Hem identificat dos nous mecanismes de regulació transcripcional; primer, demostrem que les 14-3-3 regulen la via clàssica d'NFkB afavorint l'export citoplasmàtic dels complexes p65/IkB-alfa després de l'activació per TNF-alfa. Aquest mecanisme podria jugar un paper rellevant en l'activació d'NFkB en càncer de mama. En aquest article es demostra com les 14-3-3 regulen la via clàssica d'NFkB afavorint l'export citoplasmàtic dels complexes p65/kBalfa després de l'activació per TNF-alfa.Demostrem que p65 conté dos dominis d'unió a 14-3-3 que inclouen els aminoàcids 38-44 i 278-283, i mapem el lloc d'unió d'IkB-alfa a 14-3-3 en els aminoàcids 60-65. La mutació d'aquests dominis redistribueix p65 i IkB-alfa al nucli de les cèl.lules suggerint que 14-3-3 participa en l'export d'aquestes proteïnes del nucli.El tractament amb TNF-alfa promou el reclutament de 14-3-3 i d' IkB-alfa als promotors de gens diana d'NFkB així com la unió de p65 a les 14-3-3. A l'inhibir l'activitat NFkB amb un dominant negatiu de les 14-3-3, els complexes IkB-alfa /p65 s'acumulen al nucli de les cèl.lules. En aquestes condicions s'observa una associació constitutiva de p65 als seus gens diana que dóna lloc a una falta de resposta d'aquests gens a l'activació induïda per TNF-alfa. Així demostrem que les 14-3-3 són necessàries per la correcte regulació de la via d' NFkB ja que facilita l'export del nucli dels complexes IB/p65.En segon lloc mostrem com la proteïna IkB-alfa, descrita clàssicament com l'inhibidor de la via d' NFkB, juga un paper al nucli associant-se a la cromatina per reprimir la transcripció de gens diana de Notch com hes1 i herp2. Aquest mecanisme suposa un nou element que relaciona les vies de Notch i NFkB.En aquest article es demostra com l'inhibidor de la via d' NFkB, IkB-alfa, juga un paper nuclear associant-se a la cromatina de gens diana de Notch com hes1 i herp2, sent aquest un nou element en els mecanismes d'interrelació entre la via de Notch i la d' NFkB. Proposem que IB participa en la repressió transcripcional reclutant elements corepressors a promotors específics.En l'article es mostra com IkB-alfa interacciona amb elements repressors com corepressors nuclears i HDACs. Per immunoprecipitacions de cromatina es demostra que IkB-alfa es recluta al promotor de hes1 juntament amb HDAC1 i HDAC5. IB s'allibera temporalment del promotor de hes1 quant es tracten les cèl.lules amb TNF-alfa, aquest fet correlaciona amb un increment en l'acetilació de les histones i l'activitat transcripcional del gen. L'alliberament d'I IkB-alfa de hes1 i la seva activació transcripcional coincideix amb el reclutament d'IKK-alfa i d'IKK-beta a aquest promotor. A més a més, tant l'alliberament d' IkB-alfa de hes1 com l'increment d'acetilació de les histones induït per TNF-alfa estan afectats en els fibroblastes deficients per IKK-alfa.Al ser aquestes vies clau en la gènesi i la progressió tumoral, pensem que cal seguir estudiant els mecanismes que regulen les funcions cel.lulars normals per tal de detectar-ne els elements que es troben alterats en diferents tipus de tumor. Això ens permetrà intervenir d'una manera més eficaç al dissenyar teràpies que afecten a les vies de transducció de senyal de Nocth i d'NFkB. específiques per a cada tipus de càncer segons les alteracions identificades.

