Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-04-18T16:46:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 804756 bytes, checksum: 03a46513826b20470e24b68ca050d076 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-18T16:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 804756 bytes, checksum: 03a46513826b20470e24b68ca050d076 (MD5) Previous issue date: 2015-08-26 / Devido à sua capacidade em transmitir diversos agentes infecciosos, os carrapatos são importantes para a saúde pública e para produção animal. Dentre estes, se destaca o carrapato Rhipicephalus microplus, responsável por perdas econômicas nos países das regiões tropicais e subtropicais. Entre as medidas de controle deste ectoparasita, o controle imunológico tornou-se uma alternativa promissora, pois não gera populações de carrapatos resistentes e não há risco de resíduos em produtos de origem animal e contaminação ambiental e melhor bem estar animal. Objetivou-se neste estudo, testar a campo o efeito do peptídeo recombinante rSBm 7462 anti Rhipicephalus microplus. Avaliaram-se as condições climáticas no período de 2010 a 2014, e a dinâmica populacional do carrapato neste período, dividindo as em duas etapas, antes e após a imunização. O peptídeo recombinante foi aplicado em três doses, com intervalos de 30 dias no ano de 2012, e repetido nos anos seguintes de 2013 e 2014. O efeito do controle de carrapatos com uso do imunógeno sobre a dinâmica populacional, os parâmetros produtivos e reprodutivos dos rebanhos, assim como custo de produção, baseando-se no controle de carrapatos, apresentaram resultados satisfatórios. / Due to its ability to transmit various infectious agents, ticks are important to public health and animal production. Among these, it stands out the tick Rhipicephalus microplus, responsible for economic losses in the countries of tropical and subtropical regions. Among the control measures of this ectoparasite, the immune control has become a promising alternative because it does not generate resistant tick populations and there is no risk of residues in animal products and environmental contamination and better animal welfare. The aim of this study, test the field the effect of recombinant peptide RSBM 7462 anti Rhipicephalus microplus. Evaluated the climate conditions in the period 2010-2014, and population dynamics of the tick will be shown, dividing in two stages, before and after immunization. The recombinant peptide was administered in three doses, 30 days in the year ranges from 2012, and repeated in the following years 2013 and 2014. The effect of tick control with use of the immunogen on population dynamics, productive and reproductive parameters of herds, as well as cost of production, based on the control of ticks, showed satisfactory results.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000001.pdf: 706994 bytes, checksum: 3b1be365e85a6cde721c1c20730d3ac6 (MD5) Previous issue date: 2006 / (...) Sabe-se que a resposta de isotipos específicos tem sido associada às manifestações clínicas da doença de Chagas. Assim, nos propomos a pesquisar as subclasses de IgG no soro de indivíduos chagásicos frente a dois antígenos específicos do Trypanosoma cruzi, visando a obtenção de um perfil isotípico que seja capaz de discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e indeterminada (IND). Para isso, coletamos sangue para obtenção de soro de 60 pacientes chagásicos (CARD= 33, MIS= 7 e IND= 20), (...). Todos os pacientes foram avaliados clinicamente para caracterização das formas clínicas e realizaram exames confirmatórios para infecção pelo T. cruzi. Além disso, também coletamos sangue de 40 indivíduos sadios (indivíduos não-chagásicos= 20 e controles negativos para o cut-off= 20) que apresentaram sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi. (...) Os antígenos recombinantes (Ags-Recs) Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA) e Flagellar Repetitive Antigen (FRA) foram analisados através de SDS-PAGE, seguido por colorações pela prata e pelo ácido periódico de Schiff, ficando comprovada a integridade dos Ags-Recs e ausência de contaminações bacterianas. As concentrações ideais dos Ags-Recs e dos anti-isotipos foram estabelecidas após titulação dos mesmos. Para detecção dos isotipos utilizamos a metodologia do ELISA indireto, onde as placas de ELISA foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA. As amostras de soro foram depositadas em duplicata nos poços. A ligação dos anticorpos específicos foi detectada pela incubação dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4) conjugados à biotina, seguida da incubação de estreptavidina conjugada à peroxidase. A quantificação da reação foi determinada através do leitor de ELISA a 490 nm. Os resultados foram analisados através de um índice de reatividade, onde as densidades ópticas das amostras foram divididas pelo cut-off (média dos controles negativos adicionada de dois desvios-padrão) de suas respectivas placas. Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-Recs foi bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG. Entretanto, apenas o isotipo IgG2 específico contra o Ag-Rec FRA foi capaz de diferenciar pacientes chagásicos portadores da forma CARD daqueles portadores da forma IND, podendo, após um estudo prospectivo, servir como marcador de evolução clínica para a forma cardíaca ....

