Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Ronei Luciano Mamoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:57:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fornazim_MarciaCristina_D.pdf: 1869002 bytes, checksum: b2e5012f736532c7b201f92582544179 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resposta Th1 com a ativação eficiente de macrófagos constituiu o principal mecanismo de defesa na infecção causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Componentes do sistema imune inato que induzem a polarização a resposta adaptativa como as células dendríticas (DCs) e seus produtos foram pouco explorados, principalmente na doença humana. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotipicamente e funcionalmente DCs obtidas a partir de monócitos do sangue periférico (MSP) de indivíduos saudáveis (C), pacientes com a forma adulta (FA) e juvenil (FJ) da paracoccidioidomicose (PCM), estimuladas in vitro por células leveduriformes do fungo P. brasiliensis das cepas Pb18 (alta virulência) e Pb265 (baixa virulência). Em uma segunda etapa pretendeu-se verificar se estas DCs eram capazes de ativar linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos. Os MSP foram cultivados na presença de IL-4 e GM-CSF por 7 dias e posteriormente submetidos à estimulação por células leveduriformes do fungo (Pb18 ou Pb265) ou CD40L (controle positivo) ou somente meio (SE) por 18 horas. DCs derivadas de monócitos do sangue periférico dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) se diferenciam em DCs maduras na presença de células leveduriformes do fungo. Nos pacientes com as FA e FJ as células leveduriformes Pb18 e Pb265 induzem maturação semelhante nas DCs que passam a expressar características morfológicas e fenótipo de células maduras com aumento da expressão dos marcadores de maturação (CD83 e CCR7), das moléculas de coestimulação (CD80/B7-1 e CD86/B7-2), das moléculas envolvidas na apresentação de antígenos (HLA-I e HLA-II), dos receptores envolvidos no reconhecimento de antígenos (TLR2, TLR4 e dectina-1) e diminuição da expressão do CD1a e CD209. No grupo C foram observadas as mesmas características de fenótipo acima mencionadas, mas de forma mais evidente em DCs que foram estimuladas com as células leveduriformes da cepa Pb265, quando comparada a Pb18. DCs estimuladas com CD40L mostraram potencial máximo de expressão dos marcadores de superfície. Constatou-se também em DCs do grupo controle uma diminuição da capacidade fagocítica, após 18h de contato com as células leveduriformes do fungo, comprovando o processo de maturação, que foi mais efetivo na presença de Pb265. A análise da expressão gênica demonstrou que ambas as células leveduriformes do fungo induziram a expressão de TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 e TGF- . A estimulação das DCs com as células leveduriformes da cepa Pb265 induziu aumento da expressão de IL-6 (C, FA, FJ). Em relação à IL-10 as células leveduriformes Pb265 induziram maior expressão somente nos pacientes (FA e FJ). Na segunda etapa do estudo verificou-se que DCs fenotipicamente competentes foram capazes de estimular a proliferação de linfócitos T CD4+/CD8+ autólogos de forma mais acentuada quando eram provenientes de pacientes. Nestes grupos (FA e FJ) também foi constatada uma diminuição da frequência de linfócito T CD4+/CD8+/CD45RA+ e um aumento da frequência células CD4+/CD8+/CD45RO+ e CD4+/CD8+/CD69+. Inesperadamente, os resultados também mostraram que DCs dos 3 grupos estudados, que foram estimuladas com células leveduriformes do fungo, induziram a proliferação de linfócitos T CD3+CD4+CD25+Foxp3+, em relação às DCs que não receberam estímulos (SE). DCs de pacientes que foram estimuladas por ambas as células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IL-2, IL-17, IL- 10 e IFN- por LT/CD3+CD8(neg), quando comparada com DCs do grupo C. Por outro lado, DCs dos 3 grupos estudados (C, FA, FJ) que foram estimuladas células leveduriformes do fungo induziram uma maior produção de IFN- por LT/CD3+CD8+. Em conjunto os resultados do nosso estudo mostraram que a estimulação com células leveduriformes do fungo induz uma população heterogênea de DCs, capazes de dar origem a uma resposta linfocitária mista com proliferação de linfócito Th1 (produtoras de IFN-?), Th17 (produtoras de IL-17) e células com fenótipo regulatório Foxp3+ (produtoras de IL-10) / Abstract: A Th1 response with an efficient activation of macrophages is the main mechanism of