Estudamos nos camundongos geneticamente selecionados para alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda os efeitos tóxicos do DMBA na medula óssea e sua repercussão na resposta imunológica após 24 horas. O tratamento diminuiu a produção de IgG anti-HGG e a migração celular para o tecido subcutâneo após injeção sc com Biogel nos AIRmin, como também causou hipocelularidade, principalmente de neutrófilos maduros. Contudo, houve um aumento de blastos e neutrófilos imaturos. A análise do ciclo celular em células Lin- revelou bloqueio da fase S nos AIRmin tratados com DMBA. A cinética de dano no DNA mostrou que o reparo no DNA é mais rápido em AIRmax. Os níveis de expressão do gene parp-1 triplicou em AIRmax, enquanto que nos AIRmin aumentou p53 e caspase-3. Os AIRmin tratados com DMBA apresentam perda da capacidade proliferativa e de diferenciação quando estimuladas in vitro com fatores hematopoéticos. O DMBA causou mielotoxicidade nos AIRmin, podendo afetar o desenvolvimento da resposta imune, enquanto AIRmax foram resistentes a esses efeitos. / We investigated in mice genetically selected for high (AIRmax) or low (AIRmin) acute inflammatory response the toxic effects of DMBA treatment on the BM and its impact on the immune response. DMBA treatment diminished specific IgG anti-HGG production and the cellular migration to the inflammatory site after sc injection of biogel in AIRmin, and hypocellularity in BM, mostly in the neutrophil. However we observed an increase of immature cells. Cell cycle analysis of Lin cells showed a decrease of cells in S stage from DMBA-treated AIRmin mice. The kinetics of cell repair demonstrated the early removal of DNA lesion from DMBA-treated AIRmax mice. The parp-1 gene showed 3 fold increased mRNA expression in AIRmax cells, however in AIRmin mice there was an increase in p53 and caspase-3 mRNA mRNA expression. Myeloid cells from DMBA treated AIRmin mice showed low differentiation and proliferation capacities after in vitro hematopoietic factors. DMBA treatment produced myelotoxicity in AIRmin mice, affecting immune response development, but AIRmax mice were resistant.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T19:38:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_CamilaBononide_D.pdf: 2554249 bytes, checksum: c6b3764fee73b2d53da308d36c53522b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Anemia falciforme (AF) é um distúrbio na síntese de hemoglobina causada por uma mutação pontual que leva a produção de uma hemoglobina anormal, HbS. Em locais com baixa concentração de O2, a HbS se polimeriza resultando em uma série de alterações que podem culminar em processos vaso-oclusivos, a principal causa de dor e mortalidade entre os pacientes falciformes. A AF é uma doença inflamatória crônica caracterizada por níveis de citocinas alterados, além de um elevado número de leucócitos e lesões nas células endoteliais. Os leucócitos apresentam um papel importante na AF uma vez que, seu recrutamento pode levar a um bloqueio do fluxo sanguíneo da microvasculatura, já que são células grandes, pouco deformáveis e que aderem facilmente ao endotélio ativado, além de interagirem com eritrócitos circulantes. As estratégias terapêuticas utilizadas e desenvolvidas para o tratamento da doença baseiam-se em 3 pontos principais: 1) diminuir a concentração intracelular de HbS como, por exemplo, aumento da HbF; 2) reduzir processos inflamatórios e o estresse oxidativo; 3) inibir a adesão celular e consequentemente, reduzir a vaso-oclusão (VO). A Hidroxiuréia (HU) é um agente quimioterápico que vem sendo utilizada com sucesso no tratamento da AF. Essa droga é capaz de elevar a HbF e também de reduzir o número de células brancas. Entretanto, além dos efeitos adversos provocados por ela, nem todos os pacientes respondem à terapia. Assim, faz-se necessária uma melhor compreensão da fisiopatologia da AF, incluindo o papel dos leucócitos e os mecanismos envolvidos no processo de VO, para o desenvolvimento de terapias alternativas. Neste estudo, tivemos como objetivos principais 1) verificar a ação de fatores presentes no soro de pacientes com AF quanto à modulação do número de neutrófilos e à geração de estresse oxidativo; 2) melhor compreensão do papel dos neutrófilos na iniciação e propagação de processos inflamatórios e consequentemente a participação dessas células no processo de VO. Dados indicaram que fatores presentes no soro de pacientes com AF são capazes de alterar a apoptose de neutrófilos e também iniciar a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), possivelmente pela ativação da enzima NADPH presente nestas células. Adicionalmente, resultados obtidos com um modelo de camundongo transgênico falciforme indicaram que a ativação da via dependente de GMPc pode ser uma abordagem interessante para