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-21T16:31:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-21T16:31:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / CPqRR/FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico INCT-DT: Instituto Nacional de Ciência e tecnologia de Doenças Tropicais / Neste estudo foram avaliadas as principais alterações hematológicas e imunofenotípicas em pacientes portadores da fase crônica da esquistossomose (INF), subcategorizados por cargas parasitárias distintas, apresentando menos de 100 ovos por grama de fezes (<100) e mais de 100 ovos por grama de fezes (>100) e indivíduos negativos para ovos residentes (CA) ou não (CT) em áreas endêmicas para a doença. Amostras de fezes e sangue periférico foram coletadas para realização de exame parasitológico pelo método de Kato-Katz e hemograma, respectivamente. Logo após, foi realizado a avaliação do perfil imunofenotípico ex vivo dos leucócitos circulantes e a produção de citocinas em culturas de células mononucleares do sangue periférico, após estimulação antigênica in vitro por 12 horas na ausência ou presença de antígenos solúveis do ovo (SEA), do verme adulto (SWAP) e proteínas recombinantes (Sm22.6 e Sm29) do Schistosoma mansoni. Os resultados mostraram aumento no número absoluto de eosinófilos nos grupos INF e >100. Em relação ao perfil imunofenotípico, foi observado aumento da expressão dos receptores do Tipo Toll-2, CD80, CD86 e CD54 em monócitos dos grupos CA, INF, e >100 em relação ao grupo CT. Foi observado também aumento do receptor CD18 em linfócitos T CD4+ dos grupos CA e <100 em relação ao grupo CT, diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100 e aumento da expressão do CD18 no grupo <100 em relação ao grupo CA. Em linfócitos T CD8+ foi observado aumento na expressão do receptor do tipo Toll-2 nos grupos INF, <100 e >100 em relação ao grupo CT, aumento do CD18 nos grupos <100 e CA em relação ao grupo CT e diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100. Em linfócitos B, foi observado aumento da expressão do receptor CD80 e CD86 no grupo <100 em relação ao CT e aumento na expressão do CD86 no grupo CA em relação ao grupo CT. A análise após estimulação antigênica revelou, em monócitos, aumento da síntese de TGF-nos grupos INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao CA, redução na síntese de IL-10 e IL-12 no grupo INF em relação ao grupo CA estimulado com Sm22.6 e redução na síntese de IL-1nos grupos CAINF, <100 e >100estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao meio. Houve também, redução de expressão de IL-5 no grupo <100 em relação ao CA estimulado com Sm22.6, aumento na síntese de IFN- nos grupo INF e >100 estimulados com SEA em relação ao meio e aumento na síntese de F-e IL-10 nos grupo INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEAem relação ao grupo CA em linfócitos T CD4+. Além disso, houve aumento da síntese de IL-12 e TNF-no grupo INF em relação ao CA estimulado com SEA, redução de IL-8 no grupo >100 em relação ao grupo <100 estimulados com SEA, SWAP e Sm22.6 e redução de síntese de IL-5 no grupo INF estimulado com SWAP em relação ao CA em linfócitos T CD8+. Após a realização desse trabalho, pode-se concluir que indivíduos portadores da fase crônica e residentes em área endêmica para a doença apresentam forte expressão de moléculas co-estimuladoras, de adesão e de ativação celular em monócitos, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+ do sangue periférico, sugerindo que estes indivíduos possuam intensa atividade das células envolvidas na resposta imune contra a infecção pelo S. mansoni. Além disso, de uma maneira geral, os indivíduos infectados apresentaram, após estimulação antigênica com antígenos recombinantes, redução na síntese de citocinas pró inflamatórias e aumento da síntese de citocinas reguladoras tanto para monócitos quanto para linfócitos. Isto mostra uma enorme capacidade que esses antígenos possuem em induzir uma modulação da resposta imune relacionada à resistência a infecção e a uma menor gravidade da doença. A categorização da população estudada, segundo intensidades de infecção distintas, definiu a contribuição dessa variável para os mecanismos de resistência e susceptibilidade durante a infecção esquistossomótica. / In this study, hematological and immunological features were determined in patients with chronic phase of schistosomiasis (INF), subcategorized by distinct