defense in Paracoccidioides brasiliensis infection. Components of the innate immune system that induce the polarization of the adaptive response such as dendritic cells (DCs) and their products have been little explored, particularly in human disease. The aim of this study was to phenotypically and functionally characterize DCs obtained from peripheral blood monocytes (PBM) of healthy individuals (C), patients with the adult form (AF) and juvenile form (JF) of paracoccidioidomycosis (PCM), induced in vitro by P. brasiliensis yeasts cells of Pb18 (high virulence) and Pb265 (low virulence) strains. In a second step we sought to determine whether these DCs were capable of activating autologous CD4/CD8 T cells. PBM were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF for 7 days and then stimulated by yeasts cells (Pb18 or Pb265) or CD40L (positive control) or medium only (WE), for 18 hours. PBM of the 3 groups (C, AF, JF) acquired the capacity to differentiate into DCs in the presence of P. brasiliensis yeasts cells. In patients with FA and FJ yeast cells induced maturation of DCs with increased expression of maturation markers (CD83 and CCR7), co-stimulatory molecules(CD80/B7-1 and CD86/B7-2), antigen presentation molecules (HLA-I and HLA-II), receptors involved in antigen recognition (TLR2, TLR4 and dectin-1) and decreased expression of CD1a and CD209. DCs from group C showed the same phenotypic characteristics, more evident in DCs that were stimulated with Pb265 when compared to Pb18. DCs stimulated with CD40L showed maximum expression of surface markers. A decrease in phagocytic capacity was detected in DCs of the control group after stimulation with yeast cells, demonstrating the maturation process, which was more effective in the presence of Pb265. The gene expression analysis showed that both strains of yeasts cells induced expression of TNF- , IL-1 , IL-12p35, IL-23p19 and TGF- mRNA. Stimulation of DCs with Pb265 induced increased expression of IL-6 in all groups. Pb265 also induced a higher expression of IL-10 mRNA only in patients (AF and JF). Our study also showed that phenotypically competent DCs were able to stimulate the proliferation of autologous CD4+/CD8+ cells, mainly in patients. In these groups (FA and FJ) it was also observed a reduction in the frequency of CD4+/CD8+/CD45RA+ and na increased frequency of CD4+/CD8+/CD45RO+ and CD4+/CD8+/CD69+. Unexpectedly, the results also showed that DCs stimulated with the yeast cells induced proliferation of T lymphocytes CD3+CD4+CD25+Foxp3+, compared to DCs that received no stimulation. DCs from patients stimulated by both strains of yeast cells induced a higherr production of IL-2, IL-17, IL-10 e IFN- by LT/CD3+CD8(neg) compared with DCs from group C. Moreover, DCs from the 3 groups also induced a stronger IFN-? production by CD3+/CD8+T cells. Altogether the results showed that stimulation with P. brasiliensis yeast cells induces a heterogeneous population of DCs, capable of giving rise to a mixed lymphocyte response with proliferation of Th1, Th17, and Foxp3+ cells / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_D.pdf: 7669317 bytes, checksum: eeec29689d95e50ddec45928c2c76343 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro / Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T13:43:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T13:48:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T13:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Vieira Tomazett - 2011.pdf: 1259531 bytes, checksum: aa04f3f36448deb32394c0d322cbc8b7 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-08-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the most important endemic deep mycosis in Latin America. Understanding of the complex interactions between the fungus and host must include the identification of gene expression patterns during infection. Carbonic anhydrase (CA) belongs to the family of zinc metalloenzymes that catalyzes the reversible hydratation of carbon dioxide to bicarbonate. Transcriptional studies have shown that carbonic anhydrase of P. brasiliensis is expressed in yeast cells recovered from liver of infected mice. In the present work, we characterized the cDNAs encoding for four carbonic anhydrases of P.brasiliensis (PbCA1, PbCA2, PbCA3, PbCA4). Recombinant PbCA1, 3 and 4 were obtained in heterologous systems with 33 kDa, 28 kDa and 32 kDa respectively. Mass spectrometry analysis confirmed the sequences of the produced proteins. The