioremediation seems to be a promising method for treatment of contaminated water with this mixture. Cytogenetic tests are appropriate and efficient to identify and assess the harmful effects of substances on the organisms in their several concentrations and time of exposure. This study evaluated the effect of five BTEX concentrations, before and after the biodegradation process by microorganisms selected from raw sewage from oil refinery using the test systems of Allium cepa and HTC cells. The comparison of total chromosomal and nuclear aberrations (genotoxic alterations) performed between BTEX concentrations bioremedied and not bioremedied showed a significant decrease of these abnormalities for BTEX concentrations 1, 2 and 4. Mutagenic alterations, evaluated by the micronucleus test (MN) in meristematic cells, were significant to the BTEX concentrations 1, 2, 4 and 5 not bioremedied. When comparing the frequencies of MN between the prepared concentration of BTEX with its concentration bioremedied, there was a significant reduction for the bioremedied 1 and 4. There was no significant induction of MN to cells F1 to any of the concentrations tested. The BTEX did not cause any significant cytotoxic effect to those organisms. The test performed with micronucleus of the HTC cells revealed that the BTEX was mutagenic, but only to the highest concentration, both before and after the biodegradation. Genotoxic damage as measured by the comet assay showed that BTEX was genotoxic for all concentrations not bioremedied, tested... (Complete abstract click electronic access below)

CHAPTER 2: The aquatic environment is contaminated by toxic chemicals from industrial, agricultural and domestic activities. The environmental toxicology characterizes the effects related by chemical substances present in some species and their biological implications. The genus Rhamdia presents B chromosomes, which appear to be conserved in most species of the genus, and represents character important to the evolutionary process. The study aimed to evaluate the cytogenetic aspects of 45 copies of a population of Rhamdia quelen collected in three areas with different standards of water quality in Uberabinha River, the region of Uberlandia, Minas Gerais. The species were evaluated by the Micronucleus Test, by counting the erythrocytes. The TMN results indicate the significant genotoxic and cytotoxic potential in the points, in agreement with chemical analysis. This way the species Rhamdia quelen can be considered an efficient bioindicator. The chromosome counting showed the modal number 2n=58 with variance between none and one to seven B chromosomes. The higher frequence of B chromosomes and presence of the karyotype with seven chromosomes supernumerary occurred at Point 3, referring to the Local with the highest potentially mutagenic. There was positive correlation between the presence of B chromosomes and the interference on Environmental quality. / CAPITULO 2: O ambiente aquático está repleto de produtos químicos tóxicos oriundos de atividades industriais, agrícolas e domésticas. A toxicologia ambiental caracteriza os efeitos referentes às substâncias químicas presentes em determinada espécie biológica e suas implicações. O gênero Rhamdia apresenta cromossomos B, que parecem estar conservados em grande parte das espécies do gênero, sendo característica importante para o processo evolutivo. O trabalho objetivou avaliar os aspectos citogenéticos de 45 exemplares de uma população de Rhamdia quelen, coletados em três trechos com diferentes padrões de qualidade de água no Rio Uberabinha, região de Uberlândia, Minas Gerais. As espécies foram avaliadas pelo Teste do Micronúcleo Písceo, pela contagem de eritrócitos. Os resultados do TMN indicam significante potencial mutagênico e citotóxico nos Pontos tratados, em concordância com os parâmetros químicos analisados. Sendo assim, a espécie Rhamdia quelen pode ser considerada como bioindicador eficiente. A contagem dos cromossomos apresentou número modal 2n=58, com variação de um a sete cromossomos supranumerários. A maior frequência de cromossomos B e presença de metáfases com sete cromossomos supranumerários ocorreu no Ponto 3, referente ao Ponto de maior potencialidade mutagênica. Houve correlação positiva entre a presença de cromossomos B e a interferência da qualidade Ambiental. / Mestre em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER 2: Orlistat is the first compound of a new pharmacological class which limits dietary fat absorption by inhibiting gastric and pancreatic lipases. It does not affect the neuronal circuits regulating appetite, and its action consists basically of obstructing digestion of dietary triglycerides. Recent researches suggest that orlistat stops the growth of some tumors because it inhibits the action of fatty