Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T18:36:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203574 bytes, checksum: 27a8ee88c37be77020eb4764ddc31451 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T18:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203574 bytes, checksum: 27a8ee88c37be77020eb4764ddc31451 (MD5) Previous issue date: 2005-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Foram conduzidos experimentos de cultura de tecidos utilizando um genótipo híbrido de Eucalyptus grandis vs. E. smithii e sementes de um cruzamento controlado de E. grandis. Foram isoladas uma levedura e uma bactéria que têm dificultado a cultura in vitro e transformação genética do genótipo híbrido, sendo a bactéria identificada como Herbaspirillum huttiense (Leifson) Ding e Yokota. Dentre 34 antibióticos testados in vitro para o controle do crescimento de H. huttiense, 12 induziram halos de inibição. Sulfadiazina, estreptomicina, canamicina e penicilina foram selecionados para determinação da concentração inibitória mínima. Sulfadiazina, estreptomicina e canamicina induziram halos de inibição entre as concentrações de 256 e 512 mg L -1 , contudo, apresentaram apenas atividade bacteriostática. Penicilina não apresentou efeito bactericida ou bacteriostático em concentrações até 1024 mg L -1 . Cefotaxima, carbenicilina e timentin foram avaliados quanto ao seu efeito sobre a morfogênese in vitro de explantes de Eucalyptus grandis. Foi observado que carbenicilina e timentin, em concentrações até 600 mg L -1 , favoreceram a freqüência de explantes regenerando calos (50-70%) e a redução da necrose. Cefotaxima beneficiou a calogênese até 300 mg L -1 , concentração a partir da qual promoveu aumento dos calos necrosados (>60%). Explantes cotiledonares e de hipocótilos de E. grandis foram submetidos a altas concentrações de diferentes reguladores de crescimento (ABSA, AIA, AIB, ANA, 2,4-D, TDZ, ZEA, BAP e KIN) e a combinações de 10, 50 e 100 mg L -1 de 2,4-D e períodos de exposição de 6, 12, 24 e 48 horas. Plântulas intactas apresentaram resultados superiores (~7 raízes/explante) quanto à rizogênese adventícia comparadas a hipocótilos e cotilédones isolados (<1,5 raízes/explante). ABSA, AIA, AIB, ANA e 2,4-D aumentaram (>10 raízes/explante), enquanto TDZ, ZEA, BAP e KIN inibiram (<1 raízes/explante) de maneira significativa a indução de raízes adventícias. O alongamento de epicótilos também foi inibido por TDZ, KIN, 2,4-D, BAP e ABSA, enquanto o mesmo não ocorreu com AIA, AIB, ANA e ZEA. Foi observada uma maior eficiência de ABSA na indução do enraizamento, mesmo quando comparada à AIB. Houve um decréscimo no alongamento de epicótilos e no número médio de raízes por explante, e um aumento da necrose de explantes, com o aumento da exposição e da concentração de 2,4-D. Nos estudos com marcadores moleculares, foi determinado o perfil de 84 genótipos com base em marcadores RAPD. Foi gerado um total de 501 bandas, dos quais 450 (89,82%) foram polimórficas e 51 (10,18%) monomórficas. A análise de bootstrap com duzentas repetições para cada número de marcadores mostrou que um número de marcadores maior que 393 resultou em valores de estresse menores que 5%, menores que 5 para soma de quadrados e maiores que 0,95 para correlação. Comparando os índices de diversidade genética entre e dentro das sub- populações de E. grandis e E. urophylla, a maior parte da variabilidade foi encontrada dentro das sub-populações. Exceto para o índice de Shannon, os outros índices de variabilidade aumentaram quando os marcadores monomórficos foram retirados das análises. A análise de agrupamento baseada em marcadores RAPD demonstrou associação com a classificação taxonômica. / Tissue culture experiments were conducted with a Eucalyptus grandis vs. E. smithii hybrid genotype and E. grandis controlled cross seeds. One yeast and one bacterium, which have difficulted in vitro tissue culture and genetic transformation of the hybrid genotype, were isolated and the latter identified as Herbaspirillum huttiense (Leifson) Ding e Yokota. Among 34 antibiotics tested, only 12 inhibited bacterial growth. Sulfadiazine, streptomycin, kanamycin and penicillin were selected for determining the minimal inhibitory concentration. Sulfadiazine, streptomycin, and kanamycin presented inhibition halo at 256 and 512 mg L -1 , yet all three were bacteriostatic. Penicillin did not display bactericidal effect at the concentrations up to 1024 mg L -1 . Cefotaxime, carbenicillin and timentin effects on the in vitro morphogenesis of Eucalyptus grandis seedling explants were evaluated. It was observed that carbenicillin and timentin, up to 600 mg L -1 , favored the frequency of explants regenerating callus (50-70%) and decreased necrosis. Cefotaxime supported callogenesis up to 300 mg L -1 from which displayed an increasing frequency of necrosed explants and callus (>60%). E. grandis hypocotyl and cotyledon explants were submitted to high concentrations of different growth regulators (BSAA, IAA, IBA, NAA, 2,4- xiiD, TDZ, ZEA, BAP and KIN), and to combinations of 10, 50 and 100 mg L -1 2,4-D and 6, 12, 24 and 48 hours pre-treatment periods. Intact plantlets displayed superior adventitious rhizogenesis (~7 roots/explant) compared to isolated hypocotyl and cotyledon explants (<1.5 roots/explant). BSAA, IAA, IBA, NAA and 2,4-D enhanced (>10 roots/explant) whereas TDZ, ZEA, BAP and KIN significantly inhibited (<1 roots/explant) adventitious rhizogenesis. Epicotyl elongation was also significantly inhibited by TDZ, KIN, 2,4-D, BAP and BSAA, while IAA, IBA, NAA and ZEA did not. BSAA displayed a significantly higher effect on adventitious root induction, even compared to IBA. Epicotyl elongation and average number of roots per explant declined, whereas explant necrosis augmented, with higher 2,4-D exposures and concentrations. In the molecular marker studies, the profiles of 84 Eucalyptus genotypes based on RAPD markers were determined. A total of 501 bands was generated, from which 450 (89.82%) were polymorphic and 51 (10.18%) monomorphic. Two hundred bootstrap analysis revealed that a number higher than 393 markers provided values below 5% for stress, lower than 5 for sum of squares and higher than 0.95 for correlation statistics. Comparing the genetic diversity indexes between and within the E. grandis and E. urophylla sub-populations, most of the variability was found in the sub-populations. Except for the Shannon index, other variability indexes increased as monomorphic markers were withdrawn from the analysis. Nevertheless, clustering analysis based on RAPD markers demonstrated association with taxonomic classification.