Les ganglions de la base (GB) sont un ensemble de structures sous-corticales interconnectées impliquées dans l'apprentissage et le contrôle moteur mais aussi dans des processus motivationnels. Le fonctionnement des GB est fortement dépendant de l'équilibre d'activité entre les voies directe (striatonigrale) et indirecte (striatopallidale) par lesquelles le striatum, la principale structure d'entrée du réseau, contrôle les structures de sortie. L'objectif de ce travail était de développer et caractériser un modèle d'ablation sélective des neurones de la voie directe pour appréhender leur rôle dans les comportements impliquant les GB. Ce modèle repose sur l'expression, par transgénèse additive, du récepteur humain à la toxine diphtérique (DT) couplé à la GFP sous le contrôle du promoteur du gène slc35d3 exprimé dans les neurones striatonigraux et pas dans les striatopallidaux. La caractérisation cellulaire a été réalisée 15 jours après injection unilatérale de DT dans le striatum dorsal. La spécificité de l'atteinte est vérifiée par la diminution sélective (70%) de l'expression génique du précurseur de la substance P, marqueur de la voie directe, sans changement de celle du précurseur des enképhalines, marqueur de la voie indirecte. Les populations d'interneurones sont préservées à l'exception des interneurones cholinergiques dont le nombre est réduit de 50%. Un faisceau d'arguments démontre que cette baisse ne serait pas due à un effet direct de la DT sur les interneurones cholinergiques mais serait secondaire à la perte des neurones striatonigraux, mettant en évidence un lien étroit entre ces deux populations. / The basal ganglia (BG) are a set of subcortical structures implicated in motor learning and motor function as well as in motivational processes. BG functioning is thought to be highly dependent on the balanced activity between the direct (striatonigral) and indirect (striatopallidal) pathways by which the striatum, the main input station of the network, controls the output structures. This study aimed at developing and characterizing a model of selective ablation of the direct pathway to decipher its specific role in BG-related functions and disorders. The promoter of the slc35d3 gene, which is enriched in the striatonigral neurons, has been used to drive expression of the human diphtheria toxin (DT) receptor coupled to GFP selectively in these neurons by additive transgenesis. The cellular characterization has been performed 15 days after unilateral DT injection in the dorsal striatum. The ablation specificity is demonstrated by the selective decrease (70%) in substance P precursor mRNA levels, a marker of the direct pathway, with no change in enkephalin precursor gene expression, a marker of the indirect pathway. Striatal interneuron populations are spared, except the cholinergic population, which is reduced by about 50%. Evidence is provided that this loss may not be a direct effect of DT but a consequence of striatonigral neuron loss, revealing their crucial role for cholinergic interneuron viability. Then, we analyzed the functional consequences of the bilateral lesion of the striatonigral pathway (50-60% neuronal loss) either in the dorsal striatum or in the nucleus accumbens (NAc).

L'objectif principal de ces travaux de thèse est de développer des modèles membranaires biomimétiques pour la reconstitution et l'étude d'interactions protéine/membrane. Dans ce but, deux approches sont adoptées : l'une mettant en œuvre une plateforme basée sur des nanoparticules de silice/Au recouvertes de lipides et l'autre comprenant la formation de bicouches lipidiques découplées d'un support solide d'or. Dans la première approche, nous avons synthétisé des particules de silice de taille nanométrique contenant des grains d'or inclus dans la matrice silicique. Ces nanoparticules sont ensuite recouvertes par différents phospholipides. Les propriétés plasmoniques acquises grâce aux grains d'or sont caractérisées puis utilisées pour suivre l'interaction avec les lipides et/ou les protéines. Le suivi de ces interactions est également visualisé par analyse de la mobilité électrophorétique des particules. La deuxième stratégie développée, consiste à assembler un système membranaire sur une surface solide d'or. Dans un premier temps, une couche de calmoduline est liée à la surface de manière stable. Dans un deuxième temps, une bicouche est formée au-dessus de la couche de calmoduline par deux méthodes. La première méthode consiste à ancrer la bicouche directement sur la couche de protéine par un mécanisme faisant intervenir des lipides chélateurs. Alors que dans la deuxième méthode les lipides sont liés à la surface et découplés grâce à l'utilisation d'une surface d'or modifiée par de la cystéamine et à des lipides fonctionnalisés. L'ancrage est assuré par des groupements succinimidyl et le découplage par des polymères de polyéthylène glycol porté sur un même lipide. Dans les deux stratégies, un réservoir sub-membranaire