acid synthase enzyme, whose activity favors the survival of cancer cells. However, research concerning the long-term use of this drug is unknown, and there are doubts as to possible genotóxico/mutagenic effects from its use. Thus, this study was carried out with the aim of evaluating the mutagenic, recombinogenic and carcinogenic potential of orlistat by means of a test for somatic mutation and recombination test (SMART) and test for epithelial tumor detection (wts), both in Drosophila melanogaster. When analyzed by means of SMART, larvae descending from crosses standard and high bioactivation were chronically treated with three concentrations of orlistat (2.4, 4.8 and 9.6 mg/mL) alone and in combination with DXR (0.125 mg/mL). The results demonstrated recombinogenic effect of orlistat at all concentrations tested in the HB cross and no concentration at the ST cross. In the wts test, conducted with offspring of crosses between virgin females wts/TM3 with males mwh/mwh, larvae were treated with three concentrations of orlistat quoted separately and in combination with mitomycin C (0.1 mM). The results showed that orlistat has no carcinogenic potential, nor reduce tumors induced by mitomycin C. Therefore, in these experimental conditions, orlistat had recombinogenic effects, coupled with the increased presence of cytochrome P450, but was not able to induce or inhibit the occurrence of tumors in D. melanogaster. / CAPITULO 2: O orlistat é o primeiro composto de uma nova classe farmacológica que limita a absorção de gorduras ao promover a inibição das lipases gástrica e pancreática. Ele não possui efeitos sobre circuitos neuronais reguladores do apetite e sua ação resume-se ao bloqueio da digestão dos triglicérides dietéticos. Pesquisas recentes sugerem que o orlistat paralisa o crescimento de alguns tumores por inibir a ação da enzima ácido graxo sintetase, cuja atividade favorece a sobrevivência de células cancerosas. Entretanto, não são conhecidos resultados em longo prazo e pouco se sabe sobre possíveis efeitos genotóxicos/mutagênicos associados ao seu uso. Sendo assim, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o potencial mutagênico, recombinogênico e carcinogênico do orlistat através do teste para detecção de mutação e recombinação somática (SMART) e do teste para a detecção de clones de tumor epitelial (wts), ambos realizados em Drosophila melanogaster. Na avaliação por meio do SMART foram tratadas cronicamente larvas descendentes dos cruzamentos padrão (ST) e de alta bioativação (HB) com três concentrações de orlistat (2,4; 4,8 e 9,6 mg/mL) isoladamente e em associação com a DXR (0,125 mg/mL). Os resultados demonstraram efeito recombinogênico do orlistat em todas as concentrações testadas no cruzamento HB e em nenhuma concentração no cruzamento ST. No teste wts, realizado com descendentes do cruzamento de fêmeas virgens wts/TM3 com machos mwh/mwh, as larvas foram tratadas com as três concentrações citadas de orlistat isoladamente e em associação com a mitomicina C (0,1 mM). Os resultados mostraram que o orlistat não possui potencial carcinogênico e também não reduz os tumores induzidos pela mitomicina C. Portanto, nas presentes condições experimentais, o orlistat apresentou efeito recombinogênico, associado à presença aumentada de enzimas do citocromo P450, porém não foi capaz de induzir, nem inibir a ocorrência de tumores em D. melanogaster. / Mestre em Genética e Bioquímica

The Brazilian cerrado (tropical American savanna) is a semi-arid region in which plants are submitted to metabolic stress that triggers defense mechanisms when confronted with unfavorable environmental conditions. The Lauraceae is an economically important family with 52 genera and approximately 2500-2750 species consisting mostly of trees or tree-like shrubs, rich in biologically active secondary metabolites, such as lignans (sesamin, methylpiperitol and polyprenol-12), g-lactones (isoobtusilactone), alkaloids, flavonoids and terpenes, which have shown different biological and pharmacological activities. Several plants from Lauraceae family are considered endangered Brazilian cerrado species. According to studies conducted in the area of phytochemistry at the Chemical Department of the Federal University of Mato Grosso do Sul (UFMS), using the three species Aiouea trinervis, Nectandra cissiflora and Ocotea minarum several secondary metabolites have been already isolated, so the aim of the present study was to verify: i] the antioxidant activity of ethanolic extracts (EE) obtained from the leaves of Aiouea trinervis and from the leaves or stems of Nectandra cissiflora; 2] the genotoxic effects (evaluated for mutagenic and recombinagenic effects) of EE obtained from the leaves or fruits of Aiouea trinervis, from leaves or stems of N. cissiflora, and g-lactones from