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-07T13:31:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2953489 bytes, checksum: e27c4a2febab7908bf620dcad47424ff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T13:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2953489 bytes, checksum: e27c4a2febab7908bf620dcad47424ff (MD5) Previous issue date: 2005-09-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Atualmente, o TDZ é conhecido como indutor morfogênico, atuando como um substituto de auxinas e citocininas, na embriogênese e organogênese em várias espécies. Com base no exposto, foram realizados estudos com explantes hipocotiledonares cultivados em meio com adição de TDZ e BAP, e sem combinação entre os mesmos. Na primeira e segunda fases, avaliou-se a influência da posição do explante, da polaridade fisiológica e da orientação dos explantes no meio de cultura. Na terceira fase, avaliou-se o potencial do TDZ, como indutor da embriogênese em segmentos hipocotiledonares do maracujazeiro. No final dos estudos, constatou-se que a resposta morfogênica e a rota morfogênica em segmentos hipocotiledonares de maracujazeiro são dependentes da presença e da natureza química das citocininas adicionadas ao meio de cultura em interação com o modo pelo qual o explante é inserido no meio de cultura; a polaridade fisiológica que se estabelece nos extremos dos segmentos hipocotiledonares, bem como a magnitude desta polaridade, pode ser alterada pela natureza química da citocinina, aplicada ao meio de cultivo, e pela orientação do explante nesses meios. Na presença do TDZ, a polaridade não se estabeleceu; não houve gradiente de resposta morfogênica entre os segmentos. Segmentos hipocotiledonares podem ser induzidos à formação de uma massa de células semelhantes à proembriões e estruturas organogênicas sob influência do TDZ, sendo estas rotas morfogênicas dependentes da concentração deste fitorregulador. / TDZ is known morphogenic inductor acting as auxin and cytokinin on embryogenesis and organogenesis of several species. Based in this statement, several studies were conducted with passion fruit hypocotyledonary explants, cultivated in a medium with TDZ and BAP without combinations. In the first and the second phase of studies the influence of explant position, physiological polarity and explant orientation were studied. In the third phase of studies the TDZ potentiality as somatic embryogenesis inductor in passionfruit hypocotyledonary segments were studied. Finally, it was observed that the morphogenic response and the morphogenic rote in passion fruit hypocotyledonary segments are dependent on the presence and the chemical nature of the cytokinin in the interaction with position, polarity and orientation of the explant. In the presence of TDZ, the polarity did not establish. There have no gradient of morphogenic response among segments. Under the influence of TDZ and depending on the dose of the same the segment can be induced to form cell masses similar to proembryogenic masses or organogenic structures.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-08T16:52:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5343332 bytes, checksum: f2f90ec724baa672785c57612ee8a420 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T16:52:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5343332 bytes, checksum: f2f90ec724baa672785c57612ee8a420 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Brasil é o maior produtor mundial de café, e o café arábica (Coffea arabica L.) é o mais apreciado pelos países consumidores. Minas Gerais destaca-se como principal estado produtor de café no país, mas suas lavouras apresentam diferentes situações nutricionais, principalmente no teor de micronutrientes, como B e Cu. Condições de deficiência e excesso de nutrientes podem ocasionar o aparecimento de sintomas macroscópicos característicos e prejudicar a produção. Mesmo quando os sintomas macroscópicos não ocorrem, as plantas podem apresentar “fome ou toxidez oculta”, observados apenas anatômica e ultraestruturalmente, ou por avalição do estado nutricional. Sendo assim, objetivou-se avaliar os efeitos de doses de deficiência e excesso de B e Cu sobre os aspectos macroscópicos, anatômicos e ultraestruturais e avaliar o estado nutricional dos cafeeiros cultivados em sistema hidropônico. O cafeeiro pode ser considerado mais tolerante ao excesso de B do que à deficiência, pois sob condições de deficiência menor quantidade de B chega aos ápices caulinares pelo xilema (via apoplasto), o que promove uma série de alterações morfoanatômicas e ultraestruturais nas plantas. A deficiência de B, causa primariamente, alteração na síntese de pectinas durante a formação de novas paredes celulares de primórdios foliares em expansão. Essa alteração desencadearia uma série de processos até a abscisão foliar e, finalmente, morte do meristema apical. Além disso, a destruição dessas regiões associadas à síntese de auxina (AIA) provocaria um desbalanço hormonal em toda a planta e, nas raízes, os níveis inadequados de AIA causariam diferenciação precoce de células e tecidos, formação de raízes ramificadas e encurtadas, até necrose do ápice radicular. Assim, o evento final da deficiência de B seria a diminuição da área do sistema radicular e do potencial de absorção de água e nutrientes. Como ocorre brotação após a abscisão dos órgãos em expansão sob deficiência de B, sugere-se que também ocorra retranslocação deste nutriente pelo floema (via simplástica), das folhas mais velhas para folhas mais novas. O acúmulo de B nas folhas mais novas após a brotação corrobora com essa possibilidade. Em contrapartida, a alteração dos cloroplastos é o sintoma ultraestrutural primordial da deficiência ou do excesso de Cu em folhas de cafeeiros, o que reforça a importância desse nutriente no processo fotossintético. Porém, o atraso no surgimento de sintomas morfoanatômicos da deficiência e do excesso de Cu em cafeeiros pode ser consequência do acúmulo deste nutriente nas raízes e da retranslocação para as folhas mais novas, favorecendo a manutenção de concentrações adequadas na planta. / Brazil is the world's largest coffee producer, and arabica (Coffea arabica L.) is the most specie appreciated by the consuming countries. Minas Gerais stands out as the main coffee producing state in the country, but their crops have different nutrient conditions, especially in the micronutrient content, such as B and Cu. Conditions of deficiency and excess nutrients can cause the appearance of characteristic macroscopic symptoms and impair production. Even when the macroscopic symptoms do not occur, the plants may have "hidden hunger or toxicity," observed only anatomical and ultrastructure, or assessment of nutritional status. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of doses of deficiency and excess of B and Cu on the macroscopic, anatomical and ultrastructural aspects and assess the nutritional status of coffee grown hydroponically. The coffee may be considered more tolerant to excessive B than the deficiency. Under conditions of deficiency of B minor amount of B reaches the xylem to the shoot tip (apoplastic pathway), which promotes a series of morphoanatomic and ultrastructural alterations in plants. Deficiency of B, cause primarily, changes in pectin synthesis during the formation of new cell walls of leaf primordia expanding. This change would trigger a series of processes to leaf abscission, and ultimately death of apical meristem. Furthermore, the destruction of these regions associated with auxin synthesis (AIA) would trigger a hormonal disbalance throughout the plant and the roots. In roots, inadequate levels of AIA cause early differentiation of cells and tissues, formation of branched and shortened roots, and necrosis of the apex. Thus, the final event of B deficiency would be to reduce the area of the root system and the potential for absorption of water and nutrients. As occur regrowth after abscission of organs expanding deficiency in B, it is suggested that also this nutrient translocation occurs through phloem (symplastic pathway), older leaves to young leaves. The accumulation of B in younger leaves after regrowth corroborates this possibility. In contrast, the change of chloroplasts is the primary ultrastructural symptom of deficiency or excess Cu in coffee leaves, which reinforces the importance of this nutrient in the photosynthetic process. However, the delay in the onset of morphoanatomic symptoms of deficiency and excess Cu in coffee may be a consequence of the accumulation of this nutrient in the roots and translocation to the younger leaves, favoring the plant rebalancing. .

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T08:33:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T08:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) Previous issue date: 2015-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A aquisição de competência embriogênica por células somáticas é um processo intrigante e necessita da junção de dados genético-moleculares e citológicos para melhor compreensão dos mecanismos e mudanças celulares envolvidas. À vista disso, os objetivos desse trabalho foram isolar e caracterizar o padrão de expressão dos genes SERK e BBM por hibridização in situ durante o processo de embriogênese somática em Passiflora cincinnata, avaliar a responsividade morfogênica in vitro de P. setacea e P. cincinnata submetidas a condições de indução de embriogênese somática, bem como, acompanhar a mobilização de reservas e a expressão dos genes supracitados durante a embriogênese somática. Para tal, a partir de calos embriogênicos de P. cincinnata, com 20 dias em meio de indução (MI), extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação da sequência codante utilizando-se primers degenerados para SERK e BBM. A responsividade de embriões zigóticos maduros de P. setacea e P. cincinnata foi avaliada mediante o cultivo em meio de indução alternativo constituído por sais MS suplementado com 31,06 μM de Picloram + 2,22 μM de BA + 2,27 μM de TDZ (MIP) + 500 mg L -1 de Extrato de Malte (EM) + 13,77 μM de Espermidina (Spd). Após 30 dias as culturas foram transferidas ao meio de maturação (MM) composto de meio MS acrescido de 1,0% de carvão ativado e ausência de reguladores de crescimento. Amostras com 0, 10, 20 e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes histoquímicos e hibridização in situ, todas seguindo protocolos específicos. Para visualização da expressão dos genes SERK e BBM foi gerada uma sonda de RNA a partir de um clone sequenciado de P. cincinnata. Para P. setacea utilizou-se uma sonda heteróloga sense e antisense de P. cincinnata. O relacionamento filogenético das sequências isoladas de P. cincinnata comparadas às de outras espécies apontou que as funções das proteínas podem ser conservadas na espécie. Em SERK, o Pc contig1 agrupou-se com membros de SERK1 e SERK2, enquanto o Pc contig2 agrupou-se com membros de SERK3/BAK1. Por sua vez, o Pc contig1 de BBM, agrupou-se com membros de BBM1 e BBM2. A expressão do gene SERK foi constatada em embriões zigóticos e gradualmente diminuída até os 20 dias em MI. Aos 30 dias em MI, embriões somáticos globulares foram intensamente marcados, assim como em embriões com 5 e 40 dias em MM. Transcritos do BBM foram observados em embriões zigóticos, no entanto, a expressão foi cessada no decorrer do desenvolvimento dos embriões somáticos. A expressão foi retomada em embriões somáticos cotiledonares após 40 dias em MM, assemelhando-se ao observado no embrião zigótico. Observou-se que em P. setacea, durante o processo embriogênico, houve formação de protuberâncias que deram origem a zonas pró-embriogênicas, as quais se desenvolveram em embriões somáticos. Já em P. cincinnata houve proliferação das células do meristema fundamental e formação de meristemoides, caracterizando regiões organogênicas. Quando transferidos ao meio de maturação não houve regeneração de plantas a partir de embriões somáticos em P. setacea. Em P. cincinnata houve intumescimento das regiões calejadas e, em alguns casos, formação de primórdios foliares. Quanto à expressão gênica, em P. setacea foi constatada expressão de BBM e SERK em todas as fases analisadas, especialmente em protuberâncias e embriões somáticos formados. P. cincinnata, por sua vez, também apresentou transcritos dos genes BBM e SERK em todas as fases analisadas, sendo intensificado o sinal de hibridização na periferia dos explantes e regiões meristemáticas após 20 dias em MI. P. setacea apresentou corpos proteicos com decréscimo gradativo até os 30 dias em meio de indução. Houve presença de carboidratos e amido no