La expressió en plantes transgèniques representa una alternativa interessant per a la producció de proteïnes d'interès terapèutic. Els baixos costos de producció a gran escala, la capacitat de modificació postraduccional dels vegetals y la seguretat biològica del producte final son alguns del atractius d'aquest emergent sistema de producció.El T-20 es un nou fàrmac antiviral contra el VIH-1 que actua inhibint el procés d'entrada del virus dins la cèl·lula diana impedint que les membranes del virus i cèl·lula es fusionin. Actualment, la producció d'aquest pèptid de 36 aminoàcids es realitza per síntesis química en un procés extraordinàriament complex que condiciona el elevat preu del producte final.En aquest treball s'ha adoptat una estratègia per acumular el T-20 a plantes consistent en la seva expressió mitjançant una fusió amb diferents dominis rics en prolina de gamma-zeïna, proteïna de reserva de 27 kDa del blat de moro. Anteriors estudis han demostrat que aquests dominis tenen la capacitat de quedar retinguts dins el reticle endoplàsmic y induir la formació de cossos proteics en plantes transgèniques de tabac.S'ha utilitzat dos espècies vegetals, tabac i arròs, per tal de testar el nivell d'acumulació del T-20 en fusió en diferents teixits. En plantes de tabac s'ha escollit una expressió constitutiva mitjançant el promotor 35S per acumular a fulla el T-20 fusionat amb quatre seqüències riques en prolina diferents (Rx3, R3, P4 i X10), Els resultats han demostrat que, tant per transformació estable com transitòria, la fusió Rx3-T20, que conté tota la regió N-terminal de la gamma-zeïna, és la que s'acumula millor en fulles de tabac. A demés, en una línia transgènica s'ha comprovat que aquesta proteïna de fusió no només es estable enfront la dessecació de la fulla, sinó que la seva expressió s'activa durant aquest procés degut segurament al lloc d'inserció dins el genoma de la planta. També s'han obtingut línies transgèniques d'arròs per tal d'acumular el T-20 específicament a gra, beneficiant d'aquesta forma l'estabilitat y emmagatzemament del fàrmac. Després de comprovar que el promotor de la gamma-zeïna era actiu però no específic en plantes transgèniques d'arròs, es va optar per la utilització d'un promotor endogen, RP5, per tal d'expressar la proteïna de fusió Rx3-T20 específicament a gra d'arròs. Es van assolir alts nivells d'acumulació específica a gra, comparables amb els generats amb un promotor constitutiu 35S.Tant a tabac com a arròs es van portar a terme experiments de fraccionament subcel·lular mitjançant gradients de sacarosa que van mostrar que les proteïnes de fusió s'acumulaven en una fracció densa on sedimenten els cossos proteics de blat de moro. A demés, mitjançant inmunolocalització al microscopi confocal s'ha pogut visualitzar l'acumulació de la proteïna de fusió Rx3-T20 en fulles de tabac en unes estructures esfèriques compatibles amb cossos proteics. En arròs, la localització sota el microscopi electrònic ens ha demostrar l'acumulació d'aquesta proteïna dins els cossos proteics de tipus I naturals de l'arròs.Amb l'objectiu de demostrar que el sistema l'expressió en plantes permetia obtenir el fàrmac T-20 actiu es va desenvolupar un procés de purificació a partir de fulles de tabac consistent en una precipitació amb sulfat d'amoni, cromatografia de bescanvi aniònic, digestió amb proteasa y purificació per HPLC. Es va demostrar que el producte final corresponia per espectrometria de masses al T-20 y que, mitjançant experiments en cultiu cel·lular, presentava la mateixa activitat antiviral que el T-20 produït per síntesis química. D'aquesta manera es conclou que l'expressió en plantes transgèniques representa un sistema de producció de T-20 alternatiu a la síntesis química. / "PRODUCTION OF A HIV-1 FUSION INHIBITOR IN TOBACCO AND RICE PLANTS": Plants provide convenient systems for the production of valuable recombinant proteins. Compared with the traditional production systems (i.e. microbial fermentation and mammalian cell cultures), plants have advantages in terms of cost, scalability and safety. Plants can be grown on an agricultural scale reducing the production costs of the recombinant protein and have similar post-translational pathways to animal. This make plants an interesting system for the heterologous production of human therapeutic proteins (Fischer, 1998). In this work we present the efficient production of the HIV-1 fusion inhibitor T20 in tobacco and rice transgenic plants.T20, a 36 amino acids peptide homologous to HR2 region of HIV-1 gp41 envelop protein, belongs to a new class of anti-HIV drugs known as fusion inhibitors (Wild et al., 1993). It has been proposed that T20 inhibits HIV-1 cell entry in T-cell lines by blocking conformational changes of gp41 (Chan et al., 1998, Liu et al., 2005) (fig.1). T20 was licensed on May 2003 by the FDA for the treatment of HIV-infected individuals.It is known that endoplasmic reticulum (ER) retention of recombinant proteins improves their accumulation and stability. Our approach to accumulate high levels of T20 in transgenic plants is based on the ability of proline-rich domains of γ-zein to self-assemble conferring stability to fusion proteins in the ER. γ-Zein is a maize storage protein that naturally accumulates in ER-derived protein bodies (PB) in endosperm cells. Previous studies demonstrated the ability of N-terminal γ-zein region to induce formation of PB in a heterologous plant system (Geli et al, 1994). Four chimeric genes were constructed coding for praline-rich-domains fused to the T20 sequence.We were interested to test the production of T20 fused to ZERATM domains in two different plant systems: tobacco and rice. The expression of the recombinant protein in tobacco provides large amounts of non-food biomass, whereas the expression in crop seeds using a specific promoter permits large storage periods.