parasitic loads in those with less than 100 eggs per gram of feces (<100) or more than 100 eggs per gram of feces (> 100). Non infected patients resident (CA) or not (CT) in endemic areas for the disease were evaluated as control groups. Stool samples and peripheral blood were collected to perform parasitological exams and hemogram, respectively. Afterwards, it was performed the immunophenotypic profile of circulating leukocytes and cytokine pattern in peripheral blood mononuclear cells cultures after antigenic stimulation in vitro at 12 hours in the absence or presence of soluble egg antigens (SEA), soluble worm antigen preparation (SWAP) and recombinant proteins of Schistosoma mansoni (Sm22.6 and Sm29 ). The results showed an increase in the absolute number of eosinophils in INF and >100 groups. It was also observed an increase in expression of TLR2, CD80, CD86 and CD54 on monocytes from CA, INF, and >100 groups as compared to CT group. It was still observed an increase in the CD18 receptor expression in T CD4+ lymphocytes from CA and <100 groups as compared to CT group. Decreased CD18 expression on >100 as compared to <100 group as well as increased expression of CD18 in <100 group as compared to CA group were also detected. Analyses of T CD8+ lymphocytes demonstrated an increase in the TLR2 expression from INF, <100 and >100 groups as compared to the CT group. Increased CD18 expression in <100 and CA groups as compared to CT group as well as decreased in CD18 expression from >100 as compared to <100 group were still revealed. In B lymphocytes, there was an increase in the both CD80 and CD86 expressions on <100 group as compared to CT group, and an increase in the CD86 expression from CA group as compared to CT group. The analysis after antigenic stimulation revealed in monocytes increased TGF- synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to CA group, and decreased IL-10, IL-12 synthesis from INF group as compared to CA group, and decreased IL-1 syntheses from CA, INF, <100 and >100 groups estimualated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation. There was also reduction in positivity for IL-5 from <100 group stimulated with Sm22.6 as compared to CA group and increase in the IFN- from INF and >100 groups stimulated with SEA as compared to absence of stimulation  increase in F- and IL-10 synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation by T CD4+ lymphocytes besides of increased IL-12 and TNF- from INF group stimulated with SEA as compared to CA group decreased IL-8 syntheses from >100 group stimulated with SEA, SWAP and Sm22.6 as compared to <100 group and decreased IL-5 syntheses from INF group stimulated with SWAP as compared to CA group by T CD8+ lymphocytes. In conclusion, the individuals with chronic phase of schistosomiasis and residents in endemic areas for the disease have strong expression of co-stimulatory, adhesion and cell activation molecules in circulating monocytes, B cells and CD4+ and CD8+ T lymphocytes, suggesting that these individuals have intense cellular activity that might be involved in immune response against S. mansoni infection. Overall, infected individuals presented, after antigenic stimulation in vitro with recombinant specific antigens, reduced syntheses of pro-inflammatory cytokines apart of increased regulatory cytokine synthesis from both monocytes and lymphocytes revealing a great ability of these antigens to induce a modulation of immune response related to the resistance to infection as well as a lower disease severity. The subcategorization of the study population according to distinct intensity of infection better define the contribution of this parameter to resistance or susceptibility during Schistosoma mansoni infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-18T18:08:55Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T18:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses. / The population control of sand flies, containment of epidemics in the early stages and facilitating early diagnosis of infected individuals are strategies outlined by WHO for surveillance and control of Leishmaniasis. In this context, serologic tests using both the salivary gland sonicate (SGS) of sandflies as soluble Leishmania antigen (SLA) are important tools for the control / diagnosis of Leishmaniasis. However, tests based on the use of antigens derived from crude fractions, despite showing high sensitivity, some of these antigens cross-react with epitopes shared by other pathogens / vectors. Moreover, the preparation of antigens has adequate reproducibility due to difficulty in obtaining and / or standardization of these. In this study, we aimed to identify biomarkers for the surveillance and control of Leishmaniasis, through use of recombinant proteins from the saliva of sandflies as biomarkers of exposure to vector and through the use of recombinant proteins of Leishmania to get a more accurate serodiagnosis for human leishmaniasis. On the first step, ELISAs were performed against the recombinant protein from the saliva of the vector L. longipalpis (rLJM11 and rLJM17) to estimate the positive anti-saliva on a small number of sera from children from an endemic area for VL. It was observed that the sera that recognize the SGS of L. longipalpis also recognize in different proportions of rLJM17 and rLJM11 proteins. Further, each recombinant protein was able to detect anti-saliva seroconversion in sera from a second endemic area for VL, with increase in recognizing when the two recombinant proteins were used in combination. Furthermore, the ROC analysis showed the superior performance of the combination of rLJM17 + rLJM11, these data confirmed using a large panel of 1077 serum samples from individuals from another endemic area for LV. At this stage, our results indicate that proteins rLJM11 + rLJM17 represent a promising epidemiological tool that can assist in the implementation of control measures against Visceral Leishmaniasis. In a second step, ELISAs were performed against a series of recombinant proteins of Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, and H4 KMP11) so antigenic proteins were selected against serum from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL) and that presented high specificity when tested against sera from patients with other diseases (Chagas disease, Systemic Lupus Erythematosus, Leprosy and Tuberculosis). To identify the effectiveness of recombinant proteins, ROC curves were used to select antigens possibly more efficient than SLA. Recombinant proteins HSP70 and H2A were selected for having high sensitivity in recognizing sera from patients with LM and LC respectively. In the last experimental stage using sera from individuals with other pathologies, it was observed that the reduced cross-reactivity against the recombinant antigen, especially for rHSP70 when compared to that observed for the SLA. Our results show the high antigenicity of rHSP70, suggesting the possibility of using this recombinant protein for serodiagnosis of Leishmaniasis. In this work, it was possible to identify and validate the use of recombinant proteins of the parasite and of the saliva of sandflies as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to Leishmaniasis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-10T16:21:40Z No. of bitstreams: 1 Jessica Mariane Ferreira Mendes Produção... 2016.pdf: 1965926 bytes, checksum: ac5119592b97390470f4914f6fcbddf0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-05-10T16:21:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Jessica Mariane Ferreira Mendes Produção... 2016.pdf: 1965926 bytes, checksum: ac5119592b97390470f4914f6fcbddf0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-10T16:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jessica Mariane Ferreira Mendes Produção... 2016.pdf: 1965926 bytes, checksum: ac5119592b97390470f4914f6fcbddf0 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral (LV) canina pode contribuir para o controle da doença no homem. Visando o desenvolvimento de uma vacina contra LV canina, antígenos recombinantes de L. infantum foram selecionados em nosso laboratório pelo uso de uma mistura de soros de seres humanos ou cães naturalmente infectados pela L. infantum. Alguns destes antígenos foram testados em diversos protocolos de imunização, incluindo uso de diferentes adjuvantes, em camundongos ou cães. A imunização de camundongos ou cães com um dos antígenos recombinantes (rLci2B) usado isoladamente ou em associação com saponina induziu resposta imune Th2 ou Th1/Th2, respectivamente, não protetoras contra a infecção experimental. Com a determinação da sequência deduzida de aminoácidos notou-se que a maioria dos antígenos selecionados apresenta um segmento com sequência de aminoácidos única (domínio não repetitivo) e segmentos com sequência de aminoácidos com motivos repetitivos (domínios repetitivos). Possivelmente a incapacidade dos antígenos recombinantes de induzir uma resposta imune predominantemente Th1, protetora contra a LV, seria por conta da presença de domínios repetitivos, que favorecem a apresentação antigênica por linfócitos B e, consequentemente, estimulam uma resposta imune Th2. Para avaliar o direcionamento da resposta imune pelos dois tipos de domínio, novas construções de DNA foram concebidas de modo a codificar apenas domínio(s) não repetitivo(s) ou domínio(s) não repetitivo(s) e domínios repetitivos. OBJETIVOS: Produzir quatro proteínas recombinantes com domínios não repetitivos (rLci2-NT-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT e rLci12-NT-CT) e avaliar a capacidade desses polipeptídios de induzir resposta imune celular in vitro em cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram realizadas: a) a subclonagem de construções de DNA (Lci3-NT-CT, Lci10-NT e Lci12- NT-CT) em um plasmídeo apropriado para expressão em Escherichia coli, b) a determinação de condições apropriadas para produção das proteínas recombinantes (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT-2R e rLci10- NT) c) a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade e d) avaliação da capacidade dos polipeptídios de induzir estimulação de células mononucleares sangue periférico (PBMC) de cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum. RESULTADOS: Três (rLci2-NT-CT, rLci2-NT-5R-CT, rLci3- NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci10-NT e rLci10-NT-2R) dos quatro pares de polipeptídios recombinantes foram expressos, produzidos e purificados. Três antígenos recombinantes (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT e rLci3-NT-2R-CT) promoveram a linfoproliferação in vitro utilizando PBMC de cães assintomáticos inoculados por via dérmica com L. infantum CONCLUSÕES: Três das seis proteínas produzidas induziram a linfoproliferação, sendo a maior linfoproliferação encontrada para PBMC estimulado com a proteína sem domínios repetitivos (rLci2-NT-CT). Avaliações adicionais são necessárias para comprovar a utilidade destas moléculas em formulação de vacina contra leishmaniose visceral canina. / An effective vaccine against visceral leishmaniasis (VL) dog can help to control the disease in man. Aiming at development of a vaccine against canine VL, recombinant antigens of L. infantum were selected in our laboratory by using a mixture of sera from humans or dogs naturally infected with L. infantum. Some of these antigens were tested in different immunization protocols, including use of different adjuvants in mice or dogs. The immunization of mice or dogs with a recombinant antigens (rLci2B) used alone or in combination with saponin induced Th2 response or Th1 / Th2, respectively, did not protective against experimental infection. With the determination of the deduced amino acid sequence it was noted that most of the antigens selected segment has a unique amino acid sequence (non-repetitive domain) and segments of amino acid sequence with repetitive motifs (repetitive domains). Possibly the inability of recombinant antigens to induce an immune response predominantly Th1 protective against LV would be due to the presence of repetitive domains that promote antigen presentation by B cells and thus stimulate an immune response Th2. To assess the direction of the immune response by two types of domain, new DNA constructs were designed to encode only the domain (s) not repetitive (s) or domain (s) not repetitive (s) and repetitive fields. MATERIALS AND METHODS: Were performed: a) subcloning DNA constructs (rLci3-NT-CT, rLci10-NT and rLci12-NT-CT) into a suitable plasmid for expression in Escherichia coli, b) determining the appropriate conditions for the production of proteins recombinant (rLci2- NT-5R-CT, rLci2-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci3-NT-CT, rLci10-NT-2R and rLci10-NT) c) purification of recombinant proteins by chromatography affinity d) evaluating the ability of polypeptides rLci2-NT-CT, rLci3-NT-CT and rLci10-NT to induce stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy dogs inoculated dermal with L. infantum. RESULTS: Three (rLci2-NT-CT, rLci2-NT-5R-CT, rLci3-NT-CT, rLci3-NT-2R-CT, rLci10- NT and rLci10-NT-2R) of the four pairs of recombinant polypeptides are expressed, produced and purified. Three recombinant antigens (rLci2-NT-5R-CT, rLci2-NT-CT and rLci3-NT-2R-CT) promoted lymphocyte proliferation in vitro using asymptomatic dogs PBMC inoculated dermal L. infantum CONCLUSIONS: Three of the six proteins produced induced lymphoproliferation, most lymphoproliferation was found to PBMC stimulated with the protein without repetitive domains (rLci2-NT-CT). Additional evaluations are necessary to confirm the utility of these molecules against canine visceral leishmaniasis vaccine formulation

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:29:32Z : No. of bitstreams: 1 bortolossi_jc_me_jabo_prot.pdf: 1992127 bytes, checksum: 4589472b07077a15576f670c58a3f88c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O cancro cítrico doença causada pela bactéria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), representa muitos prejuízos para citricultura brasileira e mundial. Em 2002, a Xac teve todo seu genoma seqüenciado. Uma biblioteca de mütantes foi constituída e os mutantes foram analisados por inoculação in planta, deste modo tres mutantes foram selecionados por apresentarem diferenças nos sintomas, quando comparados com a estirpe selvagem Xac. Os genes nocauteados nos mutantes codificam três proteínas diferentes: DGTP pirofosfato tiamina sintase, envolvida na biossíntese de vitamina B 1, a subunidade E da enzima PHA sintase, que atua na síntese de polihidroxialcanoatos. que acumulados na forma de grânulos intracelulares