explante e seu decréscimo após 10 dias, e verificou-se a síntese de novo de amido aos 30 dias de indução, quando há formação de embriões somáticos. Não foi verificada a presença de corpos lipídicos durante o processo embriogênico. Já em P. cincinnata, constatou-se corpos proteicos e amido de forma moderada em todas as etapas de desenvolvimento e a presença de carboidratos totais e corpos lipídicos foi averiguada nas fases iniciais de indução. Após 20 dias, houve mobilização dessas substâncias de reserva concomitantemente com a formação e desenvolvimento de meristemoides. Deste modo, sugere-se que a expressão desses genes está associada aos processos de aquisição de competência embriogênica e podem servir como marcadores moleculares desse processo. Os resultados do isolamento e expressão dos genes SERK e BBM em P. cincinnata são inéditos e contribuem para o melhor entendimento dos processos que envolvem a embriogênese somática na espécie. Nosso trabalho apresenta dados inéditos da indução de embriões somáticos em P. setacea e como as espécies estudadas apresentam respostas morfogênicas divergentes quando submetidas ao mesmo meio de indução. E ainda, relatamos à expressão dos genes BBM e SERK e a mobilização de compostos de reserva no decorrer dos eventos morfogênicos in vitro em P. setacea e P. cincinnata. / The acquisition of embryogenic competence in somatic cells is intriguing process and requires both molecular-genetic and cytological knowledge to better understand the mechanisms and cellular changes involved. Based on this, the aim of this study was to isolate and characterize the expression of SERK and BBM genes in somatic embryos of Passiflora cincinnata, as well as to evaluate the morphogenic in vitro response of Passiflora setacea and P. cincinnata somatic embryogenesis inducted and monitoring the reserve mobilization and expression of the these genes during embryogenesis. For this, RNA was extracted and cDNA was obtained from embryogenic calli of P. cincinnata after 20 days in induction medium (IM), which was used as template for the coding sequence amplification with degenerate primers of SERK and BBM. Mature zygotic embryos of P. setacea and P. cincinnata were inoculated on MS medium supplemented with 31.06 μM of picloram + 2.22 μM of benzyladenine + 2.27 μM of thidizuron + 500mg L -1 of malt extract + 13.77 μM of spermidine. After 30 days, the cultures were transferred to the maturation medium (MM), composed of MS medium supplemented with 1 % of activated charcoal without growth regulators. Samples with 0, 10, 20 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, histochemical analyzes and in situ hybridization, following specific protocols. A RNA probe from P. cincinnata cDNA was generated to figure out the expression of SERK and BBM genes, whereas to P. setacea a heterologous sense and antisense probe of P. cincinnata was used. The phylogenetic relationship of P. cincinnata isolated sequences compared with other species suggests that the functions of the proteins are preserved. In SERK, the Pc contig1 grouped up with SERK1 and SERK2 members, while the Pc contig2 grouped with SERK3/BAK1 members. On the other hand, the BBM Pc contig1 was grouped with BBM1 and BBM2 members. The expression of SERK gene was found in zygotic embryos and gradually decreased until 20 days in the IM. After 30 days in the IM, globular somatic embryos were intensely marked with the hybridization signal, as well as embryos with 5 and 40 days in the MM. BBM transcripts were observed in zygotic embryos, but the expression was stopped during the somatic embryos development. The expression was resumed in somatic globular embryos after 40 days in the MM, similar to that observed in zygotic embryos. In the second chapter, in P. setacea embryogenesis process, it was observed the formation of lumps that originate pro-embryogenic zones, which developed into somatic embryos. In P. cincinnata a proliferation of the ground meristem cells and meristemoids formation occurred, emphasizing organogenic regions. When transferred to MM, there was no plant regeneration from somatic embryos of P. setacea. In P. cincinnata, swelling of callus regions and, in some cases, formation of leaf primordia was observed. Regarding the gene expression, in P. setacea there was BBM and SERK expression in all stages, especially in lumps and somatic embryos. Also P. cincinnata showed transcripts of BBM and SERK genes in all stages, with intensification of the hybridization signal at the explants edges and meristematic regions after 20 days in the IM. Protein bodies were found in P. setacea, decreasing gradually until 30 days in the IM. Carbohydrate and starch levels decreased after 10 days, but there was de novo synthesis of starch at 30 days of induction, coupled with the somatic embryos formation. No lipid bodies during the embryogenic process were verified. In P. cincinnata protein bodies and starch were moderately present in all development stages whereas carbohydrates and lipid bodies were present only at the early stages of induction. After 20 days, these reserve substances were mobilized, along with the meristemoids formation and development. Therefore, it is suggested that the expression of these genes is associated with embryogenic competence acquisition process and can be a molecular marker of this process. These results of isolation and expression of SERK and BBM genes in P. cincinnata are original and contribute to a better understanding of the processes involving somatic embryogenesis in this species. This work brings a new approach for somatic embryogenesis induction in P. setacea and highlights how these two species show different responses when submitted to the IM. In addition, the expression of the genes BBM and SERK as well as the mobilization of reserve compounds during in vitro morphogenic events in P. setacea and P. cincinnata were related.