La infertilitat és una malaltia que afecta a un 15% de les parelles en edat reproductiva. En la meitat dels casos, el problema té un origen masculí. Però, tot i els avenços existents en la fisiologia de la reproducció, encara hi han un 10% de parelles amb una infertilitat d'origen desconegut. Així, aprofitant les noves tecnologies existents tal com la proteòmica (gels 2D, anàlisis per MS/MS, etc.) es va decidir realitzar un estudi de l'espermatozoide humà per tal d'aprofundir en el coneixement de les proteïnes implicades en la fertilització. Primer, es va realitzar un estudi per descriure part del proteoma de l'espermatozoide humà. Es van descriure 98 proteïnes, localitzant-les en un mapa 2D. Un 22% d'aquestes proteïnes es van descriure per primera vegada com a presents en l'espermatozoide humà. D'un 11% no se'n coneix la funció, mentre que un 23% tenen una funció relacionada amb la transcripció, la síntesi proteica o l'intercanvi proteic. Aquesta dada és sorprenent ja que, fins fa poc, es creia que l'únic objectiu de l'espermatozoide era portar el material genètic masculí fins l'oòcit femení. La resta de proteïnes tenen una funció que s'engloba dintre d'aquestes categories: 23% relacionades amb la producció d'energia; 11% relacionades amb el cicle cel·lular, l'apoptosis i l'estrès oxidatiu; 10% relacionades amb el citoesquelet, el flagel i el moviment cel·lular; 9% relacionades amb la transducció de senyal; 7% relacionades amb el reconeixement cel·lular; i, per últim, un 6% té una funció relacionada amb el metabolisme. D'aquestes 98 proteïnes (amb 3 proteïnes noves d'un altre estudi realitzat al laboratori), es va fer un estudi comparant la seva abundància relativa entre pacients astenozoospèrmics i controls (donants de semen). D'aquesta comparació, es van trobar 17 proteïnes amb una abundància relativa diferent entre pacients i donants. Aquestes proteïnes són ACTB, ANXA5, COX6B, H2A, PIP i el seu precursor,i dos punts corresponents a S100A9; totes aquestes es troben disminuïdes en els pacients. La resta de proteïnes son la forma precursora de CLU, DLD, FH, SEMG1, a més d'HSPA2, IMPA1, PSMB3, TEX12 i un punt que conté dos proteïnes: MPST i la forma precursora d'ECH1. Totes aquestes proteïnes es troben augmentades en pacients. La majoria d'aquestes proteïnes es poden agrupar en tres grans grups: proteïnes relacionades amb la producció d'energia (COX6B, DLDpre, FHpre i ECH1pre), amb l'estructura i el moviment (ACTB, PIP i PIPpre, H2A i SEMG1), i senyalització cel·lular i regulació ( ANXA5, S100A9 i IMPA1). A més, es va realitzar un estudi paral·lel estudiant les mateixes 101 proteïnes, però amb pacients normozoospèrmics (sense cap causa aparent d'infertilitat) i donants de semen de fertilitat probada. Donat el caràcter tan exclusiu de les mostres, nomès es van poder comparar sis pacients versus 5 donants. Tot i això, es van trobar dos proteïnes amb diferències a la seva abundància relativa. Aquestes proteïnes són la PDIA3 i la TEX12. Aquestes dades, però, no es poden considerar com a definitives, ja que el valor obtingut per a aquestes mostres de p (p<0.001) ens indica que un de cada 100 resultats pot ser degut a l'atzar. Així, una d'aquestes proteïnes pot ser un fals possitiu.Amb aquests valors quantitatius, es va realitzar una agrupació no dirigida per tal de veure si aquestes proteïnes ens agrupaven les mostres segons el seu fenotip. Per a la comparació "astenozoospèrmics vs donants", l'agrupació va ser possitiva; en una branca de l'arbre resultant, teníem tots els pacients i, a l'altra, tots els donants.Per últim, es va posar a punt la metodologia DIGE en mostres d'espermatozoides humans. Tot i que es necessitaran més dades per a acabar d'ajustar el procediment, els primers resultats són encoratjadors. / Infertility is a disease that affects 15% of couples at reproductive age. In about a half, the problem has a male origin. Conventional 1-DE has in the past provided a wealth of information concerning the major sperm proteins. However, so far there are relatively few reports exploiting the potential of the present proteomic tools to identify and to study additional yet-unidentified important proteins present in human spermatozoa. In this work, 2-DE of proteins from spermatozoa led to the identification of 98 different proteins. The function of these proteins turned out to be energy production (23%), transcription, protein synthesis, transport, folding and turnover (23%), cell cycle, apoptosis and oxidative stress (10%), signal transduction (8%), cytoskeleton, flagella and cell movement (10%), cell recognition (7%), metabolism (6%) and unknown function (11%). As many as 23% of the proteins identified have not been previously described as being expressed in human spermatozoa. Also, asthenozoospermia is one of the most common findings present in infertile males, but its aetiology remains unknown in most cases. Present proteomic tools now offer the opportunity to identify proteins which are differentially expressed in asthenozoospermic semen samples and potentially involved in infertility. In this work, we compared the expression of 101 sperm protein spots in 20 asthenozoospermic samples to that of 10 semen donor controls using two-dimensional proteomic analysis. This results in seventeen protein spots, that have been identified at different amounts in the asthenozoospermic samples compared with controls. These are cytoskeletal actin-B, annexin-A5, cytochrome C oxidase-6B, histone H2A, prolactin-inducible protein and precursor, calcium binding protein-S100A9 (2 spots), clusterin precursor, dihydrolipoamide dehydrogenase precursor, fumarate hydratase precursor, heat shock protein-HSPA2, inositol-1 monophosphatase, 3-mercapto-pyruvate sulfurtransferase/dienoyl-CoA isomerase precursor, proteasome subunit-PSMB3, semenogelin 1 precursor and testis expressed sequence 12. The detected amount of these proteins enabled the grouping of asthenozoospermic sperm samples in an unsupervised clustering analysis. So, in conclusion, we have identified several proteins present at different amount in asthenozoospermic sperm samples. These proteins could be candidates towards the development of diagnostic markers, and open up the opportunity to gain further insight into the pathogenic mechanisms involved in asthenozoospermia.