expression of PbCAs transcripts was evaluated by using real-time RT-PCR in mycelium, yeast cells and mycelium to yeast transition, in yeast cells exposed to CO2 and yeast cells recovery directly from liver and spleen. In the presence of CO2, PbCA1, PbCA2 and PbCA4 gene expression was reduced in the course of time. PbCA1 transcript expression was induced during the mycelium to yeast transition. PbCA2 and PbCA4 gene expression was higher in yeast cells, when compared to mycelium and mycelium to yeast transition. Pbca1 was induced yeast cells recovery directly from liver and spleen while the transcripts for Pbca2 and Pbca4 were repressed in all condictions. The gene expression data suggest differential roles of the CAs in the fungal physiology. / Paracoccidioidomicose (PCM) é a mais importante micose endêmica na América Latina. A compreensão das interações complexas entre o fungo e o hospedeiro deve incluir a identificação de padrões de expressão gênica durante a infecção. Anidrase carbônica (CA) pertence à família de metaloenzimas de zinco que catalisa a hidratação reversível do dióxido de carbono para bicarbonato. Estudos transcricionais têm mostrado que uma anidrase carbônica de P. brasiliensis é expressa em células de levedura recuperadas de fígado de camundongos infectados. No presente trabalho, nós caracterizamos os cDNAs que codificam para quatro anidrases carbônicas de P.brasiliensis (PbCA1, PbCA2, PbCA3, PbCA4). As recombinante de PbCA1, PbCA3 e PbCA4 foram obtidas em sistemas heterólogos com 33 kDa, 28 kDa e 32 kDa, respectivamente. Análise por espectrometria de massas confirmou as seqüências das proteínas produzidas. A expressão dos transcritos de Pbcas foi avaliada usando real-time RT-PCR em micélio, levedura e transição de micélio para levedura; em células de levedura expostas a CO2 e células de leveduras recuperadas diretamente do fígado e baço. Na presença de CO2, a expressão dos genes de Pbca1, Pbca2 e Pbca4 foi reduzida no decorrer do tempo. A expressão do transcrito de Pbca1 foi induzida durante a transição de micélio para levedura. A expressão de Pbca2 e Pbca4 foi maior em células de levedura, quando comparada com micélio e transição de micélio para levedura.O transcrito para Pbca1 foi induzido em células de leveduras recuperadas diretamente do fígado e baço, enquanto que os transcritos para Pbca2 e Pbca4 foram reprimidos em todas as conduções. Os dados de expressão gênica sugerem diferentes papéis das CAs na fisiologia dos fungos.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T12:28:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T12:33:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T12:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-07-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The genus Paracoccidioides comprises a complex of phylogenetic species of dimorphic pathogenic fungi, the etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a disease confined to Latin America and of marked relevance in its endemic areas due to its high frequency and severity. The members of the Paracoccidioides genus are distributed in distinct phylogenetic species (S1, PS2, PS3 and 01-like) that potentially differ in their biochemical and molecular characteristics. In this work, we performed the proteomic characterization of different members of the genus Paracoccidioides. We compared the proteomic profiles of Pb01 (01-like), Pb2 (PS2), Pb339 (S1) and PbEPM83 (PS3) using 2D electrophoresis and mass spectrometry. The proteins/isoforms were selected based on the staining intensity of the spots as determined by image analysis. The proteins/isoforms were in-gel digested and identified by peptide mass fingerprinting and ion fragmentation. A total of 714 spots were detected, of which 343 were analyzed. From these spots, 301 represented differentially expressed proteins/isoforms among the four analyzed isolates, as determined by ANOVA. After applying the FDR correction, a total of 267 spots were determined to be differentially expressed. From the total, 193 proteins/isoforms were identified by PMF and confirmed by ion fragmentation. Comparing the expression profiles of the isolates, the proteins/isoforms that were related to glycolysis/gluconeogenesis and to alcohol fermentation were more abundant in Pb01 than in other representatives of the genus Paracoccidioides, indicating a higher use of anaerobic pathways for energy production. Those enzymes related to the oxidative stress response were more