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-12-02Bitstream added on 2014-06-13T20:37:35Z : No. of bitstreams: 1 paz_ta_me_araiq.pdf: 1193700 bytes, checksum: 6489d53c5b06afd24ac5bdf2e56d9611 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivo estabelecer metodologia de cultivo e produção de células e/ou órgãos in vitro da espécie Salacia campestris com vista à obtenção de triterpenos quinonametídeos. Para isso, aplicando-se técnicas biotecnológicas, diversas tentativas de inserir a espécie in vitro foram realizadas utilizando explantes de folhas (limbo foliar e pecíolo), endosperma e sementes. Raízes obtidas in vitro foram cultivadas por 105 dias, sendo a presença e o teor de triterpenos quinonametídeos avaliados no decorrer deste período. Sistemas radiculares de plantas jovens (1 ano) cultivadas em casa de vegetação e sistemas radiculares de plantas adultas foram também analisadas quanto à presença e teor de triterpenos quinonametídeos. Foram utilizadas técnicas cromatográficas e de espetrometria de massas (EM) para a detecção e identificação de 22β-hidroximaitenina, maitenina e netzahualcoieno. Os ensaios citotóxicos in vitro foram realizados, como os dois últimos quinonametídeos, frente à linhagem de células normais 3T3 (fibroblasto) e de células tumorais HeLa (cólon de útero) e B16-F10 (melanoma murino). A partir de explantes de endosperma inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com 20 g/L de sacarose, acrescido com 4,0 mg/L de AIB (ácido indolbutírico) e 100 mg/L de PVP (polivinilpirrolidona), foram obtidas raízes in vitro. A partir dos estudos fitoquímicos foram detectados e identificados, nas raízes in vitro e em sistemas radiculares de plantas cultivadas em casa de vegetação, os triterpenos quinonametídeos maitenina e 22β-hidroximaitenina, enquanto que nos sistemas radiculares coletados em campo foram identificados os triterpenos maitenina e netzahualcoieno. O isolamento dos três triterpenos citados também foi realizado. Para as raízes cultivadas... / This work aimed to establish a methodology of cultivation and production of in vitro cells and /or organs of Salacia campestris, trying to obtain the quinone-methide triterpenes. Based on this and applying biotechnological techniques, several attempts to insert this species in an in vitro system were performed using leaf explants (leaf and petiole), endosperm and seeds. The in vitro roots obtained were cultured for 105 days, and the presence and content of quinone-methide triterpenes were evaluated during this period. The roots of young plants (1 year) grown in a greenhouse as well roots of adult plants were also analyzed for the presence and content of the quinone-methides. The analysis of the quinone-methides were performed using chromatographic techniques and mass spectrometrometry (MS) led to the identification of 22β-hydroxymaytenin, maytenin and netzahualcoyene. The in vitro cytotoxic assays were performed using the quinone-methides maytenin and netzahualcoyene, comparing with the normal cell line 3T3 (fibroblast) as well the HeLa tumor cells (uterus carcinoma) and B16-F10 (murine melanoma). The in vitro roots were obtained from endosperm explants, inoculated in WPM medium supplemented with 20 g/L sucrose, 4.0 mg/L IBA (indole-butyric acid) and 100 mg/L PVP (polyvinylpyrrolidone). The phytochemical studies of the in vitro roots and roots of plants grown in a greenhouse resulted in the identification of the quinone-methide triterpenes maytenin and 22β-hydroxymaytenin, while from the natural roots were identified the quinone-methides maytenin and netzahualcoyene. All of the triterpenes were also isolated. The results obtained for in vitro roots indicated that the greatest accumulation of biomass occurred on the 60th day of culture and the highest levels of maytenin (972.11 mg/g) and ... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maysa Furlan / Coorientador: Ana Maria Soares Pereira / Banca: Paulo Sérgio Pereira / Banca: Renato Paiva / Resumo: Este trabalho teve como objetivo estabelecer metodologia de cultivo e produção de células e/ou órgãos in vitro da espécie Salacia campestris com vista à obtenção de triterpenos quinonametídeos. Para isso, aplicando-se técnicas biotecnológicas, diversas tentativas de inserir a espécie in vitro foram realizadas utilizando explantes de folhas (limbo foliar e pecíolo), endosperma e sementes. Raízes obtidas in vitro foram cultivadas por 105 dias, sendo a presença e o teor de triterpenos quinonametídeos avaliados no decorrer deste período. Sistemas radiculares de plantas jovens (1 ano) cultivadas em casa de vegetação e sistemas radiculares de plantas adultas foram também analisadas quanto à presença e teor de triterpenos quinonametídeos. Foram utilizadas técnicas cromatográficas e de espetrometria de massas (EM) para a detecção e identificação de 22β-hidroximaitenina, maitenina e netzahualcoieno. Os ensaios citotóxicos in vitro foram realizados, como os dois últimos quinonametídeos, frente à linhagem de células normais 3T3 (fibroblasto) e de células tumorais HeLa (cólon de útero) e B16-F10 (melanoma murino). A partir de explantes de endosperma inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com 20 g/L de sacarose, acrescido com 4,0 mg/L de AIB (ácido indolbutírico) e 100 mg/L de PVP (polivinilpirrolidona), foram obtidas raízes in vitro. A partir dos estudos fitoquímicos foram detectados e identificados, nas raízes in vitro e em sistemas radiculares de plantas cultivadas em casa de vegetação, os triterpenos quinonametídeos maitenina e 22β-hidroximaitenina, enquanto que nos sistemas radiculares coletados em campo foram identificados os triterpenos maitenina e netzahualcoieno. O isolamento dos três triterpenos citados também foi realizado. Para as raízes cultivadas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work aimed to establish a methodology of cultivation and production of in vitro cells and /or organs of Salacia campestris, trying to obtain the quinone-methide triterpenes. Based on this and applying biotechnological techniques, several attempts to insert this species in an in vitro system were performed using leaf explants (leaf and petiole), endosperm and seeds. The in vitro roots obtained were cultured for 105 days, and the presence and content of quinone-methide triterpenes were evaluated during this period. The roots of young plants (1 year) grown in a greenhouse as well roots of adult plants were also analyzed for the presence and content of the quinone-methides. The analysis of the quinone-methides were performed using chromatographic techniques and mass spectrometrometry (MS) led to the identification of 22β-hydroxymaytenin, maytenin and netzahualcoyene. The in vitro cytotoxic assays were performed using the quinone-methides maytenin and netzahualcoyene, comparing with the normal cell line 3T3 (fibroblast) as well the HeLa tumor cells (uterus carcinoma) and B16-F10 (murine melanoma). The in vitro roots were obtained from endosperm