L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique. / γ-aminobutyric acid (GABA) is the principal inhibitory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in diverse pathologies such as epilepsy, anxiety, depression and drug addiction. GABAergic modulation of neuronal activity involves two different subsets of receptors: the GABAA receptor chlorine channel and the heterodimer of G protein coupled receptors (GPCR) GABAB. Each of these receptors is responsible for mediating distinct parts of the GABA-induced signaling. Upon stimulation, it is vital for the cell to control the signaling input and prevent overstimulation, using mechanisms such as functional desensitization and down-regulation to achieve this. The processes controlling GABAB receptor activity are atypical for a GPCR and have yet to be fully characterized. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms controlling GABAB activity by discovering novel proteins interactions mediating receptor desensitization, internalization and ubiquitination. In the first study, we identified the N-ethylmaleimide sensitive factor (NSF) as a GABAB interacting protein and characterized its interaction site as the coiled-coil structure on both GABAB sub-units. We also showed that this interaction is sensitive to the ATPase state of NSF and that agonist treatment of GABAB led to dissociation of NSF from the receptor in a protein kinase C (PKC) dependent manner. Interestingly, GABA-induced PKC activation was dependent on the NSF-GABAB interaction, suggesting a feedback mechanism for PKC. Both PKC and NSF were involved in mediating receptor desensitization, suggesting a novel role of NSF in receptor signaling regulation. In the proposed model, NSF interacts with GABAB at the basal state, and upon agonist stimulation, PKC is activated and can phosphorylate the receptor, promoting NSF dissociation and GABAB desensitization. We then studied constitutive GABAB ubiquitination and degradation and its regulation by PKC and the deubiquitinating enzyme USP14 (Ubiquitin-specific protease 14). GABAB shows a high constitutive ubiquitination and internalization level. Activation of PKC promotes both phenomena and accelerates the rate of lysosomal receptor degradation. In contrast, USP14 promotes post-endocytic deubiquitination of the receptor, but also accelerates receptor degradation in a catalytically-independent manner. Our results suggest a mechanism where PKC-induced cell surface ubiquitination promotes GABAB endocytosis and USP14 interaction promotes endosomal sorting toward lysosomal degradation. In the third study, we identified the growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) as a protein interacting with the PEST (proline, glutamate, serine, threonine rich) sequence of GABAB1 through a SH3-domain interaction and forming a ternary complex with the functional GABAB heterodimer. We showed that Grb2 can regulate cell surface density of GABAB by decreasing constitutive endocytosis, suggesting that this interaction can compete for binding of the PEST sequence with proteins such as the GABAA γ2S sub-unit or the COPI complex (1, 2), promoting higher cell surface stability. In proposing novel molecular mechanisms controlling GABAB signaling and cell surface expression through NSF, PKC, USP14 and Grb2, this thesis highlights the complex regulation of GABAB activity by its functional desensitization, ubiquitination, endocytosis and degradation.

Les rétinopathies ischémiques (RI) sont la cause majeure de cécité chez les personnes âgées de moins de 65 ans. Il existe deux types de RIs soit la rétinopathie du prématuré (ROP) ainsi que la rétinopathie diabétique (RD). Les RIs sont décrites en deux phases soit la phase de vasooblitération, marquée par une perte importante de vaisseaux sanguins, et une phase de néovascularisation secondaire à lʼischémie menant à une croissance pathologique de vaisseaux. Cette seconde phase peut générer des complications cliniques telles quʼun oedème dans lʼhumeur vitré ainsi que le détachement de la rétine chez les patients déjà atteints dʼune RI. Les traitements approuvés pour les RIs visent à réduire la formation des vaisseaux pathologiques ou lʼoedème; mais ceux-ci malheureusement ne règlent pas les problèmes sous-jacents tels que la perte vasculaire et lʼischémie. La rétine est un tissu hautement vascularisé qui contribue à lʼirrigation et à lʼhoméostasie des neurones. Lʼinteraction neurovasculaire, comprenant de neurones, vaisseaux et cellules gliales, contribue au maintien de cette homéostasie. Durant le développement, les neurones et les cellules gliales jouent un rôle important dans la vascularisation de la rétine en sécrétant des facteurs qui stimulent l'angiogenèse. Cependant, nos connaissances sur lʼinteraction neurovasculaire dans les RIs sont limitées. En identifiant les interactions importantes entre les cellules composant cette unité neurovasculaire dans la rétine, nous pourrons viser des cibles qui engendreront une revascularisation seine afin de diminuer les signes pathologiques chez les patients atteints dʼune RI. Les travaux présentés dans cette thèse visent à mieux expliquer