fruits of A. trinervis; 3] the antimutagenic effects of EE obtained from leaves of A. trinervis and from leaves or stems of N. cissiflora. The antioxidant activities were evaluated in vitro using the 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging method. The data observed with DPPH test demonstrates antiradical activity of plant extracts. The wing somatic mutation and recombination test (SMART) using Drosophila melanogaster is a short term test suited for the detection of genotoxic activity of pure compounds or complex mixtures as well as for studies on antigenotoxicity. The SMART was used to evaluate the genotoxicity of EE obtained from the leaves or fruits of A. trinervis and EE from the leaves or stem of N. cissiflora as well as of g-lactones (isoobtusilactone) isolated from fruits of A. trinervis. The extracts and the g- lactone fraction showed no mutagenic effects on spontaneous DNA lesions. Due to these preliminary observed results, EE from the leaves of A. trinervis and EE from the leaves or stem of N. cissiflora were used in combination with the free radical generator doxorubicin (DXR) (used as chemotherapeutic agent) for antigenotoxic evaluation. All in all, when EE were combined with DXR, the results generally indicated a dose-related antigenotoxic (antimutagenic) effects, which depends on to different secondary metabolites found in each type of extract, which probably operate through different mechanisms of action. / O cerrado brasileiro (savana Americana tropical) é uma região semiárida, na qual as plantas são submetidas ao estresse metabólico, que induz mecanismos de defesa quando confrontado com condições ambientais desfavoráveis. A família Lauraceae é formada por 52 gêneros e aproximadamente 2500 espécies, consistindo principalmente de árvores e arbustos ricos em metabólitos secundários, tais como lignanas (sesamina, metilpiperitol e poliprenol-12), g-lactonas (isoobtusilactona), alcalóides, flavonóides e terpenos, os quais têm mostrado diferentes atividades biológicas e farmacológicas. Várias plantas da família Lauraceae são consideradas espécies do cerrado brasileiro, ameaçadas de extinção. Em estudos fitoquímicos realizados com as espécies Aiouea trinervis, Nectandra cissiflora e Ocotea minarum, conduzidos pelo Departamento de Química da Universidade Federal do Mato Grosso do Sul (UFMS) foram identificados entre outros metabólitos a sesamina e flavonóides, os quais são atribuídos atividade antioxidante e antigenotóxica. A atividade antioxidante de extratos etanólicos (EE) foi avaliada in vitro usando o ensaio antioxidante 2,2-diphenyl-1- picrydrazyl (DPPH). O teste para detecção de mutação e recombinação somática em células de asas (SMART) em Drosophila melanogaster é um teste de curta duração para a detecção de atividade genotóxica de compostos puros ou misturas complexas, assim como para estudos de antigenotoxicidade. O SMART foi usado para avaliar a genotoxicidade e /ou antigenotoxicidade dos EE, da g-lactona (isoobtusilactona) e dos alcalóides (triptofol, ocoteína e dicentrina). O objetivo do presente estudo foi verificar: 1] a atividade antioxidante de (EE) obtidos de folhas de Aiouea trinervis, de folhas e caule de Nectandra cissiflora e folhas e frutos de Ocotea minarum; 2] os efeitos genotóxicos (avaliados quanto aos efeitos mutagênicos e recombinogênicos) de EE obtidos de folhas e frutos de Aiouea trinervis, de folhas e caule de Nectandra cissiflora e folhas e frutos Ocotea minarum, e da g-lactona (isoobtusilactona), e dos alcalóides triptofol, ocoteína e dicentrina; 3] os efeitos antimutagênicos de EE obtidos de folhas de Aiouea trinervis, de folhas e caule de Nectandra cissiflora, de folhas e frutos de Ocotea minarum. Os dados observados com o teste DPPH demonstraram a atividade anti-radical dos extratos obtidos das folhas de Aiouea trinervis e Nectandra cissiflora e dos frutos de Ocotea minarum. Somente os alcalóides ocoteína e dicentrina apresentaram atividade genotóxica. Devido a esses resultados os EE de folhas de A. trinervis, folhas e caule de N. cissiflora e folhas e frutos de O. minarum foram associados com o gerador de radicais livres doxorrubicina (DXR) para avaliação de antigenotoxicidade. De modo geral, quando os EE foram combinados com DXR, os resultados indicaram efeitos antigenotóxicos relacionados com dose específica e dependendo dos metabólitos secundários encontrados em cada tipo de extrato, os quais provavelmente operam por meio de diferentes mecanismos de ação. / Doutor em Genética e Bioquímica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plant Jurema preta (Mimosa hostilis) is traditionally used in semi-arid regions of Brazil, for painkillers and anti-inflammatory, in the form of tea from bark. Despite the use of plants with medicinal purposes is part of the knowledge already popularized