abundant in Pb01, Pb2 and Pb339, indicating a better response to ROS in these members of the Paracoccidioides complex. The enzymes of the pentose phosphate pathway were abundant in Pb2. Antigenic proteins, such as GP43 and a 27-kDa antigenic protein, were less abundant in Pb01 and Pb2. The proteomic profile indicates metabolic differences among the analyzed members of the Paracoccidioides genus. / O gênero Paracoccidioides compreende um complexo de espécies filogenéticas do fungo patogênico dimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença restrita à América Latina e de relevância acentuada em suas áreas endêmicas, devido à sua alta frequência e gravidade. Os membros do gênero Paracoccidioides são distribuídos em espécies filogenéticas distintas (S1, PS2, PS3 e 01-like) que diferem potencialmente nas suas características bioquímicas e moleculares. Neste trabalho, foi realizada a caracterização proteômica de diferentes membros do gênero Paracoccidioides. Foram comparados os perfis proteômicos de Pb01 (01-like), Pb2 (PS2), Pb339 (S1) e PbEPM83 (PS3) utilizando eletroforese 2D e espectrometria de massa. As proteínas / isoformas foram selecionados com base na intensidade de coloração dos spots conforme determinado por análise de imagem. As proteínas / isoformas foram excisadas do gel, digeridas e identificadas por PMF (Peptide mass fingerprinting) e fragmentação iônica. Um total de 714 spots foi detectado, 343 foram analisados. A partir destes spots, 301 apresentaram-se diferencialmente expressos entre os quatro isolados analisados, determinado por ANOVA. Depois de aplicar a correção FDR, um total de 267 spots foram diferencialmente expressos. Do total, 193 / isoformas proteínas foram identificadas por PMF e confirmadas por fragmentação iônica. Comparando-se os perfis de expressão dos isolados, as proteínas / isoformas que foram relacionados para a glicólise / gliconeogênese e fermentação alcoólica foram mais abundantes em Pb01 do que em outros representantes do gênero Paracoccidioides, indicando uma maior utilização das vias anaeróbias para a produção de energia. Enzimas relacionadas com a resposta ao estresse oxidativo foram mais abundantes em Pb01, Pb2 e Pb339, indicando uma melhor resposta às ROS nestes membros do complexo Paracoccidioides. As enzimas da via das pentoses foram abundantes em Pb2. Proteínas antigênicas, tal como GP43 e uma proteína antigênica de 27 kDa, foram menos abundantes em Pb01 e Pb2. O perfil proteômico indica diferenças metabólicas entre os membros analisados do gênero Paracoccidioides.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-03T12:46:00Z No. of bitstreams: 2 Disssertação - Fausto Guimarães Costa - 2015.pdf: 7717372 bytes, checksum: 0c97192720a82947f88e00adcc4dc90b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-03T12:47:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Disssertação - Fausto Guimarães Costa - 2015.pdf: 7717372 bytes, checksum: 0c97192720a82947f88e00adcc4dc90b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-03T12:47:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Disssertação - Fausto Guimarães Costa - 2015.pdf: 7717372 bytes, checksum: 0c97192720a82947f88e00adcc4dc90b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-04-16 / Paracoccidioidomycose / A Paracoccidioidomicose...

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-19T17:05:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-20T13:06:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T13:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Paracoccidioides is a termodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), the most frequent systemic mycosis that affects mainly the rural population in Latin America. The fungus grows as yeast when grown at 35-37° C and as mycelium at temperatures below 28° C. The establishment and severity of the disease depends on factors inherent to the fungus and the host. The diversity presented among isolates of the same genus has been explored between the microorganisms and attempt to clarify differences possibly related to virulence existing between isolates that cause the same disease. The secretion of proteins in a cell is a highly dynamic mechanism and is directly involved in the first pathogen contact with the host cells, enabling their survival, multiplication and dissemination. In order to try to elucidate this diversity the proteomic profile of secretome of two isolates of Paracoccidioides, PbEpm83 and Pb01, that in our experimental