A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse agronômico no genoma das plantas e pode ser empregada na tentativa de obter plantas resistentes a doenças. No entanto, para se obter uma planta transgênica é necessário primeiramente estabelecer um procotolo eficiente de regeneração de plantas in vitro. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a organogênese in vitro e a transformação genética de limão Volkameriano e laranja azeda com um fragmento do gene da capa protéica do CTV. Para a organogênese in vitro utilizou-se, como explante, segmento internodal, obtido de planta cultivada em casa-de-vegetação, segmento de epicótilo, coletado de plântula cultivada in vitro e segmento de cotilédone associado ao hipocótilo obtido de semente introduzida in vitro. Esses explantes foram mantidos em meio de cultura EME suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L- 1), sendo incubados sob fotoperíodo de 16 h de luz ou em condições de escuro por 30 dias e então transferidos para fotoperíodo de 16 h de luz. A avaliação foi realizada após 45 dias de cultivo, determinando-se o número de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A caracterização anatômica do processo de regeneração foi realizada por meio de cortes histológicos. Pela análise dos dados foi possível verificar que a organogênese in vitro ocorreu a partir dos três tipos de explantes testados, sendo que, nas duas espécies em estudo, os melhores resultados foram obtidos com o cultivo de segmento de cotilédone associado ao hipocótilo. As concentrações de BAP que estimularam as melhores taxas de regeneração foram de 1,0 e 1,5 mg L-1, para limão Volkameriano, e 0,5 e 1,0 mg L-1 para laranja azeda. A incubação dos explantes em ausência de luz favoreceu a regeneração in vitro. Pela análise histológica foi possível observar que o processo de regeneração, a partir dos três tipos de explantes testados, ocorreu por meio de organogênese indireta. O protocolo de desenvolvimento estabelecido durante os experimentos de organogênese in vitro foi utilizado para a transformação genética dessas espécies via Agrobacterium, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201, com um fragmento do gene da capa protéida do CTV, em uma construção gênica do tipo hairpin. As gemas de limão Volkameriano e laranja azeda identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS foram enxertadas in vitro em citrange Carrizo. A confirmação da transformação genética foi realizada pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento de 671 pb, correspondente a parte do gene amplificada. / Genetic transformation permits the introduction of agronomically important genes in plant genome and can be utilized in order to produce disease resistant plants. However for the recovery of transgenic plants is required to establish an efficient in vitro plant regeneration protocol. In this work the aim was to study an in vitro organogenesis and the genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with a sequence of the CTV coat protein gene. For in vitro organogenesis explant internodal segments collected from plants cultivated in greenhouse, epicotyl segments obtained from in vitro cultivated seedlings and cotyledon fragment with hypocotyl attached obtained from in vitro germinated seed were used as explant. These explants were cultured in EME medium supplemented with benzilaminopurine (BAP 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L-1). Cultures were maintained under a 16 h photoperiod or in the dark for 10 d and then transferred to a 16 h photoperiod. The evaluation was performed 45 d after the incubation determining the number of responsive explant and the number of buds per explant. The anatomical characterization of in vitro regeneration process was carried out through histological analyses. The in vitro organogenesis occurred in the three types of explant tested, however cotyledon fragment with hypocotyl attached showed higher morphogenetic potential in both species. The best responses of regeneration were obtained when the medium was supplementation with 1,0 e 1,5 mg L-1 BAP for the Volkamer lemon and 0,5 e 1,0 mg L-1 BAP for the sour orange. The incubation in darkness favored the in vitro regeneration. The histological analyses showed that the regeneration process occurred through indirect organogenesis in the three types of explants tested. The developed protocol was use for genetic transformation of Volkamer lemon and sour orange with Agrobacterium, containing pCAMBIA 2201 plasmid with a sequence of CTV coat protein gene, in a hairpin construction. Volkamer lemon and sour orange shoots identified as transgenic by histochemical test GUS were micrografted into Carrizo citrange. PCR analysis were performed after micrografted showing the presence of the 671 pb fragment of the transgene.

