Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

Ecstasy é o nome popular do 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), uma droga de abuso utilizada por adultos jovens. Diversos relatos têm mostrado existência de correlações positivas entre o abuso do Ecstasy e o aparecimento de doenças infecciosas. Muitos estudos em modelos animais mostram que o MDMA induz alterações de imunidade inata e adquirida; entretanto pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais estes efeitos ocorrem. Desta forma, buscamos neste trabalho os mecanismos neuroimunes pelos quais o MDMA diminui a atividade de neutrófilos e altera a distribuição de leucócitos nos diferentes compartimentos imunes. Além disso, avaliamos se os efeitos induzidos pelo MDMA afetam a resposta a uma infecção experimental induzida por Listeria monocytogenes. Nossos resultados mostram que 60 minutos após a administração de MDMA na dose 10mg/kg, houve 1) diminuição do burst oxidativo de neutrófilos induzido por SAPI e PMA e, também, da porcentagem e da intensidade da fagocitose dos neutrófilos sanguíneos; 2) diminuição da celularidade total da medula óssea e aumento da mesma no baço, além de diminuição do peso relativo do baço; 3) aumento na porcentagem de neutrófilos e diminuição na porcentagem de linfócitos sanguíneos; e 4) diminuição da expressão de NFB de neutrófilos sanguíneos. O tratamento com metirapona ou RU-486 prévio ao tratamento com MDMA foi capaz de inibir 5) os efeitos observados em todos os parâmetros avaliados na diminuição da atividade de neutrófilos; 6) as alterações das porcentagens de neutrófilos e linfócitos sanguíneos e 7) a diminuição da expressão de NFB. Observamos, ainda, que o tratamento com 6-OHDA ou ICI-118,551 prévio ao tratamento com MDMA 8) não foram capazes de inibir os efeitos induzidos pelo MDMA na atividade de neutrófilos e na contagem diferencial de leucócitos sanguíneos; no entanto, 9) preveniram as alterações de celularidade induzidas por MDMA na medula óssea e no baço, e 10) a diminuição do peso relativo do baço. Por fim, observamos em um modelo de infecção experimental por LM que o MDMA 11) induziu mielosupressão (diminuição do CFU na medula óssea e aumento no baço); 12) diminuiu o número de leucócitos sanguíneos e a celularidade da medula óssea; 13) aumentou a celularidade do baço; 14) diminuiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) e quimiocina (MCP-1) nas primeiras 24 h; e 15) aumentou a produção das mesmas citocinas e quimiocina após 72 h da indução da infecção. Desta forma, concluímos que os efeitos induzidos pelo MDMA sobre a atividade de neutrófilos foram provavelmente mediados pela diminuição da expressão de NFB induzido pela ação da corticosterona e que a corticosterona, também está envolvida com as alterações na contagem diferencial de neutrófilos e linfócitos. As catecolaminas periféricas responderam pelas alterações na distribuição de leucócitos entre baço e medula óssea, e diminuição do peso relativo do baço. Além disso, o MDMA pode ser considerado uma droga imunossupressora visto que diminuiu a resistência a uma infecção por LM por mecanismos neuroimunes / Ecstasy is the popular name of 3,4-metylendioxymetamphetamine (MDMA), a drug of abuse mainly used by young adults. Several reports have shown the existence of a positive correlation between Ecstasy abuse and increased susceptibility to infectious diseases. Some studies using animal models report that MDMA induces alterations in both innate and adaptive immunity, however little is known about the mechanisms that generate such alterations. Therefore, we sought for neuroimmune mechanisms that could be involved in the previously reported decreasing on neutrophil activity and alteration in the leukocyte distribution. Moreover, we analyzed the host resistance to Listeria monocytogenes after MDMA treatment. We show that MDMA (10 mg/kg), 60 min after administration: 1) decreases SAPI and PMA-induced oxidative burst and percentage/intensity of phagocytosis of circulating neutrophils; 2) decreases bone marrow cellularity while increases it in the spleen, and also decreases spleen relative weight; 3) increases neutrophil percentage while decreases lymphocyte percentage in the blood; and 4) decreases NFB expression on circulating neutrophils. Metyrapone or RU-486 prior to MDMA treatment abrogates 5) the MDMA effects previously reported on neutrophil activity; 6) alterations in the percentage of circulating neutrophils and lymphocytes, and 7) decreasing of NFB expression. We also show that 6-OHDA or ICI-118,551 prior to MDMA treatment were not able to 8) abrogated the MDMA effects previously reported on neutrophil activity and blood