conditions of infection showed different behaviors was characterized. The use of Ultra Performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MSE) allowed the identification of 92 proteins / isoforms among the strains. Of the 92 proteins identified, 36 were preferentially secreted in PbEpm83 and 35 preferentially secreted in Pb01. Among the identified we can highlight proteins related to various biological processes: adhesion to the ECM, proteins related to thermal and oxidative stress, cell rescue, defense and virulence, proteins with immunogenic capacity, proteins related to defense against antifungal, heat shock proteins, among others. Our analysis showed that most of the proteins identified using non-conventional secretory pathways. Among the identified proteins there are already related proteins as virulence factors, such as, ATP synthase, mitochondrial Peroxiredoxin PRX 1, fructose bisphosphate aldolase, Didpeptidil peptidase, Thioredoxin, TCTP, Hsp70 and Hsp88. Our results highlight the importance of secreted proteins in the establishment of infection and that these species, within the same genus, maintain differences in the levels of protein expression that may reflect their behavior in the success of the infection. / Paracoccidioides é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), a mais frequente micose sistêmica que afeta, principalmente, a população rural na América Latina. O fungo cresce como levedura quando cultivado à 35-37 °C e como micélio à temperaturas inferiores à 28 °C. O estabelecimento e severidade da doença dependem de fatores inerentes ao fungo bem como ao hospedeiro. A diversidade apresentada entre isolados de um mesmo gênero tem sido explorada entre micro-organismos e procura elucidar diferenças possivelmente relacionadas à virulência existentes entre isolados que causam a mesma doença. A secreção de proteínas em uma célula é um mecanismo altamente dinâmico e que está diretamente envolvido nos primeiros contatos do patógeno com as células do hospedeiro, capacitando sua sobrevivência, multiplicação e disseminação. A fim de tentar elucidar essa diversidade o perfil proteômico do secretoma de dois isolados de Paracoccidioides, PbEpm83 e Pb01, pertencentes à duas espécies filogenéticas diferentes, que em nossas condições experimentais de infecção apresentaram comportamentos diferentes foi caracterizado. A utilização da Cromatografia Líquida de Ultraperformance acoplada à Espectrometria de Massas (UPLC-MSE) permitiu a identificação de 92 proteínas/isoformas entre as amostras testadas. Das 92 proteínas identificadas, 36 foram preferencialmente secretadas em PbEpm83 e 35 preferencialmente secretadas em Pb01. Dentre as identificadas podemos destacar proteínas relacionadas à vários processos biológicos: adesão à MEC, proteínas relacionadas ao estresse térmico e oxidativo, resgate celular, defesa e virulência, proteínas com capacidades imunogênicas, proteínas relacionadas à defesa contra antifúngicos, proteínas de choque térmico, entre outras funções. Nossas análises mostraram que a maioria das proteínas identificadas utilizam vias secretórias não-convencionais. Entre as proteínas identificadas estão proteínas já relacionadas como fatores de virulência: ATP sintase, Peroxirredoxina mitocondrial PRX 1, Frutose bifosfato aldolase, Didpeptidil peptidase, Tioredoxina, TCTP, Hsp70 e Hsp88. Nossos resultados ressaltam a importância das proteínas secretadas no estabelecimento da infecção e que estas espécies dentro do mesmo gênero mantêm diferenças nos níveis de expressão proteica que podem refletir em seu comportamento no sucesso da infecção.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-07-13T21:03:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-07-14T13:01:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T13:01:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2012-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides is a thermal dimorphic fungus that causes Paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. Immune cells have a variety of defense mechanisms against pathogens, such as the production and release of nitric oxide (NO), one of the reactive nitrogen species (RNS). RNS react with cellular components, resulting in damage to DNA and membranes, inhibition of repiration and inactivation of cellular enzymes. To understand how Paracoccidioides responds to nitrosative stress, this study aims to identify genes that might contribute to this response. The Paracoccidioides yeast cells grouth was evaluated in the presence of various concentrations of sodium nitrite (NaNO2). The nitrosative stress was confirmed by quantification of nitrite in the cultures supernatant and by the inhibition of the cytochrome c oxidase (complex IV) activity. The transcriptional analyzes were performed by sequencing a cDNA library constructed with Paracoccidioides mRNA obtained after incubation of fungal cells with 500 µM NaNO2 during 1 h. The results show the induction of transcripts related to several cellular pathways, including genes of mitochondrial electron transport chain. The expression of selected transcripts was confirmed by quantitative real time RT-PCR. Moreover, mitochondrial activity measured by XTT method was reduced in the presence of NaNO2 during the first 2 hours of treatment. Additionally, the NADP+/NADPH ratio is lower during nitrosative stress, as demonstrated. The results suggest that the induction of transcripts associated with energy production during nitrosative stress may reflect a compensatory effect on the inhibition of enzymes that carry out this metabolic function, probably to ensure the production of energy and/or contribute to the redox balance by generation of NADPH. / Paracoccidioides é um fungo termodimórfico causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma doença endêmica na América Latina. Células do sistema imune humano possuem uma variedade de mecanismos de defesa contra patógenos, como a produção e liberação de óxido nítrico (NO), uma das espécies reativas de nitrogênio (RNS). RNS reagem com os componentes celulares, o que resulta em danos ao DNA e membranas, inibição da respiração e inativação de enzimas celulares. Para entender como Paracoccidioides responde ao estresse nitrosativo, esse trabalho tem como objetivo identificar genes que possam contribuir para esta resposta. O crescimento de células de levedura de Paracoccidioides foi avaliado na presença de várias concentrações de nitrito de sódio (NaNO2). O estresse nitrosativo foi confirmado através da quantificação de nitrito no sobrenadante das culturas e da inibição da atividade da enzima citocromo c oxidase (Complexo IV). As análises transcricionais foram feitas a partir do sequenciamento da biblioteca de cDNA construída utilizando-se mRNA obtido após incubação de células leveduriformes de Paracoccidioides na presença de 500µM de NaNO2 durante 1 hora. Os resultados mostram a indução de transcritos relacionados a várias vias celulares, incluindo genes da cadeia mitocondrial transportadora de elétrons. A expressão de alguns desses transcritos foi confirmada por PCR quantitativo em tempo real. Adicionalmente, a atividade mitocondrial, avaliada através do método do XTT, apresentou-se reduzida na presença de NaNO2 durante as primeiras 2 horas de tratamento. A razão NADP+/NADPH foi avaliada, apresentando-se menor durante o estresse nitrosativo. Os resultados sugerem que a indução de transcritos relacionados à produção de energia durante o estresse nitrosativo possa refletir um efeito compensatório sobre a inibição de enzimas que desempenham esta função metabólica, provavelmente para assegurar a produção de energia e/ou contribuir para o balanço redox através da geração de NADPH.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-18T13:15:58Z No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-18T13:17:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-18T13:17:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Lívia do Carmo Silva - 2017.pdf: 33507637 bytes, checksum: 4e4e645677db485bad788889218760cd (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis (PCM) is the cause of several deaths from systemic mycoses. The etiological agents of PCM belong to the genus Paracoccidioides spp., restricted to the regions of Latin America. The infection is acquired by inhaling conidia that primarily settle in the lungs, and can spread to other organs. The treatment of PCM is commonly performed with administration of antifungals such as amphotericin B, itraconazole and co-trimoxazole. The toxicity and side effects of antifungals, added over the long treatment time, has stimulated research for new bioactive compounds. Thus, with the objective of to identify the anti- Paracoccidioides spp. of compounds derived from chalcones and nitrogen heterocycles and to identify the molecular targets and mode of action of argentilactone and RRF-128 in P. brasiliensis were used methodologies such as shape-based virtual