a inibição da adesão de neutrófilos à parede vascular sob condições inflamatórias. Além disso, os dados mostram que o uso de drogas que amplificam os efeitos da HU poderiam ser úteis na prevenção da VO / Abstract: Sickle Cell Disease (SCD) is a disorder of hemoglobin synthesis, caused by a point mutation, and resulting in the production of abnormal sickle hemoglobin, HbS. The consequence of low oxygen levels is HbS polymerization, which is responsible for the vaso-occlusive phenomenon that is the hallmark of the disease. SCD is a chronic inflammatory disease characterized by alterations in cytokine levels and an increase in leukocytes number and endothelial cell injury. Leukocytes play an important role in SCD since their recruitment to the microvasculature, consequent adhesion to the vessel wall, and interactions with other cells may interrupt the blood flow and culminate in vaso-occlusion. Therapeutic strategies for SCD treatment are based on three points: 1) reduction of intracellular HbS concentration, for example, by increasing the erythrocytic HbF concentration; 2) reduction of inflammatory processes and oxidative stress; 3) inhibition of cellular adhesion and, as a consequence, a reduction in vaso-occlusion. HU is a chemotherapeutic drug used for SCD treatment. This drug is able to increase HbF concentrations and reduce white blood cells counts, although it has some adverse effects and some patients do not respond to this therapy. Thus, it is necessary to fully understand the mechanisms that contribute to the vaso-occlusive process, including the role of the leukocytes in this phenomenon. The goals of this study are: 1) To check the influence of factors present in SCD serum on mechanisms that may affect the neutrophil count and oxidative stress generation; 2) understand the role of neutrophils in the initiation and propagation of vascular inflammation and vaso-occlusion. Date indicate that factors present in the SCD serum are able to alter neutrophil apoptosis and induce reactive oxygen species (ROS) generation, possibly by the activation of the NADPH enzyme expressed in these cells. Additionally, results obtained from a SCD inflammatory mouse model indicate that an activation of the cGMP - dependent pathway can inhibit neutrophil adhesion to the vascular endothelium cells after inflammatory induction and that drugs that amplify the effects of HU may represent a potential new therapy for SCD treatment / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silveira_AngelicaAparecidaAntoniellis_M.pdf: 1268408 bytes, checksum: 22c750391706cfa07cb1fd66d9e8a9c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Durante a resposta inflamatória, os neutrófilos e outros leucócitos aderem ao endotélio, deixando os vasos sanguíneos e movimentando-se ativamente em direção ao foco inflamatório. A migração dos neutrófilos para sítios inflamatórios depende de uma série de eventos adesivos e quimiotáticos, resultantes da ativação de moléculas de adesão como as selectinas e integrinas e receptores de quimiocinas. Devido às suas propriedades, os neutrófilos podem ser ativados por proteínas de sinalização intracelular, as Rho GTPases, que auxiliam os neutrófilos a desempenhar esta função por interferirem em mudanças no citoesqueleto. Estas proteínas também estão envolvidas na adesão e proliferação celular. Os neutrófilos são capazes de sintetizar óxido nítrico (NO), sendo que esta produção de NO é um importante componente da resposta imune inata durante a inflamação. Estudos demonstraram que os neutrófilos têm papel indutor na geração de inflamação e esforços visando compreender o mecanismo adesivo destas células nos processos inflamatórios podem ser um ponto chave para intervenções farmacológicas em doenças que são caracterizadas por inflamação vascular com consequente obstrução de fluxo sanguíneo. Diante disso, este estudo objetivou avaliar o papel da via do NO e das Rho GTPases no mecanismo pelo qual os estímulos inflamatórios aumentam a adesão de neutrófilos. Também foi avaliado os efeitos da sinvastatina na modulação das propriedades adesivas de neutrófilos, como ferramenta para auxiliar no estudo do envolvimento das Rho GTPases, Rac1 e RhoA, no processo adesivo destas células. Este mecanismo foi estudado a partir de neutrófilos isolados do sangue periférico por ensaios de adesão estática e em fluxo e citometria de fluxo. Além disso, foi analisada a expressão gênica das Rho GTPases, Rac1 e RhoA, através de PCR em tempo real. Sob potente estímulo de TNF-?, as propriedades adesivas dos neutrófilos aumentam significativamente. Inibidores de NO sintase e doadores de NO não alteraram as propriedades adesivas de neutrófilos quando estimulados com TNF-?. Não observamos grande diferença quanto à adesão e expressão das moléculas de adesão na superfície dos