explants, inoculated in WPM medium supplemented with 20 g/L sucrose, 4.0 mg/L IBA (indole-butyric acid) and 100 mg/L PVP (polyvinylpyrrolidone). The phytochemical studies of the in vitro roots and roots of plants grown in a greenhouse resulted in the identification of the quinone-methide triterpenes maytenin and 22β-hydroxymaytenin, while from the natural roots were identified the quinone-methides maytenin and netzahualcoyene. All of the triterpenes were also isolated. The results obtained for in vitro roots indicated that the greatest accumulation of biomass occurred on the 60th day of culture and the highest levels of maytenin (972.11 mg/g) and ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:59:22Z : No. of bitstreams: 1 reis_ll_me_ilha.pdf: 689455 bytes, checksum: a31101bab836f9617f87a471bc0c86aa (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A mangabeira Hancornia speciosa Gomes, pertencente à família Apocynaceae, considerada uma frutífera nativa do Brasil e encontrada em várias regiões do país. A propagação via sementes é a mais utilizada, porém perdem o poder germinativo assim que são retiradas do fruto, em função de sua recalcitrância. A propagação vegetativa por meio da estaquia também não se consolidou, em função do baixo percentual de enraizamento. Desta forma essa pesquisa teve por objetivo aprimorar o conhecimento técnico-cientifico sobre a clonagem da mangabeira pelas técnicas da alporquia e micropropagação. O trabalho de propagação por alporquia foi realizado em um pomar de mangabeira, localizado na Fazenda de Ensino Pesquisa e Extensão – FEPE/UNESP, localizado no município de Selvíria-MS. Os experimentos de micropropagação in vitro foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos-LCT da UNESP, Campus de Ilha Solteira-SP. O experimento de propagação vegetativa via técnica da alporquia, foi realizado em ramos semilenhosos, em plantas adultas de mangabeira. Após 95 dias, contabilizou-se o número de raízes, porcentagem de calejamento e enraizamento. Para o estabelecimento in vitro, os frutos foram coletados na FEPE/UNESP, no Município de Selvíria, MS. As sementes tiveram seus tegumentos removidos para facilitar a germinação e desinfestadas para inoculação em diferentes tipos de meio de cultura para determinação da influência das concentrações salinas sobre o desenvolvimento inicial de plântulas de mangabeira. Para o alongamento e multiplicação, microestacas de mangabeira foram subcultivadas em meio de cultura Wood Plant Medium (WPM) contendo 6-benzilaminopurina (BAP) em interação com ácido α- naftalenoacético (ANA), em diferentes concentrações. Ao final deste experimento foram contabilizadas principalmente a formação de multibrotações... / The mangabeira Hancornia speciosa Gomes, belonging to the family Apocynaceae, considered a fruit native to Brazil found in several regions of the country. The propagation of seeds is the most used, but lose their germinating power so they are removed from the fruit, because of their recalcitrance. Vegetative propagation by cuttings is also not consolidated, due to the low percentage of rooting. Therefore this research aimed to improve the technical and scientific knowledge about the cloning of mangabeira by layering and micropropagation techniques. The work of spreading by layering was performed in an orchard mangabeira in Fazenda Teaching Research and Extension - FEPE / UNESP, located in the municipality of Selviriaa-MS. The micropropagation in vitro experiments were performed at the Tissue Culture Laboratory of the LCT-UNESP, SP, Ilha Solteira-SP. The experiment of vegetative propagation through layering technique, was performed in semi-hardwood branches on adult plants of Hancornia speciosa Gomes. After 95 days, counted the number of roots, percentage of callus and roots. To establish in vitro, the fruits were collected in FEPE / UNESP, in the Selvíria, MS. The seeds had their coats removed to facilitate the germination and sterilized prior to inoculation in different types of culture medium to determine the influence of salt concentrations on the early development of seedlings of H. speciosa. For the elongation and multiplication, micro mangaba were subcultured in culture medium Wood Plant Medium (WPM) containing 6- benzylaminopurine (BAP) in interaction with α-naphthaleneacetic acid (NAA) in different concentrations. At the end of this experiment were mainly accounted for the formation of multibrotações and the rate of multiplication of the explants. For the rooting of microshoots Mangabeira, tested different concentrations of indol-3-butyric acid (IBA) in culture medium... (Complete abstract click electronic access below)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O jambú (Acmella oleracea), hortaliça empregada na culinária e na medicina popular no Norte do Brasil, tem sido objeto de pesquisas em diversas áreas revelando aplicações promissoras. Entretanto, são encontrados poucos registros relacionados à sua composição e valor nutricional inorgânico. Neste estudo, foram desenvolvidos dois métodos de tratamento de amostras, calcinação (CA) e digestão úmida (DU), para a quantificação de K, Na e Li por Fotometria de Chama e Ca, Cu, Fe, Mn, Ni e Zn por Espectrometria de Absorção Atômica por Chama, em amostras de folhas (Fo), flores (Fl) e folhas-flores (Fo-Fl) de jambú produzidas e comercializadas em Boa Vista/RR, considerando a complexidade das matrizes, a otimização instrumental para cada espécie estudada, a eficiência analítica e laboratorial por meio de experimentos de adição e recuperação de analitos e por comparação com Material de Referência (MR) de Braquiária brizantha e a essencialidade e/ou toxicidade das espécies sob estudo nos limites de tolerância fisiológicos. Os métodos CA e DU mostraram-se eficientes para todas as espécies metálicas nas amostras sob estudo, com desvios padrões relativos abaixo de 10 % para a maioria das espécies e recuperações na faixa de 90 a 110 %, exceto para o Li no método DU, em que necessita de otimizações. Os teores de Cu se mostram próximos e os de Ni abaixo dos seus respectivos limites de quantificação (LOQs), em ambos os métodos e para todas as amostras. Porém, o método DU exibe melhores LOQs para o Ca, Cu, Fe e Zn, enquanto o método CA para o K, Mn, Na e Ni e para o Li, os resultados são semelhantes. Os testes estatísticos, F e t emparelhado (95 % de confiança) aplicados aos resultados dos dois métodos mostram não existir diferenças significativas entre as suas precisões e concentrações em todas as espécies, bem como entre as amostras de Fo e Fo-Fl. As quantificações do MR com o uso dos métodos estabelecidos evidenciam o bom desempenho laboratorial e a aplicabilidade destes métodos em outras matrizes ambientais, exceto para o Fe no método CA para o qual são necessárias adequações. Além disso, os métodos são promissores para a determinação de outras espécies metálicas. De modo geral, o método CA apresenta em relação ao método DU, menores: número de reagentes, quantidades de resíduos, etapas de manipulação e riscos de contaminações da amostra. No entanto o método CA apresenta baixa velocidade de destruição da matéria orgânica e elevado consumo de energia elétrica. Logo, os métodos apresentam vantagens e desvantagens, um em relação ao outro, inerentes aos tratamentos aplicados. Quanto ao potencial nutricional do jambú, recomenda-se sua inserção na dieta humana, visto que a ingestão de 50 g em massa úmida desta hortaliça contribui com altos teores em Li e Mn, sendo as Fl fontes em Cu. Os resultados obtidos para as espécies metálicas, cinzas e umidade nas amostras estudadas se mostram próximos aos de alguns dados da literatura. Os resultados demonstram novas opções de métodos de tratamento de amostras para a quantificação de espécies metálicas em tecidos vegetais, bem como assinalam novas informações sobre alimentos consumidos nacionais que poderão ser úteis na complementação de bases de dados de composição mineral e na popularização do jambú como fonte nutricional. / The jambu (Acmella oleracea), vegetable used in cooking and in popular medicine in northern Brazil, has been the subject of research in several areas showing promising applications. However, few records are found related to its inorganic composition and nutritional value. In this study, two methods were developed for treatment of samples, calcination (CA) and wet digestion (DU), for the quantification of K, Na and Li by Flame Photometry and Ca, Cu, Fe, Mn, Ni and Zn by Flame Atomic Absorption Spectrometry in leaf samples (Fo), flowers (Fl) and leaves-flowers (Fo-Fl) of jambu produced and marketed in Boa Vista/RR, considering the complexity of the matrices, the instrumental optimization for each species studied, the analytical and laboratory efficiency by analytes addition and recovery experiments and comparison with Brachiaria brizantha Reference Material (MR) and the importance and / or toxicity of the studied species in the limits of physiological tolerance. The CA and DU methods were efficient for all metallic species in the studied samples, with relative standard deviations below 10 % for most species and recoveries in the range of 90 to 110 %, except for the Li in DU method, that requires optimization. Cu contents are shown next and the Ni below their respective limits of quantitation (LOQs), in both methods and for all samples. However, the DU method showed improved LOQs for Ca, Cu, Fe and Zn, while the CA method for K, Mn, Na and Ni, and for the Li the results are similar. Statistical tests, F and paired t (95% confidence) applied to the results of both methods show that there arent significant differences between their accuracy and concentrations in all species, and between samples of Fo and Fo-Fl. The quantification of MR with the use of established methods show good performance laboratory methods and their applicability in other environmental matrices, except for Fe in the CA method that are necessary adjustments. Furthermore, methods are promising for the determination of other metallic species. In general, the CA method presents in compared to the DU method, lower: the number of reactants, amounts of waste, handling steps and the risk of contamination of the sample. However, the CA method presents a low rate of destruction of organic matter and high energy consumption. Therefore, the methods have advantages and disadvantages, one over the other, attached to the treatments. In relation of the jambu nutritional potential, it is recommended for insertion in the human diet, whereas the intake of 50 g wet weight of this vegetable contributes a high content of Li and Mn, and the Fl are a Cu sources. The results obtained for the metallic species, ash and moisture in the samples studied are shown next to some literature data. The results show new methods options for processing samples for quantification of metallic species in plant tissues, as well as new information on national food consumed could be useful in complementation databases mineral composition and jambu popularization with a source nutrition.

O objetivo deste estudo foi identificar características de uso da luz para explicar a distribuição diferencial das espécies tolerantes à dessecação homeoclorófila Anemia flexuosa e peciloclorófila Pleurostima purpurea em ambientes sombreados e expostos, respectivamente, de comunidades vegetais de afloramentos rochosos. A cultivar Oryza sativa IAC 202 foi incluída para comparações. Durante um ciclo completo de desidratação - dessecação - reidratação foram avaliados parâmetros fotossintéticos de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a, associados ao conteúdo relativo de água (CRA) e de pigmentos fotossintéticos de plantas intactas sob temperatura e umidade relativa do ar constantes de 25°C e de 55%, respectivamente. As plantas foram submetidas à diferentes densidades de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF de 0, 100 e 400 ?mol fótons m-2s-1) nas fases de desidratação e dessecação, dependendo da espécie. O. sativa foi avaliada somente durante as fases de desidratação e dessecação sob condições ambientais variáveis de casa de vegetação. A diminuição da assimilação líquida de CO2 (A) foi acompanhada pelo aumento da dissipação de calor avaliada pelos coeficientes de extinção nãofotoquímica (qN e NPQ) nas três espécies. Após cessação de A, a eficiência quântica efetiva (?PSII e Fv\"/Fm\"), a taxa de transporte de elétrons (ETR) e o coeficiente de extinção fotoquímica (qP) foram mantidos relativamente altos em P.purpurea, mas cessaram simultaneamente com A em A.flexuosa. Em O.sativa, ?PSII, ETR e qP diminuíram substancialmente após a cessação de A, mas Fv\"/Fm\" foi mantido. A eficiência quântica potencial (Fv/Fm) foi a última variável a diminuir nas três espécies durante a desidratação. Após a reidratação de P.purpurea e A.flexuosa foi observado inicialmente o estabelecimento da respiração e em seguida um balanço levemente positivo de CO2, quando os valores de Fv\"/Fm\", ?PSII, ETR, qP e Fv/Fm de P.purpurea recuperaram quase totalmente, enquanto qN e NPQ diminuíram. A.flexuosa apresentou uma recuperação apenas parcial de Fv\"/Fm\", ?PSII, ETR, qP e Fv/Fm quando o balanço de CO2 se tornou levemente positivo, tendo sido a recuperação ainda menor para o tratamento de desidratação no escuro associado à dessecação na luz. A.flexuosa tolerou a perda de 88% do CRA. O enrolamento foliar durante a desidratação é uma forma de proteção contra a luz no estado dessecado de A.flexuosa. Mesmo no estado dessecado ocorrem processos de interação dos fotossistemas II com a luz em A.flexuosa. P.purpurea baseia sua proteção contra a luz na ativação de processos de dissipação de calor, vias de consumo de elétrons diferentes do ciclo redutivo do CO2 e, em última instância, na perda de clorofilas. Plantas dessecadas de P.purpurea permanecem viáveis no estado desidratado por pelo menos 42 dias. P.purpurea tolerou a perda de 94% do CRA. A recuperação do turgor da parte aérea de P.purpurea ocorre necessariamente pela absorção de água pelas raízes durante a reidratação. Foi evidenciada uma aclimatação de A.flexuosa quando desidratada sob condição de luz. Os resultados não foram conclusivos em relação à sustentação da hipótese, considerando que as diferenças de recuperação observadas para A.flexuosa nos diferentes tratamentos luminosos, em geral, não foram significativas. / The aim of this study was to identify characteristics of light use that could explain the differential distribution of homoiochlorophyllous and poikilochlorophyllous desiccation tolerant plants Anemia flexuosa and Pleurostima purpurea, respectively, in shaded and exposed microsites of rock outcrop plant communities. Oryza sativa IAC 202 was included in the study for comparisons. Leaf gas exchanges, fluorescence chlorophyll, relative water content (RWC) and photosynthetic pigment content were evaluated in intact plants under constant temperature and relative humidity of 25°C and 55%, respectively, during a complete cycle of dehydration - desiccation - rehydration. The plants were exposed to different photosynthetic photon flux densities (PPFD of 0, 100 and 400 ?mol photons m-2s-1) during dehydration and desiccation phases, according to species. O.sativa was evaluated only during dehydration and desiccation phases under variable environmental conditions in a greenhouse. In all species, the decrease in CO2 net assimilation (A) was accompanied by increased heat dissipation assessed by nonphotochemical quenching coefficients (qN and NPQ). The effective quantum yield (?PSII and Fv\"/Fm\"), electron transport rate (ETR) and photochemical quenching coefficient (qP) were kept relatively high after A cessation in P.purpurea, but in A.flexuosa ceased simultaneously with A. In O.sativa, ?PSII, ETR and qP decreased substantially after A cessation, but Fv\"/Fm\" was maintained. The potential quantum yield (Fv/Fm) was the last variable to decrease during dehydration in all species. After rehydration, the establishment of respiration was observed initially in P.purpurea and A.flexuosa. Then, a slightly positive CO2 balance was associated with the almost total recovery of Fv\"/Fm\", ?PSII, ETR, qP and Fv/Fm in P.purpurea, while qN and NPQ decreased. A.flexuosa showed only a partial recovery of Fv\"/Fm\", ?PSII, ETR, qP and Fv/Fm when the CO2 balance became slightly positive, and recovery was even lower for the treatment of dehydration in dark associated to desiccation in light. A.FLEXUOSA TOLERATES A LOSS OF 88% OF RWC. Leaf curling during dehydration is also a form of light protection in the dried state in A.flexuosa. Interactions between photosystem II and light occur even in the dried state of A.flexuosa. P.purpurea bases its protection against light activating heat dissipation process, ways of electron consumption different of reductive CO2 cycle and, in last instance, chlorophyll loss. P.purpurea remains viable in dried state for at least for 42 days, and tolerates a loss of 94% of RWC. The shoot rehydration in P.purpurea occurs necessarily by roots water uptake. A.flexuosa showed an acclimation when dried under light conditions. The results were not conclusive regarding the hypothesis, since differences in recovery observed for this species in the different light treatments, in general, were not significant.

Muitos estudos têm sido direcionados para gerar melhorias na cultura de cana-de-açúcar, sendo uma das alternativas o uso de técnicas biotecnológicas, como a embriogênese somática (ES). O objetivo deste projeto foi estudar a multiplicação celular na ES de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280. Culturas embriogênicas (CE) e não-embriogênicas (CNE) foram monitoradas e parâmetros bioquímicos foram analisados. Foi observado que CE e CNE apresentaram crescimento máximo aos 24 dias de cultivo, sendo que as CE apresentaram maior incremento em matéria fresca. Dos carboidratos analisados, a sacarose foi predominante em CE, enquanto a glicose predominou em CNE. Os conteúdos de glicose e frutose variaram simultaneamente em CE. As concentrações de amido, poliaminas (Pas) totais e a razão entre PAs [Razão PA= Put/(Spd+Spm)] apresentaram maiores valores nas CNE, sendo a espermidina a poliamina predominante em CE e putrescina em CNE. O conteúdo de proteínas totais foi significativamente maior em CE, em todas as fases de crescimento. / Many studies have been directed to generate improvements in the sugarcane cultures, one of the alternative use of biotechnology techniques such as somatic embryogenesis (SE). The objective of this project was to study the cell multiplication in SE of sugarcane, variety SP80-3280. Embryogenic cultures (EC) and non-embryogenic (NEC) were monitored and biochemical parameters were analyzed. Was observed that EC and NEC showed maximum growth to 24 days of culture, and the EC showed greater increase in fresh weight. Of the carbohydrates tested, sucrose was predominant in EC, while glucose was predominant in the NEC. The contents of glucose and fructose varied simultaneously in EC. The concentrations of starch, polyamines (PAs) and the ratio of total PAs [Ratio PA = Put / (Spd + Spm)] showed higher values in the NEC, and the spermidine is predominant polyamine to EC and putrescine is predominant in NEC. The content of total protein was significantly higher in CE, at all stages of growth.