screening, minimum inhibitory and fungicidal concentration, cytotoxicity in fibroblast cells, interactions between antifungal, proteomic and chemoproteomics. After the virtual screening, 33 chalcones were proposed as anti-Paracoccidioides molecules, being this activity confirmed by biological assays. Among the compounds, eight aryl and heteroaryl chalcones had selectivity index considered attractive, highlighting Labmol-75 with selectivity index of 64.4 in P. lutzii and 32.2 in P. brasiliensis. In addition, Labmol-75 showed additive interaction with amphotericin B and co-trimoxazole. In relation to nitrogen heterocycles, of the 22 tested compounds, RRF-128 was the most important. RRF-128 showed to inhibit the growth of P. brasiliensis in low concentrations, selectivity index of 64.10, interacting synergistically with itraconazole. In addition, the proteomic analyzes of P. brasiliensis in the presence of the compound provided evidence that the energy metabolism of the fungus is induced to produce acetyl-CoA and that the synthesis of membrane sterols is impaired. In relation to argentilactone, 331 proteins were identified as ligands to this compound in the chemoproteomics assay and after being functionally classified, it was observed that the most representative functional classes are related to amino acid metabolism, energetic and detoxification. The inhibition of the enzymatic activity of malate dehydrogenase, citrate synthase and pyruvate dehydrogenase by argentilactone was confirmed. In addition, argentilactone induced the production of reactive oxygen species, and inhibited chitin and glucan synthesis and arrest of the cell cycle in the G0/G1 phase. From these results, it can be concluded that the compounds Labmol-75, RRF- 128 and argentilactone showed to be promising antifungal agents. / Paracoccidioidomicose (PCM) é a causa de várias mortes por micoses sistêmicas. Os agentes etiológicos da PCM pertencem ao gênero Paracoccidioides spp., restritos às regiões da América Latina. A infecção é adquirida por inalação de conídios que primariamente se instalam nos pulmões, podendo disseminar para outros órgãos. O tratamento da PCM é comumente realizado com a administração de antifúngicos como anfotericina B, itraconazol e co-trimoxazol. A toxidade e efeitos colaterais dos antifúngicos, adicionado ao longo tempo de tratamento, têm impulsionado pesquisas por novos compostos bioativos. Assim, com objetivo de identificar a atividade anti-Paracoccidioides spp. de compostos derivados de chalconas e heterociclos nitrogenados e identificar os alvos moleculares e modo de ação de argentilactona e RRF-128 em P. brasiliensis foram empregadas metodologias como rastreio virtual shape-based, concentração inibitória e fungicida mínima, citotoxicidade em células de fibroblastos, interações entre antifúngicos, proteômica e quimioproteômica. Após o rastreio virtual, 33 chalconas foram propostas como moléculas anti-Paracoccidioides, sendo esta atividade confirmada pelos ensaios biológicos. Dentre os compostos, oito aril e heteroaril chalconas tiveram índices de seletividades considerados promissores, destacando-se Labmol-75 com índice de seletividade de 64,4 em P. lutzii e 32,2 em P. brasiliensis. Além disso, Labmol-75 apresentou interação aditiva com anfotericina B e co-trimoxazol. Dos 22 compostos heterociclos nitrogenados, o RRF-128 apresentou resultados promissor. RRF-128 foi capaz de inibir o crescimento de P. brasiliensis em baixas concentrações e apresentou índice de seletividade de 64,10. Além disso, RRF-128 interagiu de forma sinérgica com itraconazol. As análises proteômicas de P. brasiliensis na presença de RRF-128 forneceram evidências de que o metabolismo energético do fungo é direcionado para produção de acetil-CoA e que a síntese de esteróis de membrana está comprometida. Quanto à argentilactona, 331 proteínas foram identificadas como ligantes a este composto utilizando abordagem quimioproteômica e após serem classificadas funcionalmente, observou-se que as classes funcionais mais representativas são relacionadas ao metabolismo de aminoácidos, energético e detoxificação. A inibição da atividade enzimática de malato desidrogenase, citrato sintase e piruvato desidrogenase por argentilactona foi confirmada. Além disso, argentilactona induziu a produção de espécies reativas de oxigênio, inibiu síntese de quitina e glicana, bem como o aprisionamento do ciclo celular na fase G0/G1. A partir destes resultados, conclui-se que os compostos Labmol-75, RRF-128 e argentilactona são promissores antifúngicos.