neutrófilos usando inibidor de Rac1, porém o composto Y-27632, inibidor de ROCK (Rho-associated coiled coil forming protein serine/threonine kinase), proteína efetora de RhoA, mostrou aumentar a adesão dos neutrófilos sob condições basais. O uso da sinvastatina modulou as propriedades adesivas e a expressão de Mac-1 nos neutrófilos na presença de um estímulo inflamatório, apoiando evidências de seu uso como anti-inflamatório. Em destaque foi observado que o Y-27632 reverteu o efeito da sinvastatina sob estímulo de TNF-? e que o mevalonato e os isoprenóides intermediários da via do colesterol, GGPP e FPP, não foram capazes de reverter o efeito da sinvastatina. Dados indicam que a via de sinalização dependente em NO-GMPc aparentemente não modula as propriedades adesivas dos neutrófilos sob condições inflamatórias. Por outro lado, resultados indicam que as Rho GTPases parecem estar envolvidas na regulação das propriedades adesivas dos neutrófilos sob condições inflamatórias. O envolvimento de ROCK na adesão celular ainda não está completamente compreendido, mas de acordo com nossos resultados podemos sugerir a hipótese de que esta enzima efetora tenha um papel na inducão de adesão dos neutrófilos na presença de um estímulo inflamatório. A sinvastatina foi capaz de inibir as propriedades adesivas de neutrófilos quando ativados indicando mais uma utilidade desta classe de drogas no tratamento de doenças inflamatórias. O papel das Rho GTPases nas propriedades adesivas dos neutrófilos sob condições inflamatórios ainda precisa ser melhor elucidado / Abstract: During the inflammatory response, neutrophils and other leukocytes adhere to the endothelium leaving the blood vessels and actively moving towards the inflammatory focus. The migration of neutrophils to inflammatory sites depends on a variety of chemotactic and adhesive events resulting from the activation of adhesion molecules such as selectins and integrins and chemokine receptors. Due to its properties, neutrophils may be activated by small intracellular signaling proteins, the Rho GTPases, which help neutrophils to fulfill this function by interfering in cytoskeletal changes. These proteins are also involved in cell adhesion and proliferation. The neutrophils are able to synthesize nitric oxide (NO), and this production of NO is an important component of innate immunity during inflammation. Studies have shown that neutrophils play a role in inducing inflammation and generation of efforts to understand the adhesive mechanism exerted by neutrophils in inflammatory processes may be a key point for pharmacological interventions for diseases that are characterized by vascular inflammation with consequent obstruction of blood flow. Thus, this study aimed to evaluate the role of the NO pathway and the Rho GTPases in the mechanism by which inflammatory stimuli increases neutrophil adhesion. We also assessed the effects of simvastatin on neutrophil adhesive properties as a tool to aid in studying the involvement of Rho GTPases, RhoA and Rac1 in these mechansims. Neutrophils were isolated from peripheral blood and aspects of adhesion studied by static and flow adhesion assays as well as flow cytometry. In addition, we analyzed the gene expression of Rho GTPases, Rac1 and RhoA by real time - PCR. Following a strong stimulation with TNF-?, the adhesive properties of neutrophils increase significantly. NO synthase inhibitors and NO donors did not modify the adhesive properties of neutrophils when stimulated with TNF-?. We did not observe any significant differences in the adhesion of neutrophils and the expression of adhesion molecules on their surface in the presence of a Rac1 inhibitor. However, an inhibitor of ROCK (Rho-associated coiled coil forming protein serine/threonine kinase, an efector protin for the RhoA), Y-27632, was shown to increase the adhesion of neutrophils under basal conditions. The use of simvastatin decreased adhesive properties and modulated the expression of Mac-1 of neutrophils in the presence of an inflammatory stimulus, supporting the use of this class of drugs as anti-inflammatory agents. Importantly, the attenuating effects of simvastatin on TNF-? stimulated neutrophil adhesion were reversed by Y-27632, whereas the cholesterol pathway intermediates, mevalonate, and the isoprenoids, GGPP FPP, were unable to reverse the effects of this drug. Data indicate that the NO-cGMP signaling pathway does not appear to modulate the adhesive properties of neutrophils under inflammatory conditions. Moreover, results suggest that Rho GTPases may be involved in the regulat ion of the adhesive properties of neutrophils. The involvement of ROCK in cellular adhesion is not yet fully understood but, according to our findings, it may be hypothesized that this protein effector has a role in the induction of neutrophil adhesion. Simvastatin was able to inhibit the adhesive properties of neutrophils when activated, indicating another use of this class of drugs for the treatment of inflammatory diseases. The role of Rho GTPases in the adhesive properties of neutrophils under inflammatory conditions should be further elucidated / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

A icterícia por hiperbilirrubinemia indireta afeta mais de 60% dos recém-nascidos a termo. O tratamento, quando necessário, é realizado através da fototerapia. Não existem estudos na literatura avaliando os efeitos da fototerapia na função dos neutrófilos de recém-nascidos. O melhor entendimento da função dos neutrófilos nos recém-nascidos antes e após a fototerapia seria importante para avaliar as possíveis repercussões na expressão dos neutrófilos desencadeadas pelo tratamento fototerápico. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a função dos neutrófilos, através da mensuração pela citometria de fluxo da expressão dos principais marcadores de superfície em recémnascidos ictéricos, antes e após 24 horas de fototerapia. Metodologia: Foram incluídos recém-nascidos com idade gestacional ≥ 35 semanas e peso de nascimento ≥ 2000g, que possuiam critérios da Academia Americana de Pediatria para tratamento fototerápico. Os critérios de exclusão foram: mal-formações congênitas, síndromes com alterações cromossômicas, erro inato do metabolismo, infecções do grupo STORCH, asfixia neonatal, sepse ou suspeita de sepse, exsanguineotransfusão, transfusão de hemocomponentes e uso de imunoglobulina. Foi realizada a avaliação de expressão da intensidade média de fluorescência (IMF) de CD10, CD11b, CD11c, CD15, CD16, CD18, CD62L, CD64 e CD66, antes do início e após 24 horas do início da fototerapia. Foram utilizados o teste T de Student para análise dos dados. Resultados: Foram incluídos 25 recém-nascidos no estudo, com idade mediana de 53 (27.5-75.5) horas de vida e bilirrubina média de 13.6±2.85 mg/dL. Não houve diferença estatística na expressão de CD11b, CD15, CD18, CD62L, CD64 e percentual de neutrófilos antes e após 24 horas de fototerapia. Ocorreu aumento da expressão de CD10 8 (p=0.038) e CD16 (p=0.017) e redução da expressão de CD11c (p=0.023) e CD66acde (p=0.004) após 24 horas de fototerapia. Conclusão: Os recém-nascidos submetidos ao tratamento fototerápico apresentaram aumento da expressão de CD10 e de CD16 e diminuição da expressão de CD11c e de CD66acde após 24 horas de exposição, que pode estar relacionado a um efeito antiinflamatório da fototerapia nos recém-nascidos expostos a este tratamento. / Jaundice due to indirect hyperbilirubinemia affects more than 60% of term neonates. The treatment when necessary is carried out using phototherapy. There are no studies in the literature evaluating the effect of phototherapy on the function of neonates' neutrophils. A better understanding of the function of neutrophils in neonates before and after phototherapy would be important in order to assess potential effects on the expression of neutrofils triggered by the phototherapy treatment. The aim of this study was to assess and compare the function of neutrophils by measuring the expression of the main surface markers in icteric neonates, using flow cytometry, before and after 24 hours of phototherapy. Methodology: Neonates at a gestational age ≥ 35 weeks and at a birth weight ≥ 2000g who met the criteria of the American Academy of Pediatrics for phototherapy were included. The exclusion criteria were: congenital malformations, syndromes with chromosomal alterations, inborn errors of metabolism, infections of the STORCH group, neonatal asphyxia, sepsis or suspicion of sepsis, exchange transfusion, transfusion of blood components, and use of immunoglobulin. The evaluation of the MFI expression of CD10, CD11b, CD11c, CD15, CD16, CD18, CD62L, CD64 and CD66 was performed before and 24 hours after the initiation of phototherapy. The chi-square and Student T tests were used for data analysis. Results: Twenty-five neonates were included in the study at the mean age of 53 (27.5- 75.5) hours of life and with a mean bilirubin level of 13.6±2.85 mg/dL. There was no statistical difference in the expression of CD11b, CD15, CD18, CD62L, CD64 and percentage of neutrophils before and after 24 hours of phototherapy. There was an increase in the expression of CD10 (p=0.038) and CD16 (p=0.017) and a reduction in 10 the expression of CD11c (p=0.023) and CD66acde (p=0.004) after 24 hours of phototherapy. Conclusion: The newborns submitted to phototherapy had increased expression of CD10 and CD16 and decreased expression of CD11c and CD66acde after 24 hours of exposure, which may be related to an anti-inflammatory effect of phototherapy on the neonates exposed to this treatment.

O Brasil possui condições climáticas adequadas para o desenvolvimento de um grande número de frutas nativas e essa biodiversidade tem se tornado um caminho promissor para a descoberta de novos compostos bioativos capazes de ser utilizados na formulação de alimentos funcionais e medicamentos. Os compostos fenólicos apresentam ações específicas, podendo atuar como antioxidantes e anti-inflamatórios, assim prevenindo doenças crônicas. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antioxidante, antiinflamatório e a composição fenólica de dez frutas nativas brasileiras ainda pouco conhecidas: araçá-boi (Eugenia stipitata), cambuití-cipó (Sagerectia elegans), murici vermelho (Bysonima arthropoda), murici guassú (Byrsonima lancifolia), morango silvestre (Rubus rosaefolius), cambuci (Campomanesia phaea), jaracatiá-mamão (Jacaratia spinosa), juquirioba (Solanum alterno-pinatum), fruta-do-sabiá (Acnistus arborescens) e cajá (Spondias mombin L.). Os extratos etanólicos (80% v/v) das polpas foram analisados inicialmente quanto à capacidade de sequestro dos radicais ABTS&#8729+ e ROO&#8729. A atividade anti-inflamatória foi avaliada in vivo por meio do modelo de migração de neutrófilos induzida por carragenina, enquanto que a composição fenólica foi realizada por técnicas cromatográficas (CLAE-DAD e CG-EM). As 5 frutas com as maiores atividades biológicas foram ainda analisadas quanto à capacidade de sequestro de O2 &#8729-, HOCl e NO&#8729, atividade anti-inflamatória por meio do ensaio de ativação do fator nuclear-&kappa;B (NF-&kappa;B) e composição fenólica por espectrometria de massas de alta resolução (LC-ESI-QTOF-MS). Em relação ao sequestro do radical ABTS&#8729+ o cambuití-cipó apresentou a maior atividade (749,88 &mu;mol TE.g-1) e para o ROO&#8729 o murici vermelho apresentou a maior atividade antioxidante (559,09 &mu;mol TE.g-1). Os animais tratados com araçá-boi, cambuití-cipó, murici vermelho, cajá e morango silvestre apresentaram reduções no influxo de neutrófilos comparados ao grupo carragenina (p < 0,05). Por meio das técnicas de CLAE-DAD e CG-EM foi possível identificar compostos fenólicos pertencentes a classe dos flavonoides (catequina, epicatequina, rutina, quercetina glicosilada, kaempeferol glicosilado, quercetina, procianidina B1 e procianidina B2), sub-classe do ácido hidroxibenzóico (ácido gálico) e sub-classe dos ácidos hidrocinâmicos (ácido cumárico, ácido ferúlico e caféico). O araçá-boi, cambuití-cipó, murici vermelho, morango silvestre e cajá foram as cinco frutas que apresentaram as maiores atividades antioxidantes e/ou anti-inflamatórias, cujo perfil fenólico por LC-ESI-QTOF-MS indicou a presença de 18 compostos no araçá-boi, 32 no cambuitícipó, 26 no murici vermelho e 20 e 11 compostos no morango silvestre e cajá, respectivamente. Vários dos compostos fenólicos identificados foram encontrados pela primeira vez nessas espécies. O cambuiti-cipó e murici vermelho se destacaram em relação ao sequestro de HOCl (EC50 4,99 e 4,41 &mu;g mL-1, respectivamente) e o cambuití-cipó foi o mais ativo para desativar o radical O2 &#8729- (EC50 68,33 &mu;g mL-1) e NO&#8729 (EC50 0,78 &mu;g mL-1). Já os extratos de murici-vermelho, cambuití-cipó e morango silvestre inibiram significativamente a ativação do NF-&kappa;B. Portanto, as frutas nativas brasileiras são fontes de substâncias antioxidantes e anti-inflamatórias, bem como de uma grande diversidade de compostos fenólicos, os quais podem propiciar importantes benefícios para a saúde humana. / Brazil has favorable climatic conditions for the development of a large number of native fruits and this biodiversity has become a promising path towards the discovery of new bioactive compounds capable of being used in the formulation of functional foods and medicines. Phenolic compounds show specific action mechanisms, being able to act as antioxidants and anti-inflammatories, thus preventing chronic diseases. However, few Brazilian native fruits are well known and consumed by the population, undermining the investigation of chemical composition as well as the identification/quantification of bioactive compounds. In light of this, the objective of this work was to evaluate the antioxidant and anti-inflammatory potentials as well as the phenolic composition of ten underexploited Brazilian native fruits, namely: araçá-boi (Eugenia stipitata), cambuití-cipó (Sagerectia elegans), murici vermelho (Bysonima arthropoda), murici guassu (Byrsonima lancifolia), morango silvestre (Rubus rosaefolius), cambuci (Campomanesia phaea), jaracatiá-mamão (Jacaratia spinosa), juquirioba (Solanum alterno-pinatum), fruto-do-sabiá (Acnistus arborescens) and cajá (Spondias mombin L.). Pulps ethanolic extracts (80%, v/v) were initially analyzed regarding scavenging capacity of the ABTS&#8729+ and ROO&#8729 radicals. Antiinflammatory activity was evaluated in vivo using the carrageenan-induced neutrophil migration model, while phenolic composition was determined