long, detailed studies about the action of the constituents in the organisms need further investigation, because know that difference of doses lead to damage to health. Phytochemical studies of compounds of some species of the genus Mimosa (Mimosa pudica and Mimosa rubicaulis) showed antioxidant activity, toxicological and bactericidal, depending on the dose applied, but very little is known about the likely effects mutagenic and/or antimutagenic of Mimosa hostilis. In attempt to occupy this gap, this study aims to investigate the mutagenic and protective effect of tree concentrations of aqueous extracts of Mimosa hostilis (3,91, 15,625 e 62,5 mg/mL) through the SMART technique (Somatic Mutation and Recombination Test) of wing through 2 crosses standard (ST) and high bioactivation (HB) in 3 strains of Drosophila melanogaster: multiple wing hairs (mwh), flare 3 (flr3) and Oregon R / flr3 (ORR/flr3). The results showed mutagenic and antimutagenic in concentrations tested. The antagonistic effects (mutagenic and antimutagenic) observed is a reflection of the constitution phytochemical complex of M. hostilis aqueous extract, where individual and synergistic effects of its components can be related directly or indirectly with the potential mutagenic and antimutagenic matches. However, it is important to identify which of these components, alone or combined, are responsible for the data presented here, to the best use of the plant as herbal medicine. / A planta Jurema preta (Mimosa hostilis) é tradicionalmente utilizada em regiões semi-áridas do Brasil, com fins analgésicos e antiinflamatórios, na forma de chá das cascas. Apesar do uso popular de plantas com fins medicinais, estudos detalhados sobre a ação dos constituintes nos organismos necessitam de maiores investigações, pois se conhece que a diferença de dosagens pode causar efeitos danosos à saúde. Estudos fitoquímicos de compostos de algumas espécies do gênero Mimosa (Mimosa pudica e Mimosa rubicaulis) revelaram ação antioxidante, bactericida e toxicológica, a depender da dosagem aplicada; entretanto, pouco se conhece sobre os prováveis efeitos mutagênicos e/ou antimutagênico de Mimosa hostilis. Na tentativa de preencher esta lacuna, este trabalho objetivou investigar os possíveis efeitos mutagênico e protetor de três concentrações de extrato aquoso de Mimosa hostilis (3,91, 15,625 e 62,5 mg/mL) por meio do SMART (Somatic Mutation and Recombination Test) de asa, utilizando 2 cruzamentos: padrão (ST) e de alta bioativação (HB) em 3 linhagens de Drosophila melanogaster (multiple wing hairs (mwh), flare 3 (flr3) e Oregon R/ flr3 (ORR/flr3)). Os resultados mostraram efeito mutagênico e antimutagênico nas concentrações testadas. Os efeitos antagônicos (mutagênicos e antimutagênicos) observados são um reflexo de constituição fitoquímica complexa do extrato aquoso de M. hostilis, onde efeitos isolados e sinérgicos de seus componentes possam estar relacionados diretamente ou indiretamente com os potenciais mutagênico e antimutagênico encontrados. No entanto, torna-se importante identificar quais destes constituintes, isolados ou combinados, são responsáveis pelos dados aqui apresentados, para o melhor emprego da planta como produto fitoterápico.

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T11:57:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Regis_WiliamCesarBento_D.pdf: 2288615 bytes, checksum: 63ccd34d93524d993a42e51b4e2f9855 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os estudos em biologia estrutural avançaram muito nos últimos anos e inúmeras informações, obtidas principalmente por dados cristalográficos, ajudaram no entendimento dos mecanismos de ação e efeito biológico de várias proteínas contudo o caminho que vai da síntese até a estruturação dde uma porteína aidna é pouco conhecido. Uma descrição termodinâmica detalhada de proteínas é fundamental para se entender seu papel biológico e conhecer as interações e forças que determinam o enovelamento. Este é o foco pincipal deste trabalho que utilizou para isso as mioglobinas de baleia e de cavalo. O estudo da apomioglobina se divide quase igualmente entre as proteínas oriundas de espermacete, a qual está clonada, e de cavalo, a qual é obtida comercialmente. Ambas possuem alta homologia e comportamento similar quanto ao enovelamento, assumindo-se em geral que estas proteínas apresentam o mesmo fenômeno no que diz respeito ao enovelamento. Contudo, esta hipótese pode não ser verdadeira, o que torna necessário medir e comparar a estabilidade destas proteínas. Apenas recentemente um método confiável para medir a estabilidade de mioglobina em uma reação reversível foi implantado: análise do desenovelamento por uréia de um derivado ciano de mioglobina em uma faixa de pH limitado. Nossos resultados mostraram que a mioglobina de cavalo