La metabolòmica ha adquirit recentment un gran interès gràcies al gran ventall d'aplicacions que presenta, que l'han convertit en una eina clau en diferents camps com la diagnosi de malalties, el seguiment de tractaments farmacològics i l'estudi de les interaccions entre diferents sistemes. A més, juntament amb la genòmica i la proteòmica, ha permès l'assignació de nombroses funcions genètiques i enzimàtiques.L'objectiu de la present tesi doctoral és una aplicació de diferents tècniques analítiques com LC-MS/MS, GC-MS, o NMR a l'estudi dels metabòlits de cinc espècies vegetals amb uns objectius concrets en cadascuna. En cada cas s'ha seleccionat la tècnica més adequada segons la naturalesa dels metabòlits a estudiar i el tipus d'objectiu plantejat. Existeix una gran varietat de metabòlits secundaris a les plantes, però aquest treball s'ha centrat, particularment, en l'estudi dels compostos fenòlics i els alcaloides (concretament els alcaloides de les Amaryllidaceae), ja que constitueixen dos tipus de metabòlits d'especial rellevància. D'una banda, tenen una gran importància biològica en les plantes, i de l'altra, gràcies a la seva activitat farmacològica, poden exercir nombrosos efectes beneficiosos que poden ser de gran interès en l'elaboració de fàrmacs o bé en el camp de l'alimentació.Dins la gran varietat d'aplicacions de la metabolòmica, la present tesi ha abordat els següents aspectes:1)Estudi de l'activitat antioxidant del material de rebuig del lavandí (Lavandula x intermedia Emeric ex Loiseleur) després de la destil·lació dels seus olis essencials, i identificació dels compostos fenòlics responsables d'aquesta activitat. Es va avaluar el contingut total en compostos fenòlics, així com l'activitat antioxidant, de diferents fraccions mitjançant diferents mètodes, i es van identificar un total de 23 compostos fenòlics per LC-MS/MS en les mateixes fraccions. D'aquesta manera es pretén proposar aquest material de rebuig com a nova font d'obtenció d'antioxidants naturals que, a més, suposaria el reciclatge d'aquest material.2) Estudi del paper dels compostos fenòlics en la resposta de les plantes davant l'estrès abiòtic i la senescència, mitjançant la identificació i comparació qualitativa i quantitativa d'aquests metabòlits, a través de la tècnica de LC-MS/MS en diferents mostres de plantes de tabac i d'Arabidopsis thaliana.3) Aïllament, identificació i caracterització per tècniques de NMR de flavonoides de Crinum humile, espècie vegetal de la família Amaryllidaceae poc coneguda del Camerun, amb possible activitat farmacològica.4) Identificació, per GC-MS, dels alcaloides de les Amaryllidaceae de Pancratium canariense, espècie poc estudiada en termes de composició química, amb especial atenció a la possible detecció de nous derivats de la galantamina, alcaloide amb activitat anticolinesteràsica, utilitzat en el tractament de la malaltia de l'Alzheimer.El present treball de tesi no pretén, però, ser una anàlisi metabolòmica completa d'un seguit de plantes, sinó una contribució a la metabolòmica, una petita mostra de la gran varietat de possibilitats de la seva aplicació, i una aportació d'una sèrie de resultats que poden ser útils tant en el camp de la recerca de la bioquímica vegetal, com en el camp de la farmacologia i la fitoquímica. / Metabolomics has recently received much interest owing to its wide range of applications, and has become a key strategy in different fields such as disease diagnostics, clinical trial monitorization, toxicity assessment or systems-biology studies. Furthermore, together with genomics and proteomics, metabolomics has led the assignment of several enzyme and gene functions.The present PhD thesis aims to apply different analytic techniques and strategies such as LC-MS/MS, GC-MS or NMR to study the metabolites from five plant species, with specific objectives in each case. Each analytic technique was selected according to the type of metabolites that were object of study and the specific aim proposed. From the great variety of secondary metabolites in plants, this work has particularly studied phenolic compounds and alkaloids (specifically the Amaryllidaceae alkaloids).Among the wide range of metabolomics applications, this thesis has focused on the following objectives:1) Investigation of the phenolic composition of lavandin (Lavandula x intermedia Emeric ex Loiseleur) waste obtained after the distillation of essential oils for the perfume industry to find an alternative use for this material as a new source of natural antioxidants. The antioxidant activity of different fractions as well as their total phenolic content were evaluated by different methods. A total of twenty-three phenolic compounds were identified by LC-MS/MS. 2) Study of phenolic compounds behaviour in plant response to abiotic stress and senescence by identifying and quantifying these metabolites by LC-MS/MS in different samples of tobacco and Arabidopsis thaliana.3) Isolation and identification by NMR of flavonoids from Crinum humile, a plant species of unknown chemical composition.4) Identification by GC-MS of Amaryllidaceae alkaloids from Pancratium canariense, with special attention to the detection of new galantamina derivatives, an alkaloid used in Alzheimer therapy.