est créé entre la bicouche étanche et le support. Le suivi des constructions moléculaires est réalisé par résonance plasmonique de surface et analyse du retour de fluorescence. De plus le système est implémenté par des électrodes afin d'étudier l'effet d'application de potentiel sur la bicouche. Après caractérisation, le modèle membranaire est validé par la reconstitution de la translocation de la toxine CyaA de Bordetella pertussis. Cette protéine dispose en effet d'un mécanisme d'internalisation singulier qui permet d'explorer tout le potentiel de notre modèle membranaire. / The main objective of this work is to develop biomimetic membrane models for the reconstitution and study of protein/membrane interaction. Two devices were designed: one operate a nanometric platform composed of phospholipids coated lipid silica/Au nanoparticles, while the other including tethered lipid bilayer reconstitution on a gold surface. The first approach needs the synthesis of nanometer sized gold/silica particles and that are subsequently coated with different phospholipids. The plasmonic properties provided by gold seeds are characterized and they are of utility to follow the interaction between lipids and/or proteins at the surface. Following of these interactions was also realized with electrophoretic mobility analysis. The second biomimetic device involves a membrane assembly on a gold surface. In a first time, a calmodulin layer is bound on the surface. In a second time, a lipid bilayer is assembled above the calmodulin layer by two approaches. In the first approach the lipid bilayer is anchored on the protein layer with chelators lipid and His-Tag bearing by the proteins. While, in the second approach, lipids are bound on the surface and tethered with the use of a cysteamin modified gold surface and functionalized lipids. The anchorage is realized by succinimidyl group and the tethering by polyethylene glycol group wearing by one kind of lipid. A sub-membrane reservoir is created under the lipid bilayer. The biomimetic model formation was followed by plasmonic resonance and fluorescence recovery after photobleaching. After their characterization the tethered model is validated by reconstitution of a particular mechanism: the CyaA toxin from Bordetella pertussis translocation.

La plasticité génomique de Staphylococcus aureus lui permet d’acquérir des gènes codant des facteurs de virulence mais aussi des gènes de résistance aux antibiotiques, notamment la cassette de résistance à la méticilline (SCCmec). La résistance à la méticilline est d’abord apparue dans des souches hospitalières à l’origine de grands clones pandémiques nosocomiaux, puis a ensuite émergé en milieu communautaire chez des souches virulentes possédant la leucocidine de Panton-Valentine. Nous avons observé en 2002, en milieu hospitalier et communautaire, l’émergence inquiétante de S. aureus résistant à la méticilline (SARM) portant le gène tst de la toxine du choc toxique staphylococcique (TSST-1). Notre travail a consisté à : (i) l’élaboration de nouveaux outils contribuant à la description de clones de SARM, notamment d’un outil de typage de la cassette SCCmec, (ii) la caractérisation phénotypique et moléculaire de ce nouveau clone, (iii) l’étude de l’épidémiologie de ce clone, (iv) l’exploration de la pathogénie de ce clone en recherchant les propriétés génétiques qui lui confèrent une telle virulence et épidémicité, et notamment en identifiant le rôle de la TSST-1. Le clone de SARM tst+ est un clone épidémique de fond génétique ST5 en Multi Locus Sequence yping, atteignant principalement les sujets jeunes, et responsable d’infections variées à la fois toxiniques et suppuratives. Il est doté d’une cassette SCCmec atypique de type I tronquée dont le rôle dans le potentiel épidémique et de virulence de ce clone reste à déterminer. Enfin, la TSST-1 ne semble pas jouer un rôle déterminant, direct ou indirect, dans la pathogénie pléiotropique de ce clone / The plasticity of the Staphylococcus aureus genome confers to this specie the ability to gain accessory genes encoding virulence factors as well as antibiotic resistance determinants such as Staphylococcal cassette chromosome mec SCCmec that encodes methicillin-resistance. Methicillin resistance first emerged in hospital-acquired strains originally of successful nosocomial pandemic clones, and is also risen in virulent community-acquired strains containing the Panton-Valentine leucocidin. In 2002, we observed the worrying emergence of a new methicillin-resistant S. aureus (MRSA) clone that contains the tst gene encoding toxic shock syndrome toxin (TSST-1) responsible for both hospital and community-acquired infections. Our study was focused on: (i) new tools for MRSA description, mainly on a SCCmec typing tool, (ii) the characterisation of this new clone by molecular and phenotypic methods, (iii) the epidemiology of this clone, (iv) the pathogenic potential of this clone and the investigation of the genetic features that enhance transmission and virulence, particularly the role of TSST-1. The tst+ MRSA clone is an epidemic clone of genetic background ST5 by multilocus sequence typing that occurs mainly in young people and is responsible for a wide diversity of clinical syndromes including toxin-mediated and suppurative diseases. This clone harbours a peculiar cassette “truncated SCCmec type I” which could play an important role in virulence and transmission but are still under investigation. TSST-1 does not play a determining role (either directly or indirectly) in the pleiotropic pathogenesis of this clone