cette interaction neurovasculaire en soulignant des concepts importants propres aux RIs. En utilisant un modèle de rétinopathie induite par lʼoxygène chez la souris, qui reproduit les caractéristiques importantes de la ROP (et en certaines instances, la RD), nous identifions quelques molécules clés jouant un rôle significatif dans les RIs soit la sémaphorine 3A (sema3A), lʼIL-1β, ainsi que le récepteur PAR2. Nos résultats démontrent que Sema3A, sécrétée par les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) durant une ischémie, empêche la revascularisation normale et que cette expression est induite par lʼIL-1β provenant des microglies activées. En bloquant Sema3A directement ou via lʼinhibition de lʼIL- 1β, nous remarquons une revascularisation seine ainsi quʼune diminution importante des vaisseaux pathologiques. Cela nous indique que Sema3A est impliquée dans la guidance vasculaire et quʼelle contribue à la pathogenèse des RIs. Lʼactivation de façon exogène de PAR2, identifié aussi comme régulateur du récepteur de lʼIL-1β (IL- 1RI) sur les CGRs, se traduit par une diminution séquentielle de lʼIL-1RI et de Sema3A ce qui mène également à une revascularisation seine. En conclusion, ces travaux soulignent lʼimportance de lʼinteraction neurovasculaire ainsi que la guidance vasculaire dans les RIs. Ils renforcent lʼimportance de la communication entre neurone, vaisseau et microglie dans la pathogenèse des RIs. Finalement, nous identifions quelques molécules clés qui pourront servir comme cibles afin de lutter contre lʼischémie qui cause des problèmes vasculaires chez les patients atteints dʼune RI. / Ischemic retinopathies (IRs), namely, retinopathy of prematurity (ROP) and diabetic retinopathy (DR), are the major cause of blindness in persons under the age of 65. IRs are biphasic disorders described by an initial vasoobliterative phase marked by a persistent microvascular degeneration, which leads to ischemia. Retinal ischemia, secondary to vessel loss, incites a second neovascularization phase represented by an aberrant, misdirected neovessel formation into the vitreous, which can cause adverse clinical complications including vitreous hemorrhaging and tractional retinal detachment. While current treatments aim at reducing vitreous/retinal hemorrhaging and/or pathological pre-retinal neovascularization, these regimens fail to address the underlying problem; that is, microvascular decay and retinal ischemia. The retina is a highly metabolic tissue that requires a significant amount of nutrients and oxygen. This is supplied by an intricate and highly regulated vascular network required to maintain homeostasis and proper function. The intricate cellular interactions in the neurovascular unit – the consortium of vessel, neurons and support glia – are required for regulating and maintaining homeostasis under normal conditions. However, the understanding of how this unit functions under ischemic stress, that which is seen in patients suffering from IRs, is not well defined. The present work underlines several important concepts of neurovascular coupling in IRs in efforts to identify potential therapeutic agents that may help curb retinal ischemia by stimulating normal revascularization. Using a mouse model of oxygen-induced retinopathy (OIR), which reproduces the salient features of ROP (and in some instances DR), we identified key players involved in generating the pathophysiological signatures associated with IRs; namely, semaphorin3A (Sema3A), interleukin-1β (IL-1β) and protease-activated receptor 2 (PAR2). Our results show that neuronal-derived Sema3A, secreted by ischemic retinal ganglion cells (RGCs), acts as a potent vaso-repulsive molecules that impedes normal revascularization. Activated microglia contribute to this process by secreting IL-1β, which induces paracrine release of Sema3A expression contributing to microvascular decay as well as pathological pre-retinal neovascularization. Inhibition of Sema3A or IL-1β translates to rapid revascularization and, as a result, a significant reduction in pathological neovessel formation. These results demonstrate that Sema3A is directly involved in vascular guidance and precipitates the pathophysiological features associated with IRs. PAR2, found on RGCs, was also identified as a key regulatory mechanism involved in dampening IL-1β induced Sema3A mediated vascular decay by reducing IL-1 receptor (IL-1RI). Exogenous activation of neuronal PAR2 translates to a sequential reduction of both IL-1RI and Sema3A resulting in accelerated revascularization and consequentially pre-retinal neovascularization. In conclusion, these studies highlight the importance of neurovascular coupling associated with IRs. Herein, we demonstrate the consorted interaction between neuron, vessel and glia and its impact on shaping the retinal vasculature during disease. Moreover, we underscore the significant impact of neuronal guidance cues in manifesting the salient vascular features of IRs. Finally, we identify key players that may serve as potential therapeutic avenues in curbing retinal ischemia in efforts to reduce vascular complications associated with IRs.