O crescimento de plantas, órgãos, tecidos e células in vitro depende do desenvolvimento de meios de cultura otimizados para a perfeita interação de componentes essenciais como fitorreguladores, fonte de carbono e nutrientes minerais. Os fatores que limitam o crescimento de órgãos ou tecido in vitro são similares a aqueles que limitam o crescimento in vivo. Com o objetivo de testar a influência do estado nutricional de plantas matrizes de cenoura Daucus carota Link em potássio na morfogênese in vitro, plantas obtidas de sementes germinadas em substrato e cultivadas em vasos com areia em condições de casa de vegetação, foram submetidas a tratamentos com soluções nutritivas contendo variáveis níveis de potássio. Decorridos 30 e 60 dias de tratamento, explantes dessas plantas (internódios) foram coletados, desinfetados e inoculados em meio de cultura sólido de MS contendo também diferentes concentrações de potássio e acrescido de 0,1mg.L -1 da auxina 2,4-D buscando indução de calogênese na ausência de luz. Diferenciação celular via embriogênese somática foi conseguida em ausência de auxina em condições de fotoperíodo de 16/8 horas (claro/escuro). A avaliação da calogênese foi feita aos 60 dias após a inoculação, com base na massa de matéria fresca e seca dos calos formados por explante. A avaliação da diferenciação celular (número de plantas/explante) e taxa de diferenciação celular (número de plantas/g de matéria seca de calos) foi realizada após 30 dias de cultivo em condições de luz. A indução de calogênese e crescimento celular nos explantes de matrizes tratadas foi influenciada pelo tratamento pelos níveis de K + na solução nutritiva e pela duração dos tratamentos. Explantes de matrizes tratadas com alta concentração de K + resultaram em indução e crescimento de calos em matéria fresca e seca inversamente proporcional à concentração de K + no meio de cultura tanto para tratamento por 30 dias como para 60 dias. Tratamentos de curta duração (30 dias) com altos níveis de K + nas soluções nutritivas e baixos níveis de K + no meio de cultura influenciaram negativamente a regeneração de plantas (nº plantas/explante) nos calos dos explantes das matrizes tratadas. No entanto, taxas mais altas de diferenciação celular (nº plantas/g de matéria seca de calos) ocorreram nos calos de explantes de matrizes tratadas por 30 dias com solução nutritiva contendo maiores níveis de potássio e inoculados em meio de cultura contendo concentrações iguais ou maiores de que a do meio MS. / The growth of plants, organs, tissues and cells in vitro culture depends on the development of optimized culture medium for the perfect interaction among essential components such as phytoregulators, carbon source and minerals nutrients. The factors limiting the growth of organs or tissues in vitro conditions are similar to those limiting growth in vivo conditions. The objective of this work was aimed at studying the influence of the potassium nutritional status of matrixes plants of carrot Daucus carota Link on the in vitro morphogenesis. Matrixes plants were obtained from seeds germinated in organic substratum and cultivated in plastic pots containing washed sand in greenhouse conditions. The matrixes plants were then submitted to treatments with nutrients solutions containing variable potassium levels. After 30 and 60 days treatment, explants (internodes) were collected, disinfested and inoculated in solid culture medium of Murashige and Skoog (MS) containing different potassium concentrations and supplemented with 0,1mg.L -1 of 2,4-D for callogenesis induction in dark conditions. Cell differentiation by somatic embryogenesis was pursued by culturing the calli in auxina-free same culture medium in growth room under photoperiod of 16/8 hours (light/dark). The evaluation of the callogenesis induction and cell growth was carried out 60 days after explants inoculation, based on the mass of fresh and dry matter accumulation on each explant. The evaluation of cell differentiation (plant formed/explant) and of cell differentiation rate (number of plants formed/g of dry matter of callus) was carried after 30 days of culturing under light conditions. Callogenesis induction and cell growth on the explants of treated matrixes plants were affected by the potassium treatment levels in the nutrient solution and by the duration of the treatments. Explants from treated plants with the higher K + concentrations showed callus induction and growth inversely proportional to the concentration of K + in the culture medium for both (30 and 60 days) treatment duration. However the callogenesis accumulated after 60 days treatment was twice as much as that of 30 days treatments. Short time treatments duration (30 days) with higher levels of K + in the nutrient solutions and low concentrations of K + in the culture medium influenced the cell differentiation negatively (nº plants/explant) in the callus of the explants from treated plants. Cells from calli induced on explants from matrixes plants for 30 days were more morphogenic than the cells in the 60 days treatment where high callogenesis was observed. Also better cell differentiation rate was observed on calli induced on explants from treated matrixes plants with nutrient solutions containing the highest potassium levels and inoculated on MS culture medium containing highest potassium concentrations.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagação tem merecido destaque devido à rápida produção de mudas saudáveis num espaço físico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axênicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta técnica, havendo a busca cada vez maior de métodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminação que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepção de contaminação dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axênica, pois inúmeros trabalhos têm mostrado, que mesmo em microplantas assintomáticas consideradas axênicas, existe uma comunidade endofítica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatização das culturas, sendo, portanto, microrganismos benéficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endofítica presente em diversas espécies de microplantas assintomáticas consideradas axênicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, método de micropropagação e manipulação. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomáticas, em fase de multiplicação por mais de um ano, provenientes de três laboratórios diferentes, submetidas à caracterização por meio de testes histoquímicos, à análises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois métodos (trituração e fragmentação), à análises moleculares utilizando a extração do DNA genômico total e PCR-DGGE, além da extração e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e análises ultraestruturais, evidenciaram a presença de uma comunidade endofítica, colonizando os tecidos de diferentes espécies de microplantas, provenientes de três laboratórios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistência de plantas axênicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endofítica pode atribuir características de interesse agronômico às diferentes espécies vegetais. / Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered \"axenic\" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species.