é 2,1 kcal/mol menos estável que a mioglobina de espermacete em pH 5,0 e 25 ºC. Além disso, a mioglobina de cavalo agregou em altas concentrações, como medido por experimentos de gel filtração e ultracentrifugação analítica. A alta estabilidade da mioglobina de espermacete foi identificada tanto para a forma apoquanto para a forma holo e se mostrou independente de pH, na faixa de 5 até 8, e da presença de até 200 mM de cloreto de sódio. A substituição dos resíduos de alanina nas posições 15 e 74 por glicina, encontrados na mioglobina de cavalo, diminuiu a estabilidade da proteína em 1,0 kcal/mol. As apoproteínas de mamíferos que mergulham são significativamente mais estáveis do que as apoproteínas de mamíferos terrestres. Este fenômeno pode ser explicado pela suposição de que sob pressão seletiva um acúmulo de mutações que levam a pequenas estabilizações nas características globais de estabilidade das proteínas. Mamíferos que mergulham em grandes profundidades, como a baleia, são expostos a anaerobiose prolongada e conseqüente condições de acidose. Isto pode levar a uma série de acúmulos de mutações que promoverão resistência ao desenovelamento e a perda do grupo heme, fenômenos que podem ocorrer durante a acidose (Tang et al., 1998). Os resultados deste trabalho indicaram que a propensão a formação de hélices é um componente importante para explicar as diferenças de estabilidade entre as mioglobinas de cavalo e de espermacete / Abstract: The work in the literature on the stability and folding pathway of myoglobin is almost equally divided between horse myoglobin, which is available commercially, and sperm whale myoglobin, which must be cloned and expressed. The two proteins share high homology, show similar folding behavior and it is often assumed that all folding phenomena found with one protein will also be found with the other. This assumption may not be true, which makes essential to compare their basic properties, such as stability and dependence on temperature and salt concentration. However, no reliable method have been used to access the precisely difference in stability between these two proteins because it was not possible until recently to measure the stability of holoMb in a reversible unfoldingr efolding reaction. The reversible folding of myoglobin can be measured by using the cyanmet derivative and urea unfolding but only in a limited pH range. We report data at equilibrium showing that horse myoglobin was 2.1 kcal/mol less stable than sperm whale myoglobin at pH 5.0, 25 ºC, and aggregated at high concentrations as measured by gel filtration and analytical ultracentrifugation experiments. The higher stability of sperm whale myoglobin was identified for both apo and holo forms, and was independent of pH from 5 to 8 and of the presence of sodium chloride. We also show that the substitution of sperm whale myoglobin residues Ala15 and Ala74 to Gly, the residues found at positions 15 and 74 in horse myoglobin, decreased the stability by 1.0 kcal/mol, indicating that helix propensity is an important component of the explanation for the difference in stability between the two proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Anna Wedell / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:24:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soardi_FernandaCaroline_D.pdf: 4267789 bytes, checksum: 80c77e1664dcc041014d42a92bdd435e (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A causa mais freqüente de hiperplasia congênita da adrenal (HCA) é a deficiência da enzima CYP21A2 responsável por cerca de 90% dos casos, seguida da deficiência de CYP11B1, a qual é responsável por 5-8%. A deficiência de CYP21A2 apresenta diferentes sintomas clínicos, que podem variar de uma forma leve não clássica (NC) a uma forma grave clássica, dividida em virilizante simples (VS) e perdedora de sal (PS). Enquanto a deficiência de CYP11B1 é classificada nas formas clássica e não-clássica, dependendo da gravidade do fenótipo. As diferentes formas destas deficiências estão associadas a mutações distintas ou a combinação de mutações nos genes, sendo estas mutações provenientes dos genes homólogos ou não. O primeiro objetivo desta tese foi identificar novas mutações em alelos de 31 pacientes. As variantes protéicas novas p.G56R, p.L107R e p.L142P e, as raras p.H62L, p.H62L+p.P453S e p.R408C do gene CYP21A2 foram expressas para comparar as atividades da enzima CYP21A2 nas suas formas normal e mutantes. Foi objetivo, também, estudar através da técnica de mini-genes as possíveis alterações no processo de splicing para as variantes IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E do gene CYP21A2 e para a variante g.1753G>A do gene CYP11B1. O estudo da atividade enzimática do gene CYP21A2, realizado pela técnica de mutagênese sítio-dirigida, demonstrou