El trasplante renal es la mejor opción disponible para el tratamiento de la enfermedad renal crónica avanzada, tanto en términos de supervivencia como de calidad de vida de los pacientes. La escasez de órganos disponibles para el procedimiento es la mayor limitación de este tipo de terapéutica y por tanto prolongar la vida útil de los injertos renales es la principal prioridad en el contexto del trasplante renal. Después del primer año de funcionamiento del trasplante, la disfunción crónica del injerto (DCI) constituye la principal causa de daño y perdida injerto renal. Esta tesis es un análisis de la correlación del estudio del proteoma urinario mediante espectrometría de masas con la severidad y subtipo histológico de la disfunción crónica del injerto. Los sujetos fueron agrupados según el resultado de la biopsia del injerto y el análisis proteómico mediante espectrometría de masas se realizó en una muestra obtenida antes de realizar la biopsia por indicación clínica. Se realizaron dos tipos de estrategias mediante espectrometría de masas: un primer abordaje, utilizando MALDI- TOF, previa extracción del muestra mediante cromatografía de fase reversa mostró diferencias en el perfil proteómico urinario entre sujetos sanos, pacientes trasplantados con buena función del injerto renal y pacientes con disfunción crónica del injerto. Un segundo estudio mediante LC-MS-MS cuantificó estas diferencias y además aportó información acerca de la secuencia de los péptidos diferenciales. Péptidos específicos derivados de uromodulina y bradiquinina son candidatos a biomarcadores de buen funcionamiento del injerto renal, ya que su presencia en la orina puede ser utilizada para discriminar entre pacientes trasplantados con disfunción del injerto renal y pacientes trasplantados con buena función del injerto. Los niveles elevados del ión 642.5 y niveles bajos del ión 638.0 derivado de uromodulina son característicos de la orina proveniente de pacientes con disfunción crónica del injerto y permiten detectar sus subtipos histológicos. Los iones de m/z 645.59 y m/z 642.61 estaban aumentados de forma significativa en pacientes con rechazo crónico activo mediado por anticuerpos respecto a pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular aislada (4.4-2.7 fold change) y pacientes trasplantados con función estable del injerto (5.3-14.6 fold change) permitiendo cuantificar las diferencias entre estos dos subtipos de disfunción crónica del injerto ya demostradas en los análisis cualitativo con MALDI-TOF. Este trabajo es la primera prueba de concepto de la utilidad de la proteomica urinaria para detectar biomarcadores y el futuro diseño de una herramienta diagnóstica no invasiva en la disfunción crónica del injerto y en dos de sus subtipos histológicos: Fibrosis intersticial y atrofia tubular sin evidencias de otras lesiones y el Rechazo crónico activo mediado por anticuerpos. / Despite optimal immunosuppressive therapy, more than 50% of kidney transplants fail because of chronic allograft dysfunction. A noninvasive means to diagnose chronic allograft dysfunction may allow earlier interventions that could improve graft half-life. In this proof-of-concept study, we used mass spectrometry to analyze differences in the urinary polypeptide patterns of patients with chronic allograft dysfunction ( with pure interstitial fibrosis and tubular atrophy and with chronic active antibody-mediated rejection) and control subjects (stable recipients and healthy control subjects). Unsupervised hierarchical clustering showed good segregation of samples in groups corresponding mainly to the four biomedical conditions. Moreover, the composition of the proteome of the pure interstitial fibrosis and tubular atrophy group differed from that of the chronic active antibodymediated rejection group, and an independent validation set confirmed these results. Specific peptides derived from uromodulin and kininogen were found to be significantly more abundant in control than in CAD patients and correctly identified the two groups. These peptides are therefore potential biomarkers that might be used for the diagnosis of CAD. In addition, ions at m/z 645.59 and m/z 642.61 were able to differentiate between patients with different forms of CAD with specificities and sensitivities of 90% in a training set and, significantly, of 70% in an independent validation set of samples. Interestingly low expression of uromodulin at m/z 638.03 coupled with high expression of m/z 642.61 diagnosed CAD in virtually all cases. Multiple reaction monitoring experiments further validated the results, illustrating the power of our label-free quantitative LC-MS approach for obtaining quantitative profiles of urinary polypeptides in a rapid, comprehensive, and precise fashion and for biomarker discovery. In summary, this study establishes a pattern for two histologic lesions associated with distinct graft outcomes and constitutes a first step to designing a specific, noninvasive diagnostic tool for chronic allograft dysfunction.

El càncer d'endometri és la malaltia ginecològica més comuna i representa la quarta neoplàsia més freqüent en la dona en els països desenvolupats. Actualment és possible diagnosticar el 80% dels casos de EEC en estadiatge I FIGO, per tant, poder aplicar cirurgia i presentar un bon pronòstic. L'estadiatge I FIGO inclou tres subtipus: afecta l'endometri (IA), infiltra el miometri <50% (IB) i >50% (IC). El nostre grup es va centrar en la identificació de nous gens implicats en el EEC mitjançant l'estudi dels patrons d'expressió gènica diferencial entre teixit endometrial sa, hiperplàsic i tumoral, així com la cerca de nous gens associats al fenotip carcinomatós endometrial amb potencial valor diagnòstic i/o pronòstic. Es va trobar que els dos gens majorment sobreexpressats eren RUNX1/AML1 i ERM/ETV5 i alhora, es troben sobreexpressats en la fase en la qual el EEC esdevé invasiu. Partint d'aquí, vam plantejar la caracterització del mecanisme d'acció del factor de transcripció ERM/ETV5 en el EEC durant els esdeveniments inicials d'invasió i disseminació. La sobreexpressió d'ERM/ETV5 a la línia cel·lular de càncer d'endometri Hec-1A indueix dispersió cel·lular que correlaciona amb un augment de l'activitat gelatinasa de la MMP2. Tant els experiments de ChiP com amb iRNA o l'ús d'un inhibidor específic de MMP2 mostren un nexe funcional entre la sobreexpressió d'ERM/ETV5 i l'activació de MMP2. En el model animal ortotòpic de EEC es demostra que l'augment de l'activitat de MMP2 associat a la sobreexpressió d'ERM/ETV5 confereix major capacitat invasiva als tumors endometrials i aquests mostren un patró més agressiu i infiltrant. Es va confirmar que ERM/ETV5 tenia un paper en els passos inicials de la disseminació endometrial ja que es van localitzar ERM/ETV5 i MMP-2 en el front d'invasió de mostres de EEC humanes amb infiltració miometrial. Per tant podem proposar que en el EEC, ERM/ETV5 actua a través de l'activitat gelatinolítica de MMP-2 per a donar major capacitat invasiva, associat al punt d'inici de la infiltració miometrial. Tot seguit vam plantejar determinar les alteracions moleculars associades a la sobreexpressió del factor de transcripció ERM/ETV5 durant la infiltració miometrial en el EEC, identificant nous marcadors moleculars o dianes terapèutiques que podrien estar sota el control de l'activitat transcripcional d'ERM/ETV5. L'anàlisi comparatiu mitjançant 2D-DIGE i espectrometria de masses dels patrons d'expressió proteica diferencial de la línia cel·lular que sobreexpressa de forma estable GFP-ERM/ETV5 anvers la línia cel·lular sense transfectar i la que presenta el vector GFP buit, determina un llistat de proteïnes diferencialment expressades que es troben implicades en la regulació d'actina i la senyalització per TGF-beta i progesterona. Vam caracteritzar la sobreexpressió específica de la proteïna Hep27 que presenta localització mitocondrial depenent d'ERM/ETV5. Estudis funcionals van demostrar associació amb l'estrès oxidatiu. L'anàlisi dels resultats obtinguts reforcen el paper d'ERM/ETV5 com a factor regulador de la migració i invasió tumoral, i assenyala la seva implicació en la resposta a l'estrès oxidatiu associat a l'inici de la invasió en el carcinoma endometrial. Fins ara, la immunohistoquímica ha estat l'eina utilitzada per a la identificació de proteïnes implicades en la invasió del carcinoma endometrial, sense tenir en compte la percepció global del front d'invasió. En aquest últim treball hem dut a terme una aproximació proteòmica per a caracteritzar components específics del front d'invasió o l'estroma reactiu mitjançant la comparació de l'àrea invasiva d'un carcinoma endometrial anvers l'àrea tumoral superficial no invasiva i el teixit normal provinents de la mateixa pacient. Així hem pogut identificar proteïnes diferencialment expressades en el front d'invasió i que es troben implicades en la morfologia cel·lular, acoblament i moviment, així com els mecanismes moleculars relacionats amb la senyalització i interacció cèl·lula-cèl·lula i la resposta moduladora a l'estrès oxidatiu. / We have recently described the Ets family transcription factor, ERM/ETV5, specifically up-regulated in EEC, and associated with myometrial infiltration. Ets family members have been correlated to tumor progression by up-regulating the expression of matrix-degrading proteases. We investigated the possibility that in EEC, ERM/ETV5 may induce the expression of genes involved in extra-cellular matrix remodeling. The overexpression of ERM/ETV5 induced scattering in the EEC cell line Hec-1A, correlating to increased MMP-2 gelatinase activity. Both ChIP and iRNA experiments and specific MMP-2 inhibitor demonstrated a functional link between ERM/ETV5 overexpression and MMP-2 activation. Orthotopically implanted overexpressing ERM/ETV5 tumors presented a more aggressive and infiltrative pattern of myometrial invasion. The specific localization of ERM/ETV5 and MMP-2 at the invasive front of myometrial infiltrating human EEC reinforced the hypothesis of a role for ERM/ETV5 in the early steps of endometrial