O cultivo in vitro de plantas possibilita o controle de fatores ambientais e nutricionais, facilitando o estudo da interação planta-bactéria e a interpretação de eventuais alterações morfofisiológicas nas microplantas, decorrentes dessa interação. Entretanto, a presença de bactérias endofíticas na micropropagação é quase sempre caracterizada como contaminação microbiana prejudicial, sendo prontamente eliminada com o uso de quimioterápicos. Essa abordagem desconsidera os efeitos benéficos que bactérias endofíticas podem trazer ao desenvolvimento vegetal, aniquilando a possibilidade de se explorar esse potencial no ambiente in vitro. Em geral, devido a sua baixa culturabilidade, as comunidades bacterianas endofíticas requerem o uso de técnicas independentes de cultivo para seu estudo. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal comprovar a presença de uma comunidade bacteriana endofítica em microplantas de abacaxizeiro (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel consideradas axênicas e os efeitos dessa comunidade na morfofisiologia vegetal após antibioticoterapia. Para tanto, técnicas de PCR-DGGE, PCR-ARISA, clonagem, sequenciamento, análises estruturais e ultraestruturais foram utilizadas. Os resultados evidenciaram que existe uma comunidade bacteriana endofítica composta por membros de Alfa, Beta, gama -proteobactérias, actinobactérias e cianobactérias, que coloniza as microplantas. Os resultados convergentes de PCR-DGGE e PCR-ARISA mostraram que essa comunidade apresentou alteração na sua estrutura e diversidade de acordo com seu nicho de colonização e com o período de cultivo da planta hospedeira, sem renovação de meio de cultura. A ação da antibioticoterapia influenciou a estrutura da comunidade bacteriana, promovendo impactos diferenciados em cada grupo bacteriano avaliado. A antibioticoterapia não promoveu a total eliminação das bactérias endofíticas. Contudo, os tratamentos ocasionaram alterações na comunidade bacteriana, resultando na redução do crescimento de raízes e outras alterações histológicas no sistema radicular das microplantas. As análises ultraestruturais comprovaram a presença de bactérias endofíticas colonizando intracelularmente o mesofilo foliar e o córtex de raízes, mesmo após a antibioticoterapia. Dessa forma, conclui-se que em microplantas de abacaxizeiro assintomáticas existe uma comunidade bacteriana endofítica intracelular, rompendo o principal paradigma da cultura de tecidos vegetais, no qual microplantas são obrigatoriamente axênicas. / The in vitro culture of plants by the control of environmental and nutritional factors, allows the study of the plant-bacteria interaction and the interpretation of possible morphophysiological changes in the microplants, from such interaction. However, the presence of endophytic bacteria in micropropagation is often characterized as harmful microbial contamination, which is promptly eliminated by the use of chemotherapeutics. This approach does not take into account the beneficial effects that endophytic bacteria can bring to the plant development, and annihilates the possibility of exploiting this potential in the in vitro environment. In general, due to its low culturability, endophytic bacterial communities require the use of culture-independent techniques for their study. In this context, this work aimed to prove the presence of bacterial endophytes in pineapple (Ananas comosus (L.) Merrill) cv. IAC Gomo-de-mel microplants considered axenics, and the effects of these in plant morphophysiology after antibiotictherapy. For this, PCR-DGGE, ARISA-PCR, cloning, sequencing, structural and ultrastructural analysis were used. The results showed that there is an endophytic bacterial community, composed of members of , , -proteobacteria, actinobacteria and cyanobacteria, which colonizes the microplants. The converging results of PCR-DGGE and ARISA-PCR showed that this community changed in its structure and diversity according to its niche of colonization and the period of cultivation of the host plant, without renewal of culture medium. The action of antibiotics influenced the bacterial community structure, promoting differential impacts on each bacterial group evaluated. Antibiotictherapy did not promote the total elimination of endophytic bacteria. However, the treatments caused changes in bacterial community, resulting in reduced growth of roots and other histological changes in the root system of the microplants. The ultrastructural analysis confirmed the presence of endophytic bacteria colonizing the intracellularly the leaf mesophyll and the cortex of roots, even after antibiotictherapy. Thus, it is concluded that in asymptomatic pineapple microplants there is an intracellular endophytic bacterial community, breaking the main paradigm of plant tissue culture, in which axenic microplants are mandatory.