que as mutações p.L107R, p.L142P e p.R408C reduziram a atividade enzimática para valores praticamente nulos, classificando-as como responsáveis pela forma PS. A alteração p.G56R apresentou uma quantidade mínima de conversão de progesterona em desoxicorticosterona, quantidade suficiente para evitar a perda de sal, sendo considerada clássica associada à forma VS. A mutação p.H62L foi encontrada no mesmo alelo que a mutação p.P34L, em uma das pacientes da casuística desse trabalho, ambas inseridas num gene quimérico portador da deleção de 30 Kb. A mutação p.H62L também foi encontrada em associação com a mutação p.P453S, em dois pacientes de origem Escandinava. No estudo funcional a mutação p.H62L reduziu parcialmente a atividade enzimática. Os resultados cinéticos classificaram essa mutação como relacionada à forma NC da deficiência de CYP21A2. Em combinação com a mutação p.P453S, observou-se um sinergismo, uma vez que reduziu a atividade da enzima para a faixa limítrofe entre NC e VS. A investigação no processo de splicing utilizando a técnica de minigenes para as alterações no gene CYP21A2 indicou que a variação IVS2+5G>A causa a perda do exon 2 na formação do mRNA, sendo relacionada à forma PS. Da mesma forma, a variação IVS2- 2A>G foi classificada como associada à forma PS, pois inseriu no mRNA 19 bases provenientes do intron 2 na junção exon2-exon3, o que modificou o frame de leitura do mRNA criando um códon de parada prematura. Por outro lado, ficou demonstrado que as variações IVS4- 15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E não interferem no processamento normal do mRNA do gene CYP21A2. No caso da alteração g.1753G>A no gene CYP11B1, que foi classificada como responsável pela forma clássica da deficiência de CYP11B1, o estudo de mini-gene indicou a perda dos últimos 45 nucleotídeos do exon 4, criando um códon de parada prematura. A elucidação do papel funcional e estrutural das mutações nos genes estudados permitiu o correto estabelecimento da correlação genótipo-fenótipo na maioria dos pacientes com HCA estudados / Abstract: Deficiency of CYP21A2 enzyme is responsible for more than 90% of congenital adrenal hyperplasia (CAH) followed by the deficiency of CYP11B1, which is responsible for 5-8% of the cases. The deficiency of CYP21A2 is normally classified in clinical forms that vary from a mild non-classical (NC) to a severe classical form, which can manifest as salt wasting (SW) or as simple virilizing (SV). Depending on the severity of phenotype, deficiency of CYP11B1 can be classified in classical or non-classical forms. In both deficiencies the clinical forms are associated with different mutations or combination of mutations, which may or may not be originated from the homologous genes. The aim of this study was to identify novel or rare mutations in alleles of 31 patients with CYP21A2 deficiency. Using site-direct mutagenesis strategies, nucleotide variants were introduced into the cDNA and the novel p.G56R, p.L107R and p.L142P and rare p.H62L, p.H62L+p.P453S and p.R408C protein variants of CYP21A2 were expressed to compare the enzymatic activity between the wild-type and mutant proteins. Furthermore, splicing activities were investigated for IVS2+5G>A, IVS2-2A>G, IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E sequence CTP21A2 variations and for g.1753G>A on CYP11B1 gene by minigene constructions. The analysis of enzymatic conversion of both CYP21A2 substrates, 17-hydroxyprogesterone and progesterone, into 11-desoxycortisol and corticosterone, respectively, showed low levels of residual activities for p.L107R, p.L142P and p.R408C, which were classified as SW mutations. Whereas, the result of enzyme activity for p.G56R indicated that it might be a SV-related mutation due a residual activity of 1.4% toward progesterone as substrate. The p.H62L was associated to p.P34L mutation in a chimeric gene present in a 30-kb deletion allele in Brazilian patients. In Scandinavian patients, the p.H62L mutation was found associated to the p.P453S which is known as a NC mutation. The p.H62L itself showed an activity within the range of NC mutations. The apparent kinetic constant confirmed this classification. A synergistic effect was observed for the allele bearing the p.H62L+p.P453S combination as it had caused a significant reduction in the enzymatic activity bringing it to the borderline level between SV and NC mutations. On the minigene analyses for CYP21A2, the IVS2+5G>A variation showed skipping of exon 2, therefore this alteration was classified as SW mutation. Likely, IVS2-2A>G was considered as a SW mutation due to the insertion of 19 nucleotides from intron 2 into the resulting mRNA, which changed the reading frame and created a premature stop codon. Conversely, the group of variations IVS4-15A>C+IVS4-8C>T+p.D183E did not affect the normal splicing of CYP21A2 mRNA. In the CYP11B1 minigene analysis, the g.1753G>A nucleotide variation was classified as responsible for the classical form of deficiency. An alternative splicing due to disruption of the normal donor site was used and the skipping of the last 45 nucleotides of exon 4 was observed. This alteration modified the mRNA reading frame and created a premature stop codon. The elucidation of functional and structural characters of the steroidogenic gene mutations led to the establishment of a correct genotype-phenotype in most patients studied. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-06T19:20:01Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Gomes de Oliveira - 2011.pdf: 1076733 bytes, checksum: 1faa803ec01cef7512bec500010c985b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-03-06T19:26:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Gomes de Oliveira - 2011.pdf: 1076733 bytes, checksum: 1faa803ec01cef7512bec500010c985b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T19:26:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Gomes de Oliveira - 2011.pdf: 1076733 bytes, checksum: 1faa803ec01cef7512bec500010c985b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-03-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Clinical studies have shown that the combinations of chemotherapeutic drugs gemcitabine (GEM) plus cisplatin (CIS) and gemcitabine (GEM) plus doxorubicin (DXR) exert important cytotoxic activity against several types of cancer in advanced stages as well as metastatic cancer. CIS, DXR and GEM have different mechanisms of action. GEM is a pro-drug that must be phosphorylated by deoxycytidine kinase to evolve into its active form. Both gemcitabine diphosphate and gemcitabine triphosphate inhibit processes required for DNA synthesis. CIS induces a variety of DNA structural changes, mainly intra- and interstrand cross-links between adjacent purine bases. DXR acts as a topoisomerase II inhibitor. This study compares the genetic toxicity effects induced by GEM+CIS and GEM+DXR co-treatments with the single drug treatments. We used the Somatic Mutation And Recombination Test (SMART), which simultaneously detects and quantifies mutagenic and recombinogenic toxicological endpoints through loss of heterozygosity of two genetic markers involved in the metabolic pathways of the Drosophila melanogaster wing hairs formation. Using the standard cross, the third-stage larvae were chronically treated with different concentrations of GEM (0.008, 0.010, 0.012 and 0.014 mM) combined with CIS (0.05 mM) or DXR (0.2 mM). Comparing with GEM single treatment, GEM+CIS and GEM+DXR co-treatments induced a synergistic effect manifested as an increment in the mutant clones frequencies. Homologous recombination was the main genotoxic effect observed. / As combinações dos quimioterápicos gemcitabina (GEM) com cisplatina (CIS) e gemcitabina (GEM) com doxorrubicina (DXR) têm demonstrado uma importante atividade citotóxica contra vários tipos de câncer em estágio avançado e/ou metastático em diversos estudos clínicos. CIS, DXR e GEM possuem diferentes mecanismos de ação, sendo este um fator importante para o sucesso da associação entre quimioterápicos. A GEM é uma pró-droga análoga de desoxicitidina que deve ser fosforilada pela desoxicitidina quinase para se tornar ativa. Ambos, gemcitabina difosfato e gemcitabina trifosfato, atuam inibindo os processos necessários para a síntese de DNA. Já a CIS induz uma variedade de mudanças estruturais, principalmente por meio de ligações cruzadas intra e intercadeias entre bases purínicas adjacentes do DNA. A DXR age como um inibidor da topoisomerase II, formando um complexo entre esta proteína e o DNA, inibindo os processos necessários para a síntese do DNA. Este estudo teve como objetivo comparar os efeitos de toxicidade genética induzidos pelos tratamentos utilizando os combinados de GEM+CIS e GEM+DXR com os tratamentos usando as drogas isoladas. Utilizamos o Teste de Mutação e Recombinação Somática (SMART), que detecta e quantifica, simultaneamente, parâmetros mutagênicos e recombinogênicos através da perda de heterozigose de dois marcadores genéticos envolvidos nas vias metabólicas da formação dos pêlos da asa de Drosophila melanogaster. Usando o cruzamento padrão, as larvas de terceiro estágio foram tratadas cronicamente com diferentes concentrações de GEM (0,008, 0,010, 0,012 e 0,014 mM), combinado com CIS (0,05 mM) ou DXR (0,2 mM). Comparando os combinados GEM+CIS e GEM+DXR com o tratamento isolado com GEM, notou-se que nos combinados houve um efeito sinérgico demonstrado pelo aumento nas frequências de clones mutantes destes em comparação com o tratamento isolado com GEM. A recombinação homóloga foi o principal tipo de efeito genotóxico observado nas combinações.