dissemination.To understand the role of ETV5 during myometrial infiltration, we analysed by 2D-DIGE technology those proteins whose expression was altered in endometrial cell lines stably over-expressing ERM/ETV5. Pathway analysis pointed to actin regulation and TGF-beta and progesterone signalling as processes regulated by ERM/ETV5. We characterized the specific up-regulation of the nuclear dehydrogenase/reductase Hep27, its ERM/ETV5-dependent mitochondrial localization, and functional studies demonstrated a link with oxidative stress.Overall, the ETV5-related proteomic approach performed in the Hec-1A cell line reinforces a role of this transcription factor in the regulation of the migratory and invasive tumour behaviour, and points to a modulated response to oxidative stress associated with the promotion of invasion in endometrial cancer. To date, the identification of proteins involved in endometrial carcinoma invasion has been essentially conducted by immunohistochemical methods, without a global perception on the invasive front. In this work we attempted a proteomic approach to characterise specific components of the invasive front or reactive stroma by comparing the invasive area of an endometrial carcinoma with the non¬invasive superficial area and normal tissue from the same patients. This led us to identify proteins involved in cellular morphology, assembly and movement, differentially expressed at the invasive front, as well as pathways like cell-to-cell signalling and interaction and a modulated response to oxidative stress as events related to endometrial carcinoma invasion. In conclusion, we describe a novel proteomic approach that specifically deals with endometrial carcinoma invasion front, allowing the identification of new players of myometrial infiltration.

La lipoproteïna lipasa (LPL) és un enzim amb un paper central en el metabolisme lipídic que, sotmès a una regulació específica de teixit, modula la distribució dels triacilglicerols circulants entre els diferents teixits de l'organisme. En el nostre grup s'han estudiat els canvis d'activitat LPL associats a una situació d'estrès. En aquest treball descrivim inicialment que l'estrès agut per immobilització en rata provoca un ràpid descens (5 minuts) de l'activitat LPL del teixit adipós blanc retroperitoneal concomitant amb un augment de l'activitat LPL a plasma. Aquesta resposta suggereix que l'alliberament de l'enzim a la sang podria constituir un mecanisme de regulació de l'activitat LPL a teixits, no descrit anteriorment. A més a més, l'augment paral·lel dels nivells de nitrat a plasma durant la immobilització i resultats previs del nostre grup suggereixen que l'òxid nítric podria participar en aquest procés d'alliberament.En aquest context, vàrem recórrer a l'ús d'eines proteòmiques amb l'objectiu d'estudiar una possible modificació post-traduccional de l'LPL produïda per l'òxid nítric o per espècies reactives del nitrogen. L'aplicació d'aquestes eines ens ha portat a demostrar: (i) la inespecificitat de l'anticòs P66, un anticòs policlonal anti-LPL emprat en estudis anteriors, (ii) l'existència d'isoformes de punt isoelèctric (pI) de l'LPL de rata i (iii) la nitració in vivo en tres residus de tirosina de l'LPL de rata en resposta a l'administració de lipopolisacàrid, que podria constituir un nou mecanisme de regulació de l'activitat LPL tissular.El descobriment de l'existència d'isoformes de pI de l'LPL, obre les portes a estudis més exhaustius dirigits a la identificació de les diferències moleculars entre les isoformes i a explorar les seves possibles implicacions funcionals. / Lipoprotein lipase (LPL) is an enzyme that plays a key role in lipid metabolism. LPL is under tissue-specific regulation and modulates the distribution of circulating triacylglycerols between the tissues of the organism. Our research group has studied the changes in LPL activity associated with stress. The present work reports that acute stress by immobilization induces a fast (5 minutes) down-regulation of retroperitoneal white adipose tissue LPL activity and a simultaneous increase in plasma LPL activity. This response suggests that the release of this enzyme from the endothelium to the bloodstream may constitute a fast mechanism of tissue LPL activity regulation that has not previously been studied.In this context, we used proteomic tools to study a potential post-translational modification in LPL induced by nitric oxide or by reactive nitrogen species. The use of such tools has allowed us to demonstrate: (i) the non-specificity of P66 antibody, a polyclonal antibody used in previous studies; (ii) the existence of isoelectric point (pI) isoforms of rat LPL; and (iii) the in vivo nitration of three tyrosine residues in rat LPL in response to lipopolysaccharide administration, which could be a new mechanism of tissue LPL activity regulation.The discovery of LPL pI isoforms opens the door to further studies aimed at identifying the molecular differences between the isoforms and at exploring their potential functional implications.

No description available.