Actuellement le polyéthylènimine (PEI) est l’agent de transfection transitoire le plus utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la production de protéines recombinantes à grande échelle par les cellules de mammifères. Il permet la condensation de l’ADN plasmidique (ADNp) en formant spontanément des nanoparticules positives appelées polyplexes, lui procurant la possibilité de s’attacher sur la membrane cellulaire afin d’être internalisé, ainsi qu’une protection face aux nucléases intracellulaires. Cependant, alors que les polyplexes s’attachent sur la quasi-totalité des cellules seulement 5 à 10 % de l’ADNp internalisé atteint leur noyau, ce qui indique que la majorité des polyplexes ne participent pas à l’expression du transgène. Ceci contraste avec l’efficacité des vecteurs viraux où une seule particule virale par cellule peut être suffisante. Les virus ont évolués afin d’exploiter les voies d’internalisation et de routage cellulaire pour exprimer efficacement leur matériel génétique. Nous avons donc supposé que l’exploitation des voies d’internalisation et de routage cellulaire d’un récepteur pourrait, de façon similaire à plusieurs virus, permettre d’optimiser le processus de transfection en réduisant les quantités d’ADNp et d’agent de transfection nécessaires. Une alternative au PEI pour transfecter les cellules de mammifèreest l’utilisation de protéines possédant un domaine de liaison à l’ADNp. Toutefois, leur utilisation reste marginale à cause de la grande quantité requise pour atteindre l’expression du transgène. Dans cette étude, nous avons utilisé le système E/Kcoil afin de cibler un récepteur membranaire dans le but de délivrer l’ADNp dans des cellules de mammifères. Le Ecoil et le Kcoil sont des heptapeptides répétés qui peuvent interagir ensemble avec une grande affinité et spécificité afin de former des structures coiled-coil. Nous avons fusionné le Ecoil avec des protéines capables d’interagir avec l’ADNp et le Kcoil avec un récepteur membranaire que nous avons surexprimé dans les cellules HEK293 de manière stable. Nous avons découvert que la réduction de la sulfatation de la surface cellulaire permettait l’attachement ciblé sur les cellules par l’intermédiaire du système E/Kcoil. Nous démontrons dans cette étude comment utiliser le système E/Kcoil et une protéine interagissant avec l’ADNp pour délivrer un transgène de manière ciblée. Cette nouvelle méthode de transfection permet de réduire les quantités de protéines nécessaires pour l’expression du transgène. / Pharmaceutical industry often employs polyethylenimine (PEI) for large scale protein production processes by transient transfection of mammalian cells. PEI condenses plasmid DNA (pDNA) by spontaneously forming positive nanoparticles known as polyplexes. Condensed pDNA is favoured for cell surface binding, internalization and protection from intracellular nucleases. While most of the cells efficiently uptake polyplexes, only 5 to 10% of captured pDNA reaches the nucleus for transgene expression. This suggests that polyplexes are hampered in their ability to route and to translocate to the nucleus necessitating large amounts of polyplexes to achieve high expression levels. By contrast, many viruses can efficiently transduce cells with only one or a few viral genome copies. Viruses have evolved to exploit cellular internalization and routing properties to express their own genetic material. We hypothesized that less pDNA would be used in an optimized transfection process if we exploited the internalization and routing properties that viruses use. DNA binding proteins could be used as an alternative to PEI to transfect mammalian cells. However, their usage is marginal due to the large protein quantities required to bind pDNA for transgene expression. If less pDNA is used less binding protein is needed. In this study, we used the E/Kcoil system to target a membrane receptor to deliver pDNA in mammalian cells. The Ecoil and Kcoil are two repeated heptapeptides which interact with a high affinity and specificity to form coiled-coil structures. We fused the Ecoil with a recombinant pDNA-binding protein. The Kcoil was fused to a stably-expressed membrane receptor in HEK293 cells. We discovered that low sulfation of the cell surface reduced non-specific binding of the pDNA:protein complex and permitted targeted binding via the E/Kcoil interaction. We demonstrate how to use recombinant pDNA-binding protein and the E/Kcoil system for targeted transgene delivery. This newly developed system provides a new transfection method, with reduced pDNA-binding protein quantities needed to achieve transgene expression.