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated the UV-C irradiation in tissues of rachis with and without berries, and berries with stems of Vitis vinifera and Vitis labrusca. In berries of cv. Isabella, the volatile compounds were analyzed on days 2, 5 and 10 of storage at 20 ºC and the effect of UV-C irradiation on the 5th day of storage. The experiments were based on four treatments of UV-C radiation (0, 1, 2 and 3 kJ m-2) with four cv. (Niagara white, Trebbiano, Cabernet sauvignon and Isabella) and evaluation times (three in berries and four rachis). The rachis with and without berries and the berries with stems remained stored at 20 ºC to evaluate physiological parameters. Ethylene production rate, respiratory rate and total polyphenols were evaluated in all tissues. Only in the rachis was determined by weight loss on days 1, 3 and 5, reducing sugars, non-reducing sugars on the 5th day. Berries and the juice from the cv. Isabella the 5th day of storage at 20 °C the total soluble solids (TSS), titratable acidity (TA), anthocyanins, total phenols, sugars and the ratio (TSS/ TA) were measured. In berries of cv. Isabella on days 2, 5 and 10 storage and berries irradiated with UV-C in amounts of 0, 1, 2 and 3 kJ m-2, volatiles were extracted by solid phase microextration. After desorption, the volatile compounds were separated by gas chromatography, identified by mass spectrometry and quantified by flame ionization detector. For the sensory analysis of the juice discriminatory tests for paired comparison of difference and test ranking were used. The physiological response of UV-C irradiation depends on the cv. and the irradiated tissue. Only the rachis of grape Vitis labrusca ‗Niagara white behaves climateric during storage in post-harvest and may reduce the self life of table grapes. This study found a possible hormetic dose of 3 kJ m-2 only for the cv. Isabella berry. 84 volatile compounds were detected over the days of storage. After 5 days storage, berries irradiated with UV-C 66 volatiles were found. And the dose of 3 kJ m-2 increased the concentration of esters and aldehydes, and 43,8% increase in the total polyphenols in berry. In the paired comparison test of difference, the judges showed greater intensity in the aroma of the juice from grapes irradiated. In the ranking test, the judges were unable to discriminate between different doses of irradiation, though differing dose control (0 kJ m-2) of the irradiated treatments. The analytical test enabled by gas chromatography to determine statistical differences between the different doses detected volatiles, especially at a dose of 3 kJ m-2, in which panelists found no difference. / Este trabalho avaliou a irradiação UV-C em tecidos vegetais de ráquis com e sem bagas, e bagas com pedúnculo de Vitis vinifera e Vitis labrusca. Nas bagas da cv. Isabel, foram analisados os compostos voláteis nos dias 2, 5 e 10 de armazenamento a 20 ºC e sobre o efeito da irradiação UV-C no 5º dia de armazenamento. Os experimentos basearam-se em quatro tratamentos de irradiação UV-C (0, 1, 2 e 3 kJ m-2), com quatro cv. (Niágara branca, Trebbiano, Isabel e Cabernet sauvignon) e tempos de avaliação (três nas bagas e quatro nas ráquis). As ráquis com e sem bagas e as bagas com pedúnculo permaneceram armazenadas a 20 ºC para avaliar parâmetros fisiológicos. Em todos os tecidos foram avaliadas a taxa de produção de etileno, taxa respiratória e polifenóis totais. Apenas na ráquis foi determinado a perda de peso nos dias 1, 3 e 5, além de açúcares redutores e não redutores no 5º dia. Nas bagas e no suco da cv. Isabel do 5º dia de armazenamento a 20 ºC foram mensurados os sólidos solúveis totais (SST), acidez total titulável (ATT), antocianinas totais, polifenóis totais, açúcares totais e a relação (SST/ATT). Nas bagas da cv. Isabel dos dias 2, 5 e 10 de armazenamento e nas bagas irradiadas com UV-C nas doses de 0, 1, 2 e 3 kJ m-2, foram extraídos os compostos voláteis por microextração em fase sólida. Após a dessorção, os compostos voláteis foram separados em cromatógrafo a gás, identificados pelo espectrômetro de massas e quantificados por detector de ionização em chamas. Para a análise sensorial do suco, foram utilizados os testes discriminativos de comparação pareada de diferença e teste de ordenação. A resposta fisiológica da irradiação UV-C depende da cv. e do tecido irradiado. Apenas a ráquis da uva Vitis labrusca ‗Niágara branca se comporta de forma climatérica durante o armazenamento na pós-colheita, podendo reduzir a vida de prateleira da uva de mesa. Neste estudo foi encontrada uma possível dose hormética de 3 kJ m-2 somente para a baga da cv. Isabel. Foram detectados 84 compostos voláteis ao longo dos dias de armazenamento. No 5º dia de armazenamento, das bagas irradiadas com UV-C, foram encontrados 66 compostos voláteis, sendo que a dose de 3 kJ m-2 aumentou a concentração de ésteres e aldeídos, além de elevar em 43,8% os polifenóis totais na baga. No teste de comparação pareada de diferença, os provadores indicaram maior intensidade no aroma do suco proveniente de uvas irradiadas. No teste de ordenação, os julgadores não conseguiram discriminar as diferentes doses de irradiação, mas diferenciaram a dose controle (0 kJ m-2) dos tratamentos irradiados. O teste analítico por cromatografia gasosa permitiu determinar diferença estatística entre as doses nos diferentes compostos voláteis detectados, principalmente na dose de 3 kJ m-2, na qual os julgadores não encontraram diferença.

A semelhança entre os eventos da embriogênese zigótica e somática permite que sejam estabelecidos parâmetros para o acompanhamento destes dois processos. Neste trabalho foi estudada a embriogênese somática em Ocotea catharinensis, nas fases de maturação e germinação, além do processo germinativo da semente zigótica, avaliando-se parâmetros bioquímicos, e a expressão diferencial de proteínas. O tratamento com ABA + PEG em culturas de embriões somáticos apresentou variações semelhantes a apresentadas por embriões zigóticos no estádio de maturação. Não se observou a germinação de embriões somáticos, contudo verificou-se que a desidratação prévia promoveu importantes alterações bioquímicas. Durante a germinação, não se observou à síntese de novas proteínas no embrião zigótico. Os estudos proteômicos no desenvolvimento da semente permitiram a seleção de polipeptídios, marcadores estádio-específicos. Os resultados obtidos possibilitam a otimização e melhor entendimento das etapas da embriogênese somática, em espécies com sementes recalcitrantes, como O. catharinensis. / The great similarity among the events of zygotic and somatic embryogenesis allows the establishment of parameters for accompaniment of these processes. In the present work it was studied the somatic embryogenesis in Ocotea catharinensis, in the maturation and germination phases, and the zygotic embryogenesis. The biochemical parameters and differential expression of proteins were evaluated: The treatment with ABA + PEG presented similar variations for zygotic embryos in the maturation stage. The germination was not observed for somatic embryos; however, it was verified that the previous dehydration promoted important biochemical alterations. With relation to the zygotic embryo, throughout the germination process, the synthesis of new proteins was not observed. The proteomic studies carried out throughout seed development, allowed the selection of polypeptides with differential expression. The results obtained open perspectives for the methodology optimization of the somatic embryogenesis, for species with recalcitrant seeds, like O. catharinensis.

O. catharinensis e O. odorifera são árvores originárias da Mata Atlântica. Historicamente estas espécies foram intensamente exploradas e atualmente encontram-se vulneráveis de extinção. A embriogênese somática é uma ferramenta de grande potencial na reprodução de espécies de difícil propagação. No presente trabalho analisou-se o efeito dos meios de cultura MS e WPM e de diferentes de ANA e 2,4-D na indução da embriogênese somática nessas espécies. Em O. catharinensis a combinação WPM + 2,4-D mostrou-se mais efetiva na indução de calos. Resultados mais expressivos foram observados no tratamento WPM + 144µM 2,4-D. Os piores índices de indução foram obtidos no meio MS + 2,4-D. Em O. odorifera não foi utilizado o meio MS. Nesta espécie, mais importante do que o tipo do regulador de crescimento foi sua concentração. Maiores percentuais de calos foram observados em concentrações mais elevadas desses reguladores. WPM + ANA mostrou-se bastante efetivo em O. odorifera, ao contrário do que foi observado em O. catharinensis, onde os resultados foram pouco expressivos. / O. catharinensis and. O. odorifera are originary trees of the brazilian Rain Forest. Historically these species had been intensely explored and are currently considered vulnerable of extintion. Somatic embryogenesis is a tool of great potential in the reproduction of species of difficult propagation. In the present work was analyzed the effect of MS and WPM and different concentrations of ANA and 2,4-D in the iniciation of somatic embryogenesis in this species. In O. catharinensis WPM + 2,4-D revealed more effective in the induction of callus. More expressive results had been observed in the treatment WPM + 144µM 2,4-D. The worse rates of induction had been observed at the combination MS + 2,4-D. In O. odorifera the MS medium was not used. In this specie more important of what the type of the growth regulator was its concentration. Higher rates of callus had been observed at higher concentrations of these regulators. WPM + ANA revealed effective in O. odorifera, in contrast of what was observed in O. catharinensis, where the results had been little expressive.

A cana-de-açúcar é uma das principais culturas agroindustriais do Brasil, sendo amplamente cultivada para a produção de açúcar e etanol. Esta cultura se torna a cada dia mais importante no cenário mundial, devido à busca constante por fontes de energia alternativas e mais sustentáveis. Para atender a crescente demanda, é necessária a liberação frequente de novas variedades, mais adaptadas às regiões de cultivo e tolerantes às alterações ambientais. Assim, o estabelecimento da metodologia de transformação genética além de contribuir para o estudo funcional de genes de interesse é uma metodologia alternativa para obtenção de novas variedades. O processo de obtenção de transgênicos é dependente de um eficiente protocolo de regeneração de plantas in vitro, que geralmente envolve uma fase de formação de células indiferenciadas (calos). A indução e a manutenção dos calos são favoráveis ao aumento da atividade de elementos de transposição (ETs) os quais são muito freqüentes no genoma de cana e podem acarretar variabilidade no genoma vegetal pela alteração dos padrões e funções gênicas devido a essa mobilização, afrontando a fidelidade genética dos cultivares transgênicos obtidos. Baseando-se na importância de reduzir o período de cultura de tecidos e controlar a atividade dos ETs durante o desenvolvimento in vitro, o objetivo desse trabalho foi buscar alternativas no controle e na redução do tempo para regeneração de plantas, inclusive com a aplicação de peptídeos hormonais, assim como de transformar geneticamente as variedades RB835089 e RB835486 com o gene Ddm1 de Arabidopsis, visando o silenciamento dos elementos de transposição em cana-de-açúcar. Para isso, foram analisados os meios de cultura MS3c e ML1G1 e o efeito da água de coco na indução e formação de calos como também na regeneração de plantas. Foram testados os meios de regeneração de plantas MSAc, SRM, ML1R3 e ML1R4, obtendo-se em média 5,2 plantas por explante no meio MSAc, que foi superior aos demais meios. Este meio foi utilizado para testar o efeito individual dos peptídeos hormonais CLV3 e PSK- em calos embriogênicos, os quais apresentaram acréscimo na regeneração de plantas para 9,3 plantas por explantes com doses de 30 µM de PSK-a. A transformação genética por biolística através da cotransformação dos genes neo e AtDdm1 resultou em 34 plantas transgênicas. O estudo da mobilização dos ETs durante o desenvolvimento in vitro foi realizado para quatro retrotransposons. A expressão heteróloga do gene AtDdm1 em cana-de-açúcar mostrou atuar no controle da expressão do retroelemento TE010. O estudo da mobilização dos retrotransposons e do gene Ddm1 endógeno de cana (SsDdm1) durante o desenvolvimento in vitro confirmou que o gene SsDdm1 foi chave no controle da expressão dos retroelementos. A transformação genética com o gene AtDdm1 aliada a rápida regeneração de plantas a partir de discos foliares possibilitam condições que minimizam a expressão dos ETs em cana-de-açúcar. / Sugarcane is one of the major agro-industrial crops of Brazil being widely cultivated for the production of sugar and ethanol. This culture has become increasingly more important on the world stage each day due to the constant search for alternative and sustainable energy sources. In order to meet growing demand, it is necessary to often release new varieties, better adapted to cultivated expansion area and tolerant to environmental changes. Thus, the establishing of genetic transformation methodology beyond of contributing to the functional study of genes of interest and it is an alternative method for obtaining new varieties. The process of obtaining transgenic plants is dependent of an efficient protocol for in vitro plant regeneration, which generally involves a phase of undifferentiated cells (callus). The induction and maintenance of callus are favorable to increase the activity of transposable elements (TEs) which are very frequent in the genome of sugarcane and may cause variability in the plant genome by altering patterns and gene functions due to this mobilization, confronting the genetic fidelity of the transgenic cultivars obtained. Based on the importance of reducing the period of tissue culture and control the activity of TEs during in vitro development, the objective of this work was to seek alternatives to control and reduce the time for plant regeneration, including the use of peptides hormone, as well as to genetically transform sugarcane varieties RB835089 and RB835486 with the Ddm1 Arabidopsis gene to silence the transposable elements in cane sugar. For this, we tested the culture media MS3c and ML1G1and the effect of coconut water in callus induction and growth as well as on plant regeneration. We tested the plant regeneration media MSAc, SRM, ML1R3 and ML1R4, obtaining an average of 5.2 plants per explants using MSAC, superior to other medium tested. It was used to test the individual effect of peptides hormones such as CLV3 and PSK- in embryogenic callus, which showed an increase in plant regeneration to 9.3 plants per explant with doses of 30µM PSK-a. Genetic co-transformation with the neo and AtDdm1 genes by biolistic resulted in 34 transgenic plants. A study of TEs during in vitro development was performed for four retrotransposons. Heterologous expression of the AtDdm1 gene in sugarcane showed to control the expression of the retroelement TE010. The study of mobilization of retrotransposons and the endogenous Ddm1 gene (SsDdm1) during in vitro development confirmed that SsDdm1 was key gene in controlling the expression of retrotransposons. Genetic transformation with the AtDdm1 gene and the fast regeneration of plants provide positive conditions to minimize the expression of ETs in sugarcane.

Esta tese apresenta o desenvolvimento de metodologias analíticas em sistemas de solução em fluxo com detecção amperométrica e espectrofotométrica explorando a utilização de tecidos vegetais como fonte enzimática para a biocatálise de reações. Desempenhos satisfatórios foram obtidos com a utilização do mesocarpo fibroso do coco (Cocus nucifera, L.) e com a casca e/ou polpa de frutos da palmeira leque (Latania sp), fontes de polifenol oxidase. Uma metodologia, simples e rápida, para a determinação dos parâmetros bioquímicos da polifenol oxidase foi desenvolvida ao longo do presente trabalho com a enzima naturalmente imobilizada no tecido do coco, pela eliminação das etapas de extração e de purificação e associando-se análise em fluxo e espectrofotometria. Parâmetros cinéticos importantes como o efeito do pH, a constante de Michaelis-Menten (Km), a velocidade máxima (Vmax),a energia de ativação (Ea) e os parâmetros térmicos (valores D, z e Q10)foram determinados utilizando como substrato o catecol. A atividade relativa junto a diferentes substratos e o efeito de inibidores foram também avaliados. Aplicações envolvendo estes tecidos vegetais em reatores empacotados (associados com FIA) ou incorporados em eletrodos de pasta de carbono (medidas realizadas em batelada) para a determinação de produtos fenólicos como catecol, fenol e dopamina, inibidores da atividade enzimática como o sulfito, bem como para a quantificação do conteúdo de água, demonstram a sua versatilidade. Os produtos fenólicos foram quantificados com boa sensibilidade (na faixa de µmol L-1) pela redução amperométrica das respectivas quinonas, produzidas pela oxidação enzimática. Aplicações com amostras reais, dentre as quais água de rio e resíduos de uma fábrica de papel puderam ser implementadas. A determinação do conteúdo de água em meio aquo-restrito explorou a estimulação, pela água, da atividade catalitica da polifenoI oxidase naturalmente imobilizada no mesocarpo fibroso do coco na presença de catecol. Esta propriedade foi utilizada para a determinação rápida e reprodutível do conteúdo de água em amostras comerciais de álcool, utilizando acetonitrila como carregador. A quantificação de sulfito baseou-se no seu efeito inibidor sobre a polifenol oxidase naturalmente imobilizada em relação à catálise oxidativa do catecol. Diversos interferentes comumente presentes em amostras de vinho foram também investigados. Durante este trabalho, foi desenvolvida uma simples e interessante maneira de conservar o mesocarpo fibroso do coco como fonte de polifenol oxidase naturalmente imobilizada. O tecido desta fruta foi desidratado e moído. O pó deste tecido, estocado a mais de dois anos à temperatura ambiente, ainda apresenta boa atividade enzimática. / The development of analytical methodologies exploring plant tissues as enzymatic source for biocatalysis of many reactions is presented in this thesis. Amperometry and spectrophotometry was associated with flow analysis for analytical purposes and for biochemical characterization of naturally immobilized polyphenol oxidase. Good performance was achieved with tissues from the fruits of two palm trees: the fibrous mesocarp of green coconut fruits, Cocus nucifera, L., and the skin and the pulp of green fruits from Latania sp. Both tissues are very effective in the biotransformation of o-diphenols to the corresponding o-quinones. A simple, fast, and new methodology for the determination of the biochemical parameters of the poyphenol oxidase naturally immobilized on the fibrous tissue was developed (eliminating the extraction and purification of enzymes) by association of flow injection analysis and spectrophotometry. For coconut tissue, cinetic parameters like pH effect, Michaelis-Menten constant (Km) and maximum rate (Vmax), activation energy (Ea) and thermal parameters (D, z and Q10values) on catechol biotransformation were determined. Also the response for several substrates as too for various inhibitors was explored. Amperometric quantification of phenolic compounds was made using the vegetal tissue in form of packed reactors (associated with FIA) or incorporated in carbon paste electrodes (measurements in batch). Very good response for catechol, phenol and dopamine was registered for this compounds, with very high sensitivity (µmol L-1 range). Applicability to real samples as for river water and for a paper plant waste water was verified. The same amperometry-FIA system was employed for enzymology in non-aqueous medium. The activity of the polyphenol oxidase contained in coconut tissues are strongly dependent of water. The strategy involves the stimulation by the content of water on the biocatalytic activity of the enzyme in the presence of catechol substrate. This strategy was used for the determination of water content in alcohol samples, in medium of dry acetonitrile. The inhibition of the enzymatic activity produced by many compounds can be explored for an indirect quantification of the inhibitor. A flow injection amperometric procedure was developed for the determination of sulphite ion based in its inhibitory effect on the activity of polyphenol oxidase on the oxidation of catechol. The effect on the bioreactor performance of potential interferents commonly present in wine samples were also investigated. During this work, it was developed a simple and interesting way to preserve coconut tissue. The mesocarp of this fruit can be dried and grounded. These tissues still with very good activity after more than two years in \"shelf temperature\".