leukocyte differential counts; nevertheless, 9) they abrogated the previously reported alterations on bone marrow and spleen cellularity, and 10) reduction on spleen relative weight. Finally, in a model of host resistance to Listeria monocytogenes we show that MDMA: 11) induces myelosuppression by decreasing CFU on bone marrow while increasing it on spleen; 12) decreases circulating leukocytes and bone marrow cellularity; 13) increases spleen cellularity; 14) decreases pro-inflammatory cytokines production (IL-12p70, TNF, IFN-, IL-6) and chemokine (MCP-1) after 24h of the infection; and 15) increases the production of the pro-inflammatory cytokines and chemokines previously reported after 72h of the infection. Thus, we conclude that the MDMA effects on neutrophil activity were mediated by the reduction of NFB expression, and this effect was induced by corticosterone elevation in the serum. Corticosterone is also involved in the alterations on neutrophil and lymphocyte counts. Catecholamines were shown to be involved in the alterations on leukocyte distribution in the bone marrow and spleen, and in the reduction of relative weight of spleen. Additionally, MDMA reduced the host resistance to Listeria monocytogenes. Therefore, MDMA can be considered an immunosuppressive drug and those effects are mediated by neuroimmune mechanisms

A determinação dos marcadores sorológicos P-ANCA (anticorpo perinuclear contra estruturas citoplasmáticas do neutrófilo) e ASCA (anticorpo anti-Saccharomyces cerevisiae) auxilia de forma menos invasiva no diagnóstico da doença inflamatória intestinal (DII). O padrão de associação mais relacionado à retocolite ulceratica inespecífica (RCUI) ocorre com ASCA- (negativo) e P-ANCA + (positivo). Na doença de Crohn (DC) ocorre o contrário, ou seja, ASCA+ e P-ANCA-. O P-ANCA é determinado por imunofluorescência indireta usando neutrófilos fixados em etanol, e o ASCA através de ELISA. De forma geral, a prevalência do P-ANCA em pacientes com RCUI tem variado entre 50 e 80% e em pacientes com DC entre 10 e 30%. Controles sadios têm revelado prevalência menor que 4% e controles patológicos em torno de 8%. Alguns trabalhos mostraram ampla variação nos resultados, sugerindo além de variação genéticas, variações metodológicas de acordo com a população estudada. Foram realizadas análises no soro de 200 pacientes para pesquisa de P-ANCA e ASCA, sendo 98 com RCUI e 102 com DC. O grupo controle foi representado por 54 indivíduos sadios. Os pacientes com DII foram oriundos do ambulatório de Gastroenterologia ? Grupo de Intestino do Hospital das Clínicas Faculdade da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). A prevalência encontrada do P-ANCA na RCUI, DC e grupo controle correspondeu a 61,2%, 16,7% e 5,6% respectivamente, enquanto que a do ASCA para a DC, RCUI e grupo controle correspondeu a 52,9%, 27,6% e 5,6% respectivamente. A sensibilidade e especificidade encontrada com o padrão ASCA+/P-ANCA- para DC foi de 45,1% e 89,% respectivamente, enquanto que para o padrão P-ANCA+/ASCA- para RCUI foi de 43,9% e 91,2% respectivamente. No que diz respeito às características clínicas e demográficas, nenhuma associação com a presença dos anticorpos foi estabelecida no presente estudo, exceto quando avaliado o uso de drogas imunossupressoras e infliximab em pacientes com DC e ASCA+ , a qual se mostrou aumentada (p=0,008). Assim sendo, a determinação dos anticorpos P-ANCA e ASCA na DII possui baixa sensibilidade, mas níveis elevados de especificidade como demonstrado em outros estudos publicados. A correlação dos anticorpos P-ANCA e ASCA com características clínicas ainda permanece controversa. / The determination of serologic markers P-ANCA (perinuclear antineutrophil cytoplasmic autoantibodies) and ASCA (anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies) assists as non-invasive way on the inflammatory bowel disease (IBD) diagnosis. The most associated pattern to ulcerative colitis (UC) occurs with ASCA- (negative) and P-ANCA + (positive). In the Crohns disease (CD) is the opposite, that is, ASCA+ and P-ANCA-. Determination of P-ANCA is performed by an indirect immunofluorescence assay, using ethanol-fixed neutrophil slides and ASCA is measured by ELISA. Usually, the prevalence of P-ANCA in patients with UC has varied between 50 and 80% and in patients with CD between 10 and 30%. Healthy controls have disclosed lesser prevalence than 4% and pathological controls around 8%. Some studies had shown a wide variation in the results, suggesting both genetic and methodologic variations, according to the studied population. Serum samples were obtained from 200 patients for analysis of P-ANCA and ASCA, being 