Le transport multicast est une solution efficace pour envoyer le même contenu à plusieurs récepteurs en même temps. Ce mode est principalement utilisé pour fournir des flux multimédia en temps réel. Cependant, le multicast classique de l’IEEE 802.11 n'utilise aucun mécanisme d’acquittement. Ainsi, l’échec de réception implique la perte définitive du paquet. Cela limite la fiabilité du transport multicast et impact la qualité des applications vidéo. Pour résoudre ce problème, 802.11v et 802.11aa sont définis récemment. Le premier amendement propose Direct Multicast Service (DMS). D'autre part, le 802.11aa introduit GroupCast with Retries (GCR). GCR définit deux nouvelles politiques de retransmission : Block Ack (BACK) et Unsolicited Retry (UR).Dans cette thèse, nous évaluons et comparons les performances de 802.11v/aa. Nos résultats montrent que tous les nouveaux protocoles multicast génèrent un overhead de transmission important. En outre, DMS a une scalabilité très limitée, et GCR-BACK n'est pas approprié pour des grands groupes multicast. D’autre part, nous montrons que DMS et GCR-BACK génèrent des latences de transmission importantes lorsque le nombre de récepteurs augmente. Par ailleurs, nous étudions les facteurs de pertes dans les réseaux sans fil. Nous montrons que l'indisponibilité du récepteur peut être la cause principale des pertes importantes et de leur nature en rafales. En particulier, nos résultats montrent que la surcharge du processeur peut provoquer un taux de perte de 100%, et que le pourcentage de livraison peut être limité à 35% lorsque la carte 802.11 est en mode d’économie d'énergie.Pour éviter les collisions et améliorer la fiabilité du transport multicast, nous définissons le mécanisme Busy Symbol (BS). Nos résultats montrent que BS évite les collisions et assure un taux de succès de transmission très important. Afin d'améliorer davantage la fiabilité du trafic multicast, nous définissons un nouveau protocole multicast, appelé Block Negative Acknowledgement (BNAK). Ce protocole opère comme suit. L’AP envoi un bloc de paquets suivi par un Block NAK Request (BNR). Le BNR permet aux membres de détecter les données manquantes et d’envoyer une demande de retransmission, c.à.d. un Block NAK Response (BNAK). Un BNAK est transmis en utilisant la procédure classique d’accès au canal afin d'éviter toute collision avec d'autres paquets. En plus, cette demande est acquittée. Sous l'hypothèse que 1) le récepteur est situé dans la zone de couverture du débit de transmission utilisé, 2) les collisions sont évitées et 3) le terminal a la bonne configuration, très peu de demandes de retransmission sont envoyées, et la bande passante est préservée. Nos résultats montrent que BNAK a une très grande scalabilité et génère des délais très limités. En outre, nous définissons un algorithme d'adaptation de débit pour BNAK. Nous montrons que le bon débit de transmission est sélectionné moyennant un overhead très réduit de moins de 1%. En plus, la conception de notre protocole supporte la diffusion scalable de lavvidéo. Cette caractéristique vise à résoudre la problématique de la fluctuation de la bande passante, et à prendre en considération l'hétérogénéité des récepteurs dans un réseau sans fil. / The multicast transport is an efficient solution to deliver the same content to many receivers at the same time. This mode is mainly used to deliver real-time video streams. However, the conventional multicast transmissions of IEEE 802.11 do not use any feedback policy. Therefore missing packets are definitely lost. This limits the reliability of the multicast transport and impacts the quality of the video applications. To resolve this issue, the IEEE 802.11v/aa amendments have been defined recently. The former proposes the Direct Multicast Service (DMS). On the other hand, 802.11aa introduces Groupcast with Retries (GCR) service. GCR defines two retry policies: Block Ack (BACK) and Unsolicited Retry (UR).In this thesis we evaluate and compare the performance of 802.11v/aa. Our simulation results show that all the defined policies incur an important overhead. Besides, DMS has a very limited scalability, and GCR-BACK is not appropriate for large multicast groups. We show that both DMS and GCR-BACK incur important transmission latencies when the number of the multicast receivers increases. Furthermore, we investigate the loss factors in wireless networks. We show that the device unavailability may be the principal cause of the important packet losses and their bursty nature. Particularly, our results show that the CPU overload may incur a loss rate of 100%, and that the delivery ratio may be limited to 35% when the device is in the power save mode.To avoid the collisions and to enhance the reliability of the multicast transmissions, we define the Busy Symbol (BS) mechanism. Our results show that BS prevents all the collisions and ensures a very high delivery ratio for the multicast packets. To further enhance the reliability of this traffic, we define the Block Negative Acknowledgement (BNAK) retry policy. Using our protocol, the AP transmits a block of multicast packets followed by a Block NAK Request (BNR). Upon reception of a BNR, a multicast member generates a Block NAK Response (BNAK) only if it missed some packets. A BNAK is transmitted after channel contention in order to avoid any eventual collision with other feedbacks, and is acknowledged. Under the assumption that 1) the receiver is located within the coverage area of the used data rate, 2) the collisions are avoided and 3) the terminal has the required configuration, few feedbacks are generated and the bandwidth is saved. Our results show that BNAK has a very high scalability and incurs very low delays. Furthermore, we define a rate adaptation scheme for BNAK. We show that the appropriate rate is selected on the expense of a very limited overhead of less than 1%. Besides, the conception of our protocol is defined to support the scalable video streaming. This capability intends to resolve the bandwidth fluctuation issue and to consider the device heterogeneity of the group members.