A produção do fruto do palmiteiro juçara tem sido bastante estimulada na região da Mata Atlântica. Este fruto possui elevados teores de compostos bioativos, como antocianinas e outros compostos fenólicos. Devido ao recente estímulo ao consumo deste fruto e ao impacto de compostos bioativos da dieta sobre a estabilidade genômica, os objetivos deste trabalho foram investigar os efeitos citotóxico, genotóxico e antigenotóxico da polpa do fruto da juçara em ratos Wistar, usando o teste do micronúcleo e o ensaio do cometa. Ratos Wistar machos receberam por gavagem água ou a polpa liofilizada do fruto da juçara reidratada com água (125, 250 ou 500 mg/kg p.c) durante 14 dias. No último dia de tratamento (14º dia), salina (NaCl, 0,9 %) ou metil-metanosulfonato (MMS, 40 mg/kg p.c.) foram administrados por via intraperitoneal, 24 horas antes da eutanásia. Foram coletados fígado e rins para a análise de glutationa reduzida (GSH), catalase (CAT), substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e para a realização do ensaio do cometa. Medula óssea e sangue periférico foram usados para o teste do micronúcleo. Os resultados mostraram que o tratamento com todas as doses da polpa do fruto da juçara não alterou os parâmetros de estresse oxidativo avaliados em rins e fígado de ratos Wistar. Além disso, não foi constatado efeito genotóxico nestes órgãos, nas três doses testadas da polpa do fruto da juçara. Em todas as doses avaliadas, a polpa do fruto da juçara não apresentou efeito mutagênico nem citotóxico em células da medula óssea e do sangue periférico de ratos Wistar. Por outro lado, a polpa do fruto do palmiteiro juçara apresentou efeito antigenotóxico frente aos danos induzidos pelo MMS em células hepáticas nas doses de 125 e 500 mg/kg p.c. A polpa deste fruto, nestas mesmas doses, também apresentou efeito antimutagênico em células do sangue periférico de ratos Wistar. A polpa liofilizada do fruto da juçara apresentou alta concentração de antocianinas, sendo majoritárias a cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo. A presença destes compostos bioativos neste fruto pode estar relacionada aos efeitos protetores frente aos danos induzidos pelo MMS, verificados neste presente estudo. Como conclusão, o consumo da polpa do fruto do palmiteiro juçara, nas doses avaliadas, não induziu genotoxicidade e mutagenicidade em ratos Wistar. Além disso, a administração da polpa do fruto da juçara em associação com o MMS reduziu a genotoxicidade e mutagenicidade induzidas por este agente indutor de danos ao DNA. / Juçara palm fruit\'s production has been intensely promoted in the Atlantic Forest region. This fruit has high content of bioactive compounds, including anthocyanins and other phenolic compounds. Due to the recent stimulus to the consumption of this fruit and the impact of dietary bioactive compounds on the genomic stability, this study aimed to evaluate the cytotoxic, genotoxic and antigenotoxic effects of juçara fruit pulp in Wistar rats, using the comet assay and the micronucleus test. Male Wistar rats received water or lyophilized juçara fruit pulp rehydrated with water (125, 250 or 500 mg/kg b.w.) by gavage for 14 days. On the last day of treatment (day 14th), saline (NaCl, 0,9 %) or methyl methanesulfonate (MMS, 40 mg/kg b.w.) were administered intraperitoneally 24 hours before euthanasia. Liver and kidneys were collected for analysis of reduced glutathione (GSH), catalase (CAT), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and to perform the comet assay. Bone marrow and peripheral blood were used for the micronucleus test. Results showed that treatment with all doses of juçara fruit pulp did not alter the oxidative stress parameters evaluated in kidneys and liver of Wistar rats. Furthermore, no genotoxic effects were observed in these organs, at all doses evaluated. At all tested doses, juçara fruit pulp also showed no mutagenic or cytotoxic effects on cells of bone marrow and peripheral blood of rats. On the other hand, juçara fruit pulp showed antigenotoxic effect at doses of 125 and 500 mg/kg b.w. against MMS-induced DNA damage in liver cells. At these same doses, juçara fruit pulp also exhibited antimutagenic effect on peripheral blood cells of Wistar rats. Juçara fruit pulp exhibited a high concentration of anthocyanins, with cyanidin-3-glucoside and cyanidin-3-rutinoside as major compounds. These bioactive compounds present in this fruit may be related to the protective effects against MMS-induced DNA damage, demonstrated in the present study. In conclusion,juçara palm fruit\'s consumption, at tested doses, did not induce genotoxicity and mutagenicity in Wistar rats. Furthermore, juçara fruit pulp associated with MMS, a DNA-damaging agent, decreased the genotoxicity and mutagenicity induced by this DNA-damaging agent.