by chromatographic techniques (HPLC-PAD and GC-MS). The five fruits with the highest biological activities were analyzed for O2&#8729-, HOCl and NO&#8729 radicals scavenging capacities, for in vitro anti-inflammatory activity by nuclear factor-&kappa;B (NF-&kappa;B) activation, and for phenolic composition by High Resolution Mass Spectrometry (LC-ESI-QTOF-MS). In relation to ABTS&#8729+ radical scavenging cambuiticipó showed the highest activity (749.88 &mu;mol TE.g-1), while for ROO&#8729 scavenging, murici vermelho had the highest antioxidant activity (559.09 &mu;mol TE.g-1). The animals treated with araçá-boi, cambuití-cipó, murici vermelho, cajá and morango silvestre reported decreases in neutrophils influx compared to carrageenan group (p <0.05). It was possible to identify by HPLC-DAD and GC-MS techniques phenolic compounds belonging to the class of flavonoids (catechin, epicatechin, rutin, glycosylated quercetin, glycosylated kaempeferol, quercetin, procyanidin B1 and procyanidin B2), subclass of hydroxybenzoic acid (gallic acid) and subclass of hydrocinnamic acids (coumaric, ferulic and caffeic acids). Araçá-boi, cambuitícipó, murici vermelho, morango silvestre and cajá were the five fruits with the highest antioxidant and / or anti-inflammatory activities. The phenolic profile analysis by LC-ESIQTOF- MS pointed the presence of 18 compounds in araçá-boi, 32 in cambuití-cipó, 26 in murici vermelho, 20 in morango silvestre and 11 in cajá. Several of the identified phenolic compounds were found for the first time in these fruit species. Cambuiti-cipó and murici vermelho stood out in relation to HOCl scavenging (EC50 4.99 and 4.41 &mu;g.mL-1, respectively) and cambuití-cipó was the most active to deactivate both O2 &#8729- radical (EC50 68.33 &mu;g.mL-1) as NO&#8729 (EC 500.78 &mu;g.mL-1). Murici vermelho, cambuití-cipó and morango silvestre extracts significantly inhibited the activation of NF- &kappa;B.Therefore, Brazilian native fruits are sources of antioxidant and anti-inflammatory substances, as well as a great diversity of phenolic compounds, which can provide important benefits for human health.

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso utilizada por adultos jovens. Diversos relatos têm mostrado existência de correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e o aparecimento de doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Desta forma, buscamos neste trabalho os mecanismos neuroimunes pelos quais o MDMA diminui a atividade de neutrófilos e altera a distribuição de leucócitos nos diferentes compartimentos imunes. Além disso, avaliamos se os efeitos induzidos pelo MDMA afetam a resposta a uma infecção experimental induzida por Listeria monocytogenes. Nossos resultados mostram que 60 minutos após a administração de MDMA na dose 10mg/kg, houve 1) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos induzido por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade da fagocitose dos neutrófilos sanguíneos; 2) diminuição da celularidade total da medula óssea e aumento da mesma no baço, além de diminuição do peso relativo do baço; 3) aumento na porcentagem de neutrófilos e diminuição na porcentagem de linfócitos sanguíneos; e 4) diminuição da expressão de NFB de neutrófilos sanguíneos. O tratamento com metirapona ou RU-486 prévio ao tratamento com MDMA foi capaz de inibir 5) os efeitos observados em todos os parâmetros avaliados na diminuição da atividade de neutrófilos; 6) as alterações das porcentagens de neutrófilos e linfócitos sanguíneos e 7) a diminuição da expressão de NFB. Observamos, ainda, que o tratamento com 6-OHDA ou ICI-118,551 prévio ao tratamento com MDMA 8) não foram capazes de inibir os efeitos induzidos pelo MDMA na atividade de neutrófilos e na contagem diferencial de leucócitos sanguíneos; no entanto, 9) preveniram as alterações de celularidade induzidas por MDMA na medula óssea e no baço, e 10) a diminuição do peso relativo do baço. Por fim, observamos em um modelo de infecção experimental por LM que o MDMA 11) induziu mielosupressão (diminuição do CFU na medula óssea e aumento no baço); 12) diminuiu o número de leucócitos sanguíneos e a celularidade da medula óssea; 13) aumentou a celularidade do baço; 14) diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) e quimiocina (MCP-1) nas primeiras 24 h; e 15) aumentou a produção das mesmas citocinas e quimiocina após 72 h da indução da infecção. Desta forma, concluímos que os efeitos induzidos pelo MDMA sobre a atividade de neutrófilos foram provavelmente mediados pela diminuição da expressão de NFB induzido pela ação da corticosterona e que a corticosterona, também está envolvida com as alterações na contagem diferencial de neutrófilos e linfócitos. As catecolaminas periféricas responderam pelas alterações na distribuição de leucócitos entre baço e medula óssea, e diminuição do peso relativo do baço. Além disso, o MDMA pode ser considerado uma droga imunossupressora visto que