O presente trabalho teve como principal objetivo obter plantas transgênicas, dos cultivares porta-enxerto limão \'Cravo\' e laranja azeda e de cultivares copa de laranja doce, expressando genes que possam influenciar no nível de resistência ao vírus da tristeza dos citros (CTV) e, possivelmente à morte súbita dos citros. Buscou-se ainda estudar a organogênese in vitro de espécies cítricas. Experimentos para a indução da organogênese in vitro foram realizados a partir de segmentos de epicótilos de plântulas germinadas in vitro de espécies cítricas avaliando-se: a resposta organogênica de três diferentes regiões do epicótilo, na presença (1,0 mg.L-1) ou ausência de BAP, em meio MT, e a regeneração em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) adicionadas ao meio MT. Também avaliou-se a regeneração de segmentos internodais de limão ?Cravo? e laranja azeda em diferentes concentrações de BAP (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) em meio MT; e de laranja azeda em meio de cultura MT e DBA3, suplementados com diferentes concentrações de BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) e ANA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). Foi utilizado o método de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens utilizando-se tecido juvenil coletado de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais) como explantes. Utilizou-se a estirpe EHA105 de A. tumefaciens, contendo os plasmídeos: a) pCTV-CP: contendo o gene da capa protéica do CTV; b) pCTV-dsCP: contendo repetições invertidas do gene da capa protéica do CTV, interligadas pelo intron do gene da quitinase de citros; c) pCTVcons: contendo uma seqüência conservada antisense do CTV. As construções gênicas foram elaboradas a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e o terminador NOS. Foram utilizados também os genes de seleção nptII e o repórter GUS. As gemas adventícias desenvolvidas foram identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS e por PCR e a confirmação da transformação genética foi feita por Southern Blot. A expressão da proteína do CTV foi verificada pelo teste serológico de PTA-ELISA. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e das concentrações da citocinina BAP é dependente do cultivar de citros. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP proporcionou um maior número de gemas adventícias regeneradas por explante, tanto em segmentos de epicótilo como em segmentos internodais dos cultivares de citros estudados. A suplementação do meio de cultura com a citocinina BAP é essencial na regeneração de gemas adventícias em segmentos internodais de laranja azeda. Foi possível regenerar plantas transgênicas, pelo protocolo de transformação genética mediado por Agrobacterium tumefaciens de limão \'Cravo\' contendo o gene da capa protéica do vírus da tristeza dos citros (pCTV-CP) utilizando-se segmentos de epicótilo e segmentos internodais como fonte de explante, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos internodias; e de laranja \'Hamlin\' contendo o gene da capa protéica do CTV, com as construções gênicas pCTV-dsCP e pCTV-CP, e com uma seqüência conservada antisense do CTV, utilizando-se segmentos de epicótilo como fonte de explante. / The objective of the present work was to obtain transgenic plants of rootstocks Rangpur lime and sour orange as well as sweet orange scion varieties, expressing genes that would possibly influence the levels of resistance to the Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus sudden death disease. The in vitro organogenesis of Citrus species was also studied. In vitro organogenesis experiments were conducted with epicotyl segments obtained from in vitro germinated seedlings of different Citrus species in order to evaluate: organogenic response of three epicotyl regions, in the presence (1,0 mg.L-1) or absence of BAP, in MT medium, and the regeneration using different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg.L-1) added to MT medium. The regeneration of internodal segments of Rangpur lime and sour orange was evaluated in MT medium with different BAP concentrations (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg.L-1) as well as sour orange regeneration in MT and DBA3 mediums, supplemented with different concentrations of BAP (0; 1,0 e 2,0 mg.L-1) and NAA (0; 0,3 e 0,5 mg.L-1). The Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation method of juvenile tissue obtained from in vitro (epicotyls) or green house cultivated plants (internodal segments) was used in this work. The EHA 105 strain was used with the following plasmids: a) pCTV-CP: containing the coat protein gene from CTV; b) pCTV-dsCP: containing inverted repeats of the coat protein gene from CTV interconnected by the Citrus quitinase gene intron; c) pCTVcons: containing an antisense sequence of CTV untranslated region. The gene constructs were built from the pCAMBIA 2201 plasmid, and contained the 35S promoter and the NOS terminator. The nptII selection gene and the GUS reporter gene were also used. The adventitious buds developed were identified as transgenic by GUS histochemical test and PCR, these results were later confirmed by Southern Blot. The transgenic coat protein expression was detected by the serological test PTA-ELISA. The morphogenic response related to the epicotyl region and BAP cytokinin were dependent on the Citrus varieties. The addition of BAP cytokinin to the culture medium showed a greater number of adventitious buds regenerated per explant in both epicotyl and internodal segments of the Citrus varieties studied. The addition of BAP to the culture medium is essential for the regeneration of adventitious buds in sour orange internodal segments. Using the Agrobacterium mediated genetic transformation protocol it was possible to regenerate transgenic plants of different varieties and gene constructs: Rangpur lime containing the coat protein gene of CTV (pCTV-CP) using epicotyl and internodal segments as explant source, and an antisense sequence of CTV untranslated region using internodal segments as explant source; Hamlin sweet orange containing the coat protein gene of CTV in constructions pCTV-CP and pCTV-dsCP, and an antisense sequence of CTV untranslated region using epicotyl segments as explant source.