Depuis les 15 dernières années, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle majeur de l’architecture nucléaire dans la régulation de l’expression des gènes et ceci dans une grande diversité de processus biologiques. Bien que la réponse immunitaire soit un de ces processus, peu de données existent sur l’organisation spatiale du génome dans les cellules immunitaires et son impact sur la régulation des gènes dans le contexte d’une réponse à l’infection bactérienne. En utilisant le porc comme organisme modèle, nous avons concentré notre étude sur les macrophages dérivés de monocytes, premières lignes de défense contre les pathogènes. Les cellules immunitaires étant les cibles des mycotoxines, nous nous sommes également intéressés aux effets de la toxine T-2 sur les macrophages et leur réponse induite par les récepteurs TLR. Un effet cytotoxique de la T-2 à une dose de 10 nM, ainsi que des effets inhibiteurs sur certaines réponses liées aux récepteurs TLR ont été mis en évidence. Nous avons ensuite examiné si les changements dans l'expression des gènes dus à l'activation impliquent un repositionnement dans l'espace nucléaire. Une analyse du transcriptome a permis d’identifier les gènes différentiellement exprimés dans les macrophages activés par le mélange LPS-IFNγ et de mettre en évidence des réseaux de gènes impliqués lors de l’activation. Les 4 gènes les plus sur-exprimés (IL1β, IL8, CXCL10 et TNFα) et les 4 gènes les plus sous-exprimés (VIM, LGALS3, TUBA3 et IGF2) ont été sélectionnés pour analyser leur comportement dans l'espace nucléaire au cours de l’activation des macrophages en utilisant la technique FISH 3D. Parmi les 4 gènes sur-exprimés, 3 présentent des modifications de leur position durant le processus d'activation alors que les 4 gènes sous-exprimés ne montent pas de variation de leur position. L'analyse de la position des gènes par rapport à leurs territoires chromosomiques (TC) a été étendue à un second type de cellules immunitaires : les neutrophiles. Des résultats similaires ont été obtenus. Les analyses ont été ensuite complétées par l'étude des 4 gènes sur-exprimés dans un type cellulaire indépendant de la réponse immunitaire (fibroblastes). Nos données suggèrent que les relocalisations dans l'espace nucléaire des gènes différentiellement exprimés dans les cellules immunitaires activées sont gène spécifique, type cellulaire spécifique et concernent essentiellement ceux qui sont sur-exprimés. / For the past 15 years, numerous studies have highlighted the role of nuclear architecture in regulating gene expression in a variety of biological processes. Although the immune response is one of these processes, few data exist on the spatial organization of the genome in immune cells and its impact on gene regulation in the context of a response to bacterial infection. Using pigs as a model organism, we focused our study on monocytederived macrophages, the first lines of defence against pathogens. As immune cells are the targets of mycotoxins, we also studied the effects of T-2 toxin on macrophages and on their responses induced by TLRs. A cytotoxic effect of T-2 at a dose of 10 nM, and an inhibitory effect on some responses related to TLRs have been demonstrated. We then examined whether changes in gene expression due to activation involve a repositioning within the nuclear space. A transcriptome analysis allowed us to identify differentially expressed genes in macrophages activated by LPS-IFNγ and to analyze gene networks involved during activation. The top 4 up-regulated genes (IL1 beta, IL-8, CXCL10 and TNF) and the top 4 down-regulated ones (VIM LGALS3, TUBA3 and IGF2) have been selected to analyze their behaviour in nuclear space during macrophages activation using 3D FISH technique. Among the 4 up-regulated genes, 3 show changes in their position during the activation process while the 4 down-regulated ones did not reposition. The analysis of gene behaviours towards their chromosome territories (CT) was extended to neutrophils and similar results were obtained. The analyses were then completed by the study of the 4 up-regulated genes in a non immune cell type (fibroblast). Our data suggest that relocation in the nuclear space of genes differentially expressed in activated immune cells is gene and cell type specific and mostly concerns those that are up-regulated.

Les stratégies thérapeutiques mises en place contre le cancer ont de nos jours besoin de nouveaux médicaments, à la fois plus actifs que ceux déjà existants et induisant moins d’effets secondaires. Ces nouvelles stratégies visent à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses. Parmi ces stratégies, ces travaux de thèse concernent la vectorisation active, à l’aide d’un vecteur protéique dérivé de la toxine de Shiga, STxB. STxB reconnait spécifiquement son récepteur biologique Gb3, surexprimé à la surface des cellules cancéreuses humaines. Ce projet de recherche porte sur la conception et la synthèse de conjugués, combinant STxB et un agent cytotoxique. Le linker chimique, qui relie ces deux espèces, a été soigneusement conçu pour respecter les deux critères suivants : être suffisamment stable et néanmoins pouvoir être clivé pour libérer l’agent cytotoxique une fois les cellules cancéreuses atteintes. Un premier linker a été construit autour du motif mercaptoethanol, lié au vecteur STxB par une liaison disulfure. La libération de l’agent cytotoxique peut donc être initiée par un réducteur biologique comme le glutathion, puis par une étape d’auto-immolation. Ce linker a été appliqué à deux composés cytotoxiques très puissants, dérivés de l’auristatine, et a conduit à des résultats prometteurs in vitro. La labilité de la liaison ester à pH acide a également été mise à profit dans l’élaboration de deux linkers, conçus autour de motifs glutamate et thréoninate. L’utilisation d’un agent cytotoxique modérément puissant a été l’occasion de développer une stratégie de multivalence, consistant à augmenter la charge d’agents cytotoxiques sur STxB. Une autre option a été de considérer les nano-batônnets d’or comme une plate-forme nanométrique multimodale, capable de lier plusieurs milliers d’agents cytotoxiques et STxB. Enfin l’incorporation d’une séquence peptidique, connue pour être substrat d’une protéase, a donné lieu à une troisième étude, reposant sur un linker clivable plus sélectivement. Plusieurs linkers ont été étudiées, selon qu’ils libèrent l’agent cytotoxique sous sa forme native ou non. / We need new therapeutic strategies to treat cancerous patients by the discovery of new drugs that would be more active than those existing and especially assigning fewer side effects. These new therapies aim to specifically target cancer cells. Among the strategies for cancer targeting, we investigated drug-targeted strategies using a proteic carrier, STxB, derived from Shiga toxin. This protein recognizes specifically its biological receptor Gb3, which is over-expressed on human cancer cells. This work consisted in the design and synthesis of conjugates combining STxB and a cytotoxic drug. The chemical linker binding these two moieties was carefully designed in order to fit requirements of both stability and ability to trigger a drug-delivery. A first linker was designed around a mercaptoethanol core, able to be conjugated to STxB by a disulfide bond. This constitutes a drug-delivery trigger, activated by a biological reducing agent such as glutathion, and followed by a self-immolative step. Two highly potent conjugates of auristatin derivatives were obtained and showed promising results in vitro. The ester bonds lability in acidic pH was exploited for the design of two amino acid based linker. With the aim of increasing the ratio of drug on STxB, we investigated several multivalent linkers. Another option was to consider gold nanorods as a nanometric platform, able to carry thousands of drugs and STxB. The incorporation of a protease substrate to produce an enzyme-cleavable linker was investigated. Several spacers, which induced release of the drug under native form or under prodrug form, were designed and tested.