diminuiu a resistência a uma infecção por LM por mecanismos neuroimunes / Ecstasy is the popular name of 3,4-metylendioxymetamphetamine (MDMA), a drug of abuse mainly used by young adults. Several reports have shown the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and increased susceptibility to infectious diseases. Some studies using animal models report that MDMA induces alterations in both innate and adaptive immunity, however little is known about the mechanisms that generate such alterations. Therefore, we sought for neuroimmune mechanisms that could be involved in the previously reported decreasing on neutrophil activity and alteration in the leukocyte distribution. Moreover, we analyzed the host resistance to Listeria monocytogenes after MDMA treatment. We show that MDMA (10 mg/kg), 60 min after administration: 1) decreases SAPI and PMA-induced oxidative burst and percentage/intensity of phagocytosis of circulating neutrophils; 2) decreases bone marrow cellularity while increases it in the spleen, and also decreases spleen relative weight; 3) increases neutrophil percentage while decreases lymphocyte percentage in the blood; and 4) decreases NFB expression on circulating neutrophils. Metyrapone or RU-486 prior to MDMA treatment abrogates 5) the MDMA effects previously reported on neutrophil activity; 6) alterations in the percentage of circulating neutrophils and lymphocytes, and 7) decreasing of NFB expression. We also show that 6-OHDA or ICI-118,551 prior to MDMA treatment were not able to 8) abrogated the MDMA effects previously reported on neutrophil activity and blood leukocyte differential counts; nevertheless, 9) they abrogated the previously reported alterations on bone marrow and spleen cellularity, and 10) reduction on spleen relative weight. Finally, in a model of host resistance to Listeria monocytogenes we show that MDMA: 11) induces myelosuppression by decreasing CFU on bone marrow while increasing it on spleen; 12) decreases circulating leukocytes and bone marrow cellularity; 13) increases spleen cellularity; 14) decreases pro-inflammatory cytokines production (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) and chemokine (MCP-1) after 24h of the infection; and 15) increases the production of the pro-inflammatory cytokines and chemokines previously reported after 72h of the infection. Thus, we conclude that the MDMA effects on neutrophil activity were mediated by the reduction of NFB expression, and this effect was induced by corticosterone elevation in the serum. Corticosterone is also involved in the alterations on neutrophil and lymphocyte counts. Catecholamines were shown to be involved in the alterations on leukocyte distribution in the bone marrow and spleen, and in the reduction of relative weight of spleen. Additionally, MDMA reduced the host resistance to Listeria monocytogenes. Therefore, MDMA can be considered an immunosuppressive drug and those effects are mediated by neuroimmune mechanisms

A Artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica e sistêmica, de etiologia desconhecida, que pode dificultar ou impossibilitar as funções habituais das articulações devido à destruição da cartilagem, edema e dor. A patogênese da AR envolve uma complexa inter-relação de fatores imunológicos, ambientais e genéticos, dificultando assim a descoberta de terapias eficientes. Na AR, o influxo de neutrófilos para a cavidade sinovial é predominante e contínuo de tal forma que, os neutrófilos são as células mais abundantes no sítio inflamatório. Uma vez ativados, os neutrófilos são capazes de produzir espécies reativas de oxigênio que, juntamente com enzimas proteolíticas, podem estar envolvidos na lesão articular observada nos pacientes com AR. A ativação dos neutrófilos pode ser mediada por receptores para IgG (Fc?R) e para o complemento (CR) presentes nas membranas dessas células, através da interação com complexos imunes (ICs). Esses receptores são também importantes moduladores das reações inflamatórias mediadas por ICs. Entretanto, a função do sistema complemento e dos Fc?R, bem como a importância de cada um na manifestação da AR ainda não está clara. Assim, neste estudo avaliou-se o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados através de receptores Fc?R e Fc?R/CR em ambos os grupos de pacientes com AR, ativa e inativa, e em controles saudáveis. Esta função celular foi avaliada por quimioluminescência (QL) dependente de luminol e de lucigenina. Os resultados mostraram que não houve diferenças na produção de QL, tanto dependente de luminol quanto de lucigenina, quando mediada por Fc?R ou pela cooperação Fc?R/CR, em ambos os grupos de pacientes com AR comparados entre si e comparados com neutrófilos de indivíduos saudáveis. No entanto, a comparação do padrão da resposta de QL dentro de ambos os grupos de pacientes com AR, mostrou que a resposta celular aos IC opsonizados por soro humano de pacientes com AR (IC-IgG/SHAR) não foi