98 with UC and 102 with CD. The control group was represented by 54 healthy individuals. Patients with IBD were selected from the Department of Gastroenterology - Intestine Group of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). P-ANCA prevalence found in UC, CD and control group were 61,2%, 16,7% e 5,6%, respectively, but ASCA prevalence in UC, CD and control group were 52,9%, 27,6% e 5,6%, respectively. Sensitivity and specificity achieved using ASCA+/P-ANCA- pattern for CD were 45,1% e 89,%, respectively, but P-ANCA+/ASCA- pattern for UC were 43,9% e 91,2% respectively. In this study, the current data did not support a relationship between the serological markers and clinical and demographic characteristics, except when evaluated the use of immunosuppresive drugs and infliximab in patients with CD and ASCA+, which were increased (p=0,008). Thus, the determination of antibodies P-ANCA and ASCA in the IBD gets low sensitivity, but high levels of especificity as demonstrated in other published reports. The correlation of antibodies P-ANCA and ASCA with clinical characteristics appears to be limited.

Orientadores: Márcio Lopes Miranda, Joaquim Murray Bustorff Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_RogerioFortunatode_D.pdf: 7693178 bytes, checksum: 55f02301a0933dc093626f6cdc21d65b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Objetivo: Elevações da pressão intra-abdominal durante o pneumoperitônio podem ocasionar oligúria ou anúria em mamíferos. Possível lesão renal decorrente ainda não foi bem documentada na literatura médica. O objetivo deste trabalho é avaliar o impacto do pneumoperitônio no parênquima renal em um modelo experimental de ratos jovens, através da expressão da neutrophil gelatinase-associated lipocalin (N-GAL), um biomarcador de lesão renal precoce. Materiais e Métodos: Vinte ratos machos jovens Sprague-Dowley foram utilizados no trabalho. Dezesseis ratos foram previamente anestesiados, traqueostomizados, flebotomizados e ventilados mecanicamente. Para análise, foram distribuídos em 4 grupos: Pneumoperitônio 1hora(h), Controle 1h, Pneumoperitônio 2h, Controle 2h. O quinto grupo, de quatro ratos, foi submetido à lesão renal através da administração de cisplatina para testar o biomarcador. Após 24h, todos os ratos foram submetidos à coleta de urina por 2 horas em gaiola metabólica; nefrectomia esquerda para quantificação por western blotting e nefrectomia direita para qualificação por immunofluorescência utilizando o biomarcador N-GAL Resultados: Os resultados foram analisados em 5 grupos de 4 ratos: Pneumoperitônio 1 e 2h, Controle 1 e 2h e Cisplatina. A expressão do N-GAL estava significantemente aumentada no grupo Cisplatina. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos Pneumoperitônio 1 e 2h e Controle 1 e 2h (P>0,05). . Conclusão: O Pneumoperitônio controlado de 1 e 2 horas em ratos não promoveu lesão renal aguda / Abstract: Objective: Elevations of intra-abdominal pressure during pneumoperitoneum can lead to oliguria or anuria in mammals. Consequent kidney injury has not been well demonstrated in the literature. The aim of this study is to investigate the post-operative kidney status after pneumoperitoneum in a rat model through expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (N-GAL), an early kidney injury biomarker. Materials and methods: Twenty male Sprague-Dowley rats were used in this experiment. Sixteen rats were previously anesthetized, tracheostomized, phlebotomized and mechanically ventilated were distributed in 4 groups: Pneumoperitoneum 1hour (h), Control 1h, Pneumoperitoneum 2h and Control 2h. The fifth group, composed of four rats, was kidney injuried with cisplatine to test the biomarker. After 24 hours all rats were submitted to a urine 2 hours output measurement, left nefrectomy to western blotting quantification and a right nefrectomy to immunofluorescence qualification of N-GAL. Results: The results were analyzed within 5 groups: Pneumoperitoneum 1 and 2h, Control 1 and 2h and Cisplatine group. The N-Gal expression was increased in the Cisplatine group. There weren't significant statistical difference between Pneumoperitoneum 1 and 2h and Control 1 and 2h groups (P>0,05). Conclusion: The 1 and 2hours controlled pneumoperitoneum isn't related to acute renal injury / Doutorado / Ciências da Cirurgia / Doutor em Ciências

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-α, IL-12 e IFN-γ, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-γ e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-α, IL-12 and IFN-γ release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-γ-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.