Les systèmes radio impulsionnelle Ultra large bande (IR-ULB), de part la nature de leurs signaux et de leurs architectures, montrent des caractéristiques intéressantes pour concurrencer les technologies existantes (Zigbee, Bluetooth et RFID) pour certaines applications nécessitant un faible coût et une faible consommation de puissance. Dans ce contexte cette thèse évalue les potentialités des systèmes IR-ULB pour la réalisation d’objets communicants miniatures.En utilisant une technologie "System In Package" (SiP), des objets communicants ULB prototype intégrant une ou plusieurs puces CMOS et une antenne ULB directement réalisée sur le boîtier sont présentés dans la thèse. Les transitions entre le circuit imprimé et les puces sont réalisées avec des fils d'interconnexion ("wirebonding"). Les points d'étude de la thèse se focalisent particulièrement sur la mise en boîtier d'une puce ULB et sur la conception sur silicium de la tête radio fréquence d'un système ULB. La réalisation d'une interconnexion faible cout par "wirebonding" entre un circuit intégré ULB et son support est problématique aux fréquences utilisées en ULB (3-10 GHz) en raison des éléments parasites importants limitant sa bande passante. Pour obtenir une transition ne dégradant pas les signaux ULB, plusieurs méthodologies d’interfaçage sont proposées permettant de réaliser sans augmentation notable de cout une transition large bande entre le circuit intégré et le circuit imprimé du boîtier. L'intégration en technologie CMOS standard des éléments principaux constituant la tête radio fréquence d'un système ULB impulsionnel (LNA, détecteur d'impulsions et générateurs d'impulsions) est étudiée. L'intérêt d'un co-design entre le silicium et le circuit imprimé lors de la conception de ces éléments est mis en avant. L'intégration ainsi que la miniaturisation du système final dans une technologie SIP sont également présentées. / Due to the nature of their signals and their architectures, Impulse Radio Ultra Wide Band (IR-UWB) systems show interesting features to compete with existing technologies (Zigbee, Bluetooth and RFID UHF) for low cost and low power applications. In this context, this thesis evaluates the potential of UWB systems for the realization of miniature communication devices.The thesis presents UWB communicating devices realized with a System in Package (SiP) technology. Devices incorporate one or several CMOS chips and an antenna directly printed on the board (PCB). Transitions between the PCB and the chips are made with standard wire bonds. The thesis especially focuses on packaging of UWB dice and on the design of UWB front end radio frequency.Due to important parasitic elements limiting its bandwidth, wire bonds transition is problematic for UWB applications (3-10 GHz). This thesis proposes several methodologies to interface integrated circuit and PCB to obtain a broadband transition without increasing cost production. The integration in standard CMOS technology of main components comprising the UWB radio frequency front end (LNA, pulse detector and pulse generator) is studied. The interest of a co-design between silicon and PCB to design these elements is pointed up. Integration and miniaturization of the final system in a SIP technology are also presented.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie auto-immune caractérisée par une fibrose cutanée et viscérale ainsi que par des anomalies microcirculatoires. Son origine multifactorielle et ses manifestations cliniques variées en font une maladie à la physiopathologie complexe. Cette maladie rare demeure une affection dont l’étiologie est encore inconnue et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Notre laboratoire a mis en évidence le rôle des formes réactives de l’oxygène en mettant au point un modèle animal induit par l’acide hypochloreux. Ce modèle nous a permis d’explorer différentes voies de signalisation intracellulaire, impliquées dans la formation de FRO, favorisant la fibrose. Dans ce travail, nous avons choisi d’explorer dans la sclérodermie systémique différentes voies de signalisation impliquées dans l’inflammation à l’aide d’un modèle de réaction du greffon contre l’hôte sclérodermiforme (GVH-Scl) et d’un modèle de sclérodermie induit par les formes réactives de l’oxygène. De plus, nous avons étudié l’impact de molécules ciblant ces voies afin de fournir de nouvelles données permettent d’enrichir l’arsenal thérapeutique de cette maladie, actuellement pauvre. Les souris obtenues à partir du premier modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire, une alopécie, une diarrhée et une inflammation hépatique. Une quantité importante d’auto-anticorps ainsi qu’une activation du système immunitaire sont retrouvées. Nous avons observés une activation de la voie de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, d’ERK1/2 et de Notch dans la GVH-Scl. L’inhibition de la voie de l’EGFR par l’erlotinib a montré une amélioration clinique associée à une réduction de la fibrose cutanée et de l’inflammation cutanée et hépatique. De plus, l’erlotinib agit sur le système immunitaire et restaure la proportion de LT CD4+ naïfs chez les souris malades ainsi que le taux d’auto-anticorps anti-topoisomérase 1. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine, AKT, ERK1/2 et Notch par le niclosamide améliore les symptômes de la GVH-Scl chez la souris. Nous avons noté une diminution de la fibrose cutanée et pulmonaire, une diminution de l’inflammation cutanée, hépatique et gastro-intestinale et une diminution de la production d’auto-anticorps. La proportion de cellules naïves parmi les LT CD4+ et CD8+ est plus élevée chez les souris malades traitées que chez les malades non traitées. Les souris du second modèle présentent une fibrose cutanée et pulmonaire et une activation du système immunitaire accompagnée d’une production d’autoanticorps anti-topoisomérase. Nous avons retrouvé une activation des voies de signalisation de STAT3, de Wnt/β-caténine et d’AKT chez les souris sclérodermiques. Nous avons également observés une activation de la voie de signalisation de STAT6 et une surexpression de KLF4 chez ces souris malades. La co-inhibition des voies de signalisation STAT3, Wnt/β-caténine et AKT par le niclosamide améliore la fibrose cutanée et pulmonaire chez les souris sclérodermiques. Cette molécule diminue le nombre et l’activation des LB et des LT CD4+ et CD8+ ainsi que la production des auto-anticorps chez les souris malades. Le traitement de souris sclérodermique par le léflunomide, inhibiteur de STAT6, a aussi montré une amélioration de la fibrose cutanée et pulmonaire et des anomalies immunitaires présentées par les souris sclérodermiques. De plus l’inhibition de STAT6 et de KLF4 par le léflunomide inhibe la polarisation des macrophages en macrophages M2. Ainsi nous avons mis en évidence le rôle des voies de signalisation de l’EGFR, de STAT3, de Wnt/β-caténine, d’AKT, de STAT6 et de KLF4 dans la physiopathologie de la sclérodermie systémique. (...) / Systemic sclerosis (SSc) is a connective tissue disorder that results in skin and inner organs fibrosis, microvascular injuries and auto-immunity. This rare disease has a complex physiopathology which is due to its multifactorial origin and its various clinical manifestations. Its etiology remains unknown and no curative treatment exists at present. Our team highlighted the role of reactive oxygen species (ROS) by developing a hypochlorous acid (HOCl)-induced mouse model of SSc. This model allowed the exploration of several intracellular signalizing pathways which were involved in ROS production and promote fibrosis. In this work, we choose to investigate inflammatory signalizing pathways in SSc with a sclerodermatous graft versus host disease (Scl-GVHD) mouse model and a ROS-induced mouse model. Moreover, we studied the effects of drugs targeting these pathways in order to reinforce data providing new therapeutics. Mice from Scl-GVHD model developed a diffuse cutaneous SSc with pulmonary fibrosis, alopecia, diarrhea and liver inflammation. Production of anti-DNA topoisomerase 1 auto-antibodies and immunological activation was also found. We observed an activation of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch signaling pathways in Scl-GVHD. Inhibition of EGFR by Erlotinib showed clinical amelioration with a decreased skin fibrosis and decreased skin and liver inflammation. Moreover, Erlotinib decreased production of activated/memory CD4+ T cells and of auto-antibody anti-topoisomerase1. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, ERK1/2 and Notch pathways by Niclosamide reversed clinical symptoms of Scl-GVHD in mice. We observed an improvement of skin and lung fibrosis, of cutaneous, hepatic and intestinal inflammation, and a reduced production of auto-antibodies. The ratio of CD4 and CD8 naive T cells was higher in Niclosamide-treated GVHD mice than in untreated GVHD mice. Mice from HOCl-model present skin and lung fibrosis and an immune activation along with the production of auto-antibodies anti-topoisomerase. We found an activation of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT signaling pathways in HOCl-mice. We also observed an activation of STAT6 signaling pathway and an overexpression of KLF4 in these sicked mice. Co-inhibition of STAT3, Wnt/β-catenin and AKT pathways by Niclosamide improves skin and lung fibrosis in HOCl-mice. This drug decreased number and activation of B cells and CD4+ and CD8+ T cells and auto-antibodies production in mice. Treatment of HOCl-mice with Leflunomide, STAT6 inhibitor, also showed an improvement of skin and lung fibrosis and of immunological abnormalities in HOCl-mice. Moreover, inhibition of STAT6 and KLF4 by Leflunomide inhibits M2 polarization of macrophages. Thus, we highlighted the role of EGFR, STAT3, Wnt/β-catenin, AKT, STAT6 and KLF4 signaling pathways in physiopathology of SSc. Use of inhibitors of these pathways such as Etrlotinib, Niclosamide and Leflunomide, indicate a clinical and biological efficacity in mouse. These drugs allow the control of the 3 characteristic features of SSc reproduced in these animal models: fibrosis, inflammation and autoimmunity and could thus be effective in fighting the development of clinical-biological abnormalities of SSc.