La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC. / Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration. Recessive MLC1 mutations are observed in 75% of patients with MLC. Genetic-linkage studies failed to identify another gene. We have showed that some patients without MLC1 mutations display the classical phenotype; others improve or become normal but retain macrocephaly. To find another MLC-related gene, we used quantitative proteomic analysis of affinity-purified MLC1 as an alternative approach and found that GlialCAM, an IgG-like cell adhesion molecule, is a direct MLC1-binding partner. Analysis of 40 MLC patients without MLC1 mutations revealed multiple different GLIALCAM mutations. Patients with the classical phenotype had two mutations, and patients with the improving phenotype had one mutation. In addition, patients with dominant GLIALCAM mutations, could also had macrocephaly and mental retardation with or without autism. Therefore, we found that GLIALCAM is the second gene found to be mutated in MLC. Furthermore, we demonstrated that GlialCAM functions as an MLC1 beta-subunit, needed for proper localization of MLC1 in cell-cell junctions. We also demonstrated that MLC1 and GlialCAM form homo- and hetero-complexes and that MLC-causing mutations in GLIALCAM mainly reduce the formation of GlialCAM homo-complexes, leading to a defect in the trafficking of GlialCAM alone to cell junctions. GLIALCAM mutations also affect the trafficking of its associated molecule MLC1, explaining why GLIALCAM and MLC1 mutations lead to the same disease: MLC. In this thesis, we also identify GlialCAM as a chloride channel ClC-2 binding partner. GlialCAM and ClC-2 colocalize in Bergmann glia, in astrocyteastrocyte junctions at astrocytic end-feet around blood vessels, and in myelinated fiber tracts. GlialCAM targets ClC-2 to cell junctions, increases ClC- 2 mediated currents, and changes its functional properties. Disease-causing GLIALCAM mutations abolish the targeting of the channel to cell junctions. Hence, we describes the first auxiliary subunit of ClC-2 and suggests that ClC-2 may play a role in the pathology of MLC disease.

Adolescence is a critical developmental period in which the brain emerges from an immature state to adulthood. This process of brain development is associated to greater cognitive capacity but also to altered emotional behaviour, such as anxiety and depressive symptoms; as well as increased sensation-seeking and risk taking behaviour. The proper development of brain and behaviour into adulthood can be negatively affected by external factors such as drug abuse and environmental conditions. This work consists firstly on, studying the impact of binge ethanol, 3, 4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) and its combination in adolescent mice. Secondly, study the consequences of early-life stressful experiences (social isolation) into adulthood. Main results obtained from the first objective are that the combination of binge ethanol and MDMA induces emotional-like alterations. These alterations can be prevented by antidepressant treatment. In addition, MDMA induces memory impairments that may be associated to oxidative damage to specific proteins in the hippocampus. Neuroinflammation is also present after MDMA treatment, but not after binge ethanol treatment, in mice striatum. Metabolomic studies indicate that brain metabolism is altered after binge ethanol, MDMA or its combination. Even though these are only preliminary results, these alterations might be due to an imbalance in tryptophan metabolism. Regarding the second objective, our findings indicate that social isolation during adolescence induces an altered response to novel and stressful situations. These alterations are probably due to altered HPA axis activity. / L'adolescència és un període crític en el desenvolupament de l’individu en el qual el cervell va d’un estat immadur a l’edat adulta. Aquest procés va acompanyat d’una elevada capacitat cognitiva però també de freqüents alteracions de tipus emocional, com l’ansietat o els símptomes depressius, així com la cerca de sensacions de risc. Un bon desenvolupament del cervell i del comportament es pot veure negativament afectat per factors externs com són l’abús de drogues i les condicions ambientals desfavorables. Aquest projecte consisteix en primer lloc, a estudiar l'impacte de l’alcohol en excés, la 3, 4-Metilendioximetamfetamina (MDMA) i la seva combinació en ratolins adolescents. En segon lloc, estudiar les conseqüències en l’edat adulta d’experiències estressants durant l’adolescència. Els principals resultats obtinguts referents al primer objectiu són que la combinació d'alcohol en excés i MDMA provoca alteracions de tipus emocional. Aquestes alteracions poden ser previngudes pel tractament amb antidepressius. A més, la MDMA indueix un deteriorament de la memòria que pot estar associada amb el dany oxidatiu a proteïnes específiques de l'hipocamp. També s’ha observat una resposta neuroinflamatòria en el cos estriat dels ratolins després del tractament amb MDMA, però no després del tractament amb etanol en excés. Finalment, estudis de metabolòmica indiquen que el metabolisme cerebral es veu alterat després de l’alcohol en excés, la MDMA o la seva combinació. Tot i que només són resultats preliminars, aquestes alteracions poden ser conseqüència d'un desequilibri en el metabolisme del triptòfan. Referent al segon objectiu, els nostres resultats indiquen que l'aïllament social durant l’adolescència indueix una resposta alterada a situacions novelles i estressants. Aquestes respostes anormals són probablement conseqüència d’alteracions en l’activitat de l’eix HPA.