Este estudo se propôs a avaliar o efeito do gás sulfídrico (H2S), produzido endogenamente em mamíferos, na sinovite induzida pela injeção intra-articular de carragenina (CGN) no joelho de ratos Wistar (250 g). Ratos foram tratados (-60 min) com indometacina, o inibidor da cistationina <font face=\"Symbol\">g-liase DL-propargilglicine (PGly) ou doador de H2S reagente de Lawesson ( LR).Os parâmetros funcionais e bioquímicos foram avaliados 4h após. Ratos com sinovite exibiram dor, alodinia e edema articular. Na cavidade articular foram mensurados níveis elevados de neutrófilos (> MPO), nitração de resíduos protéicos (3-NT), atividade da iNOS, NOx-, caspase-1, IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 e via NF-<font face=\"Symbol\">kB. O LR ou indometacina, mas não PGly, reduziu significativamente a nocicepção, edema e marcadores inflamatórios, exceto iNOS, NOx-, 3-NT e NF-<font face=\"Symbol\">kB. A PGly não modificou a dor e inflamação, mas aumentou o numero de macrófagos e atividade da iNOS (NOx-) e AP-1. Conclui-se que, enquanto a administração exógena do LR produz efeitos antiinflamatórios e anti-nociceptivos, o H2S endógeno exerce pouco efeito anti-sinovite. / In this study we evaluated the effects of exogenous and endogenous H2S on Wistar rat knee synovitis induced by the intra-articular injection of carrageenan (CGN). One hour prior to CGN injection, Rats were pre-treated with indomethacin, an inhibitor of H2S formation (DL-propargylglycine) or an H2S donor Lawessons reagent (LR). CGN evoked knee inflammation, as characterized by impaired gait, secondary allodynia of the hindpaw, joint swelling, neutrophil infiltration, increased MPO, 3-NT residues, inducible NOS (iNOS) activity and NOx-, caspase-1 and NF-<font face=\"Symbol\">kB activation. Pretreatment with LR or indomethacin significantly attenuated the pain and all the inflammatory / biochemical changes, except for the increased iNOS activity, NOx- and 3-NT. PGly potentiated synovial iNOS activity (and NOx-), enhanced macrophage infiltration and AP-1 activation, but had no effect on oedema and pain. Whereas exogenous H2S delivered to the knee joint can produce a significant anti-inflammatory and anti-nociceptive effect, locally produced H2S exerts little immunomodulatory effect.

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.

Neste estudo foi verificado os efeito do &#945;-tocoferol (AT) nas vias de sinalização celular, dependentes de proteína quinase C (PKC) e de tirosinas quinases (TK), associadas ao \"burst\" oxidativo de neutrófilos humanos. Foram realizados também estudos comparativos com o inibidor da PKC, estaurosporina, com o inibidor de tirosinas quinases, genisteína e, com o análogo solúvel da vitamina E, Trolox. Foi feita a incorporação de AT in vitro às células, e então, estas foram estimuladas ou não com acetato de forbol miristato (PMA) ou com zymosan opsonizado (Zy). AT (40 &#181;M) inibiu a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutróflos estimulados com PMA ou Zy. Estaurosporina (10 nM), genisteína (100 &#181;M) e Trolox (40 &#181;M) também tiveram efeitos inibitórios. A atividade da PKC foi inibida pelo AT e pela estaurosporina, entretanto, a atividade da enzima não foi afetada pela genisteína e pelo Trolox. PMA e Zy promoveram um aumento da fosforilação em resíduos de tirosina de proteínas de neutrófilos. AT e estaurosporina provocaram um aumento adicional na fosforilação PMA-dependente, enquanto a genisteína causou uma diminiução e, Trolox não produziu nenhum efeito. Por outro lado, os quatro compostos foram inibitórios na fosforilação Zy-dependente. A atividade de tirosina fosfatases (PTPs) foi medida em neutrófilos estimulados e não-estimulados. PMA e Zy causaram uma diminuição na atividade de PTPs. A pré-incubação com AT e Trolox causou uma reversão destes efeitos inibitórios. O inibidor de serina/treonina fosfatases, caliculina A, também foi utilizado. Nós mostramos que este composto foi capaz de reverter os efeitos inibitórios do AT na produção de ERO e