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-10T15:41:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriel Brum Tristão - 2014.pdf: 2758860 bytes, checksum: 2422850e561b8d6f9f4cfd50487ebf4c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-10T15:42:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriel Brum Tristão - 2014.pdf: 2758860 bytes, checksum: 2422850e561b8d6f9f4cfd50487ebf4c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T15:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Gabriel Brum Tristão - 2014.pdf: 2758860 bytes, checksum: 2422850e561b8d6f9f4cfd50487ebf4c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-03-11 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Approximately one third of all proteins have been estimated to contain at least one metal cofactor, being named metalloproteins. These represent one of the most diverse classes of proteins, containing metal ions provide catalytic, regulatory and structural functions. Bioinformatic tools have been developed to predict metalloproteins encoded by an organism based only on its genome sequence. Paracoccidioides complex includes termodimorphic pathogenic fungi that are found as saprobiotic mycelia in the environment and as yeast in host tissues. They are the etiologic agents of Paracoccidioidomycosis, a prevalent systemic mycosis in Latin America. It is known that many metalloproteins are important for virulence of several pathogenic microorganisms. On this way, the present work aimed to predict the cooper, iron and zinc proteins encoded by the genomes of three phylogenetic species of Paracoccidioides spp. (Pb01, Pb03 and Pb18). Cu-, Fe- and Zn-proteins represents 7% of the total proteins encoded by Paracoccidioides spp genomes. Zinc-proteins were the most abundant metalloproteins representing 5.7% of the fungus proteome, while copper and iron proteins represent 0.3% and 1.2% respectively. Functional classification revealed that metalloproteins are related to many cellular processes. Furthermore it was observed that many of these metalloproteins play roles as virulence factors, in the biology of the fungus, and an analysis of the protein interactions revealed that many of them depend on each other to perform their functions. Thus, it is concluded that the Cu-, Feand Zn- metalloproteome of Paracoccidioides is of utmost importance for biology and virulence / É estimado que por volta de um terço de todas as proteínas já conhecidas contém pelo menos um cofator metálico, sendo chamadas de metaloproteínas. Estas representam uma das mais diversas classes de proteínas, contendo íons metálicos que fornecem função catalítica, regulatória e estrutural. Atualmente ferramentas bioinformáticas tem sido desenvolvidas no intuito de prever metaloproteinas codificadas por um dado organismo tendo como base apenas a sua sequência genômica. O complexo Paracoccidioides inclui fungos termodimórficos, patogênicos que são encontrados como micélio saprobiótico no meio ambiente e como levedura nos tecidos de indivíduos infectados. Estes fungos são os agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica prevalente na América Latina. Sabe-se que muitas metaloproteínas são importantes para a virulência de vários microorganismos patogênicos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo prever as cobre, ferro e zinco proteínas codificadas pelos genomas de três espécies filogenéticas de Paracoccidioides spp. (Pb01, Pb03 e Pb18). As Cu, Fe e Zn- proteínas representam 7% do total de metaloproteínas codificadas pelos genomas de Paracoccidioides spp. As zinco proteínas foram as mais abundantes, representando 5,7% do metaloproteoma dos fungos, enquanto que as proteínas de cobre e ferro representam 0,3% e 1,2% respectivamente. A classificação funcional revelou que essas metaloproteínas estão relacionadas com muitos processos celulares. Além disso, observou-se que muitas destas metaloproteínas atuam como fatores de virulência na biologia do fungo, e uma análise da interação destas metaloproteínas revelou que muitas dependem uma da outra para exercer suas funções. Assim, conclui-se que o metaloproteoma de Cu, Fe e Zn de Paracoccidioides spp. é de extrema importância para a biologia e virulência deste patógeno humano.

Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-γ e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-γ and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.