Der pilzliche Erreger der Schwarzen Sigatokakrankheit, Mycosphaerella fijiensis (Mf), befällt fast alle Sorten (cv) der angebauten Banane Musa sp. Dabei sind weder die Reaktionen der Wirtspflanzen gegenüber dem Pathogen noch dessen Pathogenität hinreichend charakterisiert. Eine besondere Bedeutung wurde für pilzliche Sekundärmetaboliten des Pentaketid-Biosyntheseweges als spezifische Toxine innerhalb des Pathosystems postuliert. Die vorliegende Arbeit hat die experimentelle Untersuchung der Wirt-Pathogeninteraktionen zur Zielsetzung und wendet Methoden der Gewebekultur und Chromatographie zur bio-chemischen und physiologischen Charakterisierung des pflanzlichen und pilzlichen Stoff-wechsels an. Bezüglich der pflanzlichen Abwehrmechanismen von resistenten Musa cv konnte eine hypersensitive Reaktion (HR), die Aktivierung des Enzyms PAL und die Anreicherung von post-infektionellen Substanzen zur Hemmung des Pilzwachstums nachgewiesen werden. Im Er-regermetabolismus wurden unter in vitro-Bedingungen die Pentaketide Flaviolin, 2-Hydroxy-juglon, Juglon und 2,4,8-Trihydroxytetralon (-THT) bestimmt. Die Konzentration an 2,4,8-THT konnte sowohl durch die Anwendung des synthetischen Wirkstoffes Tricyclazol ® sowie durch natürliche Aktivatoren aus interzellulärem Blattgewebe resistenter Musa cv stark gesteigert werden. Mf-Rohextrakte und ausgewählte pilzliche Substanzen wurden auf ihre Dosis-Wirkungsbeziehung gegenüber verschiedenen Musa cv untersucht. Unter in vivo-Bedingungen Mf-inokulierter Bananenpflanzen führte die Anwendung des Wirkstoffes zu einer als "zerstörerische HR" bezeichneten Nekrotisierung des Blattes in anfälligen und resistenten Sorten. Diese Ergebnisse belegen die Bedeutung des 2,4,8-THT für die Ausprägung nekrotischer Blatt-symptome, die in Abhängigkeit von der Konzentration zum jeweiligen Zeitpunkt Musa cv-spezifische Wirkungen hervorruft: In der resistenten Sorte führte die Steigerung von 2,4,8-THT zur HR und der Elizitierung postinfektioneller Abwehrreaktionen, die zur Inkompatibilität zwischen Pathogen und Wirtspflanze führen; in der anfälligen Sorte erreicht 2,4,8-THT erst nach Ausbildung einer kompatiblen Interaktion mit biotropher Ernährung toxische Dosen und wirkt als Virulenzfaktor in der nekrotrophen Phase der Pathogenese. / The fungal pathogen causing black Sigatoka disease, Mycosphaerella fijiensis (Mf), attacks almost all varieties (cv) of cultivated bananas and plantains Musa sp. However, neither the reactions of host plant in relation to the pathogen nor its pathogenicity has been characterized in detail. A special significance has been attributed to fungal secondary metabolites of pentaketid pathway as host-specific toxins within the pathosystem. The present study refers to the experimental investigation of host-pathogen interactions using tissue culture as well as chromatographic methods in order to characterize biochemical and physiological metabolisms of plant and fungus. With reference to plant defense mechanisms of resistant Musa cv, hypersensitive reaction (HR), activation of phenylalanine-ammonia lyase and accumulation of postinfectional substances which blocked fungal growth have been demonstrated. Using in vitro conditions, the pentaketide metabolites flaviolin, 2-hydroxyjuglone, juglone and 2,4,8-trihydroxytetralone (2,4,8-tht) had been determined. 2,4,8-tht concentration was significantly increased through the application of the synthetic compound tricyclazole ® and through natural activators extracted from resistant Musa cv intercellular space of leaf tissue. Dose-effect relationship between crude extracts and selected fungal substances applied to different Musa cv were investigated. Using in vivo conditions, the application of tricyclazole ® to host plants inoculated with Mf resulted in extensive necrosis of susceptible and resistant Musa cv leaves, characterized as "devastating HR". These results proof the importance of 2,4,8-tht for the development of necrotic leaf symptoms that causes host-specific reactions depending on their concentration at different moments of pathogenesis: The resistant Musa variety increases 2,4,8-tht causing HR and elicitation of postinfectional defense reactions that lead to incompatibility between pathogen and host plant; in the susceptible variety, 2,4,8-tht attains toxic doses only after establishment of a compatible interaction including biotrophic nutrition of the pathogen, acting as a virulence factor during the necrotrophic phase of pathogenesis.

Notre objectif était de rechercher une méthode d’évaluation musculaire afin de déterminer des facteurs de non réponse tissulaire à une injection de toxine botulique (TB) dans un muscle spastique, chez l’adulte post AVC et chez l’enfant paralysé cérébral (PC). Une étude de reproductibilité et 3 revues systématiques de la littérature ont été réalisées. Les mesures échographiques de l’épaisseur et de l’angle des pennation des fibres du muscle gastrocnémien médial en 2D sont reproductibles. La mesure du module d’élasticité par Shear Wave Ultrasound Elastography délivre une information fiable sur la rigidité du muscle gastrocnémien médial spastique au repos.L’analyse du devenir du muscle post-injection rapporte que la TB participe au remodelage du muscle spastique avec une atrophie persistante, répétition d’injections dépendante.L’étude de l’impact des traitements adjuvants à la TB chez l’enfant PC montre que le renforcement musculaire intensif, y compris des muscles injectés, permet de lutter contre l’atrophie sans renforcer la spasticité. Les plâtres d’allongement permettent d’optimiser le fonctionnement articulaire mais les preuves sur la diminution de la raideur musculaire restent faibles. Dans la description des facteurs pronostics d’efficacité, plus de la moitié des patients identifiés comme secondairement non-répondeurs à la TB dans la spasticité des membres ne sont pas immunisés contre la TB. Les anticorps neutralisants ne sont donc pas la principale cause de non-réponse secondaire. Une évaluation de la qualité musculaire échographique comme facteur pronostic de réponse à la TB et pour mesurer l’impact des traitements adjuvants devrait être réalisée régulièrement afin de déterminer à quel moment ces traitements ne sont plus favorables au système musculaire. / The aim was to investigate a muscle evaluation method to determine tissue factors leading to non-responsiveness to an injection of botulinum toxin (BTX) into a spastic muscle in adult post stroke and children with cerebral palsy (CP). A reproducibility study and 3 systematic literature reviews were carried out. 2D ultrasound measurements of thickness and pennation angle of medialis gastrocnemius muscle fibers are reproducible. Measurement of the modulus of elasticity by shear wave ultrasound elastography provides a reliable information about the rigidity of the spastic medial gastrocnemius muscle at rest.Analysis of the post-injection muscle fate found that BTX participates in the remodeling of the spastic muscle with persistent atrophy that is dependent on the repetition of the injections.Analysis of the impact of BTX adjuvant therapies in CP children showed that intensive muscle strengthening, including of the injected muscles, may help combat atrophy without increasing spasticity. Stretching casts are used to optimize joint function, but there is little evidence for a reduction in muscle stiffness. In the description of prognostic efficacy factors, more than half of patients identified as secondariy non-responders to BTX in limb spasticity tests were not immunized against BTX. Neutralizing antibodies were therefore not the main cause for secondary non-responsiveness. An ultrasound evaluation of muscle quality as a prognostic factor for BTX response and to measure the impact of adjuvant treatments must be regularly performed to determine when these treatments are no longer favourable for the muscle system.

Un 1er travail a étudié les effets osseux mandibulaires de l’injection unilatérale dans les muscles masticateurs de toxine botulique (BTX) chez le rat adulte. Ceci entraine une perte osseuse mandibulaire condylienne et alvéolaire homolatérale importante. Une hypertrophie osseuse de l’enthèse d’insertion mandibulaire du muscle digastrique a été observée et pourrait correspondre à une étiologie pour les tori. Les effets de la BTX sur le cartilage articulaire condylien mandibulaire dans le même modèle animal ont été recherchés par analyse microtomographique du cartilage articulaire après augmentation de contraste à l’acétate d’uranyle. Aucune différence d’épaisseur cartilagineuse n’a été mise en évidence entre les groupes contrôles et BTX.Le 3ème travail a consisté en l’étude histologique et microtomographique des tori mandibulaires chez l’homme.Les tori sont différents des exostoses des os longs par plusieurs caractéristiques (dont l’absence de Fe et Al dans la matrice osseuse) et une asymétrie du remodelage osseux a été mise en évidence.La 4ème partie a consisté en l’étude de la qualité osseuse et de la microvascularisation alvéolaire dans un modèle animal d’ostéonécrose mandibulaire (ONM) aux bisphosphonates (BP). Des signes cliniques et microtomographiques d’ONM ont été observés dans la majorité des cas. La minéralisation osseuse était plus élevée après imprégnation en BP. La microvascularisation osseuse alvéolaire apparaissait augmentée après avulsion dentaire chez les animaux contrôles mais pas chez les animaux ayant reçu des BP témoignant ainsi d’un effet anti angiogénique in vivo des BP qui pourrait jouer un rôle dans la physiopathologie de l’ONM. / First, bone changes at the mandible were studied after a unilateral botulinum toxin (BTX) injection in masticatory muscles in adult rats. A major alveolar and condylar bone loss was evidenced. The occurrence of a hypertrophic bone metaplasia at the digastric muscle enthesis was evidenced as well. This could constitute an etiological factor for tori. Then, condylar articular cartilage changes at the mandible were studied in the same BTX animal model, using microtomography after contrast enhancement of cartilage with uranyl acetate. Cartilage thickness measurement showed no difference when comparing control and BTX groups.A third work studied mandibular tori in human using histologic and microtomographic techniques. Tori appeared different from long bone exostoses by several characteristics (absence of Fe and Al in the bone matrix) and a specific asymmetric bone remodeling was evidenced.The fourth part consisted in the study of alveolar mandibular vascularization and quality of the bonematrix in an animal model of osteonecrosis of the jaws(ONJ) after bisphosphonates (BP) injections. Clinical and microtomographic signs of ONJ were found in mostof the cases. An increased mineralization of the alveolar bone was observed after BP impregnation. Microvascularization was increased after tooth extraction in the alveolar bone of control animals but it was impaired in ZA treated rats. Such an in vivo antiangiogenic effect of BPs could play a role in the pathophysiology of ONJ.

Les toxines Shiga (Stx) sont produites par Shigella dysenteriae et certaines espèces d’E. coli transmisent aux humains par la consommation d'aliments contaminés et causant des maladies graves. La toxine Stx est libérée par les bactéries dans l'intestin et par la suite, traverse les vaisseaux sanguins en aval pour atteindre leurs principaux organes cibles, notamment les reins. Les dommages causés aux reins peuvent entraîner des complications graves notamment Le syndrome hémolytique urémique (SHU). A ce jour, il n’existe aucun traitement disponible contre le SHU. Les toxines Stx usent du transport rétrograde intracellulaire pour infester les cellules endothéliales rénales et atteindre leur cible cytosolique, l'ARN ribosomal 28S. Via un screening à haut débit, il a été démontré que le composé Rétro-2 bloque le trafic rétrograde de Stx à l'interface Endosome-TGN, sans affecter la morphologie des organites cellulaires et le trafic des protéines endogènes. Au cours de cette thèse, une analyse des relations structure fonction du composé Retro-2 nous a permis d’identifier les régions de l'inhibiteur qui sont critiques pour l'activité de protection. Nous avons identifié un dérivé dihydroquinazolinone nommé Rétro-2.1 qui est à ce jour l'inhibiteur le plus puissant contre les toxines Stx. Afin d’identifier la cible moléculaire de Retro-2.1, nous avons développé des sondes photo-activables bio-actives. En outre, les données de diffraction des rayons X ont révélé que de l'activité antitoxine réside principalement dans l’énantiomère S. (S) -Retro-2.1 est 500 fois plus puissant contre Stx (50 nM) que la molécule initiale. Cette étude peut donner lieu à un nouveau concept thérapeutique ciblant la voie de transport rétrograde de la toxine à l'intérieur de la cellule hôte. Une telle stratégie thérapeutique pourrait donc être étendue à d'autres agents pathogènes qui usent également du trafic rétrograde pour une intoxication des cellules hôtes. Ce nouveau concept thérapeutique qui permet de cibler les cellules hôtes et non l'agent pathogène représente une véritable percée dans la découverte de médicaments à large spectre et réduit le risque de développement d’une résistance chez l’agent pathogène. / Shiga toxins (Stx) are produced by Shigella dysenteriae and certain species of E. coli that can be transmitted to humans primarily through consumption of contaminated foods and may cause severe disease. Stx is released by the bacteria in the intestine and subsequently, could cross the downstream blood vessels to reach their main target organs such as kidney. Damage to the kidney can result in serious life-threatening complication hemolytic uremic syndrome, for which there is no proven safe treatment available other than supportive care. Stx invades renal endothelial cells in a retrograde manner from cell surface to the endoplasmic reticulum in order to gain access to its cytosolic target, 28S rRNA. By using HTS, it was previously demonstrated that the compound Retro-2 blocks retrograde trafficking of Stx at the early endosome-TGN interface, without affecting the morphology of cellular organelles and trafficking of other endogenous proteins. In this work, different regions of the lead inhibitor Retro-2 that are critical for the protective activity have been determined by systematic structure-activity relationship studies. It allowed us to identify a dihydroquinazolinone derivative, named Retro-2.1 that is the most potent inhibitor of Stx to date and also to develop bio-active photo-activatable probes with the aim of identifying the molecular target of Retro-2 derivatives. Further, crystal X-ray diffraction data revealed that the antitoxin activity resides mainly in the S-enantiomer. (S)-Retro-2.1 has displayed 500 fold more potency (50 nM) than parent molecule against Stx cytotoxicity. This study may result in a new therapeutic concept - targeting the retrograde transport route of toxin inside host cell - for the treatment of Stx-producing E. coli infections and could therefore be extended to other pathogens that also traffic via the retrograde transport. Such a new therapeutic concept that target the host cells and not the pathogen itself would represent a real breakthrough in drug discovery leading to broad spectrum drugs.

La toxine pertussique (PTX) est une exotoxine produite uniquement par Bordetella pertussis, un pathogène de la coqueluche. Les effets de la toxine au cours d'une infection bactérienne sont bien connus, et sont pour la plupart liés à son activité ADP-ribosyltransférase qui cible les GPCRs. Or, la PTX est un antigène majeur permettant d’établir une réponse immunitaire contre B. pertussis ce qui en fait donc un composant principal de tous les vaccins anti-coqueluche actuels. De nombreux travaux sur la PTX concernent ses mécanismes moléculaires et son rôle durant la phase d'infection. Mais, il y a un manque d'information sur le rôle immunogène de la PTX.En utilisant un modèle d'infection intranasale par B. pertussis, nous avons constaté que la génération de lymphocytes T CD4 mémoires résidant (Trm) dans les poumons dépendait de l'exposition à la PTX. La toxine pertussique est couramment utilisée pour inhiber la réponse aux chimiokines, dans l'étude de la migration des cellules T. Etant donné que la plupart des récepteurs aux chimiokines sont des GPCRs, la mobilité de nombreuses cellules immunitaires, y compris les cellules T, est facilement affectée par la PTX. La migration des cellules T est un phénomène sophistiqué régulé spatio-temporellement. Nos résultats démontrent que la PTX n’affecte pas les étapes de la migration dépendantes des intégrines lorsque les cellules T sont activées.Ce travail s’intéresse à l'impact de la PTX sur la biologie des cellules T en étudiant son rôle dans la réponse immunitaire adaptative in vivo, dans un modèle animal d'infection et son impact sur la migration des lymphocytes T in vitro. / Pertussis toxin (PTX) is an exotoxin uniquely produced from Bordetella pertussis, a human respiratory tract pathogen causing pertussis disease, also known as whooping cough. The toxin is well described its virulence effects during bacterial infection. Most of these effects are due to ADP-ribosyltransferase activity of the molecule that targets G-protein coupled receptors (GPCR). On the other hand, PTX is an important antigen that provides protection against pertussis disease and a major component of all current pertussis vaccines. There are numerous literatures on PTX about its molecular mechanisms and its role during infection phase. Instead, lack of information on how PTX contributes host’s adaptive immunity has incurred confusion in understanding the immunogenic role of PTX. With intranasal infection model of B. pertussis, we detected the generation of CD4 lung-resident memory T cells (Trm) were depending on PTX exposure. For T cell migration study, PTX is being used to inhibit chemokine response. Because most of chemokine receptors are GPCR, the motility of many immune cells including T cells is easily affected by PTX. T cell migration is a sophisticate phenomenon regulated space-temporally. The results demonstrated, once T cells become activated and effector, are less influenced than inactivated T cells.This thesis reports the impact of PTX on T cells in two parts; 1) Role of PTX in adaptive immune response by in vivo infection system and 2) Influence of PTX on T cell motility by in vitro assays.