La ghréline acylée, une hormone produite par l’estomac, favorise la prise de poids corporel, majoritairement sous forme de masse grasse, par le biais de divers mécanismes centraux et périphériques via le récepteur sécrétagogue de l’hormone de croissance (GHSR). Le GHSR est un récepteur couplé aux protéines G qui, en plus de répondre à la ghréline acylée, possède une signalisation indépendante de la ghréline par le biais de son activité constitutive ou par une modulation de réponses dopaminergiques via oligomérisation du GHSR avec des récepteurs dopaminergiques. Malgré les puissantes réponses pharmacologiques à la ghréline acylée, des modèles animaux capables d’appréhender la complexité du système ghréline acylée-GHSR in vivo manquent, ce qui a considérablement ralenti l’élucidation des rôles physiologiques de cette hormone et de son récepteur. En effet, les modèles génétiques murins générés jusqu’à présent manquent de spécificité au niveau de l’hormone (incapacité à discriminer la ghréline acylée de la ghréline désacylée), et/ou au niveau du GHSR (incapacité à discriminer les différents modes de signalisation du GHSR). Dans ce contexte, de nouveaux modèles qui impacteraient de façon différentielle les voies de signalisation du GHSR seraient des outils pertinents pour contribuer au déchiffrage du système ghréline acylée-GHSR in vivo. Nous nous sommes ainsi attachés à caractériser un modèle de rats porteur d’une mutation ponctuelle dans le Ghsr qui prédit la délétion d’un domaine régulateur dans l’extrémité C-terminale du GHSR (GhsrQ343X). Dans des modèles cellulaires, nous avons montré que cette mutation découple le GHSR des processus d’internalisation du récepteur et de recrutement de la β-arrestine induits par la ghréline acylée, tout en augmentant la réponse aux agonistes du GHSR dans la voie des protéines G. Conformément à ce mécanisme, les rats mutants homozygotes GhsrM/M ont une réponse accrue à l’administration d’agonistes du GHSR sur le plan de la libération d’hormone de croissance, de la prise alimentaire ou de l’activité locomotrice. L’exploration physiologique et comportementale des rats GhsrM/M indique que la mutation GhsrQ343X est associée à une augmentation du poids et de l’adiposité indépendamment de la prise alimentaire, une diminution de l’oxydation globale des acides gras, de la flexibilité métabolique et de la tolérance au glucose, sans impact critique sur la prise alimentaire homéostatique. En outre, étant donné que la mutation GhsrQ343X n’augmente pas les niveaux circulants de ghréline, le phénotype métabolique général des rats GhsrM/M est en accord avec une sensibilité augmentée du GHSR en réponse au tonus endogène de ghréline acylée. Enfin, des résultats préliminaires suggèrent que la mutation GhsrQ343X pourrait être associée à des altérations relatives aux fonctions de récompense et de mémoire dont les mécanismes sous-jacents restent à décrypter. En résumé, nous proposons le modèle de rat mutant GhsrQ343X comme un nouvel outil, plus spécifique que les modèles murins d’invalidation génétique, pour explorer in vivo la signalisation du GHSR dans diverses fonctions biologiques, et à plus long terme aider au design de composés pharmacologiques ciblant le GHSR efficaces dans un cadre clinique. / The stomach-derived hormone acyl ghrelin promotes body weight gain, mostly in the form of fat mass, by means of several central and peripheral mechanisms mediated by the growth hormone secretagogue receptor (GHSR). The GHSR is a G protein-coupled receptor that, in addition to respond to acyl ghrelin, displays agonist-independent signaling through high constitutive activity and possibly heteromerization with dopamine receptors. Despite the potent biological properties of exogenous acyl ghrelin, the lack of animal models able to apprehend the complexity of the acyl ghrelin-GHSR system in vivo has been hampering the elucidation of its physiological roles. Indeed, genetic mouse models generated so far lack specificity either at the level of the hormone (not able to discriminate between acyl ghrelin versus desacyl ghrelin) and/or at the level of the GHSR (not able to discriminate between GHSR signaling modes). In this context, new models differentially affecting GHSR signaling pathways would represent valuable tools to decipher the acyl ghrelin-GHSR system in vivo. We therefore aimed at characterizing a new rat model carrying a point mutation in Ghsr that predicts