na atividade de PKC dos neutrófilos. Os resultados deste trabalho mostram que AT modulam ambas as via de sinalização, PKC e TK-dependentes, associadas com o \"burst\" oxidativo de neutrófilos humanos e, que esta modulação pode ser devido a ativação de fosfatases pelo AT. / The effects of &#945;-tocopherol succinate (TS) on the signaling pathways, dependent of protein kinase C (PKC) and tirosine kinases (TK), associated with the oxidative burst of human neutrophils were analysed. Comparative studies with the PKC inhibitor, staurosporine, the TK inhibitor, genistein and the soluble analogous of vitamin E, Trolox were also performed. TS was incorporated into neutrophils and cells were then, stimulated or not with phorbol myristate acetate (PMA) or with opsonized zymosan (OZ). TS (40 &#181;mol/l) inhibited the production of reactive oxygen species (ROS) by PMA or OZ-stimulated neutrophils. Staurosporine (10 nmol/l), genistein (100 &#181;mol/l) and Trolox (40 &#181;mol/l) were also inhibitory. PKC activity was inhibited by TS and staurosporine, however, the enzyme activity was not affected by genistein and Trolox. PMA and OZ promoted tyrosine phosphorylation in neutrophil proteins. TS and staurosporine caused a further increase of tyrosine phosphorylation of proteins in PMA-stimulated neutrophils, whereas, genistein diminished the levels of phosphorylation, and Trolox did not alter them. On the other hand, the four compounds decreased the tyrosine phosphorylated proteins in OZ-stimulated neutrophils. Protein tyrosine phosphatases (PTP) activity was measured in both resting and stimulated cells. PMA and OZ-stimulated neutrophils showed a decrease on PTP activity. Pre-incubation with TS or with Trolox caused partial recovery of the basal activity of stimulated neutrophils. The serine/threonine phosphatase inhibitor, calyculin A, was also utilized, and we showed that this compound was capable of reversing the inhibitory effects of TS on ROS production and PKC activity by neutrophils. These results show that TS modulates both PKC- and TK-dependent signaling pathways associated with the oxidative burst in human neutrophils, and this modulation could be due the activation of phosphatases by TS.

Introdução: Os anticorpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) são classificados em três padrões observados na imunofluorescência indireta (IFI) utilizando neutrófilos humanos fixados em etanol e formaldeído como substrato. O c-ANCA apresenta forte associação com a enzima neutrofílica proteinase 3 (PR3), enquanto o p-ANCA está fortemente associado à mieloperoxidase (MPO). Na hepatite autoimune (HAI), colangite esclerosante primária (CEP) e doença inflamatória intestinal (DII) é observado outro padrão de IFI classificado como p-ANCA atípico que não apresenta reatividade contra as enzimas PR3 e MPO. Objetivo: Determinação da frequência dos diferentes padrões de ANCAs na CEP com ou sem DII concomitante (CEP/DII+, CEP/DII-), em três subtipos de hepatite autoimune (HAI-1 com anticorpo antimúsculo liso padrão tubular; HAI-2 com anticorpo antimicrossoma de fígado e rim tipo 1; HAI antiantígeno hepático solúvel/fígado e pâncreas, na colangite biliar primária (CBP) e em controles saudáveis. O anticorpo antinúcleo poderia estar presente em todos os subtipos. Os resultados dos ANCAs foram comparados com os do ELISA para verificação de concordância entre os padrões e as reatividades antigênicas. Metodologia: Foram estudados 249 pacientes (42 CEP/DII+; 33 CEP/DII-; 31 HAI-1; 30 HAI-2; 31 HAI-3; 52 CBP; 30 indivíduos saudáveis). As amostras de soro desses pacientes foram processadas pelos ensaios comerciais INOVA: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTMPR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; e em lâminas com neutrófilos humanos fixados em etanol preparadas in house. Para as análises estatistícas foram utilizados os testes de Fisher com correção de Holm, os testes kappa e de McNemar. Resultados: O p-ANCA esteve presente em 4 (1,6%), o c-ANCA em 3 (1,2%), o