constituem substâncias de reserva da célula, e podem formar biopolímeros e, ainda o terceiro gene nocauteado, que codifica uma proteína hipotética. As curvas de crescimento revelaram que o mutante da DGTP pirofosfohidrolase tiamina sintase não se desenvolve na planta hospedeira. O mutante da PHA sintase cresce menos que a Xac selvagem nos dois primeiros dias de avaliação, já o mutante da proteína hipotética sofre uma fase de declínio a partir do oitavo dia de avaliação experimental. A subunidade E da PHA sintase da Xac, gene codificador desta proteína foi donado em vetor de expressão e a proteína recombinante foi produzida em E.coli na forma solúvel. / The citric canker disease caused for the bacterium gram negative Xantlzomonas axonopodis pv. citri (Xac), presents many damages for Brazilian and world-wide citriculture. In 2002, aiming to know the mechanisms of attack of the disease, the Xac had alI its sequenced genome. A library of mutants was constituted and the mutants had been analyzed by inoculation in plant, three mutants had been isolated for not to show differences in the symptoms when compared with the wild lineage Xac. The mutants codify three different proteins: DGTP pyrophosphate tiamine synthase involved in biosynthesis B 1 vitamin; enzyme PHA synthase subunit E that is involved in the synthesis of polyhydroxyalkanoate, in the intracellular granule f01111, they constitute substances of reserve of the cell an can still to form biopolymer; and hypothetical proteins. The profile of growth of the wild Xac and the mutated Xacs in the three cases of the mutants had been evaluated in order to compare the profile of growth of the bacterial wild and mutant during the infection in citric host. The growth curves showed that the mutant of the DGTP pyrophosphate tiamine synthase does not develop the disease in the host plant. The PHA synthase grows less than the wild Xac in the first days of evaluaction, however the mutant of the hypotetical, shown a decline period for eighth day of the experimental evaluaction. The subunit E the PHA synthase of the Xac, the code gene of this protein was cloned in expression vector and the recombinant protein was produced in E.coli in the soluble form.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015.pdf: 1441432 bytes, checksum: a83fe75ef6bcdf6aded59803a162d33a (MD5) Previous issue date: 2008-08-20 / As cisteíno proteases são enzimas proteolíticas que possuem os resíduos de cisteína e histidina em seu sítio catalítico. Essa classe de enzimas está presente na grande maioria dos organismos, desde bactérias, fungos, protozoários, plantas e animais. As propriedades físico-químicas destas proteases têm sido amplamente caracterizadas, entretanto suas funções biológicas ainda não foram completamente elucidadas. Trabalhos com cisteíno proteases de plantas têm sugerido diversas funções biológicas para estas enzimas. O presente estudo tem como objetivo a produção recombinante e a caracterização de uma cisteíno protease (tipo catepsina B) de cana-de-açúcar. A produção recombinante da enzima foi realizada em E. coli nas formas solúvel e insolúvel, sendo que esta última foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A caracterização da enzima foi realizada pela análise da hidrólise de substratos fluorescentes. Testes de inibição contra a cisteíno protease foram feitos utilizando-se inibidores recombinantes endógenos produzidos em nosso laboratório (CaneCPI-1 e CaneCPI-4), como também o inibidor específico para cisteíno proteases (E64) e o inibidor específico para catepsinas B (CA074). A inibição foi realizada com sucesso com os inibidores endógenos, como também com os inibidores sintéticos específicos. A atividade inibitória do CA074 demonstrada contra a cisteíno protease da cana-de-açúcar sugere que esta enzima seja uma cisteíno protease tipo catepsina B.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016.pdf: 1206354 bytes, checksum: fc07f54941a23475ae348908f318c08a (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / Financiadora de Estudos e Projetos / As serpinas são conhecidos inibidores de serino proteases, enzimas notáveis por participarem de inúmeros processos fisiológicos importantes. A proteólise não regulada pode levar ao surgimento de doenças e problemas funcionais e, portanto, a função dos inibidores é fundamental para o bom funcionamento do organismo. No genoma da cana-de-açúcar foi identificada uma ORF (Open Reading Frame) que codifica uma serpina. Visto que essa planta é de grande importância para a economia brasileira e muitos trabalhos vêm sendo desenvolvidos visando à melhora da produção e estratégias de defesa contra parasitas e, dado que na literatura não se tem descrita nenhuma serpina de cana-de-açúcar, o objetivo desse trabalho foi caracterizar uma serpina presente nessa planta, denominada cana-serpina. Para isso, a ORF contida no clone SCJLRT1015H07.g foi isolada e subclonada para posterior expressão recombinante e purificação da proteína. A canaserpina recombinante pura foi capaz de inibir a atividade enzimática da quimiotripsina e tripsina, com um valor de IC50 de 0,46 e 0,50 &#956;M, respectivamente. Além disso, a formação do complexo covalente SDS-estável foi visualizado no ensaio com tripsina, embora fracamente e no ensaio com a quimiotripsina foi possível visualizar apenas um possível complexo clivado. Portanto, esse trabalho procura contribuir para a identificação e caracterização da primeira serpina descrita para a cana-de-açúcar e trabalhos posteriores poderão identificar a especificidade em relação a outras enzimas, buscando relacioná-las a possíveis alvos endógenos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6246.pdf: 4525981 bytes, checksum: 69b0012bfc897e466c42b6036376948c (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / Universidade Federal de Minas Gerais / Polygalacturonases (PGases) are enzymes which hydrolyze glycosidic linkages &#61537;- 1,4 between pectic acid residues, and are produced by plants, fungi, bacteria and yeasts. The fungus L. gongylophorus, Atta sexdens ant mutualist, secretes enzymes with PGase activity. The project was developed in two approaches: study with recombinant and native PGase. The activity on polygalacturonic acid of native PGase in fungus culture medium was determined, and its purification from crude extract was performed by (NH4)2SO4 precipitation and molecular exclusion chromatography. PGase kinetic parameters (Vmax and KM), optimal pH and temperature were determined, and the enzyme was immobilized on magnetic particles, proved to be a good method to future work inhibitors search. A cDNA library was constructed from total RNA obtained from L. gongylophorus culture in induction medium. 816 clones from the library were sequenced, allowing the identification of enzymes sequences involved in the plant cell wall degradation, some already in cloning and expression in our laboratory. Using a deposited L. gongylophorus PGase (PGase-Lg) sequence (GenBank: ADV30326.1), primers were designed to amplify the PGase-Lg gene, with cleavage sites for EcoRI, HindIII and NotI enzymes, respecting the pETSUMO (for E. coli expression) and pPICZ&#61537;A (for P.pastoris expression) reading phase vectors. From the cDNA, the PGase-Lg ORF encoding was amplified by PCR and cloned in both vectors. The clones were confirmed by plasmid DNA extraction and PCR. E. coli expression experiments of pETSUMO-PGase-Lg construction showed a great expression of His.tag-SUMO.tag-Lg-PGase fusion protein in the insoluble form and many expression and solubility assays were inefficient in solubility of expressed fusion protein. The protein refolding was performed and this was obtained in soluble form but lacks PGase activity, showing that folding may not have been correctly or E. coli fusion protein expressed does not undergo post-translational modifications to have enzymatic activity. The rPGase-Lg expressed in P. pastoris showed PGase activity on polygalacturonic acid and electrophoresis analysis suggest more than one enzyme expression, with different glycosylation content. / Poligalacturonases (PGases) são enzimas que hidrolisam ligações glicosídicas &#61537;-1,4 entre resíduos de ácido péctico, e são produzidas por plantas, fungos, bactérias e leveduras. O fungo L. gongylophorus mutualista da formiga Atta sexdens, secreta enzimas com atividade PGase. O projeto foi desenvolvido sob duas abordagens: estudo com a PGase nativa e recombinante. A atividade sobre ácido poligalacturônico da PGase nativa foi determinada no extrato bruto do fungo, e sua purificação foi feita por precipitação com (NH4)2SO4 e cromatografia de exclusão molecular. Temperatura e pH ótimos e parâmetros cinéticos Vmax e KM foram determinados, e a PGase foi imobilizada em partículas magnéticas, mostrando ser um bom método na busca de inibidores. Construiu-se uma biblioteca de cDNA a partir de RNA total obtido de cultura de L. gongylophorus em meio indutor. Foram sequenciados 816 clones da biblioteca, permitindo identificar sequências de enzimas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, algumas em fase de clonagem e expressão em nosso laboratório. Utilizando uma sequência de PGase de L. gongylophorus (PGase-Lg) depositada (GenBank: ADV30326.1), foram desenhados oligonucleotídeos para a amplificação do gene da PGase-Lg, com sítios de clivagens das enzimas EcoRI, HindIII e NotI, respeitando a fase de leitura dos vetores pETSUMO (para expressão em E.coli) e pPICZ&#61537;A (para expressão em P.pastoris). A partir do cDNA, a ORF codificante da PGase-Lg foi amplificada por PCR e clonada nos dois vetores. Os clones foram confirmados por extração de DNA plasmidial e PCR. Experimentos de expressão em E. coli da construção pETSUMO-PGase-Lg apresentaram grande expressão da proteína em fusão His.tag-SUMO.tag-PGase-Lg na forma insolúvel, e vários ensaios de expressão e solubilidade se mostraram ineficientes na solubilidade da proteína em fusão expressa. Realizou-se o refolding da proteína e esta foi obtida na forma solúvel, porém sem atividade, mostrando que o enovelamento pode não ter ocorrido corretamente ou que a proteína em fusão expressa pela E. coli não sofre as modificações pós-traducionais necessárias. A rPGase-Lg expressa em P. pastoris apresentou atividade PGase em ácido poligalacturônico, e análise em eletroforese sugere a expressão de mais de uma proteína, com conteúdos diferentes de glicosilação.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:39Z : No. of bitstreams: 1 000837650_20170101.pdf: 129928 bytes, checksum: bcf92a65a2ae8f3fe651ecb9b7e44699 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:50Z: 000837650_20170101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:07Z : No. of bitstreams: 1 000837650.pdf: 3998019 bytes, checksum: 27c55eb98a37acdb1cdea68262f691ce (MD5) / O agente etiológico da leishmaniose visceral no Brasil, é a Leishmania chagasi. Ela é transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, que adquire o parasito ao realizar o hematofagismo em animais infectados. O presente trabalho teve como objetivo estudar a resposta imune de camundongos BALB/c imunizados com a proteína recombinante produzido a partir do gene A2-L de L. chagasi, amostra isolada de um cão atendido no Hospital Veterinário da FCAV-UNESP, campus de Jaboticabal-SP, e avaliar a capacidade dessa proteína recombinante em induzir imunoproteção nos animais, após desafio com o parasito. Quarenta camundongos foram divididos em quatro grupos: G1, 10 animais inoculados com promastigotas de L. chagasi; G2, 10 animais inoculados com a proteína recombinante A2-L; G3, 10 animais imunizados com a proteína recombinante A2-L e desafiados com promastigotas de L. chagasi; G4, 10 animais inoculados com solução salina (controle negativo). Os parâmetros da resposta imune humoral avaliados foram anticorpos da classe IgG e das subclasses IgG1 e IgG2a, pelo ELISA indireto. Quanto à resposta imune celular, avaliou-se a produção de células CD4+ e CD8+, pela técnica de citometria de fluxo e, as imunomarcações de CD4+, CD8+, iNOS, macrófagos, MHC I, MHC II e Linfócitos B, pela técnica de imunohistoquímica. A produção de citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10), pela técnica de PCR em Tempo Real Quantitativo de Transcrição Reversa (RTqPCR) e, a carga parasitária dos baços dos camundongos infectados com o parasita por qPCR. O grupo G3 teve um padrão de resposta humoral do tipo Th1=Th2, enquanto o grupo G1, o padrão de resposta foi do tipo Th1<Th2. O grupo G3 também apresentou maior produção de linfócitos CD8 e de células expressando MHC I, MHC II e iNOS. O grupo G3 se sobressai na produção de mRNA da IL-2, do IFN-γ e do TNF-α, pelas células do baço. A carga parasitária foi... / The causative agent of the disease in Brazil is Leishmania chagasi. It is transmitted by the bite of the sand fly Lutzomyia longipalpis, which acquires the parasite to realize the hematophagism in infected animals. This work aimed to study the immune response of BALB / c mice immunized with the recombinant protein produced from A2-L gene of L. chagasi, isolated sample of a dog the Veterinary Hospital of FCAV-UNESP, Jaboticabal and to evaluate the ability of this recombinant protein to induce immunoprotection in animals after challenge with the parasite. Forty mice were divided into four groups: G1, 10 animals inoculated with L. chagasi promastigotes; G2, 10 animals inoculated with the recombinant protein A2-L; G3, 10 animals immunized with the recombinant protein A2-L and challenged with promastigotes of L. chagasi; G4, 10 animals inoculated with saline (negative control). Characteristics evaluated humoral immune response were antibodies of the IgG class and IgG1 and IgG2a subclasses, the indirect ELISA. As for the cellular immune response, we evaluated the production of CD4+ and CD8+ by flow cytometry technique and evaluated the immunoblots of CD4+, CD8+, iNOS, macrophages, MHC I, MHC II and B lymphocytes, by the technique of immunohistochemistry. The production of cytokines (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4 and IL-10) by RT-PCR in real time and, the parasite load of the spleens of mice infected with the parasite by qPCR. The G3 had a pattern of humoral response Th1 = Th2, while the G1, the pattern was Th1< Th2. The G3 group also showed higher production of CD8 cells and cells expressing MHC I, MHC II and iNOS. The group G3 excels in the production of IL-2, IFN-γ and TNF-α, mRNA the spleen cells. The parasite load was significantly lower in the group G3, less than half of that found in G1. We therefore conclude that the G3 group produced a pattern of humoral and cellular responses, which according to literature suggests be effective ...