significativamente significantemente maior em relação à observada para os IC não opsonizados, refletindo uma ausência da cooperação Fc?R/CR nestas células. Vale ressaltar que a atividade hemolítica do complemento sérico, tanto da via clássica/lectina quanto da alternativa, não foi diferente entre os grupos estudados. Quanto à expressão dos CR, somente no grupo de pacientes com AR ativa observou-se diferenças, sendo que CR1 estava aumentado em relação ao grupo controle (p<0,05) e CR3 aumentado quando comparado ao grupo de pacientes com AR inativa (p<0,05). A expressão dos Fc?R, CD32 e CD16, não foi diferente entre os grupos estudados. Ainda, as análises de correlação da expressão dos diferentes receptores de membrana mostraram: (i) correlação positiva CD16 vs CR1 somente nos grupos com AR, ativa e inativa; (ii) correlação positiva CD16 vs CR3 no grupo com AR ativa; (iii) ausência de correlação entre a expressão de CD32 e o número de neutrófilos CD32+ no grupo com AR ativa; e (iv) correlação positiva entre a expressão de CR3 e o número de neutrófilos CR3+ no grupo com AR ativa. O conjunto de resultados sugere que estas diferenças ocorrem apenas durante a atividade da doença, reforçando a hipótese que estas alterações sejam uma característica adquirida da doença. Desta forma, este estudo pode contribuir para esclarecer mecanismos envolvidos na patogênese da AR, que possam ser alvos em potencial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos específicos para esta doença. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic and systemic inflammatory disease of unknown etiology that can impair the usual joint functions, due to cartilage damage, edema and pain. The RA pathogenesis involves multiple interacting immunological, environmental and genetic factors, making it difficult to find effective therapies. Neutrophils are the most abundant cells at AR inflammatory sites, since they migrate continuously to the synovial cavity. The activated neutrophils generate reactive oxygen species and release a variety of proteases that seem to be involved in the joint lesions of RA patients. Neutrophil activation can be mediated by membrane receptors for IgG (Fc?R) and for complement (CR) through interaction with immune complexes (IC). These receptors are also very important modulators of IC-mediated inflammatory reactions. However, the role of the complement system and Fc?R and the hierarchy of them in the manifestation of RA are still unclear. In this study, we evaluated the neutrophil oxidative burst induced by Fc?R and Fc?R/CR, from RA patients at active and inactive disease stages, and from healthy controls. This cellular function was assessed by luminol- and lucigenin-enhanced chemiluminescence (CL) systems. When neutrophils were stimulated via Fc?R or Fc?R/CR cooperation, we found that the cellular responses of active and inactive RA patients were not significantly different when compared to each other and to the healthy controls, by using both CL systems. However, the comparison between the active and inactive RA groups revealed that the CL responses triggered by IC opsonized with RA serum were not significantly higher than those observed for neutrophils stimulated only via Fc?R (IC-IgG), reflecting an absence of Fc?R/CR cooperation in these cells. In addition, the hemolytic activities of serum complement, classical/lectin and alternative pathways, were not different among the groups studied. With regard to the CR expression, only neutrophils from the active RA group showed an increased number of CR1 and CR3 on their surfaces when compared with the control (p<0.05) and the inactive RA groups (p<0.05), respectively. The Fc?R expressions, CD32 and CD16, were not different among the groups studied. In addition, correlation analysis of the expression among the different receptors showed: (i) a positive correlation CD16 vs CR1 in both RA groups, active and inactive; (ii) a positive correlation CD16 vs CR3 in the active RA group; (iii) an absence of correlation between the CD32/neutrophil expression and the number of this cell bearing CD32 in the active RA groups; and (iv) a positive correlation between the CR3/neutrophil expression and the number of this cell bearing CR3 in the active RA group. These results suggest that such differences could be occurring just during the activity of the RA, supporting once again an acquired characteristic of the disease. This study can contribute for the understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of the RA, which might become potential targets for the development of specific therapeutic agents for this disease.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-&#945;, IL-12 e IFN-&#947;, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-&#947; e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-&#945;, IL-12 and IFN-&#947; release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-&#947;-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.