truncation of a regulatory domain in the C-terminus, the GhsrQ343X mutation. In cellular models, this mutation was found to uncouple the GHSR from agonist-dependent receptor internalization and β-arrestin recruitment, while enhancing GHSR responsiveness in the G protein pathway. Accordingly, homozygous mutant GhsrM/M rats show enhanced responsiveness to exogenous GHSR agonists in terms of growth hormone release, food intake and locomotor activity. Physiological and behavioral exploration of GhsrM/M rats supports that the GhsrQ343X mutation is associated with increased body weight gain and adiposity independently of calorie intake, reduced whole-body fat oxidation, metabolic flexibility and glucose tolerance, without any critical impact on homeostatic feeding behavior. Moreover, given that circulating ghrelin levels are not increased by the GhsrQ343X mutation, the overall metabolic phenotype of GhsrM/M rats is consistent with enhanced GHSR sensitivity to the endogenous tone of acyl ghrelin. Furthermore, preliminary results suggest that the GhsrQ343X mutation could be associated with behavioral alterations related to reward and memory functions, through mechanisms that remain to be elucidated. Altogether, we propose the GhsrQ343X mutant rat model as a novel tool, more specific than knockout mouse models in its mechanism-of-action, to explore GHSR signaling across biological functions in vivo, and ultimately help in the design of efficient GHSR-targeting drugs.

La transplantation d’hépatocytes représente une alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies métaboliques dont l’hypercholestérolémie familiale. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines représentent de nouvelles sources de cellules hépatiques. Nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches humaines en cellules hépatiques et généré ainsi des cellules dérivées de cellules iPS de patients atteints d’hypercholestérolémie familiale. / Hepatocyte transplantation represents an alternative to liver for the treatment of metabolic diseases including familial hypercholesterolaemia. Embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS) represent new sources of hepatic cells. We have developed an approach to differentiate human stem cells into hepatic cells and thus we have generated hepatic cells derived from iPS of familial hypercholesterolaemia patients.

Le récepteur hypophysaire de la GnRH (RGnRH) joue un rôle crucial dans le contrôle de la fonctionde reproduction. Dans le promoteur distal du Rgnrh, j’ai caractérisé un élément de réponsebifonctionnel répondant aux protéines LIM à homéodomaine ISL1/LHX3 et à GATA2. D’autre part,deux motifs TAAT situés dans la région plus proximale confèrent à ce gène la capacité de répondreaux facteurs Paired-like PROP1 et OTX2. Tous ces facteurs, exprimés précocement au cours del’ontogenèse hypophysaire, pourraient participer à l’émergence de l’expression du Rgnrh. Hors del’hypophyse, j’ai découvert que le Rgnrh est exprimé au cours du développement postnatal dansl’hippocampe de rat, où il module la plasticité synaptique. Par ailleurs, j’ai identifié deux nouveauxsites d’expression, la rétine et la glande pinéale. Ces résultats mettent en lumière l’importancefonctionnelle de ce récepteur et de son ligand et les rôles multiples qu’il ont acquis au cours del’évolution des Vertébrés. / In the pituitary, the GnRH receptor (GnRHR) plays a crucial role in the neuroendocrine control ofreproductive function. Within the distal region of the Gnrhr promoter, I have characterized abifunctional response element modulated by the LIM homeodomain proteins ISL1/LHX3 and byGATA2. Besides, in the proximal region of the promoter, two TAAT motifs conferred response toPaired-like factors PROP1 and OTX2. All these factors are expressed during pituitary ontogenesis andcould participate in the onset and regulation of Gnrhr expression. Outside of the pituitary, I havediscovered that the Gnrhr was expressed during postnatal development in the rat hippocampus, whereit modulated synaptic plasticity. Furthermore, I have identified two novel sites of Gnrhr expression, theretina and the pineal gland. Altogether, these data highlight the functional importance of this receptorand its ligand as well as the multiple roles they have acquired during vertebrate evolution.

La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien. / Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle.