A ativação do receptor CB1, leva a modulação de processos intracelulares que muda a resposta celular de acordo com o estímulo, além de estar envolvida em mecanismos de proliferação, diferenciação, movimentação e morte celular. O objetivo desse trabalho foi avaliar a participação desse sistema em processos oxidativo e inflamatório relacionados à neurodegeneração in vitro. Foi utilizado a linhagem de neuroblastoma Neuro2a diferenciada em células dopaminérgicas que foram expostas a três condições: com 6OHDA, H2O2 e LPS e co-tratadas com o agonista do receptor CB1 ACEA e o antagonista/agonista inverso AM251 por 24 horas. Utilizamos parâmetros funcionais de viabilidade celular, produção de espécies reativas de oxigênio e técnica de western blot. O tratamento com ACEA ou ACEA/AM251 produziram um aumento da viabilidade celular nos três modelos de exposição propostos; redução da produção de espécies reativas de oxigênio e ativação da via da proteína ERK1/2, além da inibição da morte celular pela diminuição da expressão da caspase 3. Concluímos que os canabinoides escolhidos foram capazes de proteger as células dopaminérgicas do dano oxidativo e inflamatório através do aumento da sobrevida celular por diminuição da produção de ROS. / The CB1 receptor activation leads to modulation of intracellular processes that change the cellular response according to the stimulus, as well as being involved in mechanisms of proliferation, differentiation, cell movement and death. The present study evaluated the participation of this system in oxidative and inflammatory processes related to neurodegeneration in vitro. We have used the Neuro2A neuroblastoma lineage, which those were differentiated into dopaminergic cells, and exposed to 6OHDA, H2O2 and LPS. They were co-treated with ACEA, CB1 receptor agonist, and AM251, the CB1 receptor antagonist/inverse agonist, for 24 hours. We used functional parameters of cell viability, production of reactive oxygen species and protein analyses by western blot. Treatment with ACEA or ACEA/AM251 produced an increase in cell viability; reduced production of reactive oxygen species and activation of the ERK1/2 protein, in addition to inhibition of cell death by decreasing the expression of caspase 3 in all three models proposed. We concluded that chosen cannabinoids were able to protect dopaminergic cells from oxidative damage and inflammation through the increased cell survival by decreasing the production of ROS.

A neurodegeneração é o resultado da destruição progressiva e irreversível dos neurônios no sistema nervoso central, apresentando causas desconhecidas e mecanismos patológicos não totalmente elucidados. Fatores como a idade, o aumento da formação de radicais livres e/ou estresse oxidativo, defeito no metabolismo energético, a inflamação e acúmulo de elementos neurotóxicos e de proteínas malformadas no lúmen do retículo endoplasmático (RE) contribuem para o desenvolvimento dos processos neurodegenerativos. O sistema canabinoide tem sido proposto como neuroprotetor em diversos modelos de neurodegeneração como hipóxia aguda e epilepsia, isquemia cerebral, lesão cerebral e modelos de estresse oxidativo. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar o papel do sistema canabinoide em uma linhagem de neuroblastoma (Neuro 2a) submetida a condições de estresse oxidativo (H2O2), inflamação (LPS) e estresse do RE (tunicamicina), avaliando parâmetros de viabilidade celular e vias de sinalização envolvidas. Nossos resultados mostram que o agonista canabinoide ACEA foi capaz de proteger as células da morte celular causada pela inflamação e pelo estresse de retículo endoplasmático, mas não pelo estresse oxidativo. Esse efeito neuroprotetor exercido pelo ACEA parece pelo menos em parte ocorrer via receptor CB1 no modelo de inflamação e ser independente deste receptor no modelo de estresse de RE. Os efeitos neuroprotetores observados envolveram a modulação dos níveis de proteínas pré-apoptóticas, CHOP e Caspase 12, e da proteína relacionada à sobrevivência celular ERK 1/2. Nossos dados sugerem um papel neuroprotetor do sistema canabinoide em mecanismos relacionados aos processos neurodegenerativos e propõem a manipulação desse sistema como possível alvo terapêutico. / Neurodegeneration is the result of progressive and irreversible destruction of neurons in the central nervous system, with unknown causes and pathological mechanisms not fully elucidated. Factors such as age, increased formation of free radicals and/or oxidative stress, defects in energetic metabolism, inflammation and accumulation of neurotoxic factors and misfolded proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) contribute to the development of neurodegenerative processes. The cannabinoid system has been proposed as neuroprotector in several models of neurodegeneration such as acute hypoxia and epilepsy, cerebral ischaemia, brain injury and oxidative stress models. This work aimed to investigate the role of the cannabinoid system in a neuroblastoma line (Neuro 2a) submitted to oxidative stress (H2O2), inflammation (LPS) and ER stress (tunicamycin) conditions, assessing cell viability parameters and signaling pathways involved. Our results show that the ACEA cannabinoid agonist was able to protect cells from cell death caused by inflammation and ER stress, but not from oxidative stress. This neuroprotective effect exerted by ACEA appears to occur at least in part via the CB1 receptor in inflammation model and it seems to be independent of this receptor in the ER stress model. The neuroprotective effects observed involved the modulation of the levels of pre-apoptotic proteins CHOP and Caspase 12 and the cell survival related protein ERK 1/2. Our data suggest a neuroprotective role of the cannabinoid system in mechanisms related to neurodegenerative processes and propose it as possible therapeutic target.

A lesão medular é uma injúria do sistema nervoso central que resulta em grande déficit funcional. É uma condição relacionada ao desenvolvimento industrial e tecnológico e acomete principalmente adultos jovens em idade produtiva. Apesar de algumas tentativas terapêuticas estarem sob investigação, ainda não há tratamento eficaz que garanta recuperação funcional. A maioria das estratégias utilizadas visa estimular eventos de neuroplasticidade. A cúrcuma é um composto dietético que tem potencial terapêutico por interferir em processos inflamatórios, oxidativos e imunológicos. O presente estudo investigou possíveis efeitos terapêuticos da cúrcuma após hemissecção medular em ratos. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Escola de Artes, Ciências e Humanidades. Os animais foram submetidos à hemissecção medular após a medula espinhal ser exposta por laminectomia. Os animais foram divididos em 2 grupos experimentais: i) lesionado com cúrcuma (LC); ii) lesionado sem tratamento (LS). Os testes comportamentais BBB Score, Combined Behavior Score, plano inclinado e Beam Walking foram realizados 24h, 72h e 7 dias depois da lesão para avaliar o reaprendizado medular e a recuperação funcional. Os resultados demonstraram melhora do comportamento sensitivo-motor dos animais, provavelmente envolvendo neuroproteção das vias de tato, dor e pressão. As propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes da cúrcuma podem ter levado à melhora funcional. Análises celulares e moleculares são necessárias para entendermos melhor os efeitos no epicentro da lesão depois do tratamento com a cúrcuma. Um dos possíveis efeitos prováveis é sobre a conversão de alguns ácidos graxos envolvidos na inflamação, como o ácido araquidônico, diminuindo sua ação e gerando ganhos funcionais. O uso da cúrcuma na fase aguda da hemissecção medular interferiu positivamente na recuperação sensitivo-motora deflagrando, portanto, eventos de neuroproteção e neuroplasticidade / The spinal cord injury is a condition that results in severe functional deficit. It is related to the industrial and technological development and affects mainly young adults. Despite some therapeutic trials are under investigation, there is no treatment that guarantees functional recovery. Most of those strategies for recovery involve neuroplasticity. Curcumin is a dietetic compound with known therapeutic potential, interfering on inflammatory, oxidative and immunological processes. The present study investigated the effects of the treatment with curcumin on acute phase of spinal cord hemi-section in rats. The protocol has been approved by Ethics Committee of School of Arts, Sciences and Humanities. The animals were submitted to hemi-section after laminectomy and were divided in two groups: i) injured with curcumin (LC); ii) injured without treatment (LS). The following behavioral tests were performed 24h, 72h and 7 days after lesion: BBB Score, Combined Behavior Score, inclined plane and Beam Walking test aiming to evaluate medular relearning and functional recovery. The tests indicated an improvement of the sensitive-motor behavior probably by neuroprotection of tactile, pain and pressure pathways. The anti antiinflammatory and antioxidant properties of curcumin could result in functional improvement. Cellular and molecular analysis are necessary to better understand the effects could be over the conversion of some fatty acids involved on inflammation, such as arachidonic acid, reducing its action and promoting functional gain. The use of curcumin in the acute phase of spinal cord hemi-section seems to interfere positively in sensorial-motor recovery triggering neuroprotection and plasticity

A doença de Alzheimer (AD) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pelo declínio progressivo da função cognitiva. Esta é a maior causa de demência, sendo que a grande maioria dos casos da AD é do tipo esporádica (SAD), a qual tem como principal fator de risco o envelhecimento. A injeção intracerebroventricular de estreptozotocina (icv-STZ) tem sido utilizada como modelo experimental da SAD em roedores e representa uma promissora ferramenta para análises etiopatogênicas e avaliação de novas propostas terapêuticas para a AD. O modelo icv-STZ mostra muitos aspectos das anormalidades da SAD, produzindo decréscimo no metabolismo cerebral de glicose e energia, prejuízo cognitivo, estresse oxidativo, astrogliose, perda neuronal e angiopatia amiloide. A geleia real (GR), substância produzida pelas abelhas operárias da espécie Apis mellifera, vem sendo popularmente utilizada há mais de 30 anos em áreas relacionadas à alimentação saudável e medicina natural. Pesquisas apontam que a GR possui uma série de atividades farmacológicas, incluindo ação neuroprotetora, antioxidante, anti-inflamatória e melhora da função cognitiva. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento oral prolongado com geleia real em ratos Wistar submetidos ao modelo icv-STZ sobre o aprendizado e memória, e na neuroproteção, esta avaliada pela neurogênese, neurodegeneração e estresse oxidativo. A injeção icv-STZ utilizada neste trabalho induziu efeitos deletérios no hipocampo de ratos, sendo estes representados por déficit cognitivo avaliado no labirinto aquático de Morris, e desenvolveu acentuada neurodegeneração, além da redução da neurogênese e aumento do estresse oxidativo. Por outro lado, a administração oral prolongada da GR foi capaz de induzir efeitos benéficos em animais lesionados pela injeção icv-STZ, ampliando o tempo de retenção da memória espacial operacional dos animais, reduzindo a neurodegeneração, aumentando a proliferação de novos neurônios e reduzindo o nível de estresse oxidativo na região do giro denteado do hipocampo. Assim, a Geleia Real mostrou efeitos benéficos em funções cognitivas e uma ação neuroprotetora no modelo experimental de AD esporádica / Alzheimer\'s disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by progressive decline in cognitive function. This is the major cause of dementia and the sporadic AD (SAD) represents the majority of cases which aging is the main risk factor. Intracerebroventricular injection of Streptozotocin (icv-STZ) has been used as an experimental model of SAD in rodents and represents a promising tool for etiopathogenic analysis and evaluation of new therapeutic proposals for AD. The icv-STZ model shows many aspects of SAD abnormalities, resulting in decreased brain glucose and energy metabolism, cognitive impairment, oxidative stress, astrogliosis, neuronal loss, and amyloid angiopathy. Royal jelly (RJ), a substance produced by worker honeybees of the Apis mellifera species, has been popularly used for more than 30 years in areas related to healthy eating and natural medicine. Researches indicate that RJ has a series of pharmacological activities, including neuroprotective, antioxidant, anti-inflammatory action and improvement of cognitive function. The objective of this study was to investigate the effects of long-term oral treatment with royal jelly in Wistar rats submitted to the icv-STZ on working memory version of the Morris\' water maze task and neuroprotection, evaluated by neurogenesis, neurodegeneration and oxidative stress. In this work, the icv-STZ injection induced deleterious effects in the hippocampus, which were represented by cognitive impairments, and developed marked neurodegeneration, besides the reduction of neurogenesis and increased oxidative stress. On the other hand, RJ long-term oral administration was able to induce beneficial effects in animals lesioned by icv-STZ injection, increasing the retention time on working spatial memory, reducing neurodegeneration and oxidative stress level and increasing the proliferation of new neurons in the hippocampus. Thus, Royal Jelly showed beneficial effects on cognitive functions and a neuroprotective action in the STZ experimental model of sporadic AD

Introdução: A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a forma mais frequente de epilepsia em adultos. Um modelo experimental de ELT consiste na indução de status epilepticus (SE) em animais por administração de Pilocarpina. Este modelo induz mudanças patofisiológicas e comportamentais em ratos muito semelhantes às observadas em seres humanos com ELT. Apesar da literatura apresentar dados relacionados às respostas celulares, pouco se conhece a respeito do envolvimento de cascatas de sinalização com insultos epileptogênicos no sistema nervoso. A enzima fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K) está envolvida na ativação da cascata de sinalização intracelular da Akt. A Akt é uma proteína cinase especifíca de serina/treonina cuja forma ativa proporciona um controle no crescimento e proliferação celular, bem como induz um sinal de sobrevivência para a proteção de células contra a apoptose. Alguns estudos mostram que a ativação da PI3K é inibida por potentes drogas, tais como a LY294002 e a Wortmanina. A PI3K ativa a Akt e a cascata de sinais extra e intracelulares neuroprotetores pós-insultos. O estudo da ação de inibidores da PI3K em modelos de epilepsia pode fornecer dados sobre o envolvimento da Akt em sinais neuroprotetores. Objetivos: Avaliar o efeito do SE por injeção intra-hipocampal de Pilocarpina na ativação da Akt, bem como os efeitos do bloqueio desta cascata sobre as alterações patológicas observadas no hipocampo de ratos na fase aguda pós-SE. Metodologia: Ratos da cepa Wistar machos (250-300 g) foram divididos em grupos de tratamento, sendo tratados com injeções ipsilaterais na região posterior do hipocampo, com uma hora de intervalo entre drogas, das drogas: Salina e Pilocarpina (grupo Sal+Pilo), LY294002 e Pilocarpina (LY+Pilo) e Wortmanina e Pilocarpina (Wort+Pilo). No grupo considerado como controle foram injetadas as seguintes drogas: Salina e Salina (grupo Sal+Sal) ou Dimetilsulfóxido e Salina (grupo DMSO+Sal). O tempo de SE induzido por Pilocarpina foi fixado em 2 horas. Grupos de animais foram sacrificados nos instantes de 1 dia e 7 dias após o SE e seus encéfalos foram processados objetivando a imuno-histoquímica para NeuN, GFAP e Akt (pan). Resultados: A densidade neuronial na região do hilo do hipocampo foi menor no grupo Sal+Pilo, seguido dos grupos LY+Pilo e Wort+Pilo, avaliando-se os vários níveis de formação hipocampal e região posterior. Para a análise da astrogliose, na camada granular, o grupo LY+Pilo apresentou maior número de astrócitos positivos; na região do hilo hipocampal, os grupos LY+Pilo e Wort+Pilo apresentaram baixa expressão para a proteína Akt, comparados aos grupos Controles; assim como o grupo Wort+Pilo, em CA2, apresentou baixa expressão da proteína Akt somente na região posterior. Os animais Sal+Pilo sobrevida-7dias pós-SE revelaram maior expressão da Akt quando comparados com o grupo Sal+Pilo sobrevida-1dia pós-SE. Quanto à análise comportamental, o grupo Wort+Pilo apresentou maior latência para o início do SE que o grupo Sal+Pilo, não sendo observado diferença de severidade, uma vez atingido o SE. Conclusões: Na hipótese de trabalho, o uso de inibidores da fosforilação de Akt resultaria em maior morte neuronial, astrogliose e expressão inalterada da Akt. Ao contrário do esperado, os grupos que receberam injeções intra-hipocampais de inibidores de Akt, antes da indução de SE, exibiram menor perda neuronial, menor astrogliose e menor expressão da Akt para os vários níveis de formação hipocampal e no hipocampo posterior. Porém, o grupo Sal+Pilo sobrevida-7 dias pós-SE exibiu maior expressão para Akt quando comparado com o grupo Sal+Pilo de sobrevida-1 dia pós-SE. Além disso, o pré-tratamento com Wortmanina demonstrou um maior tempo de latência para o início do SE, o que nos sugere uma maior neuroproteção do que LY294002. / Introduction: Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of adult human epilepsy. An experimental model of TLE, the Pilocarpine induced epilepsy, followed by pathofisiologic and behavioural alterations in rats resembling human diagnosis with TLE. Although there are several data on cell response in literature, few information exist on the cascade of signals involved in epileptogenesis process of central nervous system. The phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) is involved in activation of Akt intracellular signaling cascade. The serine/threonine kinase Akt, that in active form promote a control of growth and cell proliferation, such as survival sign protecting cells from apoptosis. Some studies have shown that activation of PI3K is blocked by potents pharmacological inhibitors, for example the LY294002 and Wortmannin. PI3K activate Akt and both extra and intracellular cascade signals involved in neuroprotection after seizures. The study of inhibitors mechanism in model of epilepsy can provide information on the involvement of Akt in signals of neuroprotection. Objectives: To evaluate the effects of SE by the intrahippocampal injection of Pilocarpine in Akt activation, and the effects of the blockade of this cascade on pathologic alterations observed in hippocampus of rats in acute phase after SE as well. Methods: Male Wistar rats (weighing 250 to 300 g) were divided in groups treated ipsilaterally with injections in the posterior region of hippocampus with an elapsed time of one hour subsequently after each injection of following substances: Physiological Saline and Pilocarpine (group Sal+Pilo), LY294002 and Pilocarpine (LY+Pilo), and Wortmannin and Pilocarpine (Wort+Pilo). Control groups were treated with the following drugs Saline + Saline (group Sal+Sal) or Dimethylsulphoxide + Saline (DMSO+Sal). A fixed time of 2 hours was considered for evaluating the SE induced by Pilocarpine. Animals were sacrificed 1 day and 7 days after SE, and their brains were processed imunohistochemically for NeuN, GFAP and Akt (pan) detecting. Results: The neuronal density in the hippocampal hilus was lower in the Sal+Pilo group, followed by LY+Pilo and Wort+Pilo groups, this evaluate various levels of hippocampal formation and posterior region. For the analysis of reactive astrogliosis of the granular cell layer, the LY+Pilo group presented a great number of GFAP-positive astrocytes. In the hilar region, the LY+Pilo and Wort+Pilo groups presented a reduced Akt expression compared to the Control group, such as the group Wort+Pilo in CA2, presented a reduced Akt expression only in posterior region. The Sal+Pilo animals with a survival time of 7 days after SE revealed higher Akt expression when compared to the Sal+Pilo animals with a survival time of 1 day. In behavioural analysis, the Wort+Pilo group presented major time of latency to SE than Sal+Pilo group, without differences in the disease severity, once reached the SE. Conclusions: On the contrary to the original hypothesis of this work, the use of inhibitors of Akt phosphorylating resulted in an unaltered neuronal death, astrogliosis and Akt expression. The groups that received intrahippocampal injection of Akt inhibitors before inducing SE exhibited a reduced neuronal loss, astrogliosis and Akt expression to the various levels of hippocampal formation and posterior region. But, to the Sal+Pilo group with a survival time of 7 days after SE induction exhibited greater Akt expression than Sal+Pilo group with a survival time of 1 day after SE induction. However, the pretreatment with Wortmannin displayed major time of latency to SE induction, suggesting this substance as a better neuroprotector than LY294002, according to the methodology applied in this study.

Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T23:13:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Blanco_YaraCarollo_D.pdf: 7163711 bytes, checksum: 880b23b56e210670cf37c82408110b1b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Malária é a principal doença parasitária do mundo, infectando 300-500 milhões de pessoas e levando ao óbito cerca de 1 milhão de indivíduos anualmente. As infecções maláricas geralmente não apresentam complicações, no entanto, infecções por Plasmodium falciparum podem se desenvolver em formas graves da doença, como a malaria cerebral. A malaria cerebral e considerada uma síndrome multifatorial, envolvendo a citoadesão de eritrócitos infectados por P. falciparum (EIPf) através de diferentes receptores como CD36, ICAM-1, VCAM, P-selectina e E-selectina, sendo o ICAM-1 apontado como o principal receptor. Varias evidências sugerem ainda que o desbalanço da resposta imune do hospedeiro, a ativação endotelial e alterações na cascata de coagulação desempenham papel importante na patogênese da MC. Além disso, outros fatores como a presença de heme livre e NOS também tem sido apontados como essenciais para o desenvolvimento da MC... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Malaria still is a major parasitic disease in the world, infecting 300-500 million people and leading to death about 1 million people annually. Usually malaria infections do not lead to complications, however some infections, mainly, by Plasmodium falciparum can evolve into severe forms of disease such as cerebral malaria (CM). CM is considered a multifactorial syndrome involving cytoadhesion of P. falciparum-infected erythrocytes (PfEI) to different host receptors such as CD36, VCAM, P-selectin and E-selectin and ICAM-1 , which is considered the main receptor involved in MC. A large body of evidences suggests that the imbalance of the host immune response, endothelial activation and changes in the coagulation cascade play an important role in the pathogenesis of CM. Moreover, of free heme, and NOS has also been identified as essential for the development of CM...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Parasitologia / Doutor em Parasitologia

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perez_Matheus_M.pdf: 2859331 bytes, checksum: 541101c0093208622bf70dc9b70cf007 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O sistema nervoso é muito sensível à lesões e sua capacidade regenerativa é limitada. Assim, na maioria dos casos, o reparo tecidual não ocorre ou ocorre de forma incompleta, causando danos irreversíveis. Embora o sistema nervoso do neonato apresente maior capacidade regenerativa do que o adulto, a regeneração também é um processo complexo e limitado. Para melhor compreensão dos mecanismos e limitações da regeneração do SNC, tanto na fase neonatal como na fase adulta, diversos modelos de lesão têm sido propostos por vários autores, inclusive transecção de nervo periférico. Através desses estudos experimentais, diferentes modalidades terapêuticas foram sugeridas, com intuito de evitar as alterações que levam à morte neuronal, seja na fase neonatal ou adulta. Para isso, muitas substâncias, com propriedades neuroprotetoras, têm sido testadas no processo de regeneração, plasticidade sináptica e para evitar a morte neuronal após lesão do sistema nervoso. Dentre a grande variedade de substâncias com potencial neuroprotetor, estão alguns derivados da planta Cannabis sativa. Um deles, o canabidiol (CBD), é o principal componente não-psicotrópico produzido nas glândulas encontradas na superfície das folhas da planta. O presente trabalho teve como objetivo investigar o potencial neuroprotetor do canabidiol e, para isso, foram utilizados ratos neonatos da linhagem Wistar, divididos nos seguintes grupos experimentais: grupo submetido à axotomia do nervo isquiático e tratamento com o canabidiol (grupo CBD), grupo submetido à axotomia e tratamento veículo (grupo PB) e grupo controle, com axotomia sem tratamento (grupo sem tratamento). Assim, cortes histológicos utilizando coloração de Nissl mostraram que os grupos tratados com canabidiol (15 e 30mg/kg) mostraram maior sobrevivência (21%; p<0.0001) de motoneurônios medulares, quando comparados aos grupos que não foram tratados com canabidiol ou tratados com canabidiol (5mg/kg). A análise imunohitoquímica, empregando o anticorpo anti-sinaptofisina revelou, no grupo tratado com canabidiol, preservação de imunoreatividade, refletindo preservação de circuitos sinápticos medulares. Tal manutenção de terminais foi 30% superior nos grupos tratados com canabidiol, comparativamente aos grupos controle (p=0,0003). A imunoistoquímica para os anticorpos anti-GFAP (astrócito) e anti-IBA 1(migroglia) revelou uma menor imunomarcação para o grupo tratado com canabidiol, quando comparado aos grupos não tratados. Tal fato demonstra que o canabidiol reduz astrogliose (anti-GFAP) em 30% (p=0,0149) e reação microglial em 27% (p=0,0086). A análise para detecção de células apoptóticas, através reação de TUNEL (teminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick end labeling), mostrou que o tratamento com canabidiol foi neuroprotetor, quando comparado ao grupo axotomia sem tratamento (p=0,0063). Em conjunto, os presentes resultados mostram que o canabidiol apresenta promissora propriedade neuroprotetora, devendo ser melhor investigado, com vistas ao seu emprego clínico futuro / Abstract: The CNS is very sensitive to injury and their regenerative capacity is limited, so in most cases the tissue repair does not occur or occurs incompletely, leading to irreversible damage. Although the nervous system of neonatal rats presents a greater regenerative capacity than adults, the regenerative process is still complex and limited. To better understand the mechanisms and limitations of CNS regeneration, both in the neonatal and adulthood, various injury models have been proposed by several authors, including peripheral nerve transaction. Through these experimental studies several therapeutic modalities have been proposed, in order to prevent the neuronal death caused by injuries and pathological processes. For this reason, many substances with neuroprotective properties have been tested in the regeneration process, synaptic plasticity and to prevent neuronal death after nervous system injury. Among the wide variety of substances with potential neuroprotective action, some are derived from the Cannabis sativa. One, cannabidiol (CBD) is the major non-psychotropic component produced by the glands found on the surface of plant leaves. The present study aimed to investigate the neuroprotective potential of CBD. We used Wistar neonatal rats that were divided into the following experimental groups: sciatic nerve axotomy and CBD treatment (CBD group), axotomy and veículo treatment (PB group) and a control group, without treatment (no-treatment group). Thus, Nissl stainning in spinal cord cross sections showed that the CBD groups (15 e 30mg/kg) had a higher neuronal survival (21%, p <0,0001) when compared to the CBD 5mg/kg group, PLB and no treatment groups. Immunohistochemical analysis, done by ipsi/contralateral ratio of integrated density of pixels quantification, of anti-synaptophysin labeling showed that CBD groups had a greater immunostaining pattern when compared to the other experimental groups (30%, p<0,0003) reflecting a higher preservation of synapses after CBD treatment. Imunolabeling Anti-GFAP and anti-Iba 1 revealed a lower immunostaining in CBD group, showing that CBD treatment decreases the astrocytosis process in 30% (p = 0,0149) and reduce reactive microgliosis in 27% (p=0,0086), when compared to the others experimental groups. Aimed to detect apoptotic cells, we used TUNEL reaction. Quantitative analysis showed that the CBD treatment reduced the apoptotic nuclei detectable, when compared to other experimental groups. These results show that CBD presents promising neuroprotective property and should be better investigated aiming its future clinical use / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Inúmeras estratégias neuroprotetoras vêm sendo desenvolvidas para o tratamento da encefalopatia neonatal causada pela hipóxia-isquemia (HI). O enriquecimento ambiental (EA) é uma ferramenta que propicia interação social, estimulação visual, sensorial e atividade física de forma espontânea e assim induz mudanças comportamentais e neurofisiológicas. O objetivo desta tese foi investigar os efeitos do EA em relação à estrutura e expressão de proteínas constituintes da barreira hematoencefálica (BHE) e parâmetros bioquímicos de citocinas neuroinflamatórias no hipocampo em fases subsequentes do desenvolvimento. Ainda, o escopo comportamental desta tese foi analisar o efeito do EA precoce sobre a ansiedade demonstrada por ratos adultos submetidos à HI. Para tanto, ratos Wistar machos e fêmeas, no 7º dia pós-natal (DPN), foram submetidos ao modelo de Levine-Rice de HI neonatal. Os animais foram divididos em quatro grupos: CTAP (controle ambiente padrão), CTAE (controle ambiente enriquecido), HIAP (hipóxia-isquemia ambiente padrão) e HIAE (hipóxia-isquemia ambiente enriquecido). Os animais dos grupos EA permaneceram no enriquecimento ambiental mantido desde o 8º DPN. Após o desmame os animais foram divididos em grupos e estimulados no EA (1 h/dia por 5 semanas). Análises da expressão de proteínas estruturantes da BHE no hipocampo (β-catenina, ocludina, conexina-43, aquaporina-4, transportador de glicose 1 - Glut-1 e proteína fibrilar glial ácida - GFAP) foram quantificadas através de Western Blotting (WB) Observamos a permeabilidade e integridade da BHE através da coloração com azul de Evans e também foi realizada imuno-histoquímica para GFAP na região 1 do corno de Ammon - CA1 do hipocampo no 22º e 60º DPN. Realizamos análises da expressão das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral alfa - TNF-α e interleucina 1 beta - IL-1β, juntamente com análise imuno-histoquímica para marcação de microglia ativada na fase adulta de animais HI submetidos ao EA. Ademais, foram avaliados os efeitos da HI e do EA sobre a ansiedade no primeiro dia de exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE) e no teste claro/escuro (TCE). Os nossos dados mostraram que o EA foi efetivo para reverter as alterações causadas pela HI aumentando a expressão de ocludina no 22º DPN e de β- catenina e GFAP no 60º DPN e diminuindo o extravasamento de azul de Evans. No 8º DPN não há alteração na BHE, sendo sugestivo de imaturidade da BHE. A avaliação imuno-histoquímica de IbA-1 demonstra ativação microglial após HI e o perfil bioquímico apresenta grande expressão das citocinas IL-1β e TNF-α em animais hipóxico-isquêmicos estimulados em EA. Através dos níveis de ansiedade encontrados, podemos estabelecer que o EA favorece uma ação menos impulsiva reduzindo o comportamento de risco dos animais após a HI. Assim, nossos resultados contribuíram para a compreensão do mecanismo da HI, visto que apresentamos de forma singular que o EA é eficaz na recuperação da disfunção da BHE maximizando os efeitos neuroprotetores de IL-1β e TNF-α sobre aspectos comportamentais relacionados à ansiedade. / Several neuroprotective strategies have been developed for the treatment of the neonatal encephalopathy caused by hypoxic ischemia (HI).The environmental enrichment (EE) is a strategy that propitiates social interaction, visual and sensorial stimulation, and physical activity spontaneously and, thus, it causes behavioral and neurophysiological changes. The aim of this thesis was to investigate the effects of EE on the structure and expression of proteins in the blood-brain barrier (BBB) and biochemical parameters of neuroinflammatory cytokines in the hippocampus in subsequent developmental stages. Moreover, the behavioral scope of this thesis was to analyze the effect of early EE on anxiety expressed by adult rats. Male and female Wistar rats, PND 7, were submitted to the Levine-Rice model of neonatal HI. The animals were divided into four groups: CSE (control - standard environment), CEE (control - enriched environment), HISE (hypoxic ischemia - standard environment) and HIEE (hypoxic ischemia - enriched environment). The animals of the EE groups were kept in the environmental enrichment since PND 8. After weaning, the animals were divided into groups and exposed to the EE (1h a day for 5 weeks). Expression analyses of the BBB structural proteins in the hippocampus (β-catenin, occludin, connexin-43, aquaporin-4, Glut-1, and GFAP) were quantified by Western Blotting (WB) We observed the BBB permeability and integrity through Evans blue staining as well as immunohistochemistry for GFAP in the CA1 hippocampus region on PND 22, and 60. We performed analyzes of the expression of the inflammatory cytokines TNF-α and IL-1β, together with immunohistochemical analysis for quantification of IbA-1 in the adult phase of HI animals submitted to EE.Furthermore, the effects of the HI and the EE on anxiety on the first day of exposition to the elevated plus maze test (EPM) and the light-dark box test (LDB) were assessed. Our data have shown that the HI reduces occludin expression on PND 22 and β-catenin and GFAP on PND 60along with the extravasation of Evans blue, indicating BBB dysfunction in these periods and reversion of the alterations by the EE. On PND 8, there is no BBB change, which is suggestive of BBB immaturity. The immunohistochemicalassessment of IbA-1 demonstrates microglial activation after HI and the biochemical profile shows great expression of IL-1β and TNF-α cytokines in hypoxic-ischemic animals stimulated in EE. Through the levels of anxiety found, we can establish that the EE favors a less impulsive behavior and reduces the anxiogenic factor of animals after HI. Thus, our results have contributed to the understanding of the HI mechanism; we presented in a unique way the recovery of the BBB dysfunction and the maximization of the neuroprotective effects of IL-1β and TNF-α on behavioral aspects related to anxiety of animals exposed to the EE after HI.

O Transtorno Bipolar é uma doença crônica e grave que apresenta curso episódico e alto impacto sobre a funcionalidade do paciente. Possui potencial para alto grau de severidade, recorrência e intensidade e estima-se que sua prevalência ao longo da vida seja de 2,4% da população mundial. A fisiopatologia deste transtorno ainda não é bem compreendida e ainda o fármaco de primeira escolha é o lítio, embora tampouco seja claro seu mecanismo de ação. O sistema purinérgico principalmente devido a suas ações sobre neuroproteção, inflamação e ativação microglial se destaca como uma via promissora de novos alvos terapêuticos, especialmente o receptor purinérgico P2X7 (P2X7R). Dessa maneira, o objetivo desta tese é caracterizar o envolvimento do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar. De maneira geral, avaliamos metabólitos do sistema purinérgico em soro de pacientes e controles, correlacionando com dados clínicos. Avaliamos a frequência do polimorfismo do P2RX7 1513A>C em pacientes e controles. Realizamos um modelo animal farmacológico de mania e investigamos o envolvimento do P2X7R neste modelo e por último buscamos melhor compreender a ação neuroprotetora do lítio verificando a participação purinérgica. Nossos resultados primeiramente nos mostraram uma diminuição nos níveis de adenosina em pacientes em comparação a controles e uma importante correlação inversa entre os níveis de adenosina e a piora dos sintomas. Demonstramos ainda que pacientes com transtorno bipolar apresentam diminuição na frequência do alelo 1513C e o potencial aumento na frequência do genótipo 1513AA e 1513AA/AC em relação aos controles configurando um pior prognóstico de aumento da forma mais ativa do receptor. Também mostramos que o P2X7R possui um papel importante no estabelecimento do modelo de mania, modulando principalmente a via dopaminérgica que é refletida na mudança comportamental observada pelo modelo e por último, o lítio foi capaz de prevenir a resposta de insulto nas células neuronais (linhagem PC-12) e não foi capaz de prevenir a ativação mediada pelo P2X7R em células microgliais (linhagem N9), indicando uma resposta celular diferenciada. Podemos concluir que de maneira translacional conseguimos demonstrar a participação do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar, sugerindo ainda um possível biomarcador tanto para diagnóstico como para progressão da doença, os níveis séricos de adenosina, e ainda um potencial biomarcador genético de predição e diagnóstico da doença, o polimorfismo do P2X7R 1513A>C, assim como contribuímos para o entendimento do mecanismo de ação do lítio e definimos um potencial novo alvo terapêutico para o transtorno, o receptor P2X7. / Bipolar Disorder is a severe and chronic psychiatric disorder that presents an episodic course and high impact on the patient's functionality. It has potential for a high degree of severity, recurrence and intensity. The prevalence throughout life of bipolar disorder is 2.4% of the world population. The pathophysiology of this disorder is still not well understood and the drug of first choice is lithium, although its mechanism of action is not clear. The purinergic system mainly due to its actions on neuroprotection, inflammation and microglial activation stands out as a promising pathway for new therapeutic targets, especially the purinergic receptor P2X7 (P2X7R). Thus, the purpose of this thesis is to characterize the involvement of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. In general, we evaluated purinergic system metabolites in serum from bipolar disorder patients and healthy controls, correlating with clinical data. We evaluated the frequency of P2RX7 1513A>C polymorphism in bipolar disorder patients and in healthy subjects. We performed a pharmacological animal model of mania and investigated the involvement of the P2X7 purinergic receptor in this model and finally we sought to better understand the neuroprotective action of lithium by verifying the purinergic participation. Our results primarily showed a decrease in adenosine levels in patients compared to controls and a significant inverse correlation between adenosine levels and worsening of symptoms. We also demonstrated that patients with bipolar disorder present a decrease in the frequency of the 1513C allele and the potential increase in the frequency of genotype 1513AA and 1513AA/AC in relation to controls, setting a worse prognosis of the most active form of the receptor. We also showed that P2X7R plays an important role in the establishment of the mania model, modulating mainly the dopaminergic pathway that is reflected in the behavioral change observed by the model. Finally, lithium was able to prevent the insult response in neuronal cells (PC-12 lineage) and was not capable of preventing P2X7R-mediated activation in microglial cells (N9 lineage), indicating a differentiated cellular response. We can conclude that in a translational way we could demonstrate the participation of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. We also suggested a possible biomarker for both diagnosis and progression of the disorder, the serum adenosine levels, and a potential genetic marker for prediction and diagnosis, the polymorphism of P2X7R 1513A>C. Lastly we contributed to the understanding of lithium action mechanism and defined a potential new therapeutic target for the disorder, the P2X7 receptor.

Durante o envelhecimento há um declínio acentuado na capacidade antioxidante celular principalmente no tecido cerebral, o que leva a um desbalanço na homeostase redox gerando danos oxidativos. O extrato de Paullinia cupana Mart possui efeitos metabólicos e propriedades farmacológicas bem descritas. Neste trabalho nós investigamos o efeito do extrato comercial de guaraná (ECG) na função cognitiva, parâmetros bioquímicos e modulação da senescência em ratos Wistar de meia-idade. Os animais foram divididos em três grupos de acordo com o tratamento (solução salina: 0,9%, ECG: 21 mg/kg/dia e cafeína: 0,83 mg/kg/dia). As soluções foram administradas diariamente por gavagem. Os testes comportamentais foram realizadas antes e após o tratamento. As análises bioquímicas foram realizadas no Sistema Nervoso Central bem como no rim, fígado e coração. Nossos dados em Campo Aberto demonstraram aumento na atividade exploratória e diminuição no comportamento de ansiedade nos animais que receberam cafeína, esse comportamento não foi observado no grupo ECG. As análises do hipocampo e estriado indicam que a ECG e/ou a cafeína alteraram parâmetros analisados de modo tecido específico. O tratamento crônico com guaraná elevou a atividade enzimática da Glutationa S-transferase assim como os carbonilação de proteínas no tecido cardíaco. O tratamento com Paullinia cupana alterou parâmetros hematológicos e reduziu os níveis de gordura gonadal nos animais tratados. Em contraste a administração de cafeína isolada foi capaz de aumentar o imunoconteúdo de Sirt1 em ambos os tecidos, renal e cardíaco. Nossos dados sugerem que ECG não melhora o desenvolvimento cognitivo, mas modifica a maquinaria de estresse oxidativo e vias de sinalização neurodegenerativa, inibindo moléculas relacionadas a vias de sobrevivência no hipocampo e estriado. Isto pode contribuir para o desenvolvimento de microambientes desfavoráveis no cérebro e distúrbios neurodegenerativos. Além disso, os resultados demonstram que os principais efeitos benéficos remetem a cafeína, além de demonstrar que ao contrário da crença popular, a administração crônica do guaraná não gerou melhora nos parâmetros avaliados referentes a cognição e senescência em ratos de meia idade. / During aging there is a marked decline in cellular antioxidant capacity mainly in brain tissue, which leads to an imbalance in redox homeostasis generating oxidative damage. The extract of Paullinia cupana Mart has well-described metabolic effects and pharmacological properties. In this work we investigated the effect of commercial guarana extract (CGE) on cognitive function, biochemical parameters and modulation of senescence in middle-aged Wistar rats. The animals were divided into three groups according to the treatment (saline, CGE or caffeine). The solutions were administered daily by oral gavage. Behavioral tests were performed before and after treatment. Biochemical analyzes were performed in the Central Nervous System as well as in the kidney, liver and heart. Our data in Open Field showed an increase in the exploratory activity and decrease in the behavior of anxiety in the animals that received caffeine, this behavior was not observed in the CGE group. Hippocampus and striatum analyzes indicate that CGE and/or caffeine altered parameters analyzed in a tissue-specific fashion. Chronic treatment with guarana increased the enzymatic activity of Glutathione S-transferase as well as carbonylation of proteins in cardiac tissue. Treatment with Paullinia cupana altered haematological parameters and reduced levels of gonadal fat in treated animals. In contrast, administration of caffeine alone was able to increase the immunocontent of Sirt1 in both renal and cardiac tissues. Our data suggest that CGE does not improve cognitive development but modifies the machinery of oxidative stress and neurodegenerative signaling pathways by inhibiting molecules related to survival pathways in the hippocampus and striatum. This may contribute to the development of unfavorable microenvironments in the brain and neurodegenerative disorders. In addition, the results demonstrate that the main beneficial effects refer to caffeine, in addition to demonstrating that contrary to popular belief, chronic administration of guarana did not improve the parameters evaluated for cognition and senescence in middle-aged rats.