p-ANCA atípico em 62 (24,9%), o c-ANCA atípico em dois (0,8%) e o padrão inconclusivo em 14 (5,6%) de 249 amostras testadas. O p-ANCA atípico foi mais frequentemente detectado na CEP/DII+ (52,4%; IC 95% = 37,7-66,6) em relação à CEP/DII- (21,2; IC 95% = 10,4-38,0), p=0,005. Não houve diferença significante na frequência do p-ANCA atípico na CEP/DII- em relação a CBP (15,38%, IC 95% = 7,83-27,89), p=0,501. O p-ANCA atípico foi significantemente mais positivo na HAI-1 (45,2%, IC 95% = 29,15-62,24, p < 0,001) e HAI-3 (32,3%, IC = 18,46-49,97, p=0,012) em comparação a HAI-2 (3,3%, IC 95% = 0-18,09). Não foi detectada diferença entre a HAI-1 e a HAI-3 (p=0,434). Ao considerarmos todos os padrões conjuntamente, persistiram as mesmas diferenças significantes entre a CEP/DII+ versus CEP/ DII- (p=0,037) e entre a HAI-2 versus HAI-1 (p=0,011) e versus HAI-3 (p=0,024). A reatividade do anti-PR3 foi encontrada em 25 das 249 amostras, sendo mais frequente na CEP/DII+ (31,0% IC 95%: 22,94 - 50,88) do que na CEP/ DII- (12,1%, IC 95%: 4,52-29,46, p = 0,025). Anticorpos anti-MPO foram identificados em oito de 249 amostras (3,2%). Das 25 amostras positivas para o anti-PR3 apenas uma apresentou c-ANCA; outras duas amostras positivas para o c-ANCA foram negativas para o anti-PR3. As oito amostras positivas para o anti-MPO não apresentaram reatividade para o p-ANCA e as quatro que tinham esse padrão não foram reativas para o anti-MPO. Entre as 62 amostras reativas para o p-ANCA atípico 49 não apresentaram reatividade para o anti-PR3 e anti-MPO. Das treze amostras positivas para o p-ANCA atípico e que exibiram reatividade ao ELISA, doze apresentaram positividade para o anti-PR3 e uma para o anti-MPO e para o anti-PR3. Conclusões: 1) Do ponto de vista de reatividade dos ANCAs e do anti-PR3 a CEP/DII+ teve comportamento diferente da CEP/ CEP/ DII - que que que que teve comportamento semelhante ao da CBP, o que pode sugerir que a maior frequência do p-ANCA atípico e do anti-PR3 esteja mais associada à DII do que à CEP; 2) Quanto à reatividade dos ANCAs, pacientes com HAI-1 e HAI-3 tiveram características semelhante entre si e diferente do da HAI-2; 3) Não houve concordância entre os resultados da IFI para os padrões c-ANCA e p-ANCA clássicos e os do ELISA anti-PR3 e anti-MPO; 4) A melhor concordância de leitura dos padrões do ANCA foi para o p-ANCA atípico, porque a maioria dos soros com esse padrão não teve reatividade nem para o anti-PR3 nem para o anti-MPO por ELISA; 5) Para doenças do aparelho digestivo (DII, CEP e HAI) é difícil relacionar os padrões do ANCA obtidos na imunofluorescência indireta com a reatividade observada nos ELISAs comerciais / Background: The antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) has 3 main subtypes according to the pattern observed by indirect immunofluorescence (IIF) on ethanol and formalin fixed human neutrophils. The cANCA has a strong association to a neutrophil enzyme proteinase 3 (PR3), while the classical pANCA has a strong association to myeloperoxidase (MPO), catepsin G, elastase, lactoferrin, lysozyme. Autoimmune hepatitis (AIH), primary sclerosing cholangitis (PSC) and inflammatory bowel disease (IBD), shows another pattern called atypical pANCA that does not react to the enzymes PR3 and MPO. Aims: Determine the frequency of different types of ANCA in PSC, with or without association to IBD (PSC/IBD+, PSC/IBD-); 3 AIH subtypes (AIH type 1, with antismooth muscle antibody (ASMA) with the tubular pattern and with or without antinuclear antibody (ANA); AIH type 2, with anti-LKM1 antibody; AIH anti-Soluble liver antigen/liver pancreas antigen (anti-SLA/LP), with or without ANA associated); primary biliary cholangites (CBP) and healthy controls. Methods: we studied 249 patients (42 PSC/IBD+; 33 PSC/IBD-; 31 AIH-1; 30 AIH-2; 31 HAI antiSLA/LP; 52 CBP; 30 healthy controls). The serum sample of these patients were processed with the INOVAÒ commercial kits: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTM PR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; and human neutrophil slides ethanol fixed in house. Statistical analysis were performed using the Fisher Test, with Holm correction when nedeed, McNemar and Kappa Test. Results: The classical pANCA were present in 1.9% (IC 95%: 0 - 11.07) CBP patients and 7.1% (IC 95%: 1.77 - 19.7) of PSC/IBD+ patients. There were no statistical significance between groups. The atypical pANCA were identified in 62 out of 249 samples (24.9%). It were more frequently detected in PSC/IBD+ (52.4%, IC 95%: 37.72-66.6) then in PSC/IBD- (21.2%, IC 95%: 10.38 - 38.05), p = 0.005. The Fisher test did not show statistical significance between PSC/IBD+ and CBP for atypical pANCA reactivity (21.2%, IC 95%: 10.38-38.05 versus 15.4%, IC 95%: 7.74 - 27.79), p = 0.56. However, there was statistical significance for atypical pANCA between AIH subtypes, p < 0,001. Among AIH subtypes, the atypical pANCA were more frequent in AIH-1 than in AIH-2 (45.2%, IC 95%: 29.15 - 62.24 versus 3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p < 0.001) and more frequent in AIH-3 than in AIH-2 (32.3%, IC 95%: 18.46-49.97 versus.3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p = 0.012). There were no statistical diference between AIH-1 e a AIH-3 (p = 0.434).None of the 30 healthy controls showed the atypical pANCA pattern. The classical cANCA were present in just 3 of 249 patient samples (1.2%), 1 CBP, 1 PSC/IBD+ and 1 AIH-1. The atypical cANCA is rarely described in the literature. We identified just 2 samples with the atypical cANCA of 249 samples (0.8%), one PSC/IBD+ patient and another AIH-2 patient. 14 out of 249 samples (5.6%), showed a positive fluorescence on ethanol fixed slides, even though we couldn\'t define a ANCA pattern because of the ANA interference. However, the Fisher test did not show a statistical significance between the studied groups (among AIH subtypes, p= 0.207 and PSC/IBD+ versus PSC/IBD-, p = 0.945). Antibodies against proteinase-3, that is considered the classical cANCA target, we detected 25 out of 249 samples (10.0%). The anti-PR3 were more frequent in PSC/IBD+ (31.0%, IC 95%: 22.94-50.88) than in PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.52-29.46), p = 0,025. Antibodies against antimyeloperoxidase, one of the target antigens of the classical pANCA, were identified in 8 out of 249 samples (3.2%). The overall ELISA results, adding the anti-PR3 and anti-MPO, show that this autoantibodies were more frequent in PSC among the other groups, mainly PSC/IBD+ (p= 0.002). It is worth mentioning that PSC/IBD+ 2 patients showed simultaneously anti-PR3 and anti-MPO reactivity. If we consider atypical pANCA as atypical pANCA by IIF and negative ELISA (anti-MPO and anti-PR3), 49 out of 249 samples (19.7%), The Fisher test showed a difference statistical significance in atypical pANCA IIF+/ELISA- between PSC/IBD+ (35.7%, IC 95%: 22.94 - 50.88) and PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.21 - 27.93), p = 0,018. The Fisher test did not show significant difference between PSC/IBD- and CBP (13.5%, IC 95%: 6.37 - 25.58), p = 1. The same test showed statistical significance reactivity of ANCA IIF+/ELISA- among AIH subtypes (p=0,001), been more frequent in AIH-1 then in AIH-2 (p = 0.001) and among AIH-3 versus AIH-2 (p = 0.025). There was no statistical difference among AIH-1 versus AIH-3, p = 0,426. Conclusion:SC/IBD+ had a different serological pattern compared with PSC/IBD-, since atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies were significantly more frequent in the former. According to the ANCA profile, PSC/IBD- had a similar behavior to PBC which may suggest that atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies are more associated with IBD than with PSC. Patients with ASMA AIH and with anti-SLA/LP had higher frequency of atypical p-ANCA than anti-LKM1 AIH; There was no concordance between the results of indirect immunofluorescence and